CN115463116A - 淫羊藿黄酮雾化吸入制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种淫羊藿黄酮雾化吸入制剂及其应用，所述雾化吸入制剂中的淫羊藿黄酮为朝藿定C单体、淫羊藿苷单体、朝藿定C与淫羊藿苷的组合物、或以朝藿定C与淫羊藿苷为主要组分的淫羊藿总黄酮，所述应用为在制备治疗或预防肺部和呼吸道炎症相关疾病的药物中的应用，其中，所述疾病包括哮喘、支气管炎、肺气肿、支气管扩张、慢性阻塞性肺病、糖皮质激素抵抗性肺部疾病、肺纤维化、间质性肺病、感染或化疗所致肺部炎症和肺动脉高压。本发明的淫羊藿黄酮雾化吸入制剂可供将药物递送至肺部，提高药物的肺部生物利用度，延长药物肺部作用时间，实现雾化吸入治疗炎症相关的呼吸道疾病的良好效果。
Description
技术领域
本发明涉及淫羊藿黄酮雾化吸入制剂及其应用，特别涉及朝藿定C单体、淫羊藿苷单体、朝藿定C与淫羊藿苷的组合物、或以朝藿定C与淫羊藿苷为主要组分的淫羊藿总黄酮雾化吸入制剂及其在制剂制备、治疗或预防肺部和呼吸道炎症相关疾病的药物中的应用，属于中药制药领域。
背景技术
肺部急性和慢性炎症是许多肺部疾病的一个主要特征。多种呼吸道肺部疾病，如哮喘、支气管炎、肺气肿、支气管扩张、慢性阻塞性肺病、肺纤维化、间质性肺病、呼吸道感染等，属于呼吸系统慢性炎症性疾病或伴发有急性炎症。抑制炎症反应可控制疾病症状或延缓疾病进程。传统上糖皮质激素，尤其是吸入糖皮质激素，广泛应用于肺部的抗炎治疗，但一方面糖皮质激素存在一定毒副作用，另一方面，很多肺部炎症存在激素抵抗现象，因此需要迫切需要开发新型抗炎药物。
中药在呼吸道疾病治疗方面发挥重要作用，例如，中药注射剂在治疗呼吸道感染、急性支气管炎、肺炎、哮喘和慢性阻塞性肺病等呼吸系统疾病方面具有重要的临床价值。这些临床应用的中药通常都具有较好的抗炎作用，并占有很大的市场份额。但中药注射剂通常存在不良反应，且有效成分在肺组织的分布浓度较低，制约了其在肺部作用效果和作用时长。在此背景下，亟待开发一种能够提高中药注射剂疗效、延长其作用时间、并可避免其不良反应的中药雾化吸入抗炎药物制剂。
发明内容
为解决现有技术中的问题，本发明提出了一种淫羊藿黄酮雾化吸入制剂及其应用。
淫羊藿总黄酮的组分通常与淫羊藿药材相关，其主成分通常为朝藿定A、B和C，以及淫羊藿苷，但也可通过选择适当的药材品种控制其主成分为朝藿定C单体、淫羊藿苷单体、或朝藿定C与淫羊藿苷。本发明经过大量研究，首次发现中药淫羊藿中的黄酮类成分朝藿定C单体、淫羊藿苷单体、朝藿定C与淫羊藿苷的组合物、或以朝藿定C与淫羊藿苷为主要组分的淫羊藿总黄酮经肺部给药后具有显著的抗炎作用，其与以淫羊藿总黄酮为主要活性成分的喘可治注射液相比，在小鼠LPS诱导的肺损伤模型上具有更强的抗炎作用，其抗炎强度和地塞米松注射液相当，达到注射给药同等的抗炎作用可降低100倍的给药剂量。进一步研究发现，肺部给药的朝藿定C单体、淫羊藿苷单体、朝藿定C与淫羊藿苷的组合物、或以朝藿定C与淫羊藿苷为主要组分的淫羊藿总黄酮可提高黄酮的肺部生物利用度，其中朝藿定C的肺部生物利用度可提高200倍；淫羊藿在肺部给药的肺部抗炎作用时间至少可维持12小时，显著优于注射给药的1小时药效维持时间。
此外，当药物为朝藿定C单体、朝藿定C与淫羊藿苷的组合物、或以朝藿定C与淫羊藿苷为主要组分的淫羊藿总黄酮时，药物具有很好的水溶性，可通过常规的生产工艺制备成为浓度高达20mg/mL的供雾化吸入用的药液。选择常规的商品雾化器即可对该药液或经稀释的药液进行有效雾化，雾化后气溶胶的主要性能取决于雾化器本身，药物溶液本身理化性质对雾化性能没有明显影响。
具体地，本发明提出了以下技术方案：
本发明提出了一种淫羊藿黄酮雾化吸入制剂，所述雾化吸入制剂中的淫羊藿黄酮为朝藿定C单体、淫羊藿苷单体、朝藿定C与淫羊藿苷的组合物、或以朝藿定C与淫羊藿苷为主要组分的淫羊藿总黄酮。
优选的，在所述朝藿定C与淫羊藿苷的组合物中，朝藿定C的质量占比为10-90％，优选为50-80％，更优选为80％(即朝藿定C与淫羊藿苷的质量比为4：1)。
优选的，在所述以朝藿定C与淫羊藿苷为主要组分的淫羊藿总黄酮中，朝藿定C与淫羊藿苷总共的质量占比为50-90％，优选为60-90％。
优选的，所述雾化吸入制剂为液体制剂、或为冻干粉经由注射用水或注射用生理盐水复溶后的液体制剂。
优选的，在所述液体制剂中，淫羊藿黄酮的浓度为0.1-20mg/mL。
优选的，所述液体制剂的pH值为4.5-8.0，优选6.0-7.4。
优选的，所述液体制剂中含有磷酸缓冲液、表面活性剂和氯化钠。
优选的，所述液体制剂为等渗溶液，其中磷酸盐含量在0-10mg/mL，所述氯化钠为等渗调节剂。
优选的，所述表面活性剂为吐温80，质量占所述液体制剂的0-0.04％。
优选的，所述液体制剂可经雾化器形成雾化吸入气溶胶。
优选的，所述雾化器为空气压缩雾化器、超声雾化器或振动筛孔雾化器。
本发明还提出了上述淫羊藿黄酮雾化吸入制剂在制备治疗或预防肺部和呼吸道炎症相关疾病的制剂中的应用，其中，所述疾病包括哮喘、支气管炎、肺气肿、支气管扩张、慢性阻塞性肺病、糖皮质激素抵抗性肺部疾病、肺纤维化、间质性肺病、感染或化疗所致肺部炎症和肺动脉高压。
相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明特别选用朝藿定C单体、淫羊藿苷单体、朝藿定C与淫羊藿苷的组合物、或以朝藿定C与淫羊藿苷为主要组分的淫羊藿总黄酮制备雾化吸入制剂，可供将药物递送至肺部，提高药物的肺部生物利用度，延长药物肺部作用时间，实现雾化吸入治疗炎症相关的呼吸道疾病的良好效果。而其他成分的淫羊藿黄酮制剂一般因水溶性较差等因素难以制备成为溶液或稳定的混悬液供雾化吸入使用，实现有效肺部沉积，或者难以成为长效雾化吸入制剂，从而所得制剂的肺部抗炎效果、肺部生物利用度以及肺部作用时间不理想。
附图说明
图1为喘可治注射液经气管和静脉给药后在LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型上抑制呼吸道细胞募集的药效结果(n＝6，均值±标准差)，*p<0.05，**p<0.01，和LPS模型组相比。
图2为喘可治注射液经气管和静脉给药后在LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型上抑制肺泡灌洗液TNF-α含量的药效结果(n＝6，均值±标准差)，*p<0.05，**p<0.01，和LPS模型组相比。
图3为喘可治注射液经气管和静脉给药后在LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型上抑制肺泡灌洗液IL-6含量的药效结果(n＝6，均值±标准差)，*p<0.05，**p<0.01，和LPS模型组相比。
图4为喘可治注射液不同成分经气管给药后在LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型上抑制肺泡灌洗液TNF-α(a)和IL-6(b)含量的药效结果(n＝6，均值±标准差)，*p<0.05，**p<0.01，和LPS模型组相比。
图5为不同剂量的淫羊藿黄酮成分和喘可治经气管给药后在LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型上抑制肺泡灌洗液TNF-α(a)和IL-6(b)含量的药效结果(n＝6，均值±标准差)，*p<0.05，**p<0.01，和LPS模型组相比。
图6为大鼠经静脉(■)和气管(●)两种途径给予淫羊藿黄酮后朝藿定C(a)和淫羊藿苷(b)的血浆药时曲线(n＝6，均值±标准差)。
图7为小鼠经静脉(■)和气管(●)两种途径给予淫羊藿黄酮后朝藿定C(c)和淫羊藿苷(d)的肺组织药时曲线(n＝3，均值±标准差)。
图8为淫羊藿黄酮溶液10mg/mL(a)和5mg/mL(b)药液经帕瑞LC Star雾化器雾化后气溶胶的液滴数量粒径分布。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
本实施例的淫羊藿黄酮雾化吸入制剂，是由朝藿定C单体冻干粉经由注射用生理盐水复溶后制得的等渗液体制剂，该液体制剂中朝藿定C的浓度为20mg/mL，同时该液体制剂中还含有0.9％的氯化钠，pH值为7。
实施例2
本实施例的淫羊藿黄酮雾化吸入制剂，是由淫羊藿苷单体微粒分散在水溶液后制得的等渗混悬型液体制剂，该液体制剂中淫羊藿苷的浓度为20mg/mL，同时该液体制剂中还含有磷酸盐含量在10mg/mL的磷酸缓冲液、0.04％的吐温80表面活性剂以及3mg/mL的氯化钠，pH值为7。
实施例3
本实施例的淫羊藿黄酮雾化吸入制剂，是由朝藿定C与淫羊藿苷质量比4：1的组合物溶于特定水溶液制备的等渗液体制剂，该液体制剂中朝藿定C与淫羊藿苷的总浓度为20mg/mL，同时该液体制剂中还含有磷酸盐含量在10mg/mL的磷酸缓冲液、0.02％的吐温80表面活性剂以及3mg/mL的氯化钠，pH值为7。
实施例4
本实施例的淫羊藿黄酮雾化吸入制剂，是由以质量比74％朝藿定C、16％淫羊藿苷和10％其它淫羊藿黄酮组成的淫羊藿总黄酮所制得的等渗液体制剂，该液体制剂中淫羊藿总黄酮的总浓度为20mg/mL，同时该液体制剂中还含有磷酸盐含量在10mg/mL的磷酸缓冲液、0.02％的吐温80表面活性剂以及3mg/mL的氯化钠，pH值为7。
实验例1喘可治注射液经气管和静脉给药后的抗炎药效比较
为明确喘可治注射液经不同给药途径给药后所发挥的肺部抗炎作用，本发明采用LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型比较评价了其经静脉注射和气管滴注给药后肺部抗炎药效的量效关系。具体是：将小鼠随机分为对照组(记为NS组)、模型组(记为LPS组)、阳性药物组(地塞米松注射给药5mg/kg，记为DXM组)、喘可治静脉给药组(给药剂量分别为100、500、2500、10000μL喘可治注射液/kg，分别记为IV-100、IV-500、IV-2500、IV-10000组)以及喘可治气管给药组(给药剂量分别为20、100、500、2500μL喘可治注射液/kg，分别记为IT-20、IT-100、IT-500、IT-2500组)，除对照组外，各组小鼠经气管给予4μg LPS，药物治疗组在给予LPS前1小时经气管给予药物溶液，在给予LPS 6小时后人道处死小鼠，收集肺泡灌洗液(BALF)，在4℃下3000rpm离心15min，收集上清和细胞沉淀，上清液冻存于-20℃。向细胞沉淀中加入100μL红细胞裂解液，静置5min,在4℃下3000rpm离心15min以去除红细胞，将细胞用100μL PBS重悬，并用细胞计数器进行细胞计数。BALF中TNF-α和IL-6水平根据制造商说明书使用Elisa试剂盒测定。
喘可治经不同给药途径给药后的抗炎药效如图1到图3所示。图1结果显示喘可治两种给药途径均可剂量依赖性地抑制呼吸道的细胞募集。其中气管给药在100μL/kg的剂量下即可显著抑制细胞募集，和模型组相比，细胞总计数可降低约45％，当给药剂量为2500μL/kg时，其抑制细胞募集的药效和阳性药物没有显著差异；而静脉给药组显著抑制细胞募集的低剂量为2500μL/kg，细胞总计数仅降低约28％，在10000μL/kg高剂量下的细胞总计数抑制率也仅有约31％。也就是说，和静脉给药相比，产生同等药效的气管给药剂量至少可降低100倍。
图2结果显示喘可治两种给药途径均可剂量依赖性地抑制BALF中的TNF-α含量。其中和模型组相比，气管给药在20μL/kg和100μL/kg的剂量下即可显著抑制TNF-α含量达35％和51％，当给药剂量为2500μL/kg时，其抑制TNF-α含量的药效和阳性药物没有显著差异；而静脉给药组显著抑制TNF-α含量的低剂量为2500μL/kg，TNF-α含量降低约40％，在10000μL/kg高剂量下的TNF-α含量抑制率也仅有约40％。也就是说，和静脉给药相比，产生同等药效的气管给药剂量至少可降低100倍。
图3结果显示喘可治两种给药途径均可剂量依赖性地抑制BALF中的IL-6含量。和静脉给药相比，产生同等药效的气管给药剂量至少可降低20倍。
实验例2喘可治注射液和淫羊藿黄酮的抗炎药效比较研究
为明确喘可治注射液中发挥抗炎作用的活性成分，本发明采用葡聚糖凝胶将其中的黄酮类组分和非黄酮类组分进行了分离，并在同等草药剂量下选用LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型对其抗炎药效进行了评价。具体是：将小鼠随机分为对照组、LPS组、喘可治组、喘可治去黄酮组以及喘可治黄酮组；喘可治去黄酮和喘可治黄酮经喘可治在SephadexLH20上样后分段制备，和喘可治草药剂量相同；药效评价实验流程如实验例1所述。
药效结果如图4所示，可以看出，喘可治注射液中的总黄酮为发挥抗炎药效的主要成分，同等剂量下其抗炎药效和喘可治注射液基本相当，而非黄酮部分则只有较弱的抗炎活性。
实验例3淫羊藿黄酮经肺部给药的抗炎作用量效关系评价
为进一步评价淫羊藿黄酮的抗炎作用，本发明选用LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型评价了不同的淫羊藿黄酮成分，包括朝藿定C单体以及朝藿定C与淫羊藿苷的组合物(质量比4:1)经肺部给药后抗炎的量效关系。具体是：将小鼠随机分为对照组、LPS组、喘可治高剂量组(黄酮含量12.5mg/kg)、朝藿定C低(0.5mg/kg)、中(2.5mg/kg)、高(12.5mg/kg)剂量组以及朝藿定C与淫羊藿苷的组合物低(0.5mg/kg)、中(2.5mg/kg)高(12.5mg/kg)剂量组，药效评价实验流程如实验例1所述。
如图5药效结果所示，朝藿定C单体以及朝藿定C与淫羊藿苷的组合物均展示出剂量依赖性的肺部抗炎药效。同等剂量下，朝藿定C单体和朝藿定C与淫羊藿苷的组合物之间的抗炎药效未见显著差异。在肺泡灌洗液中TNF-α含量抑制方面，朝藿定C单体和朝藿定C与淫羊藿苷的组合物的药效和同剂量下的喘可治未见显著差异；但在肺泡灌洗液中IL-6含量抑制方面，朝藿定C单体和朝藿定C与淫羊藿苷的组合物的药效优于同剂量下的喘可治。
实验例4淫羊藿黄酮经肺部给药的抗炎作用时效评价
本发明采用预防性给药结合LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型评价了不同的淫羊藿黄酮成分经肺部给药后的抗炎作用时长。具体是：将小鼠随机分为对照组、LPS组、LPS造模前6和12小时喘可治注射液预防性静脉给药组(剂量为2.5mL/kg)、LPS造模前6和12小时朝藿定C单体预防性气管给药组(剂量为2.5mg/kg)、LPS造模前6和12小时淫羊藿苷单体预防性气管给药组(剂量为2.5mg/kg)以及LPS造模前6和12小时朝藿定C与淫羊藿苷的组合物(质量比4：1)预防性气管给药组(剂量为2.5mg/kg)，药效评价实验流程如实验例1所述。
延长吸入药物作用时间，降低用药频次是吸入药物研发的发展趋势，维持药效至少12小时是当前肺部抗炎药物的一个重要要求。喘可治注射液注射以及淫羊藿黄酮成分经气管提前6小时和12小时给药后在LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型上抑制肺泡灌洗液TNF-α和IL-6含量的药效结果见表1(n＝3-6，均值±标准差)。
结果显示，虽然喘可治注射液高剂量注射时在实验例1中显示出显著肺部抗炎药效，但当在LPS造模前6和12小时提前给药的情况下，没有显示出任可抑制TNF-α和IL-6含量的药效，也就是说经注射给药时维持抗炎药效的作用时间少于6小时。
而淫羊藿黄酮单体朝藿定C和单体淫羊藿苷经气管给药时，其在提前6小时给药时，均可展示出显著的抗炎药效。尤其是当朝藿定C与淫羊藿苷的组合物在提前6小时或12小时肺部给药后，其均可显著抑制肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6含量。也就是说，淫羊藿黄酮气管给药后可至少维持肺部抗炎药效至少12小时。
表1
*p<0.05，**p<0.01，和LPS模型组相比。
实验例5淫羊藿黄酮经肺部和静脉给药的药代动力学比较研究
对于吸入给药而言，了解药物在肺部的过程非常重要，而淫羊藿黄酮的肺部生物药剂学特性研究未见报道，因此本发明开展了淫羊藿黄酮经肺部和静脉给药的药代动力学比较研究，以期探究淫羊藿黄酮在肺部的吸收和代谢情况。
具体实验流程是：
(1)药代操作：实验前，腹腔注射40mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠，将聚乙烯导管插入大鼠右颈静脉，用100U/mL肝素钠冲洗。术后至少恢复12小时，将颈静脉插管大鼠随机分为两组，每组6只。一组大鼠经气管给予朝藿定C和淫羊藿苷组方(4:1，剂量为1mg/kg)溶液，给药剂量为200μL。在给药前，腹腔注射40mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠，将弯曲角度为135°的22号球型针插入大鼠气管，缓慢滴注药液。将大鼠保持直立60秒以确保药物沉积。另一组大鼠经尾静脉注射给予稀释5倍的朝藿定C和淫羊藿苷组方溶液，给药剂量为1mL。分别于给药后5、10、15、30、45、60、90、120、180、240、300、360、480、720min，采用插管法从大鼠颈静脉取血。将血液样本置于肝素化的离心管中，立即在4℃下3000rpm离心15min，获得50μL血浆样本，样本保存在-20℃，用于LC-MS/MS分析。
(2)样品处理：向50μL血浆样品中加入10μL内标工作液(1000ng/mL)，将样品涡旋混合30s，用1.5mL乙酸乙酯涡旋5min提取，12000rpm离心10min后，将上层有机相转移至另一试管中，在温和的氮气流下干燥，残渣用200μL甲醇复溶，涡旋混合3min，12000rpm离心10min，取上清，进行LC-MS/MS测定。
(3)LC-MS/MS分析方法：LC-MS/MS系统由配备电喷雾电离(ESI)源系统的API4000串联四级杆质谱仪(美国应用生物系统公司)和由真空脱气器、双泵和自动进样器组成的岛津UPLC系统(日本东京岛津)组成。色谱柱为phenomenex Luna5u C18(2)(150mm×2.0mm)，进样量10μL。流动相：乙腈：0.1％甲酸水(35：65)，等度洗脱6min。柱温：40℃，流速0.22mL/min。质谱检测采用负电离模式结合MRM模式进行定量分析。
(4)结果分析：大鼠经静脉(IV)和气管(IT)两种途径给予朝藿定C和淫羊藿苷组方(4:1，剂量为1mg/kg)溶液后朝藿定C和淫羊藿苷的药时曲线见图6，计算血浆药代动力学参数见表2(n＝6，均值±标准差)。由图6可以看出，静脉注射给药后，朝藿定C和淫羊藿苷的血浆浓度在60-90分钟左右便迅速降至最低定量限1ng/mL(朝藿定C的血浆浓度在120分钟时便无法检出，淫羊藿苷的血浆浓度在90分钟时便无法检出)，平均药物滞留时间MRT约14分钟。药物溶液经气管内给药可使朝藿定C和淫羊藿苷快速从肺部吸收，其平均Tmax均为约10.8分钟。然而，气管给药可将朝藿定C和淫羊藿苷的血浆可检测时间延长至240-360分钟。血浆检出时间可通过显著增加的MRT和T1/2值得到反映。气管内滴注药液后，朝藿定C和淫羊藿苷的平均吸收时间MAT分别约为66.7分钟和108.9分钟，而它们的绝对生物利用度分别为20.4％和82％。从绝对生物利用度结果来看，朝藿定C可能在肺部发生了代谢。
表2
实验例6淫羊藿黄酮经肺部和静脉给药的肺部生物利用度比较研究
肺部抗炎药物的药效通常和血浆药物浓度之间没有相关性,而与肺组织中药物浓度直接相关，因此有必要明确药物经不同给药途径后的肺部生物利用度。本发明比较研究了淫羊藿黄酮经肺部和静脉给药的肺部生物利用度研究，以期探究给药途径对淫羊藿黄酮肺部生物利用度的影响。
具体实验流程是：
(1)肺组织分布实验操作：将小鼠随机分为2组，一组小鼠经气管给予朝藿定C和淫羊藿苷组方(4：1)溶液，另一组小鼠经尾静脉注射朝藿定C和淫羊藿苷组方(4：1)溶液，其中注射组给药剂量是气管给药组的4倍。分别在给药后5、15、30、60、120、240、360和720min将小鼠安乐死，然后心脏取血；经气管插管收集肺泡灌洗液，用生理盐水灌洗3次，并得到2.0mL的肺泡灌洗液；摘取小鼠肺组织，清洗并称重。将样本冻存于-20℃用于进一步分析。
(2)样品处理：向小鼠肺组织中加入500μL生理盐水，匀浆。精密吸取100μL小鼠肺匀浆，加入50μL内标工作液(200ng/mL)，涡旋30s，加入1500μL乙酸乙酯，涡旋5min，12000rpm离心10min，取上清于洁净的试管中，于温和的氮气流下干燥，残渣加200μL甲醇复溶，涡旋1min，12000rpm离心5min，取上清，进行LC-MS/MS分析。
(3)LC-MS/MS分析方法：同实验例5中操作。
(4)结果分析：大鼠经静脉(IV)和气管(IT)两种途径给予朝藿定C和淫羊藿苷组方的肺部药时曲线见图7，计算肺组织药代动力学参数见表3(n＝3，均值±标准差)。与静脉给药相比，药物经气管给药在肺组织中浓度更高，可以长时间维持较高的局部药物浓度。经气管给药后，朝藿定C和淫羊藿苷在肺组织中的峰值出现在第1个时间点(5分钟)，淫羊藿苷在肺组织中的浓度峰值早于静脉给药，说明气管给药可更快发挥局部药效。此外，朝藿定C和淫羊藿苷经气管给药的肺部相对生物利用度分别是静脉给药的208和68倍。说明药物经气管给药具有更好的肺靶向性。
表3
实验例7雾化气溶胶的液滴粒径分布评价
已有研究表明，吸入粒子的粒径在1-5μm可以获得最佳的肺部沉积，因此雾化气溶胶液滴粒径分布和空气动力学特性是雾化药物制剂最重要的质量参数之一。本发明分别采用激光法和撞击法评价了雾化气溶胶的实时液滴粒径分布及其空气动力学粒径分布。
具体实验操作流程是：
(1)雾化气溶胶实时液滴粒径分布的测定:将流量计连接到马尔文实时喷雾粒度分析仪的人工喉管，调节真空泵流速为15mL/min，取2mL 10mg/mL的朝藿定C和淫羊藿苷组方(4：1)溶液或稀释1倍后的溶液加入帕瑞LC Star雾化器的药杯中，将雾化器口含器咬嘴接口通过适配器直接接入人工喉管，打开软件，矫正光路背景后启动雾化器开始测定，待气溶胶透光率迅速上升时停止测试，记录雾化后实时粒径随雾化时间的变化情况，累计粒度分布百分数达到50％时对应的粒径Dx(50)也称中位粒径，室温下重复测定3次，结果取平均值。
(2)空气动力学粒径分布的测定：按照《中华人民共和国药典》2020版操作，将NGI放置在4℃冰箱中超过1.5h后，将已装好玻璃纤维滤纸的NGI按说明装配好，连接好流量计后打开真空泵，调节气流至15mL/min，取淫羊藿黄酮稀释液2mL于雾化器药杯中，将雾化器口含器咬嘴接口直接连接L型连接管，打开装置，开始计时，在预计时间内完成雾化，关闭雾化器和真空泵。以10mL 50％甲醇-水作为洗涤液，洗涤NGI各级和雾化器中残留的药物，采用HPLC测定其中朝藿定C的含量。将计算结果导入到CITDAS数据分析系统，计算可得细微颗粒分数(fine particle fraction，FPF)、质量中值粒径(MMAD)，几何标准偏差(geometricstandard deviation，GSD)用以表征雾化气溶胶的空气动力学粒径分布。重复测定3次,结果取平均值。
气溶胶的实时粒径分布也是评价雾化气溶胶体外吸入性能的重要指标，研究结果见图8。平均实时粒径结果显示，液滴粒径分布成单分布，超过95％数量的液滴分布在0.6-3.0微米，药物溶液或稀释1倍后的溶液经雾化后的中位体积粒径Dx(50)均约为3.48微米。考虑到1.5-3μm的粒子具有良好的肺沉积特性，可沉积在肺外周，说明淫羊藿黄酮溶液的雾化气溶胶粒肺部可吸入性能良好。基于NGI测试的雾化气溶胶空气动力学粒径分布结果见表4(n＝3，均值±标准差)。实验结果发现，朝藿定C的MMAD为3.25μm，可吸入的微细粒子分数(FPF)为74.6％。微细粒子分数(FPF)是进入撞击器内部小于5微米的粒子占粒子总数的质量百分比，反映了吸入气溶胶中可以沉积在肺部的药物百分比。也就是说淫羊藿黄酮溶液经雾化吸入后有74.6％的药物可沉积在肺部，其雾化性能良好。
表4
实验例8雾化气溶胶递送速率和递送总量
2020版中国药典对雾化吸入溶液的体外吸入性能评价包括雾化液滴分布、空气动力学特性、递送速率和递送总量，后两者是药典要求的雾化气溶胶质量控制参数，可预测药物粒子在肺部的沉积情况。本发明评价了淫羊藿黄酮溶液经商用雾化器雾化的沉积递送速率和递送总量。具体实验操作流程是：取2mL朝藿定C和淫羊藿苷组方(4：1)溶液于帕瑞LCStar雾化器的药杯中，将雾化器口含器咬嘴插口与呼吸模拟器的滤膜装置连接，将呼吸模拟器分别设定为成人模式(潮气量500mL、呼吸频率每分钟15循环、呼吸波形为正弦型、呼吸比为1：1)和儿童模式(潮气量150mL、呼吸频率每分钟25循环、呼吸波形为正弦型、呼吸比为1：2)。加装滤膜后开启呼吸模拟器，在雾化时间为1min时停止雾化，暂停呼吸模拟器，取出滤膜，置于装有10mL 50％甲醇-水的离心管中，涡旋30s。在滤膜装置中再放入一张新的滤膜，启动雾化器，直至雾化器无气雾喷出，雾化结束，关闭雾化器，5-10s后停止呼吸模拟器，使呼吸模拟器中的气体排尽。取出第2张滤膜，以50mL 50％甲醇-水洗涤滤膜上的药物，雾化器中残留的药物以50mL 50％甲醇-水洗涤，摇匀后涡旋。采用HPLC测定其中的朝藿定C和淫羊藿苷含量，重复测定3次，结果取平均值。第1张滤膜上吸附的药物含量与雾化时间之比即为递送速率，第1张滤膜和第2张滤膜收集药物含量之和即为递送总量，递送总量与雾化的2mL药液中药物含量之比为递送效率。
递送速率和递送总量的测试结果见表5(n＝3，均值±标准差)。结果显示，在成人模式下，雾化气溶胶的递送总量约占28.1％的加入总药量，而在儿童模式下，递送总量占总药量的约19.6％。结合NGI测定的FPF，成人和儿童可吸入药量占比分别占总加入量的21.0％和14.6％。总体上，递送的可吸入药量文献中使用该雾化器的数据基本一致，说明淫羊藿黄酮溶液制剂雾化吸入性能良好。
表5
从以上实施例及实验例结果来看，本发明的朝藿定C单体、淫羊藿苷单体、朝藿定C与淫羊藿苷的组合物、或以朝藿定C与淫羊藿苷为主要组分的淫羊藿总黄酮的雾化吸入制剂，经肺部给药后具有显著的剂量依赖性的抗肺部炎症的药效，且抗炎药效的作用时间至少可持续12小时。与注射给药相比，肺部给药可提高主要指标成分的肺部生物利用度60-200倍，在小鼠LPS诱导的肺损伤模型上具有更强的抗炎作用，其抗炎强度和地塞米松注射液相当；达到注射给药同样的抗炎作用可降低25-100倍的给药剂量。本发明的淫羊藿黄酮雾化吸入制剂可通过市售商品雾化器有效递送到肺部，是一种新型作用机制的吸入抗炎药物，具有开发潜力。
Claims (12)
1.一种淫羊藿黄酮雾化吸入制剂，其特征在于，所述雾化吸入制剂中的淫羊藿黄酮为朝藿定C单体、淫羊藿苷单体、朝藿定C与淫羊藿苷的组合物、或以朝藿定C与淫羊藿苷为主要组分的淫羊藿总黄酮。
2.根据权利要求1所述的雾化吸入制剂，其特征在于，在所述朝藿定C与淫羊藿苷的组合物中，朝藿定C的质量占比为10-90％，优选为50-80％，更优选为80％。
3.根据权利要求1所述的雾化吸入制剂，其特征在于，在所述以朝藿定C与淫羊藿苷为主要组分的淫羊藿总黄酮中，朝藿定C与淫羊藿苷总共的质量占比为50-90％，优选为60-90％。
4.根据权利要求1所述的雾化吸入制剂，其特征在于，所述雾化吸入制剂为液体制剂、或为冻干粉经由注射用水或注射用生理盐水复溶后的液体制剂。
5.根据权利要求4所述的雾化吸入制剂，其特征在于，在所述液体制剂中，淫羊藿黄酮的浓度为0.1-20mg/mL。
6.根据权利要求4所述的雾化吸入制剂，其特征在于，所述液体制剂的pH值为4.5-8.0，优选6.0-7.4。
7.根据权利要求4所述的雾化吸入制剂，其特征在于，所述液体制剂中含有磷酸缓冲液、表面活性剂和氯化钠。
8.根据权利要求7所述的雾化吸入制剂，其特征在于，所述液体制剂为等渗溶液，其中磷酸盐含量在0-10mg/mL，所述氯化钠为等渗调节剂。
9.根据权利要求7所述的雾化吸入制剂，其特征在于，所述表面活性剂为吐温80，质量占所述液体制剂的0-0.04％。
10.根据权利要求4所述的雾化吸入制剂，其特征在于，所述液体制剂可经雾化器形成雾化吸入气溶胶。
11.根据权利要求10所述的雾化吸入制剂，其特征在于，所述雾化器为空气压缩雾化器、超声雾化器或振动筛孔雾化器。
12.如权利要求1-11任一项所述的淫羊藿黄酮雾化吸入制剂在制剂制备、治疗或预防肺部和呼吸道炎症相关疾病的药物中的应用，其中，所述疾病包括哮喘、支气管炎、肺气肿、支气管扩张、慢性阻塞性肺病、糖皮质激素抵抗性肺部疾病、肺纤维化、间质性肺病、感染或化疗所致肺部炎症和肺动脉高压。
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