CN115475518A - 电泳装置 - Google Patents

电泳装置 Download PDF

Info

Publication number
CN115475518A
CN115475518A CN202211114214.2A CN202211114214A CN115475518A CN 115475518 A CN115475518 A CN 115475518A CN 202211114214 A CN202211114214 A CN 202211114214A CN 115475518 A CN115475518 A CN 115475518A
Authority
CN
China
Prior art keywords
chamber
buffer
separation
cells
membrane
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211114214.2A
Other languages
English (en)
Inventor
赵行峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Memphasys Ltd
Original Assignee
Memphasys Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2016904260A external-priority patent/AU2016904260A0/en
Application filed by Memphasys Ltd filed Critical Memphasys Ltd
Publication of CN115475518A publication Critical patent/CN115475518A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/0612—Germ cells sorting of gametes, e.g. according to sex or motility
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D57/00—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C
    • B01D57/02—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C by electrophoresis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D63/00—Apparatus in general for separation processes using semi-permeable membranes
    • B01D63/08—Flat membrane modules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D69/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by their form, structure or properties; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D69/02—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by their form, structure or properties; Manufacturing processes specially adapted therefor characterised by their properties
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D71/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by the material; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D71/06—Organic material
    • B01D71/38—Polyalkenylalcohols; Polyalkenylesters; Polyalkenylethers; Polyalkenylaldehydes; Polyalkenylketones; Polyalkenylacetals; Polyalkenylketals
    • B01D71/381—Polyvinylalcohol
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D71/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by the material; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D71/06—Organic material
    • B01D71/50—Polycarbonates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/061—Sperm cells, spermatogonia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0644—Platelets; Megakaryocytes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2313/00—Details relating to membrane modules or apparatus
    • B01D2313/44—Cartridge types
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2319/00—Membrane assemblies within one housing
    • B01D2319/06—Use of membranes of different materials or properties within one module
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Non-Silver Salt Photosensitive Materials And Non-Silver Salt Photography (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Eye Examination Apparatus (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及用于在大分子和/或细胞的电泳分离中使用的装置。

Description

电泳装置
本申请是2017年10月20日提交的，题为“电泳装置”的第201780078771.4号中国专利申请的分案申请。
技术领域
本申请要求澳大利亚临时专利申请No.2016904260(2016年10月20日提交)的优先权，其内容以其整体并入本文。
本发明涉及大分子和/或细胞的电泳分离。特别地，本发明涉及用于在大分子和/或细胞的电泳分离中使用的装置。
背景技术
在整个说明书中对现有技术的任何讨论决不应被认为是承认这种现有技术是众所周知的或形成本领域公知常识的部分。
电泳是在空间均匀电场的影响下分散颗粒相对于流体的运动。分散颗粒的运动根据颗粒上的电荷和施加的场梯度。电泳与允许带电荷的大分子或特定尺寸的细胞通过的多孔膜的组合，使得能够进行大分子或细胞的分离和提纯。
在WO 2000/013776和WO 2002/024314中描述了适合于大分子或细胞的电泳分离的装置。简言之，尺寸排阻多孔膜(下文称为分离膜)用于分离携带大分子或细胞的两个液体流，称为样品流和收获流。这些流在分离膜的任一侧和带电荷的电极之间经过。比分离膜中的孔隙小的带电荷的大分子或细胞在电场的影响下跨越膜从样品流迁移到收获流。该装置还包括缓冲剂流和水不可渗透膜，该水不可渗透膜(下文称为限制膜)允许离子通过而不允许设置在电极和分离膜之间的大分子或细胞通过。样品、收获流和缓冲剂流借助于泵和贮存器进行循环。需要循环缓冲剂(和相关联的管、泵和贮存器)以避免电极处的气体积聚并且在电解期间温度和pH的升高。然而，由于使用循环缓冲剂，在WO 2000/013776和WO2002/024314中描述的装置复杂且昂贵，并且难以净化。另外，该装置采用聚丙烯酰胺(PAm)限制膜，由于膜中可能存在有毒的丙烯酰胺单体，该PAm限制膜可能污染大分子或细胞。
因此，需要一种用于在大分子和/或细胞的电泳分离中使用的改进装置。
本发明的一个目的是克服或改良现有技术中的至少一个缺点，或提供有用的替代方案。
发明内容
用于溶液中的大分子和/或细胞的分离的先前电泳装置需要利用循环缓冲剂流来防止：
(a)电解过程中电极处的气体积聚；
(b)由于离子迁移到电极而引起跨越盒的pH梯度的积聚；以及
(c)由于电流的加热效应，样品室和收获室的温度增加。
本发明基于本发现(本文第一次公开)，即大分子和/或细胞的电泳分离不需要循环缓冲剂流。
一方面，本发明涉及一种用于溶液中的大分子和/或细胞的分离的电泳装置，该装置包括：
由尺寸排阻膜(分离膜)分隔开的样品室和收获室；
缓冲剂室，其在每个相应的样品室和收获室的侧面，其中每个缓冲剂室通过离子渗透膜(限制膜)与每个相应的样品室和收获室分隔开；以及
位于每个缓冲剂室中的电极。
在一个实施例中，缓冲剂室是非循环缓冲剂室。
在一个实施例中，缓冲剂室是密封的并包含缓冲剂溶液。
在一个实施例中，缓冲剂溶液具有低电解质含量。
在一个实施例中，缓冲剂溶液不包含盐。
在一个实施例中，缓冲剂溶液包括蔗糖。
在一个实施例中，缓冲剂溶液具有约7.5至约8.5的pH。
在一个实施例中，缓冲剂是HEPES缓冲剂。
在一个实施例中，缓冲剂是HEPES缓冲剂并且包括蔗糖。
在一个实施例中，缓冲剂是HEPES缓冲剂，包括蔗糖并且具有约7.5至约8.5的pH。
在一个实施例中，缓冲剂溶液包含30mM HEPES和250mM蔗糖，并采用三羟甲基氨基甲烷(Trizma)碱将该缓冲剂溶液调节至8.2的pH。
另一方面，本发明涉及一种用于溶液中的大分子和/或细胞的分离的电泳装置，该装置包括：
样品室，在该样品室的侧面有第一和第二收获室，每个收获室通过尺寸排阻膜(分离膜)与样品室分隔开；
缓冲剂室，其在每个收获室的侧面，其中每个缓冲剂室通过离子渗透膜(限制膜)与每个相应的收获室分隔开；以及
位于每个缓冲剂室中的电极。
在一个实施例中，每个收获室包括一个或多个分离膜，其中一个或多个分离膜基本上平行于限制膜。
在一个实施例中，每个收获室包括一个或多个分离膜，其中一个或多个分离膜基本上平行于限制膜，并且其中一个或多个分离膜中的每个分离膜的孔隙尺寸小于位于其与样品室之间的任何分离膜的孔隙尺寸。
在一个实施例中，每个样品室和收获室包含用于添加或移除溶液的一个或多个孔。
在一个实施例中，孔可以是能够密封的。
在一个实施例中，每个样品室和收获室包含用于使溶液通过每个样品室和收获室循环的入口和出口。
入口和出口可以是能够密封的。
在一个实施例中，该装置进一步包括用于将电极连接到电源的设备。
在一个实施例中，该装置是一种盒，其能够插入到包括电源的接收设备中，使得可以向电极施加电压。
在一个实施例中，该装置是一种盒，其能够插入到包括电源、泵和贮存器的接收设备，使得可以向电极施加电压，并且使得泵和贮存器与每个样品室和收获室流体连通以使溶液在每个样品室和收获室中循环。
在一个实施例中，盒是无菌的。
在一个实施例中，盒是一次性的。
在一个实施例中，限制膜包括PVA。
在一个实施例中，样品室和收获室能够进行温度控制。
在一个实施例中，限制膜不包含PAm。
在一个实施例中，限制膜具有小于15kDa的截留分子量(MWCO)。
在一个实施例中，限制膜具有小于5kDa的MWCO。
在一个实施例中，限制膜允许电场通过，但不允许大分子或细胞通过。
在一个实施例中，分离膜包括PVA。
在一个实施例中，分离膜包括聚碳酸酯。
在一个实施例中，分离膜不包含PAm。
在一个实施例中，分离膜的孔隙尺寸可以是约0.1μm至约100μm。
在一个实施例中，分离膜的孔隙尺寸可以是约0.5μm至约30μm。
在一个实施例中，分离膜的孔隙尺寸可以是约1μm至约8μm。
在一个实施例中，分离膜的孔隙尺寸可以是约1μm至约5μm。
在一个实施例中，分离膜的孔隙尺寸可以是约3μm至约5μm。
在一个实施例中，分离膜的孔隙尺寸可小于100μm。
在一个实施例中，分离膜的孔隙尺寸可小于30μm。
在一个实施例中，分离膜的孔隙尺寸可小于10μm。
在一个实施例中，分离膜的孔隙尺寸可小于8μm。
在一个实施例中，分离膜的孔隙尺寸可小于5μm。
在一个实施例中，分离膜的孔隙尺寸可小于1μm。
在一个实施例中，分离膜的孔隙尺寸可以是约100μm、约90μm，约80μm、约70μm、约60μm、约50μm、约40μm、约30μm、约20μm、约10μm、约9μm、约8μm、约7μm、约6μm、约5μm、约4μm、约3μm、约2μm、约1μm、约0.9μm、约0.8μm、约0.7μm、约0.6μm、约0.5μm、约0.4μm、约0.3μm、约0.2μm或约0.1μm。
在另外的方面，本发明涉及本发明装置用于精子分离的应用。
在另外的方面，本发明涉及本发明装置用于细胞分离的应用。
在另外的方面，本发明涉及本发明装置用于大分子分离的应用。
在另外的方面，本发明涉及本发明装置用于精子分离的应用。
在另外的方面，本发明涉及本发明装置用于血小板分离的应用。
在另外的方面，本发明涉及一种在溶液中的大分子和/或细胞的分离的方法，该方法包括将包含大分子和/或细胞的样品添加到本发明装置的样品室中，向电极施加电压并且从收获室收集分离的大分子和/或细胞。
在本发明的上下文中，词语“包括”、“包含”等应以它们的包括性来解释而不是它们的排他性的意思，也就是“包括但不限于”的意思。
如本文所用，术语“限制膜”意指允许电场通过但不允许大分子或细胞通过的膜。
如本文所用，术语“分离膜”意指多孔尺寸排阻膜。
如本文所用，术语“PAm”意指聚丙烯酰胺。
如本文所用，术语“PVA”意指聚(乙烯醇)。
如本文所用，与膜相关的术语“MWO”或“截留分子量”是指最低分子量溶质(以道尔顿为单位)，其中由膜保留至少90％的溶质，或者由膜保留90％的分子的近似分子量。
如本文所用，与膜相关的术语“孔隙尺寸”是指由膜保留的大分子或细胞的直径。
如本文所用，术语“大分子”意指包含大量原子的分子，通常通过较小亚单元(单体)的聚合来产生。大分子的示例包括蛋白质、肽、核酸和合成聚合物。
如本文所用，术语“盒”意指保持设备或装置并且易于改变或替代的盒子或容器。
附图说明
图1是示出本发明装置的一般功能的示意图。
图2是本发明装置的一个实施例的示意图。
图3是使用中的图2的装置的示意图。
图4是本发明装置的替代实施例的示意图。
图5是本发明装置的替代实施例的示意图。
图6是使用中的图4的装置的示意图。
图7是本发明的电泳装置的示例。
图8是采用苏木素和曙红染色剂染色的(HE染色的)原始样品。
图9是电泳后来自样品室的残余样品(HE染色的)。
图10是电泳后来自收获室的样品(HE染色的)。
图11是电泳后在分离膜上捕获的细胞(HE染色的)。
具体实施方式
尽管已经参考本文详述的某些实施例描述了本发明，但是其他实施例可以实现相同或类似的结果。对于本领域技术人员来说，本发明的变化和修改是显而易见的，并且本发明旨在覆盖所有这些修改和等同方案。
本发明涉及一种用于溶液中大分子或细胞的电泳分离的装置。
用于溶液中的大分子和/或细胞的分离的先前电泳装置需要对循环缓冲剂流进行使用以防止在电极处的气体积聚以及由电解引起的温度和pH的增加。
本发明基于以下发现(本文第一次公开)，当使用低电解质含量的缓冲剂时，不需要循环缓冲剂流来用于大分子和/或细胞的电泳分离。这种缓冲剂使电流减少90％，并且因此在电泳处理期间实质上降低了跨越装置的温度和pH增加(和变化)。这使得能够在装置内使用密封的缓冲剂室并且能够消除针对缓冲剂的外部管道、泵和贮存器。
在大分子和/或细胞的电泳分离中，施加到溶液的电场将使溶液内包含的带正电荷的大分子或细胞移动到负电极(阳极)和带负电荷的大分子或细胞移动到正电极(阴极)。
在本发明的装置中，分离膜被位于电场中，并且比分离膜的孔隙尺寸小的大分子和/或细胞从样品溶液穿过分离膜到收获溶液。分离膜的孔隙尺寸将根据要分离的大分子或细胞的尺寸而变化。
通过限制膜将样品和收获溶液与电极分离，所述限制膜允许离子通过但不允许大分子或细胞通过。电极处于缓冲剂溶液中，该缓冲剂溶液提供跨越盒的电压梯度，并使离子流动并生成在电极之间流动的电流。
在缓冲剂溶液中蔗糖的使用移除了使用循环缓冲剂流的需要。
可以改变样品室和收获室中的溶液以促进细胞存活。
已经概述了装置的一些操作原理，现在将描述装置本身。
参照图1，该图1是示出本发明装置的一般功能的示意图，该装置包含由分离膜分隔开的样品室和收获室。缓冲剂室在样品室和收获室侧面，其中缓冲剂室通过限制膜与样品室和收获室分隔开。施加到位于缓冲剂室中的电极的电压跨越分离膜引发电场，造成样品室中的比分离膜的孔隙尺寸小的带负电荷的大分子或细胞从样品室移动到收获室。
参照图2，该图2是本发明装置的一个实施例的示意图，该装置包含由分离膜分隔开的样品室和收获室。包含电极的缓冲剂室在样品室和收获室的侧面。通过限制膜将缓冲剂室与样品室和收获室分隔开。缓冲剂室是密封的，并且低电解质含量的缓冲剂溶液。样品室和收获室包含用于添加或移除溶液的孔。
参照图3，该图3是使用中的图2装置的示意图，样品室经由相应的孔装载包含大分子或细胞的溶液，并且收获室经由相应的孔装载接收溶液。电极连接到电源并施加电压梯度。样品室中带负电荷的大分子或细胞朝向阳极迁移，且比分离膜孔隙尺寸小的大分子或细胞穿过分离膜并进入收获室中。包含分离出的大分子或细胞的溶液经由孔从收获室中提取。如果期望分离带正电荷的大分子或细胞，可以将到电源的连接进行反接，使得带正电荷的大分子或细胞从样品室经过进入收获室中。可替代地，第二收获室可以位于样品室和容纳阴极的缓冲剂室之间，并且通过第二分离膜与样品室分隔开(图4)。
参照图5，该图5是本发明装置的替代实施例的示意图，该装置包含通过分离膜分隔开的样品室和收获室。包含电极的两个缓冲剂室在样品室和收获室的侧面。通过限制膜将缓冲剂室与样品室和收获室分隔开。缓冲剂室是密封的，并且包含低电解质含量的缓冲剂溶液。样品室和收获室包含用于使溶液在样品室和收获室中循环的入口和出口。
参照图6，该图6是使用中的图4的装置的示意图，样品室和收获室经由它们相应的入口和出口连接到包含贮存器和循环泵的样品回路和收获回路，以生成样品流和收获流。样品回路中的贮存器装载包含大分子或细胞的溶液，并且收获回路中的贮存器装载有接收溶液。电极连接到电源，并施加电压梯度。样品流中带负电荷的大分子或细胞向阳极迁移，且比分离膜孔隙尺寸小的大分子或细胞穿过分离膜并进入收获流中。分离出的大分子或细胞从收获回路中的贮存器中提取。如果期望分离带正电荷的大分子或细胞，可以将与电源的连接进行反接，使得带正电荷的大分子或细胞从样品流进入收获流中或第二收获流可以位于样品流和容纳阴极的缓冲剂室之间，并通过第二分离膜与样品流分隔开。
具有低电解质含量的缓冲剂的使用造成低电流并避免循环缓冲剂的使用。与由缓冲剂循环泵引起的脉动环境相比，这为盒中的分离过程产生了不流动环境。
密封缓冲剂室的使用允许包括电极的装置是无菌的和/或一次性的。
示例
示例1-精子的分离
将本发明的密封的非循环缓冲剂盒(SNC)的性能与现有电泳设备(CS10)在人精子(其对温度和pH的微小变化特别敏感)分离中进行比较。
在CS10和SNC中运用具有5kDA的MWCO的PVA限制膜以及具有5μm的孔隙尺寸的聚碳酸酯分离膜。
CS10使用包含30mM氯化钠的循环电极缓冲剂，并且14伏的电位差造成60-90mAmps的电流。
SNC使用密封的电极室，所述电极室包含具有低的电解质含量的缓冲剂(30mMHEPES和250mM蔗糖，利用三羟甲基氨基甲烷碱将pH值调节至7.8——称为CSM-15缓冲剂)，并且35伏的电位差造成10mAmps的电流。
通过血细胞计数器测量精子计数，并通过曙红-苯胺黑染色评估活力。
用于CS10的电压和电流结果如表1所示。
时间点(分钟) 0 1 2 3 4 5
电压(伏) 14 14 14 14 14 14
电流(毫安) 66 66 76 84 88 88
温度(℃) 19.5 19.5 20.9 21.3 21.1 21.2
表1
用于SNC的电压和电流结果如表2所示。
时间点(分钟) 0 1 2 3 4 5
电压(伏) 35 35 35 35 35 35
电流(毫安) 8 8 10 10 8 8
温度(℃) 20.2 20.3 20.6 20.5 20.8 21.1
表2
CS10用于分离精子的结果如表3所示(14伏，5分钟)。
Figure BDA0003844815390000091
表3
“残余”是指电泳后留在样品室中的精子，“选定”是指收获室中的精子。
SNC用于分离精子的结果如表4所示(35伏，5分钟)。简言之，将CSM-15缓冲剂位于样品室和收获室中允许使其平衡。移除样品室中的缓冲剂并且采用精液样品来代替，并且向电极施加电压。
Figure BDA0003844815390000101
表4
表5中示出了针对CS10和SNC获得的结果的比较。
Figure BDA0003844815390000102
表5
从表5中可以看出，SNC造成增加的收获率、增加的活力和增加的能动性。观察到的一个重要结果是，CS10具有1.7℃的温度增加(即使采用循环缓冲剂)，而SNC仅具有0.9℃的增加。该差异是由于CS10缓冲剂中较高的氯化钠浓度，其造成较高的电流(88mA)。SNC使用具有低的电解质含量的缓冲剂，并且因此电流仅仅是8mA(仅为CS10电流的十分之一)。如上所述，精子对温度变化特别敏感，并且较低的电流将保护精子的生物活力，例如能动性、顶体完整性等。
SNC使存活的人类精子的分离更容易且更快，而不会损害精子活力。SNC优于CS10，而CS10是行业标准。
示例2-血小板的分离
针对人血小板的分离来评估本发明的密封的非循环缓冲剂盒(SNC)的性能。
血小板具有约2-3μm的平均尺寸，其小于大多数血细胞，例如红细胞(4-6μm)、淋巴细胞(5-8μm)、白细胞(10-12μm)、巨噬细胞(15-20μm)。
使用以下方法，在SNC(图7)中运用具有5kDA的MWCO的PVA限制膜和具有5μm的孔隙尺寸的聚碳酸酯分离膜：
a)将未凝固的血液样品以300g×20分钟进行离心。
b)离心后样品被分成三层，底层主要包含红细胞(红色层)，中间层富含有血小板和白细胞(血沉棕黄层)，并且顶部层包括富含血小板的血浆(血浆层)。
c)将血沉棕黄层和血浆层移除到新管(称为“原始样品”)。
d)将8ml的CSM-15缓冲剂添加到SNC的缓冲剂贮存器中。
e)将1200μl血小板添加剂溶液(PAS)同时添加到样品室和收获室中并将其置留到平衡5分钟。
f)清空样品室并添加1200μl的原始样品。
g)SNC在25V的电压、75mA的最大电流和8分钟的时间下运行。
h)对原始样品、样品室和收获室进行显微镜评估。
原始样品有大量的白细胞、淋巴细胞和单核细胞——深蓝色细胞代表淋巴细胞，稍大的粉红色细胞是不同类型的白细胞，例如嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞(图8)。
样品室中的残余样品与原始样品类似，但由于大多数血小板移动到收获室中，血小板/白细胞比率明显降低(图9)。观察残余样品中的红细胞、血小板和巨噬细胞，其运行8分钟后没有细胞裂解(图9)。
收获室包含大量血小板和非常少数淋巴细胞，而且几乎所有白细胞和单核细胞都被移除(图10)。
在分离膜上捕获大量白细胞、淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞(图11)。
在整个进程中监测电流并且该电流不超过50mA(表1)：
Figure BDA0003844815390000121
表6
结果示出，使用SNC的分离进程对细胞非常温和，允许特定细胞类型的分离而没有裂解、活化或氧化损伤。

Claims (15)

1.一种用于对溶液中的细胞进行分离的电泳装置，所述装置包括：
由尺寸排阻膜(分离膜)分隔开的样品室和收获室；
非循环缓冲剂室，其在每个相应的样品室和收获室的侧面，其中每个缓冲剂室通过离子渗透膜(限制膜)与所述每个相应的样品室和收获室分隔开；以及
位于每个缓冲剂室中的电极。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述离子渗透膜具有小于15kDa的截留分子量。
3.根据权利要求1所述的装置，其中所述缓冲剂室是密封的并且包含缓冲剂溶液。
4.根据权利要求3所述的装置，其中所述缓冲剂溶液包含HEPES。
5.根据权利要求3所述的装置，其中所述缓冲剂溶液包含蔗糖。
6.根据权利要求3所述的装置，其中所述缓冲剂溶液包含30mM HEPES和250mM蔗糖，并利用三羟甲基氨基甲烷(Trizma)碱将pH值调节至7.8。
7.根据权利要求1所述的装置，其中每个样品室和收获室包含用于添加或移除溶液的孔。
8.根据权利要求7所述的装置，其中所述孔是能够密封的。
9.根据权利要求1所述的装置，进一步包括用于将所述电极连接到电源的设备。
10.根据权利要求1所述的装置，其中所述装置是盒，所述盒能够插入到包括电源的接收设备中，使得可以将电压施加到所述电极。
11.根据权利要求10所述的装置，其中所述盒是无菌的。
12.根据权利要求10所述的装置，其中所述盒是一次性的。
13.根据权利要求1所述的装置在细胞的分离中的应用。
14.根据权利要求1所述的装置在精子的分离中的应用。
15.根据权利要求1所述的装置在血小板的分离中的应用。
CN202211114214.2A 2016-10-20 2017-10-20 电泳装置 Pending CN115475518A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2016904260A AU2016904260A0 (en) 2016-10-20 Electrophoresis device
AU2016904260 2016-10-20
PCT/AU2017/051136 WO2018071977A1 (en) 2016-10-20 2017-10-20 Electrophoresis device
CN201780078771.4A CN110382087B (zh) 2016-10-20 2017-10-20 电泳装置

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780078771.4A Division CN110382087B (zh) 2016-10-20 2017-10-20 电泳装置

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115475518A true CN115475518A (zh) 2022-12-16

Family

ID=62018114

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211114214.2A Pending CN115475518A (zh) 2016-10-20 2017-10-20 电泳装置
CN201780078771.4A Active CN110382087B (zh) 2016-10-20 2017-10-20 电泳装置

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780078771.4A Active CN110382087B (zh) 2016-10-20 2017-10-20 电泳装置

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11466250B2 (zh)
EP (1) EP3528930A4 (zh)
JP (1) JP7097900B2 (zh)
CN (2) CN115475518A (zh)
AU (2) AU2017344755B2 (zh)
WO (1) WO2018071977A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230127490A1 (en) * 2016-10-20 2023-04-27 Memphasys Limited Electrophoresis device

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010052462A1 (en) * 2000-04-18 2001-12-20 David Ogle Small separation apparatus

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5854217A (en) * 1992-09-28 1998-12-29 Bearsden Bio, Inc. Allosteric modulators of the NMDA receptor and their use in the treatment of CNS disorders and enhancement of CNS function
US7066900B2 (en) 1998-12-23 2006-06-27 Life Therapeutics Removal of metabolic components from blood
US6261431B1 (en) * 1998-12-28 2001-07-17 Affymetrix, Inc. Process for microfabrication of an integrated PCR-CE device and products produced by the same
JP2003500645A (ja) 1999-05-19 2003-01-07 ビラテック アクチェンゲゼルシャフト 荷電した分子を単離するための装置および方法
JP2003514829A (ja) 1999-11-15 2003-04-22 プロテオム システムズ リミテッド 多室電気泳動
US6923896B2 (en) * 2000-09-22 2005-08-02 The Texas A&M University System Electrophoresis apparatus and method
WO2002093168A1 (en) * 2001-05-15 2002-11-21 Gradipore Limited Prion diagnostic test
AU2004238088B2 (en) * 2003-05-15 2008-04-03 Life Therapeutics Limited Cell separation
AU2003902363A0 (en) 2003-05-15 2003-05-29 Life Therapeutics Limited Cell separation
EP1689853B1 (en) 2003-10-07 2009-03-04 The University Of Newcastle Research Associates Limited Sperm cell separation by electrophoresis
DK2825636T3 (da) 2012-03-16 2020-04-20 Fertility Innovations Ltd Behandling af sædceller
GB201210496D0 (en) 2012-06-13 2012-07-25 Fertility Innovations Ltd Method and apparatus for sperm enrichment
AU2017254772B2 (en) 2016-04-22 2023-06-01 Memphasys Limited Biocompatible Polymeric Membranes

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010052462A1 (en) * 2000-04-18 2001-12-20 David Ogle Small separation apparatus

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C.AINSWORTH ET AL.: "《Development of a noval electrophoretic system for the isolation of human spermatozoa》", 《DEVELOPMENT OF A NOVAL ELECTROPHORETIC SYSTEM FOR THE ISOLATION OF HUMAN SPERMATOZOA》, pages 1 - 10 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20190241868A1 (en) 2019-08-08
AU2017344755A1 (en) 2019-05-02
AU2023201892B2 (en) 2024-08-01
CN110382087A (zh) 2019-10-25
CN110382087B (zh) 2022-08-30
EP3528930A1 (en) 2019-08-28
AU2023201892A1 (en) 2023-05-04
JP2019532675A (ja) 2019-11-14
WO2018071977A1 (en) 2018-04-26
US11466250B2 (en) 2022-10-11
JP7097900B2 (ja) 2022-07-08
EP3528930A4 (en) 2020-05-13
AU2017344755B2 (en) 2023-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5336387A (en) Electrical separator apparatus and method of counterflow gradient focusing
CA2506095C (en) Apparatus and method for preparative electrophoresis
US20060037860A1 (en) Small separation apparatus
US4963236A (en) Apparatus and methods for isoelectric focusing
JPH04233450A (ja) マルチーモダリティ電気泳動分離装置および方法
US20030019753A1 (en) Multi-port separation apparatus and method
AU2023201892B2 (en) Electrophoresis device
WO1991017815A1 (en) Apparatus and methods for isoelectric focusing
US20120090998A1 (en) Cell Separation
EP2340122A1 (en) Device and process for rapid isolation of a compound in a sample
Iritani et al. Analysis of filtration mechanism of dead-end electro-ultrafiltration for proteinaceous solutions
US20230127490A1 (en) Electrophoresis device
Righetti et al. A horizontal apparatus for isoelectric protein purification in a segmented immobilized pH gradient
KR20070116438A (ko) 혈액으로부터 핵산을 증폭하는 방법
AU2004238088B2 (en) Cell separation
EP3528935A1 (en) Sperm separation by electrophoresis
KR20160133826A (ko) 전기영동을 이용한 미세소포체 분리장치
JPS5926105A (ja) 両性電解質の分離精製装置
CA2421450A1 (en) Electrophoresis apparatus and method

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination