CN115486370B - 一种无褐化杉木外植体及其制备方法 - Google Patents

一种无褐化杉木外植体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种无褐化杉木外植体及其制备方法，制备方法包括如下步骤：剪取成年杉木树冠当年生枝条，保留枝条的带芽茎段和顶芽，剪掉其余部分，获得茎段；将茎段末端的针叶剪掉，保留基部，然后将茎段完全置于预处理液中浸泡并搅拌；将预处理后的茎段完全置于浸泡液一中浸泡；将浸泡液一中处理后的茎段进行消毒，制得。该杉木外植体具有来源广泛、污染率低的优点，可有效解决现有的杉木外植体存在的来源局限性大，培育过程中污染率高，存在褐化的问题。

Description

一种无褐化杉木外植体及其制备方法
技术领域
本发明属于杉木繁殖技术领域，具体涉及一种无褐化杉木外植体及其制备方法。
背景技术
杉木是我国南方地方最重要的乡土用材林树种，我国人民利用杉木的历史悠久，远在秦汉期间《尔雅》中就有提及，表明很早以前人民利用了该木材。杉木主要用于房屋、轮船、矿山、造纸、家具家装等生活和生产场景，是最重要的建筑材、纸浆造纸用材和装饰用材。以前杉木的主要繁殖类型有实生繁殖和无性系繁殖两种，目前，随着组培快繁技术的提高，通过组培快繁的方法对杉木进行繁殖成为主要的繁殖方式。目前组培快繁的外植体来源主要是幼龄树(小于10年)的基部萌条或者是大树伐桩上的萌条，这些材料的特点是萌条数量多，萌条位置低易于观察和选择，萌条幼嫩，杉木油等次生代谢物相对较少，组培的过程中不容易褐化，培养过程中反应快，液芽萌发快、萌发能力强，且该萌条具有生长的特性，其发育的植株不会出现偏冠现象。而成年大树冠层穗条节间显著小于基部萌条，冠层针叶紧密，尤其是针叶基部更为致密，导致针叶间缝隙较小，消毒液难以渗透，缝隙内的微生物难以杀灭，非常容易污染；而且冠层穗条直径要大于同龄的基部萌条，杉木油等内含物更多，切开以后流白浆，切口更容易褐化，因此，目前的组配方法中基本不使用冠层穗条作为外植体。
而当采用基部萌条或者是大树伐桩上的萌条作为外植体时，一般是将穗条剪切为30-50cm的长度，然后放入含水的水桶内保证，保证穗条在长期运输途中不失水，回到实验室以后再将穗条剪成10cm左右的小段进行清洗制备。现有外植体制备方法只能将穗条运回实验室进行处理，运输过程中穗条仅仅泡在水体中，未进行防褐化处理，导致后续外植体褐化率增加，污染率也增加。且现有的方法只能采用基部萌条或大树伐桩上的萌条，局限性很大。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种无褐化杉木外植体及其制备方法，该杉木外植体具有来源广泛、污染率低的优点，可有效解决现有的杉木外植体存在的来源局限性大，培育过程中污染率高，存在褐化的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种无褐化杉木外植体的制备方法，包括如下步骤：
(1)剪取成年杉木树冠当年生枝条，保留枝条的带芽茎段和顶芽，剪掉其余部分，获得茎段；
(2)将茎段末端的针叶剪掉，保留基部，然后将茎段完全置于预处理液中浸泡并搅拌；
(3)将预处理后的茎段完全置于浸泡液一中浸泡；
(4)将浸泡液一中处理后的茎段进行消毒，制得。
上述方案中，将成年杉木树冠上的穗条作为外植体的制备原料，由于成年杉木的生长趋势已经成型，因此，可选择质量优良的杉木作为来源，采用其树冠上的穗条制备外植体，有效提高了后续培养杉木的质量。且剪取的茎段进行预处理并进行浸泡，可有效降低杉木褐化的情况发生，提高外植体的成活率。
进一步地，步骤(1)中茎段的长度为10-15cm。
上述方案中，只需剪取10-15cm的茎段带回实验室进行外植体制备即可，无需携带过多的枝条，大大提高了操作人员携带的方便性以及携带量，提高了野外作业效率。
进一步地，步骤(1)中枝条上的针叶排布为轮状叶。
上述方案中，枝条上的针叶为轮状叶的可满足外植体的制备要求，为羽状叶的无法满足外植体制备要求。
进一步地，步骤(2)中预处理液包括无菌水、PVP和吐温-80，其中PVP的浓度为0.5-2.0g/L，吐温-80的浓度为0.4-0.6g/L。
进一步地，步骤(3)中浸泡液一包括无菌水、PVP和PEG6000，其中PVP的浓度0.5-2.0g/L，PEG6000的浓度为8-12g/L；茎段在浸泡液一中浸泡时间为2-10h。
进一步地，当步骤(3)中浸泡处理结束到步骤(4)中消毒处理开始的时间间隔大于2h时，需要增加对茎段的处理操作，具体为：将浸泡液一中的茎段取出，削去叶片，保留腋芽，将无叶茎段剪成带有1-2腋芽的小段，将带有腋芽的小段置于浸泡液二中浸泡。
进一步地，浸泡液二包括无菌水和PVP，其中PVP的浓度为0.5-2.0g/L；带有腋芽的小段在浸泡液二中浸泡时间为15-30min。
进一步地，预处理液、浸泡液一和浸泡液二中的PVP为PVP K-20、PVP K-30或PVPK-40。
进一步地，步骤(4)中消毒液为有效氯含量为1.6-2.1g/L的84消毒液，消毒时间为25-40min，消毒过程中摇动容器若干次，每次不低于30s，消毒完成后，用浸泡液二震荡冲洗，然后将茎段置于浸泡液二中备用。
一种无褐化杉木外植体的制备方法，其特征在于，采用权利要求1-9中任一项所述的方法制得。
本发明所产生的有益效果为：
1、本申请中选择成年杉木冠层穗条作来源，可以根据杉木的品质进行选取，有效提高了后代杉木的质量。且本申请中的方法也适用于对基部萌条进行处理，可选的杉木范围也更广，局限性更小。
2、本申请中剪取的穗条茎段在预处理液和浸泡液中进行浸泡处理，杉木外植体的各处伤口及内部均不会变黑，与之接触的培养基也不会变黑，有效避免外植体在培育过程中出现褐化的问题。主要是在浸泡过程中，PEG6000可发挥低压渗透作用，而PVP对杉木油具有助溶和分散的做作用，在浸泡过程中，通过PEG6000的低压渗透辅助作用，可将穗条内的杉木油从穗条基部切口和针叶切口处释放出来，以避免在后续培养过程中变色褐化。
本申请将茎段的末端的针叶剪掉，保留基部，可提高茎段组织的暴露面积，通过暴露的基部释放组织中的杉木油等物质，以降低茎段中杉木油含量，避免后续发生褐化的问题。
3、本申请中对杉木穗条的处理方式与常规的处理方式相比，只需剪取10-15cm长茎段即可，无需携带过多无用枝条，相同体积容器可携带的有效枝条数量提升了3-6倍，大大提高了野外作业效率。
附图说明
图1为冠层穗条和基部萌条的实务照片；
图2为对比例1中的方法处理的外植体实物照片；
图3为对比例2中的方法处理的外植体实物照片；
图4为实施例1中的方法处理的外植体实物照片。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1
一种无褐化杉木外植体，其制备方法包括如下步骤：
(1)剪取成年杉木树冠当年生且针叶排布为轮状叶的枝条，保留枝条的带芽茎段和顶芽，剪掉其余部分，获得13cm长的茎段；
(2)将茎段末端的针叶剪掉，保留基部，然后将茎段完全置于预处理液中浸泡并搅拌；预处理液包括无菌水、PVP K-30和吐温-80，其中PVP K-30的浓度为1g/L，吐温-80的浓度为0.5g/L；
(3)将预处理后的茎段完全置于浸泡液一中浸泡；浸泡液一包括无菌水、PVP K-30和PEG6000，其中PVP K-30的浓度1g/L，PEG6000的浓度为10g/L；茎段在浸泡液一中浸泡时间为5h；
(4)将浸泡液一中的茎段取出，削去叶片，保留腋芽，将无叶茎段剪成带有1-2腋芽的小段，将带有腋芽的小段置于浸泡液二中浸泡；浸泡液二包括无菌水和PVP K-30，其中PVP K-30的浓度为1g/L；带有腋芽的小段在浸泡液二中浸泡时间为20min；
(5)将浸泡液一中处理后的茎段进行消毒，消毒液为有效氯含量为1.8g/L的84消毒液，消毒时间为30min，消毒过程中摇动容器5次，每次不低于30s，消毒完成后，用浸泡液二震荡冲洗，然后将茎段置于浸泡液二中备用，制得。
实施例2
一种无褐化杉木外植体，其制备方法包括如下步骤：
(1)剪取成年杉木树冠当年生且针叶排布为轮状叶的枝条，保留枝条的带芽茎段和顶芽，剪掉其余部分，获得11cm长的茎段；
(2)将茎段末端的针叶剪掉，保留基部，然后将茎段完全置于预处理液中浸泡并搅拌；预处理液包括无菌水、PVP K-30和吐温-80，其中PVP K-30的浓度为0.8g/L，吐温-80的浓度为0.4g/L；
(3)将预处理后的茎段完全置于浸泡液一中浸泡；浸泡液一包括无菌水、PVP K-30和PEG6000，其中PVP K-30的浓度0.8g/L，PEG6000的浓度为8g/L；茎段在浸泡液一中浸泡时间为3h；
(4)将浸泡液一中的茎段取出，削去叶片，保留腋芽，将无叶茎段剪成带有1-2腋芽的小段，将带有腋芽的小段置于浸泡液二中浸泡；浸泡液二包括无菌水和PVP K-30，其中PVP K-30的浓度为0.8g/L；带有腋芽的小段在浸泡液二中浸泡时间为15min；
(5)将浸泡液一中处理后的茎段进行消毒，消毒液为有效氯含量为1.6g/L的84消毒液，消毒时间为25min，消毒过程中摇动容器2次，每次不低于30s，消毒完成后，用浸泡液二震荡冲洗，然后将茎段置于浸泡液二中备用，制得。
实施例3
一种无褐化杉木外植体，其制备方法包括如下步骤：
(1)剪取成年杉木树冠当年生且针叶排布为轮状叶的枝条，保留枝条的带芽茎段和顶芽，剪掉其余部分，获得15cm长的茎段；
(2)将茎段末端的针叶剪掉，保留基部，然后将茎段完全置于预处理液中浸泡并搅拌；预处理液包括无菌水、PVP K-30和吐温-80，其中PVP K-30的浓度为1.5g/L，吐温-80的浓度为0.6g/L；
(3)将预处理后的茎段完全置于浸泡液一中浸泡；浸泡液一包括无菌水、PVP K-30和PEG6000，其中PVP K-30的浓度1.5g/L，PEG6000的浓度为12g/L；茎段在浸泡液一中浸泡时间为8h；
(4)将浸泡液一中的茎段取出，削去叶片，保留腋芽，将无叶茎段剪成带有1-2腋芽的小段，将带有腋芽的小段置于浸泡液二中浸泡；浸泡液二包括无菌水和PVP K-30，其中PVP K-30的浓度为1.5g/L；带有腋芽的小段在浸泡液二中浸泡时间为30min；
(5)将浸泡液一中处理后的茎段进行消毒，消毒液为有效氯含量为2g/L的84消毒液，消毒时间为40min，消毒过程中摇动容器3次，每次不低于30s，消毒完成后，用浸泡液二震荡冲洗，然后将茎段置于浸泡液二中备用，制得。
实施例4
一种无褐化杉木外植体，其制备方法包括如下步骤：
(1)剪取成年杉木树冠当年生且针叶排布为轮状叶的枝条，保留枝条的带芽茎段和顶芽，剪掉其余部分，获得13cm长的茎段；
(2)将茎段末端的针叶剪掉，保留基部，然后将茎段完全置于预处理液中浸泡并搅拌；预处理液包括无菌水、PVP K-30和吐温-80，其中PVP K-30的浓度为1g/L，吐温-80的浓度为0.5g/L；
(3)将预处理后的茎段完全置于浸泡液一中浸泡；浸泡液一包括无菌水、PVP K-30和PEG6000，其中PVP K-30的浓度1g/L，PEG6000的浓度为10g/L；茎段在浸泡液一中浸泡时间为5h；
(4)将浸泡液一中处理后的茎段进行消毒，消毒液为有效氯含量为1.8g/L的84消毒液，消毒时间为30min，消毒过程中摇动容器5次，每次不低于30s，消毒完成后，用浸泡液一震荡冲洗，然后将茎段置于浸泡液一中备用，制得。
对比例1
一种无褐化杉木外植体，其制备方法包括如下步骤：
(1)剪取杉木基部萌条，将其置于无菌水中完全浸泡；
(2)将基部萌条剪成10cm长的小段，用洗洁精浸泡10min，然后用流水冲洗30min，然后剪取带芽和径尖的茎段，茎段长3cm；
(3)将茎段使用升汞进行消毒，消毒完成后，将茎段置于无菌水中备用，制得。
对比例2
一种无褐化杉木外植体，其制备方法包括如下步骤：
(1)剪取成年杉木树冠当年生且针叶排布为轮状叶的枝条，保留枝条的带芽茎段和顶芽，剪掉其余部分，获得13cm长的茎段；
(2)将茎段末端的针叶剪掉，保留基部，然后将茎段完全置于预处理液中浸泡并搅拌；预处理液包括无菌水、PVP K-30和吐温-80，其中PVP K-30的浓度为1g/L，吐温-80的浓度为0.5g/L；
(3)将预处理后的茎段完全置于浸泡液一中浸泡；浸泡液一包括无菌水、PVP K-30和PEG6000，其中PVP K-30的浓度1g/L，PEG6000的浓度为10g/L；茎段在浸泡液一中浸泡时间为14h；
(4)将浸泡液一中的茎段取出，削去叶片，保留腋芽，将无叶茎段剪成带有1-2腋芽的小段，将带有腋芽的小段置于浸泡液二中浸泡；浸泡液二包括无菌水和PVP K-30，其中PVP K-30的浓度为1g/L；带有腋芽的小段在浸泡液二中浸泡时间为20min；
(5)将浸泡液一中处理后的茎段进行消毒，消毒液为有效氯含量为1.8g/L的84消毒液，消毒时间为30min，消毒过程中摇动容器5次，每次不低于30s，消毒完成后，用浸泡液二震荡冲洗，然后将茎段置于浸泡液二中备用，制得。
试验例
从高县林场2代种子园中随机选择了10株30年生杉木大树树冠当年生穗条；筠连林场10株9年生杉木幼龄林树冠当年生穗条和基部萌条；泸定燕子沟小学的两株杉木古树(树龄＞100年)树冠当年生穗条，将上述树冠当年生穗条分别采用实施例1、对比例1和对比例2中的方法进行处理，统计每一种方法的褐化率以及污染率，具体结果见表1。并统计外植体在后续繁殖过程中的成活率，具体见表2。
褐化率＝穗条切口褐化长度≥1mm的穗条数量/穗条总数；
污染率＝细菌或真菌感染的穗条数量/穗条总数；
(注：两个指标分别统计，相互不干涉，各统计各自的。即褐化的穗条也可能被污染了。
表1：外植体处理效果
通过上述方法得知，采用实施例1中的方法处理的成年杉树树冠穗条可有效降低外植体的褐化率和污染率，提高外植体的成活率。
表2：外植体的成活率
通过上表中的数据得知，采用实施例1中的方法处理的外植体的成活率远远高于对比例1和对比例2中的成活率。
图1为冠层穗条和基部萌条的实物照片，从图中可以看出，冠层穗条的叶间缝隙更小，而基部萌条的叶间缝隙更大。
图2为对比例1中的方法处理的外植体的实物照片，从图中可以看出，外植体的伤口已经发生褐化。
图3对比例2中的方法处理的外植体的实物照片，从图中可以看出，外植体在浸泡液一中的浸泡时间过长，导致茎段末端切口出现腐烂的问题。
图4为实施例1中的方法处理的外植体实物照片，从图中可以看出，外植体表面无褐化和腐烂现象，外植体生长状态良好。

Claims (4)

1.一种无褐化杉木外植体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）剪取成年杉木树冠当年生枝条，枝条上的针叶排布为轮状叶，保留枝条的带芽茎段和顶芽，剪掉其余部分，获得茎段；
（2）将茎段末端的针叶剪掉，保留基部，然后将茎段完全置于预处理液中浸泡并搅拌；其中，预处理液包括无菌水、PVP和吐温-80，其中PVP的浓度为0.8-1.5g/L，吐温-80的浓度为0.4-0.6g/L；
（3）将预处理后的茎段完全置于浸泡液一中浸泡；其中，浸泡液一包括无菌水、PVP和PEG6000，其中PVP的浓度0.8-1.5g/L，PEG6000的浓度为8-12g/L；茎段在浸泡液一中浸泡时间为3-8h；
（4）将浸泡液一中的茎段取出，削去叶片，保留腋芽，将无叶茎段剪成带有1-2腋芽的小段，将带有腋芽的小段置于浸泡液二中浸泡，将浸泡液二中处理后的茎段进行消毒，制得；浸泡液二包括无菌水和PVP，其中PVP的浓度为0.8-1.5g/L；带有腋芽的小段在浸泡液二中浸泡时间为15-30min。
2.如权利要求1所述的无褐化杉木外植体的制备方法，其特征在于，步骤（1）中茎段的长度为10-15cm。
3. 如权利要求1所述的无褐化杉木外植体的制备方法，其特征在于，预处理液、浸泡液一和浸泡液二中的PVP为PVP K-20、PVP K-30或PVP K-40。
4.如权利要求1所述的无褐化杉木外植体的制备方法，其特征在于，步骤（4）中消毒液为有效氯含量为1.6-2.1g/L的84消毒液，消毒时间为25-40min，消毒过程中摇动容器若干次，每次不低于30s，消毒完成后，用浸泡液二震荡冲洗，然后将茎段置于浸泡液二中备用。
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