CN115436509B

CN115436509B - 一种叠氮化物叠氮取代率的检测方法

Info

Publication number: CN115436509B
Application number: CN202211026578.5A
Authority: CN
Inventors: 朱丹丹; 贺娇; 何平; 赵宣
Original assignee: Liaoning Kai Kai Technology Co ltd
Current assignee: Liaoning Kai Kai Technology Co ltd
Priority date: 2022-08-25
Filing date: 2022-08-25
Publication date: 2023-03-10
Anticipated expiration: 2042-08-25
Also published as: CN115436509A

Abstract

本发明公开了一种叠氮化物的检测方法，特别是一种叠氮取代率的定量检测方法。该方法采用DBCO试剂(特别是DBCO‑丁酸)作为衍生试剂来检测药物中叠氮基团，进一步通过衍生化试剂的减少量来定量叠氮基团的含量，该方法准确性高、特异性强、灵敏度高、重复性好，通过外标定量计算方法，在线性范围内更准确的检测了产品叠氮的取代率，从而更好的解决样品叠氮取代率检测问题及杂质控制问题，可以对叠氮化物的控制提供有力的辅助。

Description

一种叠氮化物叠氮取代率的检测方法

技术领域

本发明涉及化学品分析技术领域，特别涉及一种叠氮化物叠氮取代率的检测方法。

背景技术

聚乳酸是一种无毒、无刺激性，具有良好的生物安全性和可降解性的生物材料，已被广泛应用于骨固定修复材料、组装工程支架材料、药物控制释放载体等生物医用材料领域。然而，聚乳酸材料疏水性强，这降低了它与其它物质的生物相容性。

人们开发出了一种Azide～(Amide～linker)～PEG～b～PLA聚合物，结构式为

该叠氮化物不仅保留了聚乳酸原有的易降解、无毒无刺激的优良性质，还在连接子中引入了PEG基团，大幅提高了该聚乳酸聚合物的亲水性，叠氮基团的引入进一步拓宽了该聚合物的应用领域，如表面改性、粘附、药物递送等。目前叠氮化物的检测方法主要有容量分析法、紫外分光光谱分析法、GC法、GC-MS法、HPLC法等，例如专利文献CN110514759A公开了一种坎地沙坦酯中叠氮化合物的检测方法，其采用HPLC法对叠氮化合物进行检测。但是，HPLC法面临一个重要挑战，叠氮基团没有紫外吸收，无法采用常规的紫外检测器直接对叠氮基团进行检测。

现有技术中，尚没有针对上述聚合物叠氮取代率的检测方法。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明旨在提供一种叠氮化物Azide～(Amide～linker)～PEG～b～PLA的检测方法，特别是一种叠氮取代率的定量检测方法。其能有效反映该聚合物的叠氮基团取代率，有利于对产品的质量进行控制。

本发明第一方面提供一种叠氮化物叠氮取代率的检测方法，所述方法包括如下步骤：

(1)使用式Ⅰ所示化合物与待测样品进行衍生化反应；

(2)将步骤(1)所得反应体系通过HPLC-UV进行检测；

其中，R₁具有以下结构：

G₁和G₂独立地选自：单键、-O-、-S-、-(C＝O)-、-O(C＝O)O-、-(C＝O)NH-、-NH(C＝O)-、-NH-、-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-S(O)x-，x为1或2；

L₁选自：C1-12亚烷基、

n选自1-10的整数(例如2、3、4、5、6、7、8、9)；

R₂选自：-H、羟基、羧基、巯基、硝基、氨基、

C1-6烷基。

进一步地，步骤(1)所述待测样品中含有叠氮化物。

在本发明的一个实施方式中，待测样品中主要包含叠氮化物。

在本发明另一个实施方式中，待测样品中主要包含目标产品，且含有叠氮化物。

在本发明的一个实施例中，G₁为-(C＝O)-。

进一步地，L₁选自C1-6亚烷基，例如亚甲基、亚乙基。

在本发明的一个实施例中，G₂为单键。

在本发明的一个实施例中，R₂为-COOH。

在本发明的一个实施例中，式Ⅰ所示化合物具有如下结构：

进一步地，步骤(1)中所述衍生化反应温度为20-35℃(例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35℃)，特别是25℃。

进一步地，步骤(1)中所述衍生化反应的时间为0.5-10小时(例如0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0小时)，特别是0.5-5小时，例如4小时。

进一步地，步骤(1)中所述衍生化反应可以在搅拌下进行。

进一步地，步骤(1)中所述化合物与叠氮基团的限度值的摩尔比为1-10:1(例如1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1)，特别是1-3:1，例如1:1。

进一步地，步骤(1)中所述衍生化反应体系中还包括有机溶剂；更具体地，该有机溶剂可以选自：二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)、N,N-二甲基丙酰胺(DMPA)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)等中的一种或多种；

在本发明的一个实施例中，该有机溶剂为DMSO。

进一步地，步骤(2)所述HPLC-UV的检测目标为式Ⅰ所示化合物(特别是式Ⅱ所示化合物)。通过检测衍生剂(例如DBCO-丁酸)的减少量来定量叠氮基团。

进一步地，步骤(2)在所述衍生化产物进样前还可以适当地包括稀释的步骤。

进一步地，步骤(2)所述衍生化产物的进样量为5-15μL(如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15μL)。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)所述衍生化产物的进样量为10μL

进一步地，步骤(2)所述衍生化产物的进样温度为20～40℃(如20、25、30、35、40℃)。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)所述衍生化产物的进样温度为25℃。

进一步地，所述叠氮化物为Azide～(Amide～linker)～PEG～b～PLA，其结构式为

其中，PEG部分的分子量为4500～5500道尔顿，优选地，所述的PEG部分的分子量为5000道尔顿；PLA部分的分子量为10000～20000道尔顿，优选地，所述的PLA部分的分子量为16000道尔顿；n为聚乙二醇残基的聚合度，m为聚乳酸残基的聚合度。

进一步地，所述的检测方法是通过高效液相色谱对叠氮化物进行检测，色谱条件为：

所述高效液相色谱的色谱柱的固定相为丁基硅烷键合硅胶。

所述固定相的粒度为2～15μm(如2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm)，优选地，所述固定相的粒度为2～5μm，更优选地，所述固定相的粒度为3.5μm。

所述固定相的孔径为

(如

)，优选地，所述固定相的孔径为

更优选地，所述固定相的孔径为

所述色谱柱的长度为100～300mm(如100mm、110mm、120mm、130mm、140mm、150mm、160mm、170mm、180mm、190mm、200mm、210mm、220mm、230mm、240mm、250mm、260mm、270mm、280mm、290mm、300mm)，优选地，所述色谱柱的长度为100～200mm，更优选地，所述色谱柱的长度为150mm。

所述色谱柱的直径为4～8mm(如4.6mm、7.8mm)，优选地，所述色谱柱的直径为4.6mm。

所述高效液相色谱的流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为三氟乙酸水溶液，流动相B为三氟乙酸的乙腈溶液，流动相A+流动相B＝100％。

所述流动相A的浓度为0.01～0.5％(体积百分比)(例如0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％)，优选地，所述流动相A的浓度为0.01～0.2％，更优选地，所述流动相A的浓度为0.1％。

所述流动相A中三氟乙酸与水的体积比为0.1～1:100，优选地，所述流动相A中三氟乙酸与水的体积比为0.1～100。

所述流动相B的浓度为0.01～0.5％(体积百分比)(例如0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％)，优选地，所述流动相B的浓度为0.01～0.2％，更优选地，所述流动相B的浓度为0.1％。

所述流动相B中三氟乙酸与乙腈的体积比为0.1～1:100，优选地，所述流动相A中三氟乙酸与乙腈的体积比为0.1～100。

所述流动相的流速为0.5～1.5mL/min(如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5mL/min)，优选地，所述流动相的流速为0.8～1.2mL/min，更优选地，所述流动相的流速为1.0mL/min。

所述色谱柱的柱温为30～50℃(如30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃)，优选地，所述色谱柱的柱温为35～45℃，更优选地，所述色谱柱的柱温为38～42℃。

在本发明的一个实施例中，所述色谱柱的柱温为40℃。

进一步地，所述高效液相色谱的进样量为5～15μL(如5、8、9、10、11、12、15μL)，优选地，所述高效液相色谱的进样量为8～12μL。

在本发明的一个实施方式中，所述高效液相色谱的进样量为10μL。

进一步地，所述的高效液相色谱采用梯度洗脱程序，所述梯度洗脱程序如下：

洗脱时间为0分钟时，流动相的体积浓度：流动相A：75～85％，流动相B：余量；

洗脱时间为0～20分钟时，流动相的体积浓度：流动相A：由75～85％梯度变化为35～45％，流动相B：余量；

洗脱时间为20～25分钟时，流动相的体积浓度：流动相A：由35～45％梯度变化为2～10％，流动相B：余量；

洗脱时间为25～30分钟时，保持等度洗脱，流动相的体积浓度：流动相A：2～10％，流动相B：余量；

洗脱时间为30～31分钟时，流动相的体积浓度：流动相A：由2～10％梯度变化为75～85％，流动相B：余量；

洗脱时间为31～40分钟时，保持等度洗脱，流动相的体积浓度：流动相A：75～85％，流动相B：余量。

在本发明的一个实施方式中，所述梯度洗脱程序如下：

洗脱时间为0分钟时，流动相的体积浓度：流动相A：80％，流动相B：余量；

洗脱时间为0～20分钟时，流动相的体积浓度：流动相A：由80％梯度变化为40％，流动相B：余量；

洗脱时间为20～25分钟时，流动相的体积浓度：流动相A：由40％梯度变化为5％，流动相B：余量；

洗脱时间为25～30分钟时，保持等度洗脱，流动相的体积浓度：流动相A：5％，流动相B：余量；

洗脱时间为30～31分钟时，流动相的体积浓度：流动相A：由5％梯度变化为80％，流动相B：余量；

洗脱时间为31～40分钟时，保持等度洗脱，流动相的体积浓度：流动相A：80％，流动相B：余量。

进一步地，洗脱时间为20～60min(如20、25、30、35、40、45、50、55、60min)，优选为30～50min。

在本发明的一个实施方式中，所述的洗脱时间为40min。

进一步地，所述高效液相色谱中的高效液相色谱仪可以为岛津LC-20AD XR高效液相色谱仪。

进一步地，上述检测可以为定性检测或定量检测。

进一步地，上述定量检测可以为对叠氮基团含量的定量检测。

进一步地，上述定量检测可以通过衍生化前后式Ⅰ所示化合物(特别是式Ⅱ所示化合物)的减少量来得到叠氮基团的含量。

进一步地，上述定量检测采用外标法进行。

进一步地，所述高效液相色谱的检测器为紫外检测器。

进一步地，所述紫外检测器的检测波长为200-300nm(例如200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、270、280、290、300nm)，优选为220～270nm，更优选为254nm。

本发明第二方面提供一种式Ⅰ所示化合物作为衍生化试剂在叠氮化物的检测中的应用，

其中，R₁具有以下结构：

L₁选自：C1-12亚烷基、

n选自1-10的整数(例如2、3、4、5、6、7、8、9)；

R₂选自：-H、羟基、羧基、巯基、硝基、氨基、

C1-6烷基。

在本发明的一个实施例中，G₁为-(C＝O)-。

进一步地，L₁选自C1-6亚烷基，例如亚甲基、亚乙基。

在本发明的一个实施例中，G₂为单键。

在本发明的一个实施例中，R₂为-COOH。

在本发明的一个实施例中，式Ⅰ所示化合物具有如下结构：

进一步地，上述叠氮化物为Azide～(Amide～linker)～PEG～b～PLA，其结构式为

进一步地，所述检测通过HPLC-UV进行。

本发明公开了一种叠氮化物的检测方法，特别是一种叠氮取代率的定量检测方法。该方法采用DBCO试剂(特别是DBCO-丁酸)作为衍生试剂来检测药物中叠氮基团，进一步通过衍生化试剂的减少量来定量叠氮基团的含量，其反应选择性高，无干扰，反应条件温和，易于操作；该方法简单、快捷，无需昂贵的荧光试剂，是无紫外吸收的叠氮化物检测的有效方法，且该方法准确性高、特异性强、灵敏度高、重复性好，通过外标定量计算方法，在线性范围内更准确的检测了产品叠氮的取代率，从而更好的解决样品叠氮取代率检测问题及杂质控制问题，可以对叠氮化物的控制提供有力的辅助。

附图说明

图1为聚合物Azide～(Amide～linker)～PEG5000～b～PLA16K的核磁谱图。

图2为空白溶液的液相色谱图。

图3为样品溶液的液相色谱图(Azide-(Amide-linker)-PEG5K-b-PLA16K样品衍生后色谱图)。

图4为线性对照品溶液的线性关系图。

图5为实施例2条件下样品溶液的液相色谱图(Azide-(Amide-linker)-PEG5K-b-PLA16K样品衍生后色谱图)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本申请实施例中所述的叠氮化物Azide～(Amide～linker)～PEG5000～b～PLA16K，来源键凯科技公司，其结构式为

其中，n为聚乙二醇残基的聚合度，m为聚乳酸残基的聚合度，PEG部分的分子量为5000道尔顿；PLA部分的分子量为16000道尔顿。

叠氮化物Azide～(Amide～linker)～PEG5000～b～PLA16K的表征结果如下：

1、核磁表征：

叠氮化物Azide～(Amide～linker)～PEG5000～b～PLA16K的核磁谱图如图1所示。

2、黏度表征：

采用毛细管方法对叠氮化物Azide～(Amide～linker)～PEG5000～b～PLA16K进行黏度表征，测得其黏度为0.32dL/g。

实施例1 Azide-(Amide-linker)-PEG5K-b-PLA16K叠氮取代率的检测

采用本发明所述检测方法，具体实施方式如下：

1、HPLC仪器及方法参数

仪器：岛津LC-20AD XR高效液相色谱仪

检测器：SPD-M40紫外检测器，254nm

色谱柱：丁基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Xbridge Protein BEH C4，4.6×150mm,3.5μm,300A)

流动相A：采用0.1％三氟乙酸水溶液作为流动相A。

流动相B：采用0.1％三氟乙酸乙腈溶液作为流动相B。

按如下表进行梯度洗脱：

洗脱程序

时间	流动相A	流动相B
			0	80	20
20	40	60
			25	5	95
30	5	95
			31	80	20
40	80	20

流速：1.0mL/min。

柱温：40℃。

进样量：10μL。

工作站：Labsolution

2、溶液配制

空白溶液：水；其液相色谱图如图2所示。

对照品储备液：精密称定约100mgHO-5K-PDBCODI(HO-PEG5K-OH与DBCO合成所得)，置于10mL容量瓶中，加入适量水溶解，再加入水定容至刻度，摇匀，得到10mg/mL储备液。

二苯基环辛炔-羧酸衍生溶液配制：精密称定30mg二苯基环辛炔-羧酸置于10mL容量瓶中，加入适量二甲基亚砜溶解，再加入二甲基亚砜定容至刻度。

线性对照品溶液：分别准确移取10mg/mL对照品储备液0.05mL、0.1mL、0.25mL、0.5mL、1mL、1.5mL至5mL容量瓶，加入水定容至刻度，摇匀，得到0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL线性对照品溶液，进样量10μL对应的摩尔数分别为0.2nmol、0.4nmol、1nmol、2nmol、4nmol、6nmol；线性对照品溶液的线性关系图如图4所示。

样品溶液：精密称取100mgAzide-(Amide-linker)-PEG5K-b-PLA16K于10mL容量瓶中，按照8倍摩尔比加入二苯基环辛炔-羧酸衍生溶液，用二甲基亚砜定容至刻度，充分混匀溶解，室温衍生4小时后进样；样品溶液的液相色谱图如图3所示。

外标法计算得到Azide-(Amide-linker)-PEG5K-b-PLA16K叠氮取代率。

实施例2色谱梯度的选择

仪器：岛津LC-20AD XR高效液相色谱仪

检测器：SPD-M40紫外检测器，254nm

流动相A：采用0.1％三氟乙酸水溶液作为流动相A。

流动相B：采用0.1％三氟乙酸乙腈溶液作为流动相B。

按如下表进行梯度洗脱：

洗脱程序

流速：1.0mL/min。

柱温：40℃。

进样量：10μL。

工作站：Labsolution

图5为实施例2条件下样品溶液的液相色谱图(Azide-(Amide-linker)-PEG5K-b-PLA16K样品衍生后色谱图)，可以看出，当采用实施例2的梯度程序进行洗脱时，其效果不如实施例1(见图3)，其样品的分离度和峰形与实施例1相比均较差，因此选用实施例1所示的洗脱程序参数进行梯度洗脱。

Claims

1.一种叠氮化物叠氮取代率的检测方法，所述方法包括如下步骤：

（1）使用式Ⅰ所示化合物与待测样品进行衍生化反应；

（2）将步骤（1）所得反应体系通过HPLC-UV进行检测；

式Ⅰ

；

其中，R₁具有以下结构：

；

G₁和G₂独立地选自：-O-、-S-、-(C=O)-、-O(C=O)O-、-(C=O)NH-、-NH(C=O)-、-NH-、-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-S(O)x-，x为1或2；

L₁选自：C_1-12亚烷基、

，n选自1-10的整数；

R₂选自：-H、羟基、羧基、巯基、硝基、氨基、

、

、C_1-6烷基，

其中，步骤（1）所述待测样品中含有叠氮化物，

所述叠氮化物为Azide~(Amide~linker)~PEG~b~PLA，其结构式为

，n为聚乙二醇残基的聚合度，m为聚乳酸残基的聚合度，PEG部分的分子量为4500~5500道尔顿；PLA部分的分子量为10000~20000道尔顿，

步骤（1）中所述衍生化反应温度为20-35℃，

步骤（1）中所述衍生化反应的时间为0.5-10小时，

步骤（1）中所述化合物与叠氮基团的限度值的摩尔比为1-10:1，

步骤（1）中所述衍生化反应体系中还包括有机溶剂，该有机溶剂选自：二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基丙酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的一种或多种；

所述检测为定性检测或定量检测，所述定量检测为对叠氮基团含量的定量检测，所述定量检测是通过衍生化前后式Ⅰ所示化合物的减少量来得到叠氮基团的含量，

所述定量检测采用外标法进行，

所述的检测方法是通过高效液相色谱对叠氮化物进行检测，

色谱条件为：

所述高效液相色谱的色谱柱的固定相为丁基硅烷键合硅胶；

所述固定相的粒度为2~5μm，

所述固定相的孔径为270~330 Å，

所述色谱柱的长度为100~200mm，

所述色谱柱的直径为4~8mm，

所述高效液相色谱的流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为0.1%的三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1%的三氟乙酸的乙腈溶液，流动相A+流动相B=100%；

所述流动相的流速为0.5~1.5mL/min；

所述色谱柱的柱温为30~50℃，

梯度洗脱程序如下：

洗脱时间为 0分钟时，流动相的体积浓度：流动相A：80%，流动相B：余量；

洗脱时间为0~20分钟时，流动相的体积浓度：流动相A：由80%梯度变化为40%，流动相B：余量；

洗脱时间为20~25分钟时，流动相的体积浓度：流动相A：由40%梯度变化为5%，流动相B：余量；

洗脱时间为25~30分钟时，保持等度洗脱，流动相的体积浓度：流动相A：5%，流动相B：余量；

洗脱时间为30~31分钟时，流动相的体积浓度：流动相A：由5%梯度变化为80%，流动相B：余量；

洗脱时间为31~40分钟时，保持等度洗脱，流动相的体积浓度：流动相A：80%，流动相B：余量。

2.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的L₁选自C_1-6亚烷基，R₂为-COOH。

3.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述化合物具有如下结构：

。

4.式Ⅰ所示化合物作为衍生化试剂在叠氮化物的检测中的应用，

式Ⅰ

；

其中，所述的检测为采用如权利要求1-3任意一项所述的检测方法进行检测，R₁具有以下结构：

；

G₁和G₂独立地选自： -O-、-S-、-(C=O)-、-O(C=O)O-、-(C=O)NH-、-NH(C=O)-、-NH-、-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-S(O)x-，x为1或2；

L₁选自：C_1-12亚烷基、

，n选自1-10的整数；

R₂选自：-H、羟基、羧基、巯基、硝基、氨基、

、

、C_1-6烷基；

所述叠氮化物为Azide~(Amide~linker)~PEG~b~PLA，其结构式为

，n为聚乙二醇残基的聚合度，m为聚乳酸残基的聚合度。

5.权利要求4所述的应用，其特征在于，所述化合物具有如下结构：

。

6.权利要求4所述的应用，其特征在于，所述叠氮化物中PEG部分的分子量为4500~5500道尔顿，PLA部分的分子量为10000~20000道尔顿。

7.权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的PEG部分的分子量为5000道尔顿，所述的PLA部分的分子量为16000道尔顿。