CN115444853A - 一种防治水产动物致病纤毛虫的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种防治水产动物致病纤毛虫的方法，是使用浓度不低于浓度0.5mM的葡萄糖溶液来处理纤毛虫。本发明发现葡萄糖对三疣梭子蟹致病纤毛虫异阿脑虫有致死作用，且最低致死浓度0.5mM，其对异阿脑虫的致死浓度与当前氨基糖苷类抗生素的使用浓度相当，且不会产生抗生素耐药性及抗生素不当使用带来的环境及水产品影响。与甲醛、硫酸奎宁等广谱杀虫药相比，葡萄糖所引起的致死作用在生物中未有报道，说明其具有物种特异性。本方法与已报道的杀虫方法相比，具备特异性、高效性与环境安全性。

Description

一种防治水产动物致病纤毛虫的方法
技术领域
本发明属于水产病害防治技术领域，具体涉及一种防治水产动物致病纤毛虫的方法。
背景技术
在水产养殖领域中，为了有效的防治渔病，药物的使用是必不可少的。之前使用敌百虫、过氧化氢等药物能够有效的控制水生寄生虫的爆发。但是，药物虽然能快速有效的防治鱼病，但是会对水生经济动物产生诸多负面影响，使用不当也会引发诸多的质量安全问题。因此，水产养殖从业人员开发无毒、无害、无环境残留的针对性杀虫剂,规范杀虫剂的安全使用,确保水产品的质量安全，是非常有必要的。
盾纤类纤毛虫(以下简称“盾纤毛虫”， scuticociliate)引起的盾纤毛虫病(scuticociliatosis)是世界范围内海水养殖业最严重的疾病之一，具有感染宿主多样、爆发速度快且危害极其严重的特点。已报道的盾纤毛虫宿主包括：鱼类、甲壳类及软体类等多种水生生物。盾纤毛虫可以入侵宿主的多种组织器官造成病变，利用宿主的细胞与组织为食，进行生长和繁殖活动，并最终导致宿主死亡。
异阿脑虫(Mesanophrys sp.)隶属于真核生物界(Eukaryota)；纤毛门(Ciliophora)；寡膜纲(Oligohymenophorea)；盾纤亚纲(Scuticociliatia)；是一种兼性寄生虫，一般情况下营自由生活，以水体中的细菌、微藻与有机质等为食，但在某些环境下，这些纤毛虫可以表现为寄生性，感染宿主引起病害。异阿脑虫属的盾纤毛虫已被报道造成多种甲壳类动物及大菱鲆等鱼类的爆发性异阿脑虫病。对于三疣梭子蟹养殖物种来说，异阿脑虫病一般爆发于冬季，对越冬的三疣梭子蟹，特别是来年抱卵蟹的养殖产生不利影响，造成生产生活上的巨大损失。
当前针对致病性纤毛虫异阿脑虫的防治药物有甲醛、硫酸奎宁等。两种药物均有杀虫活性，且分别可通过浸泡或者注射的方法达到对感染异阿脑虫的水产动物预防或者治疗目的。但甲醛和硫酸奎宁均为广谱的抗虫药物，其对纤毛虫的防治效果并不理想。而且，2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中，将甲醛放在一类致癌物列表中。2019年7月23日，甲醛被列入有毒有害水污染物名录(第一批)。而且硫酸奎宁的过量使用也会引起水产养殖环境恶化与水产品质的破坏。
发明内容
本发明的目的是提供一种防治水产动物致病纤毛虫的方法，从而弥补现有技术的不足，保证越冬三疣梭子蟹的存活率。
本发明提供葡萄糖的一种用途，是在防治水产养殖环境中的致病纤毛虫中的应用。
所述的致病纤毛虫是水体养殖环境或用品中存在的致病纤毛虫；
所述的致病纤毛虫，作为实施例的具体记载，为异阿脑虫(Mesanophrys sp.)；
更进一步的，所述的水体养殖环境或用品，为三疣梭子蟹养殖水体或养殖用具。
本发明还提供葡萄糖在制备用于预防治疗水产动物致病纤毛虫的制品中的用途；
本发明再一个方面还提供一种预防或治疗预防治疗水产动物致病纤毛虫的方法，所述的方法是为了非疾病诊断治疗目的；
所述的方法，是使用浓度不低于浓度0.5mM的葡萄糖溶液来处理纤毛虫。
本发明发现葡萄糖对三疣梭子蟹致病纤毛虫异阿脑虫有致死作用，且最低致死浓度0.5mM(90mg/L)，其对异阿脑虫的致死浓度与当前氨基糖苷类抗生素的使用浓度(～100mg/L)相当，且不会产生抗生素耐药性及抗生素不当使用带来的环境及水产品影响。与甲醛、硫酸奎宁等广谱杀虫药相比，葡萄糖所引起的致死作用在生物中未有报道，说明其具有物种特异性。本方法与已报道的杀虫方法相比，具备特异性、高效性与环境安全性。
附图说明
图1：终浓度10mM、5mM、2mM和1mM葡萄糖对异阿脑虫的影响图，
图2：终浓度0.5mM葡萄糖对异阿脑虫的影响图，
图3：终浓度0.2mM、0.1mM葡萄糖对异阿脑虫的影响图，
图4：6h时间点终浓度10mM葡萄糖与对照组DAPI染色图，其中A表示终浓度10mM葡萄糖DAPI染色图片，黑色箭头所指异阿脑虫；B表示仅人工海水培养的异阿脑虫DAPI染色图片，黑色箭头所指异阿脑虫。
图5：6h时间点终浓度1mM葡萄糖与对照组DAPI染色图，其中A表示终浓度1mM葡萄糖DAPI染色图片，黑色箭头所指异阿脑虫；B表示仅人工海水培养的异阿脑虫DAPI染色图片，黑色箭头所指异阿脑虫。
图6：6h时间点终浓度1mM葡萄糖与终浓度1mM葡萄糖DAPI染色图，其中A表示终浓度10mM葡萄糖DAPI染色图片，黑色箭头所指异阿脑虫；B 表示终浓度1mM葡萄糖的异阿脑虫DAPI染色图片，黑色箭头所指异阿脑虫。
图7：24h时间点终浓度1mM葡萄糖与对照组DAPI染色图，其中A表示终浓度1mM葡萄糖DAPI染色图片，黑色箭头所指异阿脑虫；B表示仅人工海水培养的异阿脑虫DAPI染色图片，黑色箭头所指异阿脑虫。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：葡萄糖溶液对异阿脑虫的防治
设计终浓度10mM、5mM、2mM、1mM、0.5mM、0.02mM、0.01mM 葡萄糖实验组，设置实验组的阴性对照和空白对照。2mL培养体系(1.6mL人工海水+200μL葡萄糖溶液+200μL虫液)培养，每组设置三个平行。
培养液配置：人工海水(AS)高压灭菌，115℃，30min；葡萄糖溶液配置成浓度为1mol/L，并用0.22μm无菌滤膜抽滤灭菌后作为葡萄糖母液，梯度稀释到200mM、100mM、40mM、20mM、10mM、4mM、2mM实验所需浓度；从50mL广口烧瓶中取适量Leibovitz's L-15培养基20℃恒温培养下生长对数期(20000ind/mL)的异阿脑虫培养物；放入50mL离心管中与人工海水充分混匀后，均匀分装至无菌24孔细胞培养板中，使异阿脑虫数量为维持在1000 ind/mL，再加入不同浓度葡萄糖溶液100μL,放入20℃恒温培养箱中培养。
计数观察：每隔4h，每个孔样品用1mL移液枪吹打混匀，每孔取样20μL，在光学显微镜10倍镜下计数，并观察异阿脑虫的形态，活力的变化；直至异阿脑虫完全死亡为止。
DAPI染色：用双蒸水溶解DAPI染料，配制1-5mg/mL的储存液；使用时，用双蒸水或PBS稀释母液，配制成10μg/mL浓度的DAPI；以上述暴露于终浓度1mM、10mM葡萄糖的异阿脑虫为实验组，灭菌海水处理作为空白对照。每组设置3个平行，每6h染色镜检一次；分别取2mL实验组、对照组，异阿脑虫在24孔板中用浓度为10μg/mL的DAPI工作液避光染色，2mL细胞培养物中加入10μg/mL的DAPI染色液250μL，终浓度为1.1μg/mL DAPI，在避光条件下染色10min，必须充分覆盖住待染色的样品(确保每个活体细胞核都能够被染色)；染色后的2mL异阿脑虫溶液6000rpm×3min，4℃离心后去除培养基和有机质，加入1mL PBS重悬，重悬后6000rpm×3min，4℃离心去除未结合的DAPI；其余虫子继续置于20℃恒温培养箱中继续培养。
荧光观察，取20μL染色后样品置于载玻片上，在载玻片上加入5μL 1％戊二醛溶液固定，使用倒置荧光显微镜进行荧光现象观察，激发波长设置为360nm 与发射波长设置为460nm。
分析结果：最小致死浓度、致死时间、异阿脑虫形态、DAPI染色后荧光情况等。
本发明发现不同浓度葡萄糖对致病纤毛虫异阿脑虫有致死作用，且存在剂量效应关系。在0.5mM-10mM浓度下，LT50时间从24h降低到8h(图1、图 2)；低于0.02mM浓度条件下，异阿脑虫与对照组相比死亡趋势无显著差异(图 3)，表明低浓度条件下葡萄糖无毒性作用，也无促进作用。
葡萄糖对异阿脑虫造成的影响还体现在其对异阿脑虫细胞核造成破坏。其中10mM实验组6h时异阿脑虫的细胞核荧光基团减弱明显(图4)；1mM实验组6h时异阿脑虫的细胞核荧光基团与对照组相比荧光减弱(图5)；10mM、 1mM在6h时比较，10mM荧光基团明显弱于1mM，说明浓度越高细胞核浓缩的越快(图6)；1mM实验组24h时异阿脑虫细胞核荧光基团完全消失，异阿脑虫死亡，但躯体还未完全裂解(图7)。葡萄糖浓度越高，异阿脑虫细胞核受到的作用效果越快，效果也越显著。
综上，本发明发现葡萄糖对三疣梭子蟹致病纤毛虫异阿脑虫有致死作用，且最低致死浓度0.5mM(90mg/L)，其对异阿脑虫的致死浓度与当前氨基糖苷类抗生素的使用浓度(～100mg/L)相当，且不会产生抗生素耐药性及抗生素不当使用带来的环境及水产品影响。

Claims (7)

1.葡萄糖的一种用途，其特征在于，所述的用途是在防治水产养殖环境中的致病纤毛虫中的应用。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的水产养殖环境，是养殖水体或养殖用具。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的致病纤毛虫为异阿脑虫。
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的水产养殖环境，为三疣梭子蟹养殖水体或养殖用具。
5.葡萄糖在制备用于预防治疗水产动物致病纤毛虫的制品中的应用。
6.一种预防或治疗预防治疗水产动物致病纤毛虫的方法，其特征在于，所述的方法，是使用浓度不低于浓度0.5mM的葡萄糖溶液来防治纤毛虫。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的葡萄糖溶液的浓度为1-10mM。
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