CN115478094A - 水中菌落总数酶底物法测定剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水中菌落总数酶底物法测定剂及其制备方法，所述水中菌落总数酶底物法测定剂包括以下重量份的组分：9～13份的PH调节剂；9.46～10.08份的指示剂；5.62～8.14份的抑制剂；3～5份的生产剂。其中，所述PH调节剂由7～9份的氯化钠；2～4份的磷酸氢二钾；指示剂由0.3～0.5份的4‑甲基伞形酮‑β‑D‑葡萄糖醛酸苷、0.06～0.08份4‑甲基伞形酮磷酸酯、6.3～6.5份的4‑(2‑羟乙基)‑1‑哌嗪乙磺酸和2.8～3.0份的N‑(2‑羟乙基)哌嗪‑N'‑2‑乙烷磺酸构成；所述抑制剂由0.5～0.8份的硫酸镁、5～7份的硫酸铵、0.1～0.3份的羧苄青霉素二钠和0.02～0.04份的硫酸锰构成。述生生产剂由1.2～1.5份的酵母提取物、1.5～1.7份的蛋白胨、0.3～0.5份的维生素K构成。本发明能够针对水中的菌落总数进行微生物检测，同时改善检测效率、提高检测灵敏度。

Description

水中菌落总数酶底物法测定剂及其制备方法
技术领域
本发明属于饮用水检测技术领域，具体来说涉及一种水中菌落总数酶底物法测定剂，以及对该水中菌落总数酶底物法测定剂的制备方法。
背景技术
饮用水中菌落总数是指在一定条件下，经过一定时间培养后所得水样中的微生物个数，在饮用水中所测得的细菌菌落总数除说明水被生活废物污染的程度外，还指示该饮用水能否饮用。水中细菌总数与水体受有机污染的程度成正相关。因此细菌总数常作为评价水体污染程度的一个重要指标。细菌总数越大，说明水体被污染得越严重。我国现行《生活饮用水卫生标准》(GB5749--2006)规定：细菌菌落总数在1mL自来水中不得超过100个；目前我国对于水中菌落总数的检测方法，主要为细菌培养方法，即平皿计数法；使用培养基将检测水样中通过营养物经过36℃±1℃培养，48小时后得出结果。该方法属于微生物检测的传统方法，需要在实验前期做大量的培养基配置工作，检测场所需要达到无菌环境实验环境要求；对检测人员的技术水平很大程度会对实验结果造成影响，目前已经不能满足于当前我国的对公共卫生安全的检测要求，和应对当前公共卫生安全突发的复杂性。因此如何开发一种通过酶底物方法，利用4-甲基伞形酮磷酸酯和4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷作为指示剂，当酶底物被菌落送送代谢时，经过36℃培养48小时后，样品在366nm波长紫外灯下，产生蓝色荧光。该方法主要针对水中的菌落总数进行微生物检测，同时改善检测效率、提高检测灵敏度，减少人为误差是本领域技术人员需要研究的方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种水中菌落总数酶底物法测定，其能够针对水中的菌落总数进行微生物检测，同时改善检测效率、提高检测灵敏度、减少人为误差。
其采用的技术方案如下：
一种水中菌落总数酶底物法测定剂，其包括以下重量份的组分：9～13份的PH调节剂；9.46～10.08份的指示剂；5.62～8.14份的抑制剂；3～5份的生产剂。其中，所述生产剂由1.2-～1.5份的酵母提取物、1.5～1.7份的蛋白胨、0.3-0.5份的维生素K构成。
优选的是，上述水中菌落总数酶底物法测定剂中：所述PH调节剂采用7～9份的氯化钠和2～4份的磷酸氢二钾。
更优选的是，上述水中菌落总数酶底物法测定剂中：所述指示剂由0.3～0.5份的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷、0.06～0.08份登陆4-甲基伞形酮磷酸酯、6.3～6.5份的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸和2.8～3.0份的N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸构成。
更优选的是，上述水中菌落总数酶底物法测定剂中：所述抑制剂由为0.5～0.8份的硫酸镁、5～7份的硫酸铵、0.1～0.3份的羧苄青霉素二钠和0.02～0.04份的硫酸锰构成。
本发明还公开了一种制备上述水中菌落总数酶底物法测定剂的制备方法。
其包括如下步骤：
S1：分别将PH调节剂和指示剂加热至55℃、直至PH调节剂和指示剂中的水分分别小于5％；
S2：将S1所得PH调节剂和指示剂分别研磨为粉末、直至PH调节剂和指示剂的粉末颗粒分别小于60目；
S3：将S2所得PH调节剂和指示剂搅拌混匀、得PH调节剂和指示剂的混合粉末；
S4：对S3所得混合粉末中投入抑制剂、生产剂、持续搅拌2小时，制得水中菌落总数酶底物法测定剂干粉型成品。
优选的是，上述水中菌落总数酶底物法测定剂制备方法中：所述PH调节剂采用氯化钠和磷酸氢二钾；所述指示剂由4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷、4-甲基伞形酮磷酸酯、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸和N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸构成；所述抑制剂由硫酸镁、硫酸铵、羧苄青霉素二钠和硫酸锰构成。
更优选的是，所述PH调节剂采用7～9份的氯化钠和2～4份的磷酸氢二钾，所述指示剂由0.3～0.5份的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷、0.06～0.08份4-甲基伞形酮磷酸酯、6.3～6.5份的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸和2.8～3.0份的N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸构成，所述抑制剂由0.5～0.8份的硫酸镁、5～7份的硫酸铵、0.1～0.3份的羧苄青霉素二钠和0.02～0.04份的硫酸锰构成，所述生产剂由1.2～1.5份的酵母提取物、1.5～1.7份的蛋白胨、0.3～0.5份的维生素K构成。
最优选的是，所述PH调节剂采用8份的氯化钠和3份的磷酸氢二钾，所述指示剂由0.4份的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷、0.07份4-甲基伞形酮磷酸酯、6.4份的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸和2.9份的N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸构成，所述抑制剂由0.65份的硫酸镁、5份的硫酸铵、0.2份的羧苄青霉素二钠和0.03份的硫酸锰构成，所述生产剂由1.25份的酵母提取物、1.6份的蛋白胨、0.4份的维生素K构成。
相对于现有技术，本发明能够对饮用水、自来水、污水中的菌落总数实现快速检测。可配合市面上根据的84孔定量盘和MPN表格使用，可达到48小时定性定量的检测结果，不但提高了检测效率，减少了人工成本而且还降低了使用人员和环境的污染。此外，本产品可在121℃灭菌后按企业要求进行废弃处理。相对于现有产品减少了企业的环保成本。
与现有技术相比，本发明能够有效降低使用人员和环境的污染，针对水中的菌落总数进行微生物检测，同时改善检测效率、提高检测灵敏度。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将结合各个实施例作进一步描述。
实施例1：
一种水中菌落总数酶底物法测定剂，其原料包括组分：
7份的氯化钠,2份磷酸氢二钾，0.3份的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷，0.06份4-甲基伞形酮磷酸酯，6.3份的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸，2.8份的N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸，0.5份的硫酸镁，5份的硫酸铵，0.1份的羧苄青霉素二钠，0.02份的硫酸锰，1.2份酵母提取物，3.5份的蛋白胨，0.3份的维生素K。
其制备过程如下：
S1：分别将PH调节剂和指示剂加热至55℃、直至PH调节剂和指示剂中的水分分别小于5％；
S2：将S1所得PH调节剂和指示剂分别研磨为粉末、直至PH调节剂和指示剂的粉末颗粒分别小于60目；
S3：将S2所得PH调节剂和指示剂搅拌混匀、得PH调节剂和指示剂的混合粉末；
S4：对S3所得混合粉末中投入抑制剂、生产剂、持续搅拌2小时，随后控制在40℃以下停机放料、制得水中菌落总数酶底物法测定剂干粉型成品。
对比例1
取1.5份的实施例1成品投入1ml水样中进行检测。同时通过菌落总数阳性混合定量菌株和酶底物法和平皿计数法进行对比，对比实验检测结果如表1所示：
Figure BDA0003114172050000041
表1
基于上述比对实验证明，采用实施例1所提供的水中菌落总数酶底物法测定剂，在对混合定量阳性菌株进行测试时，测试结果在24小时菌落总数达到顶峰值并且一直保持至48小时未有变化，而滤膜法在24小时为成长期在48小时候达到峰值，测试结果结果均符合菌落总数阳性定量菌株的95％置信区间，通过对比，可得出结论，水中菌落总数酶底物法其灵敏度更高，检测结果更贴近事实。
实施例2：
一种水中菌落总数酶底物法测定剂，其原料包括组分：
8份的氯化钠，3份磷酸氢二钾，0.4份的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷0.07份的4-甲基伞形酮磷酸酯，6.4份的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸，2.9份的N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸，0.65份的硫酸镁，5份的硫酸铵，0.2份的羧苄青霉素二钠，0.03份的硫酸锰，1.25份酵母提取物，1.6份的蛋白胨，0.4份的维生素K。
其制备过程如下：
S1：分别将PH调节剂和指示剂加热至55℃、直至PH调节剂和指示剂中的水分分别小于5％；
S2：将S1所得PH调节剂和指示剂分别研磨为粉末、直至PH调节剂和指示剂的粉末颗粒分别小于60目；
S3：将S2所得PH调节剂和指示剂搅拌混匀、得PH调节剂和指示剂的混合粉末；
S4：对S3所得混合粉末中投入抑制剂、蛋白胨持续搅拌2小时，随后控制在40℃以下停机放料、制得水中菌落总数酶底物法测定剂干粉型成品。
对比例2
取1.5份的实施例2成品投入1ml水样中进行检测。同时通过菌落总数阳性定量菌株和酶底物法和膜过滤法进行对比，对比实验检测结果如表2所示：
Figure BDA0003114172050000051
表2
基于上述比对实验证明，采用实施例1所提供的水中菌落总数酶底物法测定剂，在对定量阳性菌株进行测试时，测试结果在24小时菌落总数达到顶峰值并且一直保持至48小时未有变化，而滤膜法在24小时为成长期在48小时候达到峰值，测试结果结果均符合菌落总数阳性定量菌株的95％置信区间，通过对比，可得出结论，水中菌落总数酶底物法其灵敏度更高，检测结果更贴近事实。
实施例3：
一种水中菌落总数酶底物法测定剂，其原料包括组分：
9份的氯化钠，4份磷酸氢二钾，0.5份的邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷，0.08份的4-甲基伞形酮磷酸酯，6.5份的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸，3.0份的N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸，0.8份的硫酸镁，7份的硫酸铵，0.3份的羧苄青霉素二钠，0.04份的硫酸锰，1.5份的酵母提取物，,3份的蛋白胨，0.5份的维生素K。
其制备过程如下：
S1：分别将PH调节剂和指示剂加热至55℃、直至PH调节剂和指示剂中的水分分别小于5％；
S2：将S1所得PH调节剂和指示剂分别研磨为粉末、直至PH调节剂和指示剂的粉末颗粒分别小于60目；
S3：将S2所得PH调节剂和指示剂搅拌混匀、得PH调节剂和指示剂的混合粉末；
S4：对S3所得混合粉末中投入抑制剂、蛋白胨、持续搅拌2小时，随后控制在40℃以下停机放料、制得水中菌落总数酶底物法测定剂干粉型成品。
对比例3
取1.5份的实施例1成品投入100ml水样中进行检测。同时通过菌落总数阳性定量菌株和酶底物法和膜过滤法进行对比，,对比实验检测结果如表3所示：
Figure BDA0003114172050000061
Figure BDA0003114172050000071
基于上述比对实验证明，采用实施例3所提供的水中菌落总数酶底物法测定剂，在对定量阳性菌株进行测试时，测试结果在24小时菌落总数达到顶峰值并且一直保持至48小时未有变化，而滤膜法在24小时为成长期在48小时候达到峰值，测试结果结果均符合菌落总数阳性定量菌株的95％置信区间，通过对比，可得出结论，水中菌落总数酶底物法其灵敏度更高，检测结果更贴近事实。
终上所述，计量按最低(实例1)、中间值(实例2)、最高(实例3)分别进行试验比对得出结论，计量在添加值在实例2中表现最好，超过中间值到最高值(实例3)对结果影响不大，试验效率上没有明显提升。
以上所述，仅为本发明的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种水中菌落总数酶底物法测定剂，其特征在于，包括以下重量份的组分：
PH调节剂 9～13份；
指示剂 9.46～10.08份；
抑制剂 5.62～8.14份；
生产剂3～5份；
所述生产剂由1.2～1.5份的酵母提取物、1.5～1.7份的蛋白胨、0.3～0.5份的维生素K构成。
2.如权利要求1所述水中菌落总数酶底物法测定剂，其特征在于：所述PH调节剂采用7～9份的氯化钠和2～4份的磷酸氢二钾。
3.如权利要求1所述水中菌落总数酶底物法测定剂，其特征在于：所述指示剂由0.3～0.5份的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷、0.06～0.08份4-甲基伞形酮磷酸酯、6.3～6.5份的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸和2.8～3.0份的N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸构成。
4.如权利要求1所述水中菌落总数酶底物法测定剂，其特征在于：所述抑制剂由0.5～0.8份的硫酸镁、5～7份的硫酸铵、0.1～0.3份的羧苄青霉素二钠和0.02～0.04份的硫酸锰构成。
5.一种水中菌落总数酶底物法测定剂制备方法，其特征在于包括如下步骤：
S1：分别将PH调节剂和指示剂加热至55℃、直至PH调节剂和指示剂中的水分分别小于5％；
S2：将S1所得PH调节剂和指示剂分别研磨为粉末、直至PH调节剂和指示剂的粉末颗粒分别小于60目；
S3：将S2所得PH调节剂和指示剂搅拌混匀、得PH调节剂和指示剂的混合粉末；
S4：对S3所得混合粉末中投入抑制剂、生产剂、持续搅拌2小时，制得水中菌落总数酶底物法测定剂干粉型成品。
6.如权利要求5所述水中菌落总数酶底物法测定剂制备方法，其特征在于：
所述PH调节剂采用氯化钠和磷酸氢二钾；所述指示剂由4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷、4-甲基伞形酮磷酸酯、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸和N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸构成；所述抑制剂由硫酸镁、硫酸铵、羧苄青霉素二钠和硫酸锰构成。
7.如权利要求5或6所述水中菌落总数酶底物法测定剂制备方法，其特征在于：所述PH调节剂采用7～9份的氯化钠和2～4份的磷酸氢二钾，所述指示剂由0.3～0.5份的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷、0.06～0.08份4-甲基伞形酮磷酸酯、6.3～6.5份的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸和2.8～3.0份的N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸构成，所述抑制剂由0.5～0.8份的硫酸镁、5～7份的硫酸铵、0.1～0.3份的羧苄青霉素二钠和0.02～0.04份的硫酸锰构成，所述生产剂由1.2～1.5份的酵母提取物、1.5～1.7份的蛋白胨、0.3～0.5份的维生素K构成。
8.如权利要求5或6所述水中菌落总数酶底物法测定剂制备方法，其特征在于：所述PH调节剂采用8份的氯化钠和3份的磷酸氢二钾，所述指示剂由0.4份的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷、0.07份4-甲基伞形酮磷酸酯、6.4份的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸和2.9份的N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸构成，所述抑制剂由0.65份的硫酸镁、5份的硫酸铵、0.2份的羧苄青霉素二钠和0.03份的硫酸锰构成，所述生产剂由1.25份的酵母提取物、1.6份的蛋白胨、0.4份的维生素K构成。
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