CN115475228A - 含l-硒代蛋氨酸寡肽在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及含L‑硒代蛋氨酸寡肽在制备抗肿瘤药物中的应用，通过利用合成的L‑硒代蛋氨酸(II)进一步制备了含L‑硒代蛋氨酸寡肽(III)。该类L‑硒代蛋氨酸寡肽具有良好的抗肿瘤活性，本发明中(II‑1)～(II‑10)对宫颈癌细胞具有很好的抑制活性。通过本发明所得的结果显示出L‑硒代蛋氨酸寡肽在药物开发体系中具有广阔的应用前景，为合成和筛选L‑硒代蛋氨酸寡肽提供了新的更广阔的思路，以期为相关疾病的治疗提供了更加有效的途径。
Description
(一)技术领域
本发明涉及含L-硒代蛋氨酸寡肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
(二)背景技术
甲硫氨酸或甲硫基丁氨酸俗名蛋氨酸(I)，是构成人体的必需氨基酸之一，参与蛋白质合成。因其不能在体内自身生成，所以必须由外部获得。如果甲硫氨酸缺乏就会导致体内蛋白质合成受阻，造成机体损害。脂质过氧化物会损害初级和次级溶酶体膜，使溶酶体内含有的作为水解的酸性磷酸酶释放出来，对细胞和线粒体膜等重要的细胞器造成损害，甲硫氨酸通过多种途径抗击这些损害。
硒是人和动物必需的微量元素，近几十年来，硒在化学与生物学中发展迅速，在过去 50年中，数百种有机硒化合物被生产出来，很多含硒化合物具有多种独特生化活性，被发现可以作为抗肿瘤剂、抗氧化剂、神经保护剂，并具有抗寄生虫、抗菌、抗病毒等生物学活性。硒化合物的生物利用度、生物活性和毒性取决于其化学结构而不是其总含量。与无机硒相比，有机硒具有更好的生物利用度、更高的营养价值和更低的毒性。作为有机硒的代表性物质，SeMet可以被认为是天然蛋氨酸的原子突变体，在许多生物体中，它会“潜入”蛋白质和酶中，取代蛋氨酸，从而赋予这些蛋白质额外的氧化还原活性并广泛参与生命体的各种生理生化活动。在蛋白质化学中，SeMet在阐释蛋白质的结构和功能方面发挥着独特的作用，成为了开发蛋白质化学活性物质的主要目标底物。
本发明是通过以光学纯L-SeMet为原料合成一系列不同序列手性寡肽，检测其对Hela (宫颈癌)细胞的毒性作用。本发明研究结果表明含L-硒代蛋氨酸寡肽具有良好的抗肿瘤活性，可开发为相关药物。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种含L-硒代蛋氨酸寡肽及其制备方法，以及该类寡肽在制备抗肿瘤活性药物中的应用，该类寡肽合成工艺简单，有较好的抗肿瘤活性，具有良好的应用价值。
本发明的技术方案如下：
一种式(III)所示的含L-硒代蛋氨酸寡肽在制备抗肿瘤药物中的应用：
式(III)中，R1以羰基与式中氨基形成肽键的氨基酸残基或二肽残基或三肽残基，R2为羟基或以氨基与式中羰基形成肽键的氨基酸残基。
进一步，R1为下列基团之一：
进一步，R2为羟基或下列基团之一：
运用技术方案将2-3种不同氨基酸与硒代蛋氨酸结合构成具有抗肿瘤活性的含硒三肽、含硒四肽化合物。
进一步，优选本发明所述含L-硒代蛋氨酸寡肽为下列之一：
优选地，所述含L-硒代蛋氨酸寡肽为式Ⅲ-1至Ⅲ-10所示化合物。进一步优选式Ⅲ-1、Ⅲ-6、或Ⅲ-4所示化合物。尤其优选式Ⅲ-6所示化合物。
进一步，所述肿瘤为宫颈癌，优选为Hela细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
(1)本发明通过利用合成的L-硒代蛋氨酸(II)进一步制备了含L-硒代蛋氨酸寡肽(III)。
(2)该类L-硒代蛋氨酸寡肽具有良好的抗肿瘤活性，本发明中(II-1)～(II-10)对Hela(宫颈癌)细胞具有很好的抑制活性。
(3)通过本发明所得的结果显示出L-硒代蛋氨酸寡肽在药物开发体系中具有广阔的应用前景，为合成和筛选L-硒代蛋氨酸寡肽提供了新的更广阔的思路，以期为相关疾病的治疗提供了更加有效的途径。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：L-硒代蛋氨酸(Ⅱ)的制备
反应式如下：
a、L-氨基丁内酯盐酸盐Ⅱ-2的制备
称取0.595g(5mmol)L-高丝氨酸于烧瓶中，加入6M·L-1HCl水溶液7.5mL，加热回流反应4h，底物反应完全，冷却，过滤得到白色固体，洗涤后，常温真空干燥，得到产物Ⅱ-2，得产物0.648g，收率94.3％。产物实测熔点218℃。
b、L-溴代高丝氨酸氢溴酸盐Ⅱ-3的制备
称取上述产物Ⅱ-2 0.548g(4mmol)于耐压瓶中，加入醋酸溶液(醋酸的质量分数为 33％)，在110℃下搅拌加热反应5.5h，底物反应完全，冷却到室温，有白色沉淀物产生，过滤得到产物Ⅱ-3，常温真空干燥，得产物0.994g，收率94.5％。1H NMR(500MHz,CD3OD) δ4.17(s,1H),3.66(td,J＝6.9,2.4Hz,2H),2.63–2.47(m,1H),2.39(d,J＝6.9Hz,1H).13CNMR(126MHz,CD3OD)δ174.33,55.91,38.18,31.80.
c、L-溴代高丝氨酸甲酯盐酸盐Ⅱ-4的制备
称取上述产物Ⅱ-3 0.973g(3.5mmol)于烧瓶中，加入3mL SOCl2，在氮气下回流1h，蒸去溶剂，冷却到0℃，加入3mL甲醇，再缓缓升温到50℃。反应完全后，蒸干溶剂，得到淡黄色糖浆状物质Ⅱ-4，常温真空干燥，得产物0.758g，收率为93.2％。
d、L-Boc-溴代高丝氨酸甲酯Ⅱ-5的制备
称取上述产物Ⅱ-4 0.693g(3mmol)于烧瓶中，加入3mL二氯甲烷搅拌使之溶解，再加入0.334g Et3N(3.3mmol)和0.719g(Boc)2O(3.3mmol)，常温过夜反应。底物反应完全，蒸干溶剂，得到固体物质，常温真空干燥，用柱层析方法进行纯化处理【V(Pet)：V(EtoAc) ＝4:1】后得到初产物，收集溶剂，蒸干溶剂，常温真空干燥得目的产物Ⅱ-5，得产物0.832g，收率为93.7％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.19(s,1H),4.41(s,1H),3.73(s,3H),3.42(s,2H),2.37(s,1H),2.19(s,1H),1.41(s,9H).
e、L-Boc-硒代蛋氨酸甲酯Ⅱ-6的制备
首先称取0.564g(3mmol)二甲基二硒醚于烧瓶中，然后加入3mL无水甲醇使之溶解，随后迅速加入干燥的0.158g(6.6mmol)NaH，此过程保证在严格的无水无氧条件下进行。观察到初期剧烈反应，室温反应40min，称取完全干燥的上述产物Ⅱ-5 0.590g(2mmol)溶于3mL无水甲醇中，加入到上述反应液中，反应过程底物消耗和产物生成情况通过GC-MS 监测，反应5h底物反应完毕，粗产物为淡黄色糖浆状物质，蒸干溶剂，用柱层析进行纯化，收集溶剂，蒸干溶剂，常温真空干燥，得到目的产物Ⅱ-6，得产物0.849g，产率91.2％。
f、L-硒代蛋氨酸甲酯Ⅱ-7的制备
称取得到的上述物质Ⅱ-6 0.467g(1.5mmol)于烧瓶中用5mL的4M·L-1HCl的1,4-二氧六环溶液溶液溶解，室温搅拌2h，有白色沉淀析出，过滤、用乙醚洗涤，得Ⅱ-6，常温真空干燥，得产物0.293g，收率为93.1％。
g、L-硒代蛋氨酸Ⅱ的制备
称取上述物质Ⅱ-7 2.11g(10mmol)于烧瓶中,加入10mL甲醇和5mL水。搅拌使之溶解，加入48mg(20mmol LiOH)，TLC跟踪检测反应，反应完全后冷却，此时有白色沉淀析出，经抽滤、乙醚洗涤和常温真空干燥后得L-硒代蛋氨酸，得产物1.494g，收率为76.2％。 ESI-MS,m/z:M+197。1H NMR(500MHz,D2O)δ3.87–3.77(m,1H),2.62(td,J＝7.9,1.4Hz, 2H),2.30–2.12(m,2H),2.02(d,J＝1.5Hz,3H).13C NMR(125MHz,D2O)δ174.32,55.91, 38.18,31.80.[α]D+21.7°(C＝0.5,2N HCl),mp＝275℃.
本发明整体反应采用从氨基酸的C端向N端一次合成的策略,其他三肽的合成与以上所述步骤一致，差异存在于缩合偶连的氨基酸种类不同或氨基酸接合顺序不同，四肽的合成是在氨基酸被Boc保护，羧基端无保护基的三肽的基础上进行与第四个氨基酸的缩合偶连, 其他步骤与三肽的合成一致。
实施例2：含L-硒代蛋氨酸寡肽Ala-Gly-SeMet-OH(III-1)的制备
反应式如下：
a、Boc-Ala-Gly-OMe的合成
取烧瓶，称取Boc-Ala-OH(1mmol，0.198g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入N,N- 二异丙基乙胺(2.4mmol，0.310g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.2mmol，0.230g)，1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.2mmol，0.162g)搅拌活化5min，然后加入L-NH2-Gly-OMe·HCl(1.3mmol，0.163g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM(60 mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液(120mL)和饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，紧接着有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，产物得0.249g,产物收率为95.9％。
b、Boc-Ala-Gly-OH的合成
将上一步产物Boc-Ala-Gly-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用0.5M·L-1HCl调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到纯净产物Boc-Ala-Gly -OH，产物得0.227g,收率96.2％。
c、Boc-Ala-Gly-SeMet-OMe的合成
将上步骤得到的Boc-Ala-Gly-OH(0.95mmol，0.234g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入N,N-二异丙基乙胺(2.28mmol，0.295g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.14mmol，0.219g),1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.14mmol,0.154g)搅拌活化5min，然后加入NH2-SeMet-OMe·HCl(1.24mmol，0.305g)反应5h。TLC监测反应完全后加入 DCM(60mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液(120 mL)和饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，随后有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，产物得0.39g,产物收率为96.5％。
d、Boc-Ala-Gly-SeMet-OH的合成
将上一步产物Boc-Ala-Gly-SeMet-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用稀盐酸调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产物Boc- Ala-Gly-SeMet-OH。随后对粗产物采用柱层析的方法进行纯化处理，洗脱剂V(Pet)：V(EtoAc)＝4:1，过程通过TLC结合茚三酮和碘缸显色监测，取洗脱液，减压浓缩得到产物。得产物0.356g，产物收率为94.3％。
e、NH2-Ala-Gly-SeMet-OH的合成
将上述得到Boc-Ala-Gly-SeMet-OH在冰浴条件下溶于4M·L-1HCl1,4-二氧六环溶液， TLC跟踪监测反应，底物反应完有新点生成，加入50mL乙醚，此时有白色沉淀析出，紧接着充分搅拌2h，此时物质变成亲水性物质，过滤得到上述物质并用150mL乙醚分3次洗涤，减压蒸发去除溶剂，得到产物0.269g，得到纯度为98.8％的终产物，收率为97.4％。其结构表征如下：1H NMR(500MHz,(CD3)2SO)δ12.67(s,1H),8.77(s,1H),8.30(dd,J＝ 13.5,6.7Hz,4H),4.28(d,J＝5.2Hz,1H),3.90–3.72(m,3H),2.45(d,J＝8.0Hz,2H),1.99– 1.82(m,4H),1.32(d,J＝6.9Hz,3H).13C NMR(126MHz,(CD3)2SO)δ173.44,170.30, 168.83,66.81,52.32,48.62,32.16,21.21,17.53,3.98.
实施例3：含L-硒代蛋氨酸寡肽Pro-Ile-SeMet-OH(III-2)的制备
a、Pro-Ile-OMe的合成
取烧瓶，称取Pro(1mmol，0.115g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入N,N-二异丙基乙胺(2.4mmol，0.310g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.2mmol，0.230g)，1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.2mmol，0.162g)搅拌活化5min，然后加入L-NH2-Ile -OMe·HCl(1.3mmol，0.236g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM(60mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液(120mL)和饱和氯化钠溶液 (120mL)洗涤，紧接着有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得产物0.232g，产物收率为95.9％。
b、Pro-Ile-OH的合成
将上一步产物Pro-Ile-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用0.5M·L-1HCl调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到纯净产物Pro-Ile-OH，得产物0.211g，收率96.2％。
c、Pro-Ile-SeMet-OMe的合成
将上步骤得到的Pro-Ile-OH(0.95mmol，0.217g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入 N,N-二异丙基乙胺(2.28mmol，0.295g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.14mmol，0.219g),1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.14mmol,0.154g)搅拌活化5min，然后加入NH2-SeMet-OMe·HCl(1.24mmol，0.305g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM (60mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液(120mL)和饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，随后有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得产物0.374g，产物收率为96.5％。
d、Pro-Ile-SeMet-OH的合成
将上一步产物Pro-Ile-SeMet-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用稀盐酸调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产物Pro-Ile-SeMet -OH。随后对粗产物采用柱层析的方法进行纯化处理，洗脱剂V(Pet)：V(EtoAc)＝4:1，过程通过TLC结合茚三酮和碘缸显色监测，取洗脱液，减压浓缩得到产物。得产物0.341g，产物收率为94.3％。其结构表征如下：1H NMR(500MHz,(CD3)2SO)δ12.88(s,1H),10.50(dd, J＝11.7,6.1Hz,1H),8.96(d,J＝8.6Hz,1H),8.69(p,J＝6.2,5.7Hz,1H),8.61(d,J＝7.7Hz, 1H),4.54(ddd,J＝9.5,7.7,4.5Hz,1H),4.42(t,J＝8.2Hz,2H),3.39(ddp,J＝27.0,17.3,5.7Hz, 2H),2.78(ddd,J＝12.4,8.6,5.1Hz,1H),2.72(d,J＝6.9Hz,1H),2.58–2.43(m,1H),2.14(s, 4H),2.11–1.91(m,4H),1.69(dtd,J＝15.0,7.5,3.3Hz,1H),1.41–1.25(m,1H),1.10(d,J＝ 6.7Hz,3H),1.04(t,J＝7.5Hz,3H).13C NMR(125MHz,(CD3)2SO)δ173.43,171.17,168.54, 66.82,58.91,57.97,52.15,46.05,36.87,30.37,24.80,23.90,21.23,15.71,11.37,3.99.
实施例4：含L-硒代蛋氨酸寡肽Phe-Pro-SeMet-OH(Ⅲ-3)的制备
a、Boc-Phe-Pro-OMe的合成
取烧瓶，称取Boc-Phe-OH(1mmol，0.265g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入N,N- 二异丙基乙胺(2.4mmol，0.310g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.2mmol，0.230g)，1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.2mmol，0.162g)搅拌活化5min，然后加入L-NH2-Pro-OMe·HCl(1.3mmol，0.215g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM(60 mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液(120mL)和饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，紧接着有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得产物0.361g，产物收率为95.9％。
b、Boc-Phe-Pro-OH的合成
将上一步产物Boc-Phe-Pro-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用0.5M·L-1HCl调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到纯净产物Boc-Phe-Pro -OH，得产物0.348g收率96.2％。
c、Boc-Phe-Pro-SeMet-OMe的合成
将上步骤得到的Boc-Phe-Pro-OH(0.95mmol，0.344g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入N,N-二异丙基乙胺(2.28mmol，0.295g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.14mmol，0.219g),1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.14mmol,0.154g)搅拌活化5min，然后加入NH2-SeMet-OMe·HCl(1.24mmol，0.305g)反应5h。TLC监测反应完全后加入 DCM(60mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液(120 mL)和饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，随后有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得产物0.494g,产物收率为96.5％。
d、Boc-Phe-Pro-SeMet-OH的合成
将上一步产物Boc-Phe-Pro-SeMet-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用稀盐酸调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产物Boc- Phe-Pro-SeMet-OH。随后对粗产物采用柱层析的方法进行纯化处理，洗脱剂V(Pet)：V(EtoAc)＝4:1，过程通过TLC结合茚三酮和碘缸显色监测，取洗脱液，减压浓缩得到产物。得产物，得产物0.455g,产物收率为94.3％。
e、NH2-Phe-Pro-SeMet-OH的合成
将上述得到Boc-Phe-Pro-SeMet-OH在冰浴条件下溶于4M·L-1HCl1,4-二氧六环溶液， TLC跟踪监测反应，底物反应完有新点生成，加入50mL乙醚，此时有白色沉淀析出，紧接着充分搅拌2h，此时物质变成亲水性物质，过滤得到上述物质并用150mL乙醚分3次洗涤，减压蒸发去除溶剂，得到产物，得到纯度为98.8％的终产物，得产物0.356g,收率为97.4％。其结构表征如下：1H NMR(500MHz,(CD3)2SO)δ12.48(s,1H),8.74–8.59(m,2H),8.39(d,J＝7.8Hz,1H),7.35–7.27(m,3H),7.21(d,J＝6.8Hz,2H),4.28–4.21(m,1H),4.19–4.07(m,2H),3.55(s,2H),3.21(s,1H),2.92(s,1H),2.63–2.51(m,1H),2.49–2.43(m,1H),2.10(dtd,J＝14.3,9.4,4.9Hz,1H),2.04–1.96(m,1H),1.91(d,J＝8.9Hz,3H),1.74(dhept,J＝ 14.1,5.1,4.5Hz,1H),1.63(d,J＝7.5Hz,2H),1.37(dp,J＝14.4,5.3Hz,1H).13C NMR(126 MHz,(CD3)2SO)δ173.20,171.32,167.40,135.16,129.91,128.98,127.81,66.82,60.14,52.56, 47.08,37.09,31.53,29.67,23.89,21.61,3.95.
实施例5：含L-硒代蛋氨酸寡肽Pro-Ile-SeMet-Gly-OH(Ⅲ-4)的制备
a、Pro-Ile-OMe的合成
取烧瓶，称取Pro(1mmol，0.115g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入N,N-二异丙基乙胺(2.4mmol，0.310g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.2mmol，0.230g)，1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.2mmol，0.162g)搅拌活化5min，然后加入L-NH2-Ile -OMe·HCl(1.3mmol，0.218g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM(60mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液(120mL)和饱和氯化钠溶液 (120mL)洗涤，紧接着有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得产物0.232g, 产物收率为95.9％。
b、Pro-Ile-OH的合成
将上一步产物Pro-Ile-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用0.5M·L-1HCl调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到纯净产物Pro-Ile-OH，得产物0.21g,收率96.2％。
c、Pro-Ile-SeMet-OMe的合成
将上步骤得到的Pro-Ile-OH(0.95mmol，0.217g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入 N,N-二异丙基乙胺(2.28mmol，0.295g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.14mmol，0.219g),1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.14mmol,0.154g)搅拌活化5min，然后加入NH2-SeMet-OMe·HCl(1.24mmol，0.305g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM (60mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液(120mL)和饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，随后有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得产物0.373g,产物收率为96.5％。
d、Pro-Ile-SeMet-OH的合成
将上一步产物Pro-Ile-SeMet-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用稀盐酸调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产物Pro-Ile-SeMet -OH。随后对粗产物采用柱层析的方法进行纯化处理，洗脱剂V(Pet)：V(EtoAc)＝4:1，过程通过TLC结合茚三酮和碘缸显色监测，取洗脱液，减压浓缩得到产物。得产物0.341g，产物收率为94.3％。
e、Pro-Ile-SeMet-Gly-OMe的合成
将上步骤得到的Pro-Ile-SeMet-OH(0.95mmol，0.372g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入N,N-二异丙基乙胺(2.28mmol，0.295g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.14mmol，0.219g),1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.14mmol,0.154g)搅拌活化5 min，然后加入NH2-Gly-OMe·HCl(1.24mmol，0.138g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM(60mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液 (120mL)和饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，随后有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得到产物386g，产物收率为96.5％。
f、Pro-Ile-SeMet-Gly-OH
将上一步产物Pro-Ile-SeMet-Gly-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用稀盐酸调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产物 Pro-Ile-SeMet-Gly-OH。随后对粗产物采用柱层析的方法进行纯化处理，洗脱剂V(Pet)： V(EtoAc)＝4:1，过程通过TLC结合茚三酮和碘缸显色监测，取洗脱液，减压浓缩得到产物。得得产物0.354g,产物收率为94.3％。其结构表征如下：1H NMR(500MHz,(CD3)2SO)δ12.50 (s,1H),10.29(dt,J＝12.8,6.1Hz,1H),8.76(d,J＝8.6Hz,1H),8.46(q,J＝17.1,12.5Hz,1H),8.29(s,1H),8.20(d,J＝8.0Hz,1H),4.38(td,J＝8.2,4.9Hz,1H),4.32–4.23(m,1H),4.21(d,J ＝8.1Hz,1H),3.79(s,1H),3.69(s,1H),3.18(qt,J＝14.0,8.5,7.3Hz,2H),2.51(d,J＝4.3Hz, 2H),2.29(dt,J＝15.6,6.2Hz,1H),2.04–1.68(m,8H),1.45(dtt,J＝15.3,7.8,3.8Hz,1H),1.10 (ddt,J＝21.1,17.2,8.9Hz,1H),0.93–0.75(m,6H).13C NMR(126MHz,(CD3)2SO)δ171.62, 171.41,170.85,168.66,66.82,58.92,58.14,53.00,46.06,41.11,36.69,33.49,30.37,24.85,23.93, 20.71,15.81,11.41,3.93.
实施例6：含L-硒代蛋氨酸寡肽Pro-Ile-SeMet-Val-OH(Ⅲ-5)的制备
a、Pro-Ile-OMe的合成
取烧瓶，称取Pro(1mmol，0.115g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入N,N-二异丙基乙胺(2.4mmol，0.310g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.2mmol，0.230g)，1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.2mmol，0.162g)搅拌活化5min，然后加入L-NH2-Ile -OMe·HCl(1.3mmol，0.236g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM(60mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液(120mL)和饱和氯化钠溶液 (120mL)洗涤，紧接着有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得产物0.232g, 产物收率为95.9％。
b、Pro-Ile-OH的合成
将上一步产物Pro-Ile-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用0.5M·L-1HCl调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到纯净产物Pro-Ile-OH，得产物0.21g,收率96.2％。
c、Pro-Ile-SeMet-OMe的合成
将上步骤得到的Pro-Ile-OH(0.95mmol，0.217g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入 N,N-二异丙基乙胺(2.28mmol，0.295g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.14mmol，0.219g),1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.14mmol,0.154g)搅拌活化5min，然后加入NH2-SeMet-OMe·HCl(1.24mmol，0.305g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM (60mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液(120mL)和饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，随后有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得产物0.374g,产物收率为96.5％。
d、Pro-Ile-SeMet-OH的合成
将上一步产物Pro-Ile-SeMet-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用稀盐酸调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产物Pro-Ile-SeMet -OH。随后对粗产物采用柱层析的方法进行纯化处理，洗脱剂V(Pet)：V(EtoAc)＝4:1，过程通过TLC结合茚三酮和碘缸显色监测，取洗脱液，减压浓缩得到产物。得产物0.340g，产物收率为94.3％。
e、Pro-Ile-SeMet-Val-OMe的合成
将上步骤得到的Pro-Ile-SeMet-OH(0.95mmol，0.386g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入N,N-二异丙基乙胺(2.28mmol，0.295g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.14mmol，0.219g),1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.14mmol,0.154g)搅拌活化5 min，然后加入NH2-Val-OMe·HCl(1.24mmol，0.208g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM(60mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液 (120mL)和饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，随后有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得到产物0.42g，产物收率为96.5％。
f、Pro-Ile-SeMet-Val-OH
将上一步产物Pro-Ile-SeMet-Val-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用稀盐酸调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产物Pro-Ile-SeMet- Val-OH。随后对粗产物采用柱层析的方法进行纯化处理，洗脱剂V(Pet)：V(EtoAc)＝4:1，过程通过TLC结合茚三酮和碘缸显色监测，取洗脱液，减压浓缩得到产物，得产物0.381g, 产物收率为94.3％。其结构表征如下：
1H NMR(500MHz,(CD3)2SO)δ12.65(s,1H),10.29(s,1H),8.75(d,J＝8.6Hz,1H),8.48 (t,J＝9.9Hz,1H),8.28(d,J＝8.0Hz,1H),7.94(d,J＝8.3Hz,1H),4.44(td,J＝8.1,5.1Hz,1H), 4.23(t,J＝8.1Hz,2H),4.13(dd,J＝8.4,5.6Hz,1H),3.53–3.31(m,1H),3.17(tq,J＝20.7,6.3 Hz,2H),2.51(d,J＝3.0Hz,2H),2.38–2.22(m,1H),2.07(tq,J＝13.4,6.8Hz,1H),1.92(m, 4H),1.89–1.72(m,3H),1.45(dqd,J＝15.1,7.5,3.3Hz,1H),1.08(s,1H),0.91–0.76(m,12H). 13C NMR(125MHz,(CD3)2SO)δ172.60,170.83,170.13,166.36,66.82,58.92,58.14,52.54, 52.00,46.06,41.11,36.69,33.49,30.37,24.85,23.93,20.71,15.81,11.41,3.93.
实施例7：含L-硒代蛋氨酸寡肽Pro-Ile-Phe-SeMet-OH(Ⅲ-6)的制备
a、Pro-Ile-OMe的合成
取烧瓶，称取Pro(1mmol，0.115g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入N,N-二异丙基乙胺(2.4mmol，0.310g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.2mmol，0.230g)，1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.2mmol，0.162g)搅拌活化5min，然后加入L-NH2-Ile -OMe·HCl(1.3mmol，0.236g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM(60mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液(120mL)和饱和氯化钠溶液 (120mL)洗涤，紧接着有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得产物0.232g, 产物收率为95.9％。
b、Pro-Ile-OH的合成
将上一步产物Pro-Ile-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用0.5M·L-1HCl调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到纯净产物Pro-Ile-OH，得产物0.210g,收率96.2％。
c、Pro-Ile-Phe-OMe的合成
将上步骤得到的Pro-Ile-OH(0.95mmol，0.217g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入 N,N-二异丙基乙胺(2.28mmol，0.295g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.14mmol，0.219g),1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.14mmol,0.154g)搅拌活化5min，然后加入NH2-Phe-OMe·HCl(1.24mmol，0.267g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM (60mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液(120mL)和饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，随后有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得产物0.343g,产物收率为95.6％。
d、Pro-Ile-Phe-OH的合成
将上一步产物Pro-Ile-Phe-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用稀盐酸调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产物Pro-Ile-Phe -OH。随后对粗产物采用柱层析的方法进行纯化处理，洗脱剂V(Pet)：V(EtoAc)＝4:1，过程通过TLC结合茚三酮和碘缸显色监测，取洗脱液，减压浓缩得到产物，得产物0.311g,产物收率为94.3％。
e、Pro-Ile-Phe-SeMet-OMe的合成
将上步骤得到的Pro-Ile-Phe-OH(0.95mmol，0.357g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入DIPEA(2.28mmol，0.295g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.14mmol，0.219g),1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.14mmol,0.154g)搅拌活化5min，然后加入NH2-SeMet-OMe·HCl(1.24mmol，0.305g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM(60 mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液(120mL)和饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，随后有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得产物 0.454g,产物收率为96.5％。
f、Pro-Ile-Phe-SeMet-OH
将上一步产物Pro-Ile-SeMet-Leu-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用稀盐酸调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产物Pro-Ile-Phe-SeMet-OH。随后对粗产物采用柱层析的方法进行纯化处理，洗脱剂V(Pet)：V(EtoAc)＝4:1，过程通过TLC结合茚三酮和碘缸显色监测，取洗脱液，减压浓缩得到产物，得产物0.402g,产物收率为94.3％。硒代蛋氨酸寡肽其结构表征如下：
1H NMR(500MHz,(CD3)2SO)δ10.24(s,1H),8.64(d,J＝8.9Hz,1H),8.46(td,J＝10.7, 6.8Hz,1H),8.34(dd,J＝14.5,8.1Hz,2H),7.28(d,J＝7.0Hz,2H),7.22(t,J＝7.5Hz,2H),7.16 (d,J＝7.4Hz,1H),4.65–4.53(m,1H),4.34(ddd,J＝9.2,7.8,4.7Hz,1H),4.28–4.15(m,2H), 3.18(dtd,J＝17.9,11.4,5.5Hz,2H),3.05(s,1H),2.86–2.75(m,1H),2.51(d,J＝1.8Hz,2H), 2.26–2.12(m,1H),2.08–1.99(m,1H),1.93(s,4H),1.87–1.74(m,2H),1.73–1.59(m,2H), 1.36(dqd,J＝15.0,7.4,4.2Hz,1H),1.10–0.92(m,1H),0.78(t,J＝7.4Hz,3H),0.73(d,J＝6.8 Hz,3H).13C NMR(125MHz,(CD3)2SO)δ178.12,176.37,175.36,173.10,142.96,134.44, 133.13,131.35,71.60,63.69,62.75,58.91,57.11,50.84,45.24,44.24,41.88,37.08,35.09,29.47, 28.70,25.91,20.41,16.16,8.74.
实施例8：含L-硒代蛋氨酸寡肽Leu-Gly-SeMet-Ile-OH(Ⅲ-7)的制备
a、Boc-Leu-Gly-OMe的合成
取烧瓶，称取Boc-Leu-OH(1mmol，0.231g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入N,N- 二异丙基乙胺(2.4mmol，0.310g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.2mmol，0.230g)，1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.2mmol，0.162g)搅拌活化5min，然后加入L-NH2-Gly-OMe·HCl(1.3mmol，0.163g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM(60 mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液(120mL)和饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，紧接着有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得产物0.29g,产物收率为95.9％。
b、Boc-Leu-Gly-OH的合成
将上一步产物Boc-Phe-Pro-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用0.5M·L-1HCl调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到纯净产物Boc-Leu-Gly -OH，得产物0.266g,收率96.2％。
c、Boc-Leu-Gly-SeMet-OMe的合成
将上步骤得到的Boc-Leu-Gly-OH(0.95mmol，0.274g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入N,N-二异丙基乙胺(2.28mmol，0.295g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.14mmol，0.219g),1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.14mmol,0.154g)搅拌活化5min，然后加入NH2-SeMet-OMe·HCl(1.24mmol，0.305g)反应5h。TLC监测反应完全后加入 DCM(60mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液(120 mL)和饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，随后有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得产物0.440g,产物收率为96.5％。
d、Boc-Leu-Gly-SeMet-OH的合成
将上一步产物Boc-Leu-Gly-SeMet-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用稀盐酸调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产物Boc-Leu-Gly-SeMet-OH。随后对粗产物采用柱层析的方法进行纯化处理，洗脱剂V(Pet)：V(EtoAc)＝4:1，过程通过TLC结合茚三酮和碘缸显色监测，取洗脱液，减压浓缩得到产物。得产物0.403g，产物收率为94.3％。
e、Boc-Leu-Gly-SeMet-Ile-OMe的合成
将上步骤得到的Boc-Leu-Gly-SeMet-OH(0.95mmol，0.456g)溶于DCM(5mL)中， 0℃下加入N,N-二异丙基乙胺(2.28mmol，0.295g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.14mmol，0.219g),1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.14mmol,0.154g)搅拌活化5min，然后加入NH2-Ile-OMe·HCl(1.24mmol，0.225g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM(60mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液(120mL)和饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，随后有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得到产物0.48g，产物收率为96.5％。
f、Boc-Leu-Gly-SeMet-Ile-OH的合成
将上一步产物Boc-Leu-Gly-SeMet-Ile-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用稀盐酸调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产物 Boc-Leu-Gly-SeMet-Ile-OH。随后对粗产物采用柱层析的方法进行纯化处理，洗脱剂V(Pet)： V(EtoAc)＝4:1，过程通过TLC结合茚三酮和碘缸显色监测，取洗脱液，减压浓缩得到产物。得产物0.4g,产物收率为94.3％。
g、NH2-Leu-Gly-SeMet-Ile-OH的合成
将上述得到Boc-Leu-Gly-SeMet-Ile-OH在冰浴条件下溶于4M·L-1HCl1,4-二氧六环溶液，TLC跟踪监测反应，底物反应完有新点生成，加入50mL乙醚，此时有白色沉淀析出，紧接着充分搅拌2h，此时物质变成亲水性物质，过滤得到上述物质并用150mL乙醚分3次洗涤，得到纯度为98.8％的终产物，得产物0.345g,收率为97.4％。其结构表征如下：
1H NMR(500MHz,(CD3)2SO)δ12.56(s,1H),8.95(s,1H),8.41(d,J＝5.6Hz,3H),8.22 (d,J＝8.2Hz,1H),8.09(d,J＝8.1Hz,1H),4.45(td,J＝8.0,5.9Hz,1H),4.13(d,J＝2.3Hz, 1H),3.93–3.67(m,3H),2.48(dddt,J＝19.0,12.1,9.6,6.5Hz,2H),2.00–1.86(m,4H),1.86– 1.75(m,1H),1.70(dq,J＝13.2,6.6Hz,1H),1.58(d,J＝7.2Hz,2H),1.40(dqd,J＝15.1,7.6,4.2 Hz,1H),1.20(ddddd,J＝17.7,13.8,10.7,7.1,2.8Hz,1H),0.92–0.78(m,12H).13C NMR(125 MHz,(CD3)2SO)δ173.17,171.56,169.76,168.48,66.82,65.37,56.91,53.19,51.36,42.45, 36.54,33.76,25.18,24.01,22.93,22.77,20.73,16.02,11.79,3.94.
实施例9：含L-硒代蛋氨酸寡肽Lys-SeMet-Pro-OH(Ⅲ-8)的制备
反应式如下：
a、Boc-Lys-SeMet-OMe的合成
取烧瓶，称取3.1(1mmol，0.693g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入N,N-二异丙基乙胺(2.4mmol，0.310g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.2mmol，0.230g)，1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.2mmol，0.162g)搅拌活化5min，然后加入 L-NH2-SeMet-OMe·HCl(1.3mmol，0.321g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM(60 mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液(120mL)和饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，紧接着有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得产物0.516g,产物收率为95.9％。
b、Boc-Lys-Se-Met-OH的合成
将上一步产物Boc-Lys-SeMet-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用0.5M·L-1HCl 调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到纯净产物Boc-Lys-SeMet-OH，得产物0.484g,收率96.2％。
c、Boc-Lys-SeMet-Pro-OMe的合成
将上步骤得到的Boc-Lys-SeMet-OH(0.95mmol，0.512g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入N,N-二异丙基乙胺(2.28mmol，0.295g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.14mmol，0.219g),1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.14mmol,0.154g)搅拌活化5 min，然后加入NH2-Pro-OMe·HCl(1.24mmol，0.204g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM(60mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液 (120mL)和饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，随后有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得产物0.57g,收率97.2％。
d、Boc-Lys-SeMet-Pro-OH的合成
将上一步产物Boc-Lys-SeMet-Pro-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用稀盐酸调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产物 Boc-Lys-SeMet-Pro-OH。随后对粗产物采用柱层析的方法进行纯化处理，洗脱剂V(Pet)： V(EtoAc)＝4:1，过程通过TLC结合茚三酮和碘缸显色监测取洗脱液，减压浓缩得到产物。得产物0.540g,收率96.8％。。
e、NH2-Lys-SeMet-Pro-OH的合成
将上述得到Boc-Lys-SeMet-Pro-OH在冰浴条件下溶于4M·L-1HCl1,4-二氧六环溶液， TLC跟踪监测反应，底物反应完有新点生成，加入50mL乙醚，此时有白色沉淀析出，紧接着充分搅拌2h，此时物质变成亲水性物质，过滤得到上述物质并用150mL乙醚分3次洗涤。得到产物0.368g，收率98.2％。其结构表征如下：1H NMR(500MHz,(CD3)2SO)δ12.75 (s,1H),8.46–8.33(m,3H),8.19(t,J＝6.4Hz,3H),4.61(tt,J＝12.1,5.8Hz,1H),4.29–4.21 (m,1H),3.85(h,J＝6.5Hz,1H),3.72–3.66(m,1H),3.60(dt,J＝9.9,6.6Hz,1H),2.77–2.58(m,4H),2.15(dq,J＝12.5,7.7Hz,1H),2.00–1.87(m,5H),1.86–1.66(m,4H),1.59(t,J＝4.9 Hz,2H),1.36(q,J＝8.4,7.9Hz,2H).13C NMR(125MHz,(CD3)2SO)δ178.26,174.41,173.70, 63.75,56.73,56.00,51.89,43.44,36.96,35.40,33.83,31.26,29.82,26.14,25.54,8.82.
实施例10：含L-硒代蛋氨酸寡肽Lys-SeMet-Ala-OH(Ⅲ-9)的制备
反应式如下：
a、Boc-Lys-SeMet-OMe的合成
取烧瓶，称取3.1(1mmol，0.693g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入N,N-二异丙基乙胺(2.4mmol，0.310g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.2mmol，0.230g)，1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.2mmol，0.162g)搅拌活化5min，然后加入 L-NH2-SeMet-OMe·HCl(1.3mmol，0.321g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM(60 mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液(120mL)和饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，紧接着有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得产物0.516g,产物收率为95.9％。
b、Boc-Lys-Se-Met-OH的合成
将上一步产物Boc-Lys-SeMet-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用0.5M·L-1HCl 调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到纯净产物Boc-Lys-SeMet-OH，得产物0.484g,收率96.2％。
c、Boc-Lys-SeMet-Ala-OMe的合成
将上步骤得到的Boc-Lys-SeMet-OH(0.95mmol，0.512g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入N,N-二异丙基乙胺(2.28mmol，0.295g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.14mmol，0.219g),1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.14mmol,0.154g)搅拌活化5 min，然后加入NH2-Ala-OMe·HCl(1.24mmol，0.173g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM(60mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液 (120mL)和饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，随后有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩。得产物0.547g,收率97.3％。
d、Boc-Lys-SeMet-Ala-OH的合成
将上一步产物Boc-Lys-SeMet-Ala-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用稀盐酸调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产物Boc-Lys-SeMet- Ala-OH。随后对粗产物采用柱层析的方法进行纯化处理，洗脱剂V(Pet)：V(EtoAc)＝4:1，过程通过TLC结合茚三酮和碘缸显色监测，取洗脱液，减压浓缩得到产物。得产物0.523g，收率97.8％。
e、NH2-Lys-SeMet-Ala-OH的合成
将上述得到Boc-Lys-SeMet-Ala-OH在冰浴条件下溶于4M·L-1HCl1,4-二氧六环溶液， TLC跟踪监测反应，底物反应完有新点生成，加入50mL乙醚，此时有白色沉淀析出，紧接着充分搅拌2h，此时物质变成亲水性物质，过滤得到上述物质并用150mL乙醚分3次洗涤。得到产物0.342g，收率98.2％。其结构表征如下：
1H NMR(500MHz,(CD3)2SO)δ12.56(s,1H),8.85(d,J＝7.8Hz,1H),8.41(dd,J＝10.8, 6.2Hz,3H),8.18(d,J＝5.9Hz,3H),4.36(d,J＝5.2Hz,1H),4.16(t,J＝7.2Hz,1H),3.85(d,J ＝5.6Hz,1H),2.71(q,J＝6.8Hz,2H),2.65–2.44(m,2H),1.93(s,4H),1.80–1.65(m,2H), 1.65–1.50(m,2H),1.38(t,J＝7.9Hz,2H),1.26(d,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(125MHz, (CD3)2SO)δ179.07,175.63,173.63,58.19,56.90,52.81,43.44,38.32,35.42,31.35,26.17,25.44, 22.18,8.70.
实施例11：含L-硒代蛋氨酸寡肽Pro-Ile-SeMet-Phe-OH(Ⅲ-10)的制备
a、Pro-Ile-OMe的合成
取烧瓶，称取Pro(1mmol，0.115g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入N,N-二异丙基乙胺(2.4mmol，0.310g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.2mmol，0.230g)，1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.2mmol，0.162g)搅拌活化5min，然后加入L-NH2-Ile -OMe·HCl(1.3mmol，0.236g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM(60mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液(120mL)和饱和氯化钠溶液 (120mL)洗涤，紧接着有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得产物0.232g，产物收率为95.9％。
b、Pro-Ile-OH的合成
将上一步产物Pro-Ile-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用0.5M·L-1HCl调节pH＝3，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到纯净产物Pro-Ile-OH，得产物0.210g，收率96.2％。
c、Pro-Ile-SeMet-OMe的合成
将上步骤得到的Pro-Ile-OH(0.95mmol，0.217g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入N,N-二异丙基乙胺(2.28mmol，0.295g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.14mmol，0.219g),1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.14mmol,0.154g)搅拌活化5min，然后加入NH2-SeMet-OMe·HCl(1.24mmol，0.305g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM (60mL)，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液(120mL)和饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，随后有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得产物 0.374g，产物收率为96.5％。
d、Pro-Ile-SeMet-OH的合成
将上一步产物Pro-Ile-SeMet-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用稀盐酸调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产物Pro-Ile-SeMet -OH。随后对粗产物采用柱层析的方法进行纯化处理，洗脱剂V(Pet)：V(EtoAc)＝4:1，过程通过TLC结合茚三酮和碘缸显色监测，取洗脱液，减压浓缩得到产物。得产物0.349g，产物收率为94.3％。
e、Pro-Ile-SeMet-Phe-OMe的合成
将上步骤得到的Pro-Ile-SeMet-OH(0.95mmol，0.512g)溶于DCM(5mL)中，0℃下加入N,N-二异丙基乙胺(2.28mmol，0.295g)，紧接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.14mmol，0.219g),1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.14mmol,0.154g)搅拌活化5 min，然后加入NH2-Phe-OMe·HCl(1.24mmol，0.386g)反应5h。TLC监测反应完全后加入DCM(60mL)并搅拌均匀，随后依次用5％磷酸水溶液(120mL)、饱和碳酸氢钠溶液 (120mL)和饱和氯化钠溶液(120mL)洗涤，随后有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液真空浓缩，得到产物0.47g，产物收率为96.5％。
f、Pro-Ile-SeMet-Phe-OH
将上一步产物Pro-Ile-SeMet-Leu-OMe溶于5mL甲醇中，冰浴条件下添加1M·L-1氢氧化锂水溶液5mL充分搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，反应液用稀盐酸调节pH＝3，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产物Pro-Ile-SeMet- Phe-OH。随后对粗产物采用柱层析的方法进行纯化处理，洗脱剂V(Pet)：V(EtoAc)＝4:1，过程通过TLC结合茚三酮和碘缸显色监测，得到产物0.433g，产物收率为94.3％。其结构表征如下：1H NMR(500MHz,(CD3)2SO)δ12.77(s,1H),10.28(s,1H),8.90–8.63(m,1H),8.44(d,J＝31.9Hz,1H),8.36–8.02(m,2H),7.21(d,J＝27.2Hz,5H),4.40(d,J＝39.1Hz,2H), 4.33–4.06(m,2H),3.32–2.98(m,3H),2.93(d,J＝10.6Hz,1H),2.39(dd,J＝47.3,33.2Hz, 3H),2.12–1.57(m,8H),1.43(s,1H),1.09(s,1H),0.80(s,6H).13C NMR(125MHz,(CD3)2SO) δ173.08,171.18,170.72,168.59,137.88,129.54,128.58,126.85,66.83,58.93,58.06,53.83, 53.03,46.05,36.98,36.77,33.71,30.38,24.84,23.93,20.62,15.79,11.41,3.91.
实施例12：含L-硒代蛋氨酸寡肽Phe-Val-SeMet-OH(Ⅲ-12)的制备
a、N-叔丁氧羰基苯丙氨酰缬氨酸甲酯Boc-Phe-Val-OMe的合成
操作同实施例2步骤a，区别在于将1-1(1mmol，0.231g)替换为3-1(1mmol，0.265g)、甘氨酸甲酯盐酸盐(1.3mmol，0.163g)替换为缬氨酸甲酯盐酸盐(1.3mmol，0.218g)，最终得到产物0.362g，收率95.7％。
b、N-叔丁氧羰基苯丙氨酰缬氨酸Boc-Phe-Val-OH的合成
操作同实施例2步骤b，区别在于将1-2替换为3-2最终得到产物0.356g，收率96.3％。 c、N-叔丁氧羰基苯丙氨酰缬氨酰硒代蛋氨酸甲酯Boc-Phe-Val-Se-Met-OMe的合成
操作同实施例2步骤c，区别在于将1-3(0.9mmol，0.259g)替换为2-3(0.9mmol，0.328g)，最终得到产物0.488g，收率97.5％。
d、N-叔丁氧羰基苯丙氨酰缬氨酰硒代蛋氨酸Boc-Phe-Val-SeMet-OH的合成操作同实施例2步骤d，区别在于将1-4替换为2-4，最终得到产物0.447g，收率93.8％。
e、苯丙氨酰缬氨酰硒代蛋氨酸NH2-Phe-Val-Se-Met-OH的合成
操作同实施例2步骤e，区别在于将1-5替换为2-5，最终得到产物0.352g，收率96.6％。其结构表征如下：1H NMR(500MHz,(CD3)2SO)δ12.65(s,1H),8.78(d,J＝8.8Hz,1H),8.44 (d,J＝7.6Hz,1H),8.42–8.25(m,2H),7.31–7.17(m,5H),4.32(ddd,J＝9.6,7.6,4.4Hz,1H), 4.27–4.10(m,2H),3.16(dd,J＝14.0,5.6Hz,1H),3.01(dd,J＝14.1,6.8Hz,1H),2.56(s,2H), 2.11–1.92(m,6H),0.91(t,J＝6.9Hz,6H).13C NMR(125MHz,(CD3)2SO)δ173.38,171.01, 168.14,135.36,130.14,128.80,127.42,66.82,58.38,53.47,52.34,37.17,32.08,31.36,21.24, 19.58,18.89,3.95.
实施例13：含L-硒代蛋氨酸寡肽(III-1)至(III-10)、(Ⅲ-12)对细胞生长抑制的测定
宫颈癌(Hela)细胞购自新加坡国立大学
(1)宫颈癌(Hela)细胞培养
培养条件：DMEM高糖培养液(购自杭州泽衡生物科技有限公司)+10％/优质胎牛血清， 37℃，气相：空气(95％)、二氧化碳(5％)。
冻存条件：DMEM高糖培养液+10％/胎牛血清+10％DMSO。
传代方法：将Hela细胞放置在T25细胞培养皿贴壁培养，培养的条件为5％的CO2和37℃，培养液为含10％ FBS的DMEM溶液。待其生长至对数期时，从培养箱中取出T25 细胞培养皿，加入2mL的胰蛋白酶消化。消化完全后，用1mL的移液枪吸出胰蛋白酶，加入1.5mL的EP管中，在1500rpm条件下离心5min，弃掉胰蛋白酶，加入培养液悬浮并稀释至培养液的细胞密度为1×105/mL。用1mL的移液枪将细胞悬浮液加到96孔板中，每孔的体积为100μL，空白对照加入100μL的不含细胞的培养液，将96孔板放到细胞培养箱中培养过夜。
(2)抗肿瘤活性实验(MTT法)
将Hela细胞放置在T25细胞培养皿贴壁培养，培养的条件为5％的CO2和37℃，培养液为含10％ FBS的DMEM溶液。待其生长至对数期时，从培养箱中取出T25细胞培养皿，加入2mL的胰蛋白酶消化。消化完全后，用1mL的移液枪吸出胰蛋白酶，加入1.5mL 的EP管中，在1500rpm条件下离心5min，弃掉胰蛋白酶，加入培养液悬浮并稀释至培养液的细胞密度为1×105/mL。用1mL的移液枪将细胞悬浮液加到96孔板中，每孔的体积为 100μL，空白对照加入100μL的不含细胞的培养液，将96孔板放到细胞培养箱中培养过夜。待96孔板的细胞长到细胞对数期时，吸取1μL不同浓度的待测样品1μL于实验组中，每个浓度设置三个复孔孵育24h。孵育完后每个孔加入10μL的CCK8试剂，在37℃、5％的 CO2的培养箱中再培养2h。对照组加入1μL含相应浓度的DMSO。培养2h后完后用酶标仪在450nm测量吸光值。用以下公式计算细胞存活率：
将上述步骤中的化合物Ⅲ-1分别换为Cisplatin、化合物Ⅲ-2、Ⅲ-3、Ⅲ-4、Ⅲ-5、Ⅲ-6、Ⅲ-7、Ⅲ-8、Ⅲ-9、Ⅲ-10，Ⅲ-12其余不变，即可测定化合物Ⅲ-2至化合物Ⅲ-10及Ⅲ-12的抗肿瘤作用。样品试验结果见表1。
表1L-硒代蛋氨酸(Ⅱ)与含L-硒代蛋氨酸寡肽对Hela细胞抑制活性
注释：Ⅲ-1—Ⅲ-10和Ⅲ-12分别对应的化合物为Ala-Gly-SeMet-OH、Ile-Pro-SeMet-OH、 Phe-Pro-SeMet-OH、Pro-Ile-SeMet-Gly-OH、Pro-Ile-SeMet-Val-OH、Phe-Val-Se-Met-Pro-OH、 Leu-Gly-SeMet-Ala-OH、Lys-SeMet-Pro-OH、Lys-SeMet-Ala-OH、Pro-Ile-SeMet-Phe-OH、 Phe-Val-SeMet-OH。
由上表可知，不管在任何浓度梯度化合物Ⅲ-12对Hela细胞的抑制作用都很小，化合物Ⅲ-1至Ⅲ-10对Hela细胞均有明显的抑制作用。当样品浓度为10ug/mL时，Cisplatin对Hela细胞的抑制率为77.9％，化合物Ⅲ-1至Ⅲ-10对Hela细胞的抑制率基本在51-76％之间，抑制效果较好的是化合物Ⅲ-6、Ⅲ-1和化合物Ⅲ-4，对Hela细胞的抑制浓度可达76％、62％和61％。
当浓度为20ug/mL时，Cisplatin对Hela细胞的抑制率为87％，化合物Ⅲ-1至Ⅲ-10对Hela细胞的抑制率基本在56-86％之间，抑制效果最好的是化合物Ⅲ-6、Ⅲ-1和化合物Ⅲ-5，对Hela细胞的抑制浓度可达86％、64％。
随着药物浓度的进一步提高到40ug/mL时，Cisplatin对Hela细胞的抑制率92％，略高于化合物Ⅲ-6为89％。
当药物浓度为80ug/mL时，化合物Ⅲ-1至Ⅲ-10对Hela细胞都有良好的抑制率：在63％-92％之间，其中，化合物Ⅲ-6为90％，接近Cisplatin的抑制率(92％)。
总之，化合物Ⅲ-1至Ⅲ-10对Hela细胞均有明显的抑制作用，低浓度时它们对Hela细胞抑制活性接近于Cisplatin，高浓度时它们对Hela细胞抑制活性要低于Cisplatin。
总体来说，化合物Ⅲ-1至Ⅲ-10这10种硒肽浓度区间为10μg/mL-80μg/mL时，随着样品浓度的提高，其对Hela细胞的抑制率大都保持在稳定区间缓慢递增。在此浓度区间内，抑制率波动幅度较为平缓，所有化合物对该肿瘤细胞的抑制率均在51％以上，具有较好的抑制这种宫颈癌细胞的能力。
Claims (8)
1.式(III)所示的含L-硒代蛋氨酸寡肽在制备抗肿瘤药物中的应用：
式(III)中，R1以羰基与式中氨基形成肽键的氨基酸残基或二肽残基或三肽残基，R2为羟基或以氨基与式中羰基形成肽键的氨基酸残基。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于R1为下列基团之一：
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于R2为羟基或下列基团之一：
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述含L-硒代蛋氨酸寡肽为下列之一：
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述含L-硒代蛋氨酸寡肽为式Ⅲ-1至Ⅲ-10所示化合物。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述含L-硒代蛋氨酸寡肽为式Ⅲ-1、Ⅲ-6、或Ⅲ-4所示化合物。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述含L-硒代蛋氨酸寡肽为式Ⅲ-6所示化合物。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为宫颈癌。
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