CN115429741B - 微针注射mRNA疫苗及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种微针注射mRNA疫苗及其应用,发现采用微针注射能提高mRNA疫苗的注射部位表达量,降低肝脏等其他脏器和组织的表达量,能延长mRNA疫苗在体内的表达时间,并能以低剂量mRNA疫苗在生物体内实现高抗体滴度,该疫苗由包含病毒mRNA、氨基丁三醇、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐等的水相溶液,以及包裹该水相溶液的脂质溶液组成;通过改进水相溶液和脂质溶液的配方,并调节水相溶液pH控制在5.5,脂质溶液中的脂质含量提高至10~20mg/mL,能够大幅提高载药量,降低试剂辅料用量,用量更少,毒副作用更小,免疫效果更好,真正实现mRNA疫苗的微针经皮给药,并具有潜在的降毒增效的应用前景。
Description
本申请主张中国在先申请,申请号:202111504624.3,申请日2021年12月10日的优先权;主张中国在先申请,申请号: 202210661776.2,申请日2022年6月13日的优先权,其所有的内容作为本发明的一部分。
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体而言,涉及一种微针注射mRNA疫苗及其应用。
背景技术
裸露的mRNA直接进入体内会被降解,如何把mRNA有效地递送到细胞内,实现高效、安全的mRNA递送,从而完成蛋白的翻译制造,是mRNA药物药效的保证。脂质纳米颗粒(LNP)是指将药物包封于内形成的微型泡囊体,可以保护RNA不被核糖核酸酶降解、可被细胞特异性摄取、进入细胞质后能及时从内涵体中释放,使得递送的mRNA能够有效表达成目标蛋白,常用作相应药物的递送载体,现在已经发展成为成熟的一类新型制剂。与传统的单层脂质体(Liposomes)或脂质囊泡(Vesicles)等相比,纳米脂质颗粒有更为复杂的微观结构,脂质纳米颗粒主要由胆固醇、磷脂、聚乙二醇修饰脂质、阳离子脂质等的组成,被认为在药理学上无活性且毒性小,也被认为具有一定的自佐剂功能,脂质纳米颗粒递送系统具有综合优势; 但当前的脂质纳米颗粒药物递送系统也具有明显的局限性,例如缺乏靶向选择性、血液循环时间短和体内不稳定性。据一些研究,在某些情况下脂质纳米颗粒不完全是免疫惰性的,而脂质纳米颗粒成分是非天然化合物,如聚乙二醇修饰脂质,可能特定情况下可能对人体有潜在刺激性或毒性,例如在个别情况下引起严重不良反应等问题和隐患。
现有的脂质纳米颗粒注射试剂通常是通过静脉、肌肉或者皮下注射,静脉注射存在一些难以克服的问题,比如:需要有一定的注射量才能产生作用;可能引起血管的损伤;注射药物可能会引起血管内膜的炎症或其他部位组织的炎症;给患者带来疼痛;需医护帮忙完成注射,使用不方便;核酸在体内表达量低等问题。而且现有的脂质纳米颗粒普遍采用肌肉、皮下注射,具有药物利用率较低、起效慢等局限性。
微针给药是一种新型的局部经皮给药技术,结合了贴膏剂的便捷性和皮内注射给药的有效性,规避了其它给药方式的不足,具有不触及神经、安全、无痛、高效渗透等多种优点。微针制品通常包括多根长度一般不超过1mm的微针,所述微针能够在皮肤角质层形成微型通道,突破皮肤角质层的阻隔,促进药物的渗透,从而减少药物在角质层的蓄积量,增加到达表皮、真皮及皮下组织的药物剂量。因此微针制品被广泛应用于促进小分子、大分子药物的透皮吸收,具有广泛的应用前景。另外,微针制品的使用极为方便,不需要专业培训,患者可以自行给药,意外针刺伤风险低,意外伤害可能小,且使用后易于处理。
现有的mRNA疫苗普遍是采用肌肉或静脉注射方式,免疫效果仍不理想,同时还增加了肝脏的负担,存在毒性,因此急需找到具有更好免疫效果,更适合于mRNA疫苗的注射方式,并改进mRNA疫苗的试剂配方,来提高免疫效果。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供了一种微针注射mRNA疫苗及其应用,发现采用微针注射能提高mRNA疫苗的肌肉表达量,降低肝脏表达量,延长mRNA疫苗在体内的表达时间,并能以低剂量mRNA疫苗在生物体内实现高抗体滴度,该疫苗由包含病毒mRNA、氨基丁三醇、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐等的水相溶液,以及包裹该水相溶液的脂质溶液组成;通过改进水相溶液和脂质溶液的配方,并调节水相溶液pH控制在5.5,脂质溶液中的脂质含量提高至10~20mg/mL,能够大幅提高载药量,降低试剂辅料用量,用量更少,毒副作用更小,免疫效果更好,真正实现mRNA疫苗的微针经皮给药,并具有潜在的降毒增效的应用前景。
一方面,本发明提供了微针在用于制备提高mRNA疫苗的注射部位表达量,降低肝脏表达量的mRNA疫苗注射用具的用途。
本发明经研究证明,通过微针注射mRNA疫苗后,mRNA主要集中在注射部位的皮肤与肌肉处表达,较少出现在肝脏和脾上表达;而采用肌肉注射mRNA疫苗后,mRNA则主要表达在肝脏和脾上。
本发明所述的“微针”和普通注射器具有区别,可以表示针头很短,或者药物试剂很少,例如采用微流通道,例如1-999微米的通道,或者用量在采用微升或者微克作为剂量单位,例如1-10微克,或者0.1-200微升。或者当采用微针注射的时候,采用微升级别的量通过微流控通道逐渐注射到人体的浅表组织部位,比如皮下、皮内或者肌肉组织等等。
研发小组经前期研究发现,与肌肉注射等其他注射方式相比,微针注射所到达的真皮中含有丰富的抗原呈递细胞,这种免疫细胞对于启动免疫反应至关重要,能够在免疫反应过程中发挥作用,故通过微针递送免疫类抗肿瘤药物具有增强疗效的潜力,且主要增强真皮的免疫效果,并不增加肝脏和脾上的表达,甚至相比肌肉注射还会降低肝脏的表达,为生物体对抗病毒提供更坚强的保护,却对内脏器官更加安全,具有显著的降毒增效的作用,从而实现局部给药,减少药物对其他脏器和组织的潜在毒性。
进一步地,所述mRNA疫苗包括水相溶液和脂质溶液,脂质溶液用于包裹水相溶液中的mRNA等物质;其中,水相溶液包括用于编码抗原的mRNA和缓冲液,缓冲液中包括氨基丁三醇和三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐;所述缓冲液pH为4~6。
微针可以真正实现无痛给药,但微针皮内注射的方式为小体积给药,因皮内组织结构的特定限制(图1),单次注射的试剂量非常小,对于提高有效药物浓度有客观需求,给药体积非常有限,如小鼠模型的给药体积不能超过200,优选控制在50/>以内,因为单次药物注射剂量偏高的试剂经皮吸收效率降低,甚至会使注射部位肿胀,给药困难。
现有的mRNA疫苗试剂的载药量较低,在生物体内要达到治疗效果所需要的用量较大(微针给药对药物的量需要控制在mg内),进行微针给药困难,而且存在试剂用量大给患者带来潜在的毒副作用增加的危害隐患。因此需要开发一种载药量更高、用量和毒副作用更低、免疫效果更好的,既可以预防也可以起到治疗作用的微针注射mRNA疫苗试剂,比如微针注射新型冠状病毒mRNA疫苗试剂,该试剂可以让人体或者哺乳动物产生抗体,用于抵抗病毒的感染或者治疗病毒感染的人体或者哺乳动物。
本发明所述载药量是指单位体积的药物试剂中mRNA的含量。
比如,现有新型冠状病毒mRNA试剂配方的载药量较低,导致同等剂量时所需的给药试剂体积偏大,小鼠模型中单次注射剂量超过50,微针给药过程中容易出现肿胀漏液,难以进行微针给药,同时由于载药量低,使较多的大分子辅料带入体内,副作用风险高。因此为了实现新型冠状病毒mRNA的微针给药,必须提高新型冠状病毒mRNA试剂的载药量。
另外,微针给药试剂的载药量低将直接影响微针治疗效果,如能提高单位体积中的药物含量,即提高载药量,也将大幅提升微针给药的疗效。
本发明通过改进mRNA疫苗试剂的水相溶液配方和pH,使微针皮内注射试剂配方中的mRNA载药量显著提升,同等辅料物质的量下,提高单位体积mRNA载药量,可以有效减少同等剂量下的给药制剂体积,成功实现微针皮内给药,并获得显著的免疫治疗效果,同时相应地减少了进入体内的大分子辅料等的量,在一定程度上降低辅料可能带来的副反应,如有效减少PEG等成分在其他脏器或组织等中的免疫刺激作用。
在一些方式中,本发明经研究证明,相比于现有的含有三甲胺、盐酸三乙胺等成分的水相溶液配方,采用本发明提供的含有氨基丁三醇和三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐的水相溶液配方能显著提升注射试剂的载药量,从而能真正实现微针给药,同时该试剂具有非常好的稳定性,可长期保存,其中的mRNA含量等药物成分含量稳定,有良好的临床应用条件。
另外,本发明发现,维持水相溶液合适的pH值,也能显著提升用于微针皮内注射的mRNA疫苗的载药量,若将pH调至4~6等偏酸性范围内,能使脂质体中负载的mRNA含量显著提升,并在特定pH条件下,即pH5.5时达到最优。其原因可能是,在制备时,在偏酸环境可以使得可电离阳离子脂质带正电荷,同等条件下可以吸附更多核酸分子(如mRNA等,本身带负电荷),且这种最优是在水相制备溶液为pH5.5时体现,相比于pH7.4或pH4等条件下的缓冲液,pH5.5时可以更加有效荷载核酸分子,达成相对稳定的可用制剂,因此载药量更高。
进一步地,所述缓冲液中还包括冰乙酸、三水乙酸钠和DEPC水,所述缓冲液pH为5.5。
进一步地,所述缓冲液中的氨基丁三醇:三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐:冰乙酸:三水乙酸钠:DEPC水的质量比为99.2:377.6:13.76:64:40。
本发明提供的水相溶液配方必须严格按照特定比例配置,才能维持在较高的载药量。
进一步地,所述脂质溶液中的脂质含量为10~20mg/mL,所述脂质包括可电离阳离子脂质、胆固醇、磷脂和PEG化脂质。
进一步地,所述脂质包括可电离阳离子脂质、胆固醇、磷脂和PEG化脂质。
本发明经大量研究证明,通过调控试剂中的脂质含量,也可显著提高脂质体的载药量。所述脂质包括胆固醇、可电离阳离子脂质、磷脂和PEG化脂质,是一种复合脂质体;提高脂质含量,是指同时提高胆固醇、可电离阳离子脂质、磷脂和PEG化脂质四种成分的含量,使脂质溶液中的脂质含量从最初的7.72mg/mL提高到10~20mg/mL,最优选为15.44mg/mL,可使脂质制剂体系的载药量由29.39左右至少提高到157.75/>左右。
进一步地,所述可电离阳离子脂质选自以下的一种或几种:C12-200、MC3、DLinDMA、DLin-MC3-DMA、DLinkC2DMA、cKK-E12、ICE、HGT5000、HGT5001、OF-02、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA、DMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、SM-102、ALC-0315、HGT4003;所述磷脂选自以下的一种或几种:神经酰胺、脑磷脂、脑苷脂、二酰基甘油、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酰基甘油钠盐(DPPG)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG),1-棕榈酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、鞘磷脂;所述PEG化脂质选自以下的一种或几种:DMG-PEG1000、DMG-PEG1300、DMG-PEG1500、DMG-PEG1800、DMG-PEG2000、DMG-PEG2200、DMG-PEG2500、DMG-PEG2700、DMG-PEG3000、DMG-PEG3200、DMG-PEG3500、DMG-PEG3700、DMG-PEG4000、DMG-PEG4200、DMG-PEG4500、DMG-PEG4700、DMG-PEG5000、ALC-0159、C8-PEG、DOGPEG、神经酰胺PEG和DSPE-PEG。
进一步地,所述可电离阳离子脂质为SM-102(十七烷-9-基-8-((2-羟乙基)(6-氧代-6-((十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯));磷脂为DSPC(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱);PEG化脂质为DMG-PEG(1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000),其PEG分子量范围可为1000~5000Da;可电离阳离子脂质:胆固醇:磷脂:PEG化脂质的质量比为(9~10):(3~4):(2~3):1。
进一步地,所述PEG化脂质为DMG-PEG2000;所述SM-102:胆固醇:DSPC:DMG-PEG2000的质量比为141.36:59.26:31.44:14.97。
进一步地,所述编码抗原的mRNA为编码新型冠状病毒的S蛋白的mRNA。
在一些方式中,编码新型冠状病毒S蛋白的mRNA为S protein-mRNA(表达新型冠状病毒的S蛋白的序列),购自阿法纳生物公司,Lot:2011092101
本发明经大量研究证明,通过微针注射新型冠状病毒mRNA疫苗,不仅用量低,而且具有更好的免疫效果。
在一些方式中,对于人体的注射剂量可以根据临床试验结果来进一步确认。
本发明提供的微针注射mRNA疫苗通过微流控纳米药物制备系统制得。
通过该方法制备的微针注射mRNA疫苗制剂良好的纳米药物特性,所制备得到的纳米载体的颗粒尺度、粒径分布、制剂稳定性等基本性能数据均实现了极好的参数控制,具备优异药物递送载体的微观结构基础;在细胞生物学水平的功能验证中,展现了极好的生物相容性、高度的核酸包载性能、优异的基因转染表达效率,安全且有效地实现了mRNA功能基因的包载、递送和表达,显示了强大的生物药学潜能和商业开发前景;经微针给药在小鼠体内表达效果优异,较传统常用的尾静脉、肌肉注射明显延长表达时间,并能提高肌肉表达量,降低肝脏表达量,具有潜在的降毒增效的应用前景。
另一方面,本发明提供了微针在用于延长mRNA疫苗的体内的表达时间,提高低剂量mRNA疫苗的抗体滴度的mRNA疫苗注射用具的用途。
本发明经研究证明,通过微针注射mRNA疫苗,相比于肌肉或静脉注射,注射的剂量更少,但免疫效果却更好,而且还能显著延长mRNA在皮肤和肌肉上的表达时间。
进一步地,所述mRNA疫苗包括水相溶液和脂质溶液,脂质溶液用于包裹水相溶液的物质;其中,水相溶液包括用于编码抗原的mRNA和缓冲液,缓冲液中包括氨基丁三醇和三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐;所述缓冲液pH为5.5。
进一步地,所述脂质溶液中的脂质含量为10~20mg/mL,所述脂质包括可电离阳离子脂质、胆固醇、磷脂和PEG化脂质。
再一方面,本发明提供了一种试剂在制备用于微针注射的mRNA疫苗的用途,所述mRNA疫苗包括水相溶液和脂质溶液,脂质溶液用于包裹水相溶液的物质;其中,水相溶液包括用于编码抗原的mRNA和缓冲液,缓冲液中包括氨基丁三醇和三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐;所述缓冲液pH为4~6。
进一步地,所述缓冲液pH为5.5。
进一步地,所述脂质溶液中的脂质含量为10~20mg/mL,所述脂质包括可电离阳离子脂质、胆固醇、磷脂和PEG化脂质。
再一方面,本发明提供了缓冲液pH在制备高载药量的微针注射mRNA疫苗中的用途,所述mRNA疫苗包括水相溶液和脂质溶液,脂质溶液用于包裹水相溶液的物质;其中,水相溶液包括用于编码抗原的mRNA和缓冲液,缓冲液中包括氨基丁三醇和三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐;所述缓冲液pH为5.5。
再一方面,脂质溶液中的脂质含量在制备高载药量的微针注射mRNA疫苗中的用途,所述mRNA疫苗包括水相溶液和脂质溶液,脂质溶液用于包裹水相溶液的物质;其中,水相溶液包括用于编码抗原的mRNA和缓冲液,缓冲液中包括氨基丁三醇和三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐;所述脂质溶液中的脂质含量为10~20mg/mL,所述脂质包括可电离阳离子脂质、胆固醇、磷脂和PEG化脂质。
本发明具有以下有益效果:
(1)发现mRNA疫苗经微针注射能提高注射部位表达量,降低肝脏表达量,并能延长刺激相应抗体表达产生时间的用途;
(2)成功实现mRNA疫苗的微针皮内注射给药,所制备得到的纳米载体的颗粒尺度、粒径分布、制剂稳定性等基本性能数据均实现了极好的参数控制,具备优异药物递送载体的微观结构基础;
(3)采用含有氨基丁三醇和三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐等成分配制的缓冲液,显著提升用于微针皮内注射的mRNA疫苗的载药量;
(4)通过改变微针皮内注射mRNA疫苗中的缓冲液pH至5.5,显著提升载药量;
(5)通过提高微针皮内注射mRNA疫苗中的胆固醇、可电离阳离子脂质、磷脂和PEG化脂质的含量,使其载药量显著提升;
(7)具有非常好的稳定性,长期存放两年以上,其中的mRNA含量不会发生降解;
(8)在细胞生物学水平的功能验证中,展现了极好的生物相容性、高度的核酸包载性能、优异的基因转染表达效率,安全且有效地实现了mRNA功能基因的包载、递送和表达,显示了强大的生物药学潜能和商业开发前景;
详细说明
定义
除非另有定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语所具有的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同。以下参考文献为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义:生物化学与分子生物学词典(Dictionary of Biochemistryand Molecular Biology),(第2版) J. Stenesh (编著),Wiley-Interscience (1989);微生物学与分子生物学词典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology) (第3版),P. Singleton和D. Sainsbury (编著),Wiley-Interscience (2007);钱伯斯科技词典(Chambers Dictionary of Science and Technology) (第2版),P. Walker (编著),Chambers (2007);遗传学词汇(Glossary of Genetics) (第5版),R. Rieger等 (编著),Springer-Verlag (1991);以及哈珀柯林斯生物学词典(The HarperCollins Dictionaryof Biology),W.G. Hale 和 J.P. Margham,(编著),HarperCollins (1991)。
尽管与本文所描述的类似或等效的任何方法和组合物可用于本发明的实践或检验,但本文描述了优选的方法和组合物。出于本发明的目的,下面为了清楚和便于参考起见对以下术语加以定义:根据长期以来的专利法惯例,当在本申请包括权利要求书中使用不带数量指示的指称物时,表示“一或多”。术语“约”和“近似”用于本文中时是可互换的,并且一般应理解为是指一个给定数字周围的数字范围,以及所叙述的数字范围内的所有数字。此外,本文中的所有数值范围应理解为包括该范围内的各个整数。
核酸
术语“核酸”包括任何可以掺入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。根据本申请使用的示例性核酸包括但不限于DNA,RNA包括信使RNA(mRNA)、其杂交体、RNAi诱导剂、RNAi剂、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核酶、催化DNA、诱导三螺旋形成的RNA、适体、载体等,在本申请中详细描述。
术语“脱氧核糖核酸”、“DNA”或“DNA分子”是指由两条链(多核苷酸)组成的分子,每条链包含单体单元核苷酸。核苷酸通过一个核苷酸的糖与下一个核苷酸的磷酸基之间的共价键在链中彼此连接,产生交替的糖-磷酸基骨架。两条分开的多核苷酸链的含氮碱基与氢键结合在一起以制备双链DNA。
术语“核糖核酸”、“RNA”或“RNA分子”是指至少2个碱基-糖基-磷酸基组合串成的链。在一个实施例中,术语包括由核苷酸组成的化合物,其中糖部分是核糖。在另一个实施例中,末端包括其中主链被改性的RNA和RNA衍生物。在一个实施例中,RNA可能是以tRNA(转移RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、反义RNA、小抑制RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)和核酶的形式存在。siRNA和miRNA的用途已有描述(Caudy A A et al,Genes & Devel16: 2491-96andreferencescitedtherein)。另外,这些形式的RNA可以是单链、双链、三链或四链的绞合。在另一实施例中,术语也包括其他类型的主链但具有相同碱基的人造核酸。在另一实施例中,人造核酸为 PNA(肽核酸)。PNA含有肽主链和核苷酸碱基,并且能够在另一实施例中与DNA和RNA 分子结合。在另一实施例中,核苷酸为改性氧杂环丁烷。在另一实施例中,通过用硫代磷酸基键取代一个或以上磷酸二酯键来改性核苷酸。在另一实施例中,改性核酸包括本领域已知的天然核酸的磷酸基主链的任何其他变体。本领域普通技术人员熟悉硫代磷酸基核酸和PNA的用途,其描述,例如,Neilsen P E,CurrOpinStruct Biol 9:353-57;and Raz N Ket al BiochemBiophys Res Commun. 297:1075-84。核酸的生产和使用是本领域技术人员熟知的,其描述, Molecular Cloning,(2001),Sambrook and Russell,eds. And Methods in Enzymology: Methods for molecularcloningin eukaryotic cells (2003) Purchio and G. C. Fareed每个核酸衍生物代表本发明的单独实施例。
用于本文时,术语“核酸”包括以下的一种或多种类型:多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)以及任何其他类型的多核苷酸,其是嘌呤或嘧啶碱基或者修饰的嘌呤或嘧啶碱基(包括无碱基位点)的N-糖苷。术语“核酸”,用于本文时,也包括核糖核苷或脱氧核糖核苷的共价键合的聚合物,所述共价键合通常通过亚基之间的磷酸二酯键,但在有些情况下通过硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等键合。“核酸”包括单链和双链DNA以及单链和双链RNA。示例性核酸包括但不限于gDNA;hnRNA;mRNA;rRNA,tRNA,微小RNA(miRNA),小干扰RNA(siRNA),小核仁RNA(snoRNA),小核RNA(snRNA)和小时序RNA(stRNA)等,及其任何组合。
经过修饰的核苷酸
在一些方式中,所述的mRNA包括经过修饰的核苷酸,其中修饰的核苷酸选择如下一种或者几种核苷酸:2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、假尿苷、N-1-甲基-假尿苷、2-硫代尿苷以及2-硫代胞苷;甲基化碱基;插入碱基;2'-氟代核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖以及己糖;硫代磷酸基和5'-N-亚磷酰胺键。以及PCT/CN2020/074825,PCT/CN2020/106696中所描述的改性核苷酸进行修饰。
mRNA可以包括至少两种核苷酸。核苷酸可以是天然存在的核苷酸或修饰核苷酸。在一些实施例中,RNA分子包括约5种核苷酸至约5,000种核苷酸。在一些实施例中,RNA分子包括至少约5种核苷酸。在一些实施例中,RNA分子包括至多约5,000种核苷酸。在一些实施例中,RNA分子包括约5种核苷酸至约20种核苷酸、约5种核苷酸至约40种核苷酸、约5种核苷酸至约60种核苷酸、约5种核苷酸至约80种核苷酸、约5种核苷酸至约100种核苷酸、约5种核苷酸至约200种核苷酸、约5种核苷酸至约500种核苷酸、约5种核苷酸至约1,000种核苷酸核苷酸、约5种核苷酸至约2,000种核苷酸、约5种核苷酸至约5,000种核苷酸、约20种核苷酸至约40种核苷酸、约20种核苷酸至约60种核苷酸、约20种核苷酸至约80种核苷酸、约20种核苷酸至约100种核苷酸、约20种核苷酸至约200种核苷酸、约20种核苷酸至约500种核苷酸、约20种核苷酸至约1,000种核苷酸、约20种核苷酸至约2,000种核苷酸、约20种核苷酸至约5,000种核苷酸、约40种核苷酸至约60种核苷酸、约40种核苷酸至约80种核苷酸、约40种核苷酸至约100种核苷酸、约40种核苷酸至约200种核苷酸、约40种核苷酸约500种核苷酸、约40种核苷酸至约1,000种核苷酸、约40种核苷酸至约2000种核苷酸、约40种核苷酸至约5,000种核苷酸、约60种核苷酸至约80种核苷酸、约60种核苷酸至约100种核苷酸、约60种核苷酸至约200种核苷酸、约60种核苷酸至约500种核苷酸、约60种核苷酸至约1,000种核苷酸、约60种核苷酸至约2,000种核苷酸、约60种核苷酸至约5,000种核苷酸、约80种核苷酸至约100种核苷酸、约80种核苷酸至约200种核苷酸、约80种核苷酸至约500种核苷酸、约80种核苷酸至约1,000种核苷酸、约80种核苷酸至约2,000种核苷酸、约80种核苷酸至约5,000种核苷酸、约100种核苷酸至约200种核苷酸、约100种核苷酸至约500种核苷酸、约100种核苷酸至约1,000种核苷酸、约100种核苷酸至约2000种核苷酸、约100种核苷酸至约5,000种核苷酸、约200种核苷酸至约500种核苷酸、约200种核苷酸至约1,000种核苷酸、约200种核苷酸至约2000种核苷酸、约200种核苷酸约5000种核苷酸、约500种核苷酸至约1,000种核苷酸、约500种核苷酸至约2000种核苷酸、约500种核苷酸至约5,000种核苷酸、约1,000种核苷酸以约2000种核苷酸、约1,000种核苷酸至约5,000种核苷酸或约2000种核苷酸至约5,000种核苷酸。在一些实施例中,RNA分子包括约5种核苷酸、约20种核苷酸、约40种核苷酸、约60种核苷酸、约80种核苷酸、约100种核苷酸、约200种核苷酸、约500种核苷酸、约1,000种核苷酸、约2000种核苷酸或约5000种核苷酸。
mRNA可以包括至少一种本申请所述的修饰核苷酸。在一些实施例中,RNA分子包括约1种修饰核苷酸至约100种修饰核苷酸。在一些实施例中,RNA分子包括至少约1种修饰核苷酸。在一些实施例中,RNA分子包括至多约100种修饰核苷酸。在一些实施例中,RNA分子包括约1种修饰核苷酸至约2种修饰核苷酸、约1种修饰核苷酸至约3种修饰核苷酸、约1种修饰核苷酸至约4种修饰核苷酸、约1种修饰核苷酸至约5种修饰核苷酸、约1种修饰核苷酸至约10种修饰核苷酸、约1种修饰核苷酸至约20种修饰核苷酸、约1种修饰核苷酸至约100种修饰核苷酸、约2种修饰核苷酸至约3种修饰核苷酸、约2种修饰核苷酸至约4种修饰核苷酸、约2种修饰核苷酸至约5种修饰核苷酸、约2种修饰核苷酸至约10种修饰核苷酸、约2种修饰核苷酸至约20种修饰核苷酸、约2种修饰核苷酸至约100种修饰核苷酸、约3种修饰核苷酸至约4种修饰核苷酸、约3种修饰核苷酸至约5种修饰核苷酸、约3种修饰核苷酸至约10种修饰核苷酸、约3种修饰核苷酸至约20种修饰核苷酸、约3种修饰核苷酸至约100种修饰核苷酸、约4种修饰核苷酸至约5种修饰核苷酸、约4种修饰核苷酸至约10种修饰核苷酸、约4种修饰核苷酸至约20种修饰核苷酸、约4种修饰核苷酸至约100种修饰核苷酸、约5种修饰核苷酸至约10种修饰核苷酸、约5种修饰核苷酸至约20种修饰核苷酸、约5种修饰核苷酸至约100种修饰核苷酸、约10种修饰核苷酸至约20种修饰核苷酸、约10种修饰核苷酸至约100种修饰核苷酸或者约20种修饰核苷酸至约100种修饰核苷酸。在一些实施例中,RNA分子包括约1种修饰核苷酸、约2种修饰核苷酸、约3种修饰核苷酸、约4种修饰核苷酸、约5种修饰核苷酸、约10种修饰核苷酸、约20种修饰核苷酸或者约100种修饰核苷酸。
mRNA可以包括至少0.1%的修饰核苷酸。修饰核苷酸的分数可以计算为:修饰核苷酸的数量/核苷酸的总数*100%。在一些实施例中,RNA分子包括约0.1%修饰核苷酸至约100%修饰核苷酸。在一些实施例中,RNA分子包括至少约0.1%的修饰核苷酸。在一些实施例中,RNA分子包括至多约100%修饰核苷酸。在一些实施例中,RNA分子包括约0.1%修饰核苷酸至约0.2%修饰核苷酸、约0.1%修饰核苷酸至约0.5%改性核苷酸、约0.1%修饰核苷酸至约1%修饰核苷酸、约0.1%修饰核苷酸至约2%修饰核苷酸、约0.1%修饰核苷酸至约5%修饰核苷酸、约0.1%修饰核苷酸至约10%修饰核苷酸、约0.1%修饰核苷酸至约20%修饰核苷酸、约0.1%修饰核苷酸至约50%修饰核苷酸、约0.1%修饰核苷酸至约100%修饰核苷酸、约0.2%修饰核苷酸至约0.5%修饰核苷酸、约0.2%修饰核苷酸至约1%修饰核苷酸、约0.2%修饰核苷酸至约2%修饰核苷酸、约0.2%修饰核苷酸至约5%修饰核苷酸、约0.2%修饰核苷酸至约10%修饰核苷酸、约0.2%修饰核苷酸至约20%修饰核苷酸、约0.2%修饰核苷酸至约50%修饰核苷酸、约0.2%修饰核苷酸至约100%修饰核苷酸、约0.5%修饰核苷酸至约1%修饰核苷酸、约0.5%修饰核苷酸至约2%修饰核苷酸、约0.5%修饰核苷酸至约5%修饰核苷酸、约0.5%修饰核苷酸至约10%修饰核苷酸、约0.5%修饰核苷酸至约20%修饰核苷酸、约0.5%修饰核苷酸至约50%修饰核苷酸、约0.5%修饰核苷酸至约100%修饰核苷酸、约1%修饰核苷酸至约2%修饰核苷酸、约1%修饰核苷酸至约5%修饰核苷酸、约1%修饰核苷酸至约10%修饰核苷酸、约1%修饰核苷酸至约20%修饰核苷酸、约1%修饰核苷酸至约50%修饰核苷酸、约1%修饰核苷酸至约100%修饰核苷酸、约2%修饰核苷酸至约5%修饰核苷酸、约2%修饰核苷酸至约10%修饰核苷酸、约2%修饰核苷酸至约20%修饰核苷酸、约2%修饰核苷酸至约50%修饰核苷酸、约2%修饰核苷酸至约100%修饰核苷酸、约5%修饰核苷酸至约10%修饰核苷酸、约5%修饰核苷酸至约20%修饰核苷酸、约5%修饰核苷酸至约50%修饰核苷酸、约5%修饰核苷酸至约100%修饰核苷酸、约10%修饰核苷酸至约20%修饰核苷酸、约10%修饰核苷酸至约50%修饰核苷酸、约10%改性核苷酸至约100%修饰核苷酸、约20%修饰核苷酸至约50%修饰核苷酸、约20%修饰核苷酸至约100%修饰核苷酸或者约50%修饰核苷酸至约100%修饰核苷酸。在一些实施例中,RNA分子包括约0.1%修饰核苷酸、约0.2%修饰核苷酸、约0.5%修饰核苷酸、约1%修饰核苷酸、约2%修饰核苷酸、约5%修饰核苷酸、约10%修饰核苷酸、约20%修饰核苷酸、约50%修饰核苷酸、或约100%修饰核苷酸。
在反应中使用的核苷酸,例如核糖核苷酸(例如组合的ATP、GTP、CTP以及UTP)的总浓度在0.5mM至约500mM之间。在一些实施例中,核苷酸的总浓度为约0.5mM至约500mM。在一些实施例中,核苷酸的总浓度为至少约0.5mM。在一些实施例中,核苷酸的总浓度为至多约500mM。在一些实施例中,核苷酸的总浓度为约0.5mM至约1mM、约0.5mM至约5mM、约0.5mM至约10mM、约0.5mM至约50mM、约0.5mM至约100mM、约0.5mM至约200mM、约0.5mM至约300mM、约0.5mM至约500mM、约1mM至约5mM、约1mM至约10mM、约1mM至约50mM、约1mM至约100mM、约1mM至约200mM、约1mM至约300mM、约1mM至约500mM、约5mM至约10mM、约5mM至约50mM、约5mM至约100mM、约5mM至约200mM、约5mM至约300mM、约5mM至约500mM、约10mM至约50mM、约10mM至约100mM、约10mM至约200mM、约10mM至约300mM、约10mM至约500mM、约50mM至约100mM、约50mM至约200mM、约50mM至约300mM、约50mM至约500mM、约100mM至约200mM、约100mM至约300mM、约100mM至约500mM、约200mM至约300mM、约200mM至约500mM或者约300mM至约500mM。在一些实施例中,核苷酸的总浓度为约0.5mM、约1mM、约5mM、约10mM、约50mM、约100mM、约200mM、约300mM或者约500mM。
合成后处理
合成后可加入5'帽和/或3'尾。帽的存在可以提供对大多数真核细胞中发现的核酸酶的抗性。“尾”的存在可以用于保护mRNA免于核酸外切酶降解和/或调节蛋白质表达水平。
可以如下添加5'帽:第一,RNA末端磷酸酶从5'核苷酸中去除一个末端磷酸基,留下两个末端磷酸基;然后通过鸟苷酰转移酶将鸟苷三磷酸(GTP)加入到末端磷酸基中,产生5,5,5 三磷酸键;然后用甲基转移酶将鸟嘌呤的7-氮甲基化。帽结构的实例包括但不限于m7G(5')ppp(5'(A,G(5')ppp(5')A 和G(5')ppp(5')G。更多帽结构在已公布的美国申请No.US 2016/0032356 中进行了描述,阿什奎尔海克(Ashiqul Haque)等,“化学修饰的hCFTR mRNA在囊性纤维化小鼠模型中恢复肺功能”(ChemicallymodifiedhCFTR mRNAsrecuperate lung function in a mouse model of cysticfibrosis),科学报告(Scientific Reports)(2018)8:16776,以及科尔(Kore)等,“5'-端帽类似物的最新进展:合成和生物分支”(Recent Developments in 5’-Terminal Cap Analogs:SynthesisandBiological Ramifications)有机化学迷你读物(Mini-Reviews in Organic Chemistry)2008,5,179-192,其通过引用并入本申请。
尾结构可以包括聚(A)和/或聚(C)尾。mRNA的3'末端(例如,3'末端的10、20、30、40、50、60、70、80、90或100种核苷酸)上的聚-A尾可以包括至少50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的腺苷核苷酸。mRNA 的3'末端(例如,3'末端的10、20、30、40、50、60、70、80、90或100种核苷酸)上的聚-A尾可以包括至少50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%胞嘧啶核苷酸。
如本申请所述,添加5'帽和/或3'尾可以有助于检测体外合成期间产生的无效转录物,因为没有加帽和/或加尾,那些过早中止的mRNA转录物的大小可能太小而无法被检测到。因此,在一些实施例中,在测试mRNA纯度(例如,mRNA中存在的无效转录物的水平)之前,将5'帽和/或3'尾加入合成的mRNA中。在一些实施例中,在如本申请所述纯化mRNA之前,将5'帽和/或3'尾加入到合成的mRNA中。在其他实施例中,在如本申请所述纯化mRNA后,将5'帽和/或3'尾加入到合成的mRNA中。
除了以上方法外,加帽或者加尾的步骤是在从DNA体外转录为RNA的转录过程总完成的,这些方法都是本领域一般技术人员可以自由选择。
根据本发明合成的mRNA可以不需进一步纯化而使用。特别地,可以使用根据本发明合成的mRNA而无需去除短聚物的步骤。在一些实施例中,根据本发明合成的mRNA进一步纯化。根据本发明可以使用各种方法纯化合成的mRNA。例如,可以使用离心、过滤和/或色谱方法进行mRNA的纯化。在一些实施例中,合成的mRNA通过乙醇沉淀或过滤或色谱法、或凝胶纯化或任何其它合适的方法纯化。在一些实施例中,通过HPLC纯化mRNA。在一些实施例中,在标准酚:氯仿:异戊醇溶液中提取mRNA,这是本领域技术人员所熟知的。在一些实施例中,使用切向流过滤纯化mRNA。合适的纯化方法包括在US 2016/0040154、US 2015/0376220、于2018年2月27日提交的PCT申请PCT/US18/19954,名称为“用于纯化信使RNA的方法”以及于2018年2月27日提交的题为“纯化信使RNA的方法”的PCT申请PCT/US18/19978中所描述的方法,所有这些都通过引用并入本申请并且可以用于实施本发明。
在一些实施例中,mRNA在加帽和封尾之前被纯化。在一些实施例中,加帽和封尾之后纯化mRNA。在一些实施例中,加帽和封尾之前和之后均纯化mRNA。在一些实施例中,通过离心在加帽和封尾之前或之后或之前和之后均纯化mRNA。在一些实施例中,通过过滤在加帽和封尾之前或之后或之前和之后均纯化mRNA。在一些实施例中,通过切向流过滤(TFF)或通过色谱法在加帽和封尾之前或之后或之前和之后均纯化mRNA。
在一些方式中,加尾是伴随转录同时完成的,因此,也可以在加尾和加帽步骤完成后对核酸进行纯化,纯化的方法如前述的方法。所以,在一些方式中,纯化步骤应该都是在封尾之后。当然, mRNA也可以在加帽之前被纯化。当然也可以在转录之后就进行纯化。可以使用本领域可用的任何方法来检测和定量mRNA的全长或无效转录物。在一些实施例中,使用印迹、毛细管电泳、色谱、荧光、凝胶电泳、HPLC、银染色、光谱、紫外(UV)或UPLC或其组合检测合成的mRNA分子。本领域已知的其他检测方法包括在本发明中。在一些实施例中,使用UV吸收光谱法通过毛细管电泳分离来检测合成的mRNA 分子。在一些实施例中,在凝胶电泳之前,mRNA被乙二醛染料变性。在一些实施例中,合成的mRNA在加帽或封尾前表征。在一些实施例中,合成的mRNA在加帽和封尾后表征。
在一些实施例中,根据本发明制备的mRNA基本上没有短聚物或无效转录物。特别地,通过毛细管电泳或乙二醛凝胶电泳,根据本发明制备的mRNA包括不可检测水平的短聚物或无效转录物。如本文所用,术语“短聚物”或“无效转录物”是指任何小于全长的转录物。在一些实施例中,“短聚物”或“无效转录物”的长度小于100核苷酸、小于90、小于80、小于70、小于60、小于50、小于40、小于30、小于20或者长度小于10核苷酸。在一些实施例中,添加5'-帽和/或3'-聚A尾后检测或量化短聚物。
序列
3’-非翻译区(3’-UTR):通常,术语“3’-UTR”是指人工核酸分子的一部分,其位于可读框的3’(即“下游”),并且其不翻译为蛋白。通常,3’-UTR 是mRNA的蛋白编码区(可读框(ORF)或编码序列(CDS))和聚腺苷酸序列之间的mRNA的一部分。在本发明的情况中,术语3’-UTR还可以包含这样的元件,其不在模板中编码,RNA由其转录,但在成熟过程中在转录后添加,例如聚腺苷酸序列。mRNA的3’-UTR不翻译为氨基酸序列。 3′UTR序列通常由在基因表达过程中被转录为各自的mRNA的基因编码。基因组序列首先转录为包含任选内含子的成熟前mRNA。成熟前mRNA随后在成熟过程中进一步被加工为成熟mRNA。该成熟过程包含以下步骤:5′加帽、剪接成熟前mRNA以切除任选内含子和3′末端修饰(如成熟前mRNA 3′末端的聚腺苷酸化和任选的核酸内切酶/或核酸外切酶切割等)。在本发明范围内,3′-UTR对应于位于蛋白编码区终止密码子,优选紧接蛋白编码区终止密码子的3′端和mRNA的聚腺苷酸序列之间。术语“对应于”意为3′-UTR序列可以是如用于限定3′-UTR序列的mRNA 序列中的RNA序列,或对应于此RNA序列的DNA序列中。在本发明范围内,术语“基因的3′-UTR”,为对应于源自该基因的成熟mRNA的 3′-UTR的序列,所述成熟mRNA即通过基因转录和成熟前mRNA的成熟获得的mRNA。术语“基因的3′-UTR”包括3′-UTR的DNA序列和 RNA序列(正义和反义链二者以及成熟和未成熟的二者)。优选3′UTR 具有多于20,30,40或50个核苷酸的长度。3′-非翻译区(3′UTR):3′UTR典型地是mRNA的一部分,其位于mRNA的蛋白编码区(即可读框)和多聚腺苷酸序列之间。mRNA的3′UTR不翻译为氨基酸序列。在本发明范围内,3′UTR对应于位于蛋白编码区终止密码子的3′端,优选紧接蛋白编码区终止密码子的3′端,并且向多聚腺苷酸序列的5′侧,优选向紧接多聚腺苷酸序列的5′侧的核苷酸延伸的成熟mRNA序列。术语“对应于”意为3′UTR序列可以是如用于限定3′UTR序列的mRNA序列中的RNA序列,或对应于此RNA序列的DNA序列中。在本发明范围内,术语“基因的3′UTR”,如“白蛋白基因的3′UTR”,为对应于源自该基因的成熟mRNA的3′UTR的序列,所述成熟mRNA即通过基因转录和成熟前mRNA的成熟获得的mRNA。术语“基因的3′UTR”包括3′UTR的DNA序列和RNA序列。
5’-非翻译区(5’-UTR):通常,术语“5’-UTR”是指人工核酸分子的一部分,其位于可读框的5’(即“上游”),并且其不翻译为蛋白。5’-UTR通常理解为信使RNA(mRNA)的特定区段,所述信使RNA位于mRNA的可读框的5’。通常,5’-UTR在转录起始位点起始并且在可读框的起始密码子之前的一个核苷酸处终止。优选地,所述5’UTR具有多于20,30,40或 50个核苷酸的长度。5’-UTR可以包含用于控制基因表达的元件,也称为调控元件。所述调控元件可以是例如核糖体结合位点。5’-UTR可以被转录后修饰,例如通过加入5’-帽修饰。mRNA的5’-UTR不翻译为氨基酸序列。5’-UTR序列通常由基因表达过程中转录为各个mRNA的基因编码。基因组序列首先转录为成熟前mRNA,其包含任选的内含子。成熟前 mRNA然后在成熟过程中进一步加工为成熟mRNA。该成熟过程包括以下步骤:5′加帽、剪接成熟前mRNA以切除任选内含子和3′末端修饰(如成熟前mRNA 3′末端的聚腺苷酸化和任选的核酸内切酶/或核酸外切酶切割等)。在本发明范围内,5′-UTR对应于位于起始密码子和例如5’-帽之间的成熟mRNA序列。优选地,5′-UTR对应于从位于5′帽的3′侧的核苷酸,更优选从紧邻5′帽的3′侧核苷酸,向位于蛋白编码区起始密码子5′侧的核苷酸,优选向紧接蛋白编码区起始密码子5′侧的核苷酸延伸的序列。紧接成熟mRNA 5′帽的3′侧的核苷酸典型地对应于转录起始位点。术语“对应于”意为5′-UTR序列可以是如用于限定5′-UTR序列的mRNA序列中的RNA序列,或与此RNA序列对应的DNA序列。在本发明范围内,术语“基因的5′-UTR”,是对应于源自该基因的成熟mRNA的5′-UTR的序列,所述成熟mRNA即通过基因转录和成熟前mRNA的成熟获得的mRNA。术语“基因的5′-UTR”包括5′-UTR的DNA序列和RNA序列(正义和反义链以及成熟和未成熟的二者)。
作为mRNA稳定化的备选方案,已经发现天然存在的真核mRNA分子含有特征稳定化元件。例如,它们可以包含在其5'末端(5'-UTR)和/ 或在其3'末端(3'-UTR)的所谓非翻译区(UTR)以及其它结构特征,如5'帽结构或3'-聚腺苷酸尾。5'-UTR和3'-UTR二者都典型地从基因组DNA 转录并且因此是成熟前(premature)mRNA元件。在mRNA加工过程中,成熟mRNA的特有结构特征,如5'帽和3'-聚腺苷酸尾(也称为多聚腺苷酸尾或聚腺苷酸序列)通常被添加于转录的(成熟前)mRNA。
3'-聚腺苷酸尾典型地是添加在转录的mRNA的3'末端的一段单调腺苷核苷酸序列。其可以包含至多约400个腺苷核苷酸。发现此种3'-聚腺苷酸尾的长度对于个体mRNA的稳定性是可能的关键要素。此外,已显示α-球蛋白mRNA的3'UTR可能是对于公知的α-球蛋白mRNA稳定性的重要因素(Rodgers等人,Regulatedα-globin mRNA decay is acytoplasmic eventproceeding through 3'-to-5'exosome-dependent decapping,RNA,8,第1526-1537页,2002)。α-球蛋白mRNA的3'UTR 明显参与特定核蛋白-复合物(α-复合物)的形成,其存在与mRNA体外稳定性相关(Wang等人,An mRNA stability complexfunctions with poly(A)-binding protein to stabilize mRNA in vitro,Molecularand Cellular biology,第19卷,第7期,1999年7月,第4552-4560页)。对于核糖体蛋白mRNA中的UTR已经进一步表明有趣的调节功能:在核糖体蛋白mRNA的5’-UTR控制生长相关的mRNA翻译的同时,该调节的严格性由核糖体蛋白mRNA中的各个3’-UTR赋予(Ledda等人,Effect of the 3’-UTR length on the translationalregulation of 5’-terminaloligopyrimidine mRNAs,Gene,第344卷,2005,p.213-220)。该机制促进核糖体蛋白的特异表达,所述核糖体蛋白通常以恒定的方式转录从而一些核糖体蛋白mRNA如核糖体蛋白S9或核糖体蛋白L32称为看家基因 (Janovick-Guretzky等人,Housekeeping Gene Expressionin Bovine Liver is Affected by PhysiologicalState,Feed Intake,and DietaryTreatment,J.Dairy Sci.,Vol.90,2007,p.2246-2252)。核糖体蛋白的生长相关的表达模式因此主要是由于对翻译水平的调节。
术语“3’-UTR元件”是指包含源自3’-UTR或源自3’-UTR的变体或片段的核酸序列或由源自3’-UTR或源自3’-UTR的变体或片段的核酸序列组成的核酸序列。“3’-UTR元件”优选是指人工核酸序列,如人工mRNA的 3’-UTR包含的核酸序列。因此,在本发明的意义中,优选地,3’-UTR元件可以由mRNA,优选人工mRNA的3’-UTR包含,或3’-UTR元件可以由各自的转录模板的3’-UTR包含。优选地,3’-UTR元件是对应于mRNA 的3’-UTR,优选人工mRNA,如通过转录基因改造的载体构建体获得的 mRNA的3’-UTR的核酸序列。优选地,本发明的意义中的3’-UTR元件作为3’-UTR行使功能或编码执行3’-UTR的功能的核苷酸序列。
因此,术语“5’-UTR元件”是指包含源自5’-UTR或5’-UTR的变体或片段的核酸序列或由源自5’-UTR或5’-UTR的变体或片段的核酸序列组成的核酸序列。“5’-UTR元件”优选是指人工核酸序列,如人工mRNA的 5’-UTR包含的核酸序列。因此,在本发明的意义中,优选地,5’-UTR元件可以由mRNA,优选人工mRNA的5’-UTR包含,或5’-UTR元件可以由各自的转录模板的5’-UTR包含。优选地,5’-UTR元件是对应于mRNA 的5’-UTR,优选人工mRNA,如通过转录基因改造的载体构建体获得的 mRNA的5’-UTR的核酸序列。优选地,本发明的意义中的5’-UTR元件作为5’-UTR行使功能或编码执行5’-UTR的功能的核苷酸序列。
根据本发明的人工核酸分子中的3’-UTR元件和/或5’-UTR元件延长和/或增加从所述人工核酸分子的蛋白生产。因此,根据本发明的人工核酸分子可以尤其包含一下一种或者几种功能的3’-UTR元件和/或5’-UTR元件:增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件,延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件,增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件,增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件,延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件,增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件,增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件,增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件,增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件,延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件,延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件,延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件,增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件,增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件,或增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件。优选地,根据本发明的人工核酸分子包含延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和/或增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的 5’-UTR元件。优选地,根据本发明的人工核酸分子包含至少一个3’-UTR元件和至少一个5’-UTR元件,即延长和/或增加从所述人工核酸分子的蛋白生产并且源自稳定mRNA的至少一个3’-UTR元件和延长和/或增加从所述人工核酸分子的蛋白生产并且源自稳定mRNA的至少一个5’-UTR元件。“延长和/或增加从所述人工核酸分子的蛋白生产”通常是指与从缺少3’-UTR和/或5’-UTR或包含参比3’-UTR和/或参比5’-UTR(如天然与ORF 组合存在的3’-UTR和/或5’-UTR)的各个参比核酸产生的蛋白的量相比,从具有各个3’-UTR元件和/或5’-UTR元件的根据本发明的人工核酸分子产生的蛋白的量。尤其是,与缺少3’-UTR和/或5’-UTR或包含参比3’-UTR和/或5’-UTR,如天然与ORF组合存在的3’-和/或5’-UTR的各个核酸相比,根据本发明的人工核酸分子的至少一个3’-UTR元件和/或5’-UTR元件延长从根据本发明的人工核酸分子,例如从根据本发明的mRNA的蛋白生产。尤其是,与缺少3’-和/或5’-UTR或包含参比3’-和/或5’-UTR,如天然与ORF组合存在的3’-和/或5’-UTR的各个核酸相比,根据本发明的人工核酸分子的至少一个3’-UTR元件和/或5’-UTR元件增加从根据本发明的人工核酸分子,例如从根据本发明的mRNA的蛋白生产,尤其是蛋白表达和/或总蛋白生产。优选地,与缺少3’-UTR和/或5’-UTR或包含参比3’-UTR和/或参比 5’-UTR,如天然与ORF组合存在的3’-UTR和/或5’-UTR的各个核酸的翻译效率相比,根据本发明的人工核酸分子的所述至少一个3’-UTR元件和/ 或所述至少一个5’-UTR元件不消极影响核酸的翻译效率。甚至更优选地,与其天然情况下各个ORF编码的蛋白的翻译效率相比,翻译效率由3’-UTR和/或5’-UTR增强。本文中使用的术语“各个核酸分子”或“参比核酸分子”意为-除不同 3’-UTR和/或5’-UTR之外-参比核酸分子是与包含3’-UTR元件和/或 5’-UTR元件的本发明的人工核酸分子相当的,优选相同的。
药物组合物
本申请还披露了包括化合物、蛋白(抗原、抗体、抗体片段、融合蛋白、肽链,氨基酸序列等等)、改性核苷、改性核苷酸或本申请提供的改性核酸的药物组合物。
在一些实施例中,本发明的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的任何方法给予受试者,例如肠胃外、经口、经粘膜、经皮、肌肉内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内、阴道内或肿瘤内。
药物组合物可以通过静脉内、动脉内或肌内注射液体制剂来施用。合适的液体制剂包括溶液、悬浮液、分散液、乳液、油等。在一些实施例中,药物组合物是静脉内给药的,因此配制成适于静脉内给药的形式。在一些实施例中,药物组合物是动脉内给药的,因此配制成适于动脉内给药的形式。在一些实施例中,药物组合物是肌肉内给药的,因此配制成适于肌内给药的形式。药物组合物可以使用囊泡给药,例如,脂质体 (see Langer,Science249:1527-1533(1990);Treatetal.,inLiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer, Lopez-BeresteinandFidler(eds.),Liss,NewYork,pp. 353-365(1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; see generallyibid)。
药物组合物可以口服给药,因此,可以配制成适于口服给药的形式,即固体或液体制剂。合适的固体口服制剂可以包括片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂等。合适的液体口服制剂可以包括溶液、悬浮液、分散液、乳液、油。
药物组合物可以局部给予体表,因此可以配制成适于局部给药的形式。合适的局部制剂可包括凝胶、软膏、乳膏、洗剂、滴剂等。对于局部给药,可以制备组合物或其生理学上可耐受的衍生物,并在有或没有药物载体的情况下作为溶液,悬浮液或乳液施用于生理学上可接受的稀释剂中。药物组合物可以作为栓剂给药,例如直肠栓剂或尿道栓剂。在一些实施例中,药物组合物通过皮下植入颗粒给药。在一些实施例中,颗粒在一段时间内提供药剂的受控释放。药物组合物可另外包括药学上可接受的赋形剂,如本申请所用,包括任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体载体、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等,适合于所需的特定剂型。雷明顿《药学的科学与实践》,第21版,A.R.Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, Md.,2006;incorporated herein byreference)披露了用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于其制备的已知技术。
在一些实施例中,药学上可接受的赋形剂的纯度为至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。在一些实施例中,赋形剂被批准用于人类和兽医用途。在一些实施例中,赋形剂经美国食品和药物管理局批准。在一些实施例中,赋形剂是药用级。在一些实施例中,赋形剂符合美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
用于液体制剂的药学上可接受的载体可以是水性或非水性溶液、悬浮液、乳液或油。非水溶剂的实例可以是丙二醇、聚乙二醇和可注射的有机酯,例如油酸乙酯。含水载体可包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液、包括盐水和缓冲介质。油的实例可以是石油、动物、植物或合成来源的油,例如花生油、大豆油、矿物油、橄榄油、向日葵油和鱼肝油。
非消化道给药的载体(用于皮下、静脉内、动脉内或肌内注射)可包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液和固定油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂,例如基于林格氏葡萄糖的电解质补充剂等。实例可以是无菌液体,例如水和油,添加或不添加表面活性剂和其他药学上可接受的佐剂。通常,水、盐水、葡萄糖水溶液和相关糖溶液、以及二醇如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体载体,特别是对于可注射溶液。油的实例可以是石油、动物、植物或合成来源的油,例如花生油、大豆油、矿物油、橄榄油、向日葵油和鱼肝油。
药物组合物可进一步包括粘合剂(例如阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、卡波姆、乙基纤维素、瓜尔胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮)、崩解剂(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、瓜尔胶、羟基乙酸淀粉钠)、各种pH和离子强度的缓冲剂(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸基)、白蛋白或明胶等添加剂、以防止吸收到表面、洗涤剂(例如吐温20、吐温80、普朗尼克F68、胆汁酸盐)、蛋白酶抑制剂、表面活性剂(例如十二烷基硫酸钠)、渗透增强剂、增溶剂(例如甘油、聚乙二醇甘油)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠、丁基化羟基苯甲醚)、稳定剂(例如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、增粘剂(例如卡波姆、胶体二氧化硅、乙基纤维素、瓜尔胶)、甜味剂(例如阿斯巴甜、柠檬酸)、防腐剂(如硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)、润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠)、流动助剂(如胶体二氧化硅)、增塑剂(如邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯)、乳化剂(例如卡波姆、羟丙基纤维素、十二烷基硫酸钠)、聚合物涂层(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)、涂料和成膜剂(例如乙基纤维素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)和/或佐剂。
本申请提供的药物组合物可以是控释组合物,即组合物,其中化合物在给药后的一段时间内释放。控释或持续释放组合物可包括在亲脂性贮库(例如脂肪酸、蜡、油)中的制剂。在一些实施例中,药物组合物可以是立即释放组合物,即组合物,其中整个化合物在给药后立即释放。
递送载体
可使用任何方法配制和递送根据本发明合成的mRNA用于体内生产蛋白质,例如抗体,或者抗原,或者抗体片段或者抗原片段等。在一些实施例中,将mRNA封装到转移载体中,例如纳米颗粒。除此之外,这种包封的一个目的通常是保护核酸免受可能含有降解核酸和/或引起核酸快速排泄的系统或受体的酶或化学物质的环境的影响,并促进细胞摄取和相应序列的表达。因此在一些实施例中,合适的递送载体能增强其中包括mRNA的稳定性和/或促进mRNA递送至靶细胞或组织。在一些实施例中,纳米颗粒可以是基于脂质的纳米颗粒,例如包括脂质体或基于聚合物的纳米颗粒。在一些实施例中,用于递送载体的纳米颗粒可具有约1~1000nm之间的颗粒直径。纳米颗粒可包括至少0.001、0.01/>、0.1/>、1/>、10、100/>、1mg、10mg、100mg、1g或更多mRNA。
当然,这种纳米粒子也可以是核壳类结构的颗粒,如果核酸与聚合物混合形成了核,然后再在核结构外包裹脂质体,也可以通过本发明的混合器来完成。可以先通过混合器让核酸和聚合物形成微粒结构,然后在通过混合器让微粒与脂质成分形成微粒结构。这种所谓的核壳结构,例如专利申请号201880001680.5中所有核的材料以及壳的材料都可以用本发明的混合器来形成,该专利的所有组成核的材料和形成壳的材料都是本发明的一个具体实施方式。
在一些实施例中,转运载体是脂质体囊泡、或促进核酸转移至靶细胞和组织的其他手段。合适的转运载体可以包括但不限于脂质体、纳米脂质体、含神经酰胺的纳米脂质体、蛋白脂质体、纳米颗粒、磷酸钙-硅酸盐纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、纳米晶颗粒、半导体纳米颗粒、聚(D-精氨酸)、纳米树枝状聚合物、淀粉基递送系统、胶束、乳剂、囊泡、质粒、病毒、钙磷酸基核苷酸、适体、肽和其他载体标签。还考虑使用生物离子胶囊和其他病毒衣壳蛋白组装体作为合适的转移载体。(Hum. Gene Ther. 2008 September;19(9):887-95)。
脂质纳米颗粒可以包括一种或以上阳离子脂质、一种或以上非阳离子脂质、一种或以上基于甾醇的脂质、和/或一种或以上PEG-改性脂质。脂质体可包括三种或更多种不同的脂质组分,脂质的一种不同组分是基于甾醇的阳离子脂质。在一些实施例中,基于甾醇的阳离子脂质是咪唑胆固醇酯或“ICE”脂质(参见WO2011/068810,其通过引用并入本申请)。在一些实施例中,基于甾醇的阳离子脂质可构成脂质纳米颗粒(例如,脂质体)中总脂质的不超过70%(例如,不超过65%和60%)。合适的脂质的实例可包括,例如,磷脂酰化合物(例如,磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂。
阳离子脂质的非限制性实例可包括(但不限于)C12-200、MC3、DLinDMA、DLin-MC3-DMA、DLinkC2DMA、cKK-E12、ICE(咪唑基)、HGT5000、HGT5001、OF-02、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA和DMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、 DLin-K-XTC2-DMA 、SM-102、ALC-0315和HGT4003等,或其组合。
非阳离子脂质的非限制性实例可以包括(但不限于)神经酰胺、脑磷脂、脑苷脂、二酰基甘油、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酰基甘油钠盐(DPPG)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG),1-棕榈酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、鞘磷脂、或其组合。
在一些实施例中,PEG改性脂质可以是PEG长度可以是1000~5000Da的聚(乙烯)二醇链,其共价连接到具有C6-C20长度的烷基链的脂质上。PEG改性脂质的非限制性实例可包括(但不限于)DMG-PEG1000、DMG-PEG1300、DMG-PEG1500、DMG-PEG1800、DMG-PEG2000、DMG-PEG2200、DMG-PEG2500、DMG-PEG2700、DMG-PEG3000、DMG-PEG3200、DMG-PEG3500、DMG-PEG3700、DMG-PEG4000、DMG-PEG4200、 DMG-PEG4500、DMG-PEG4700、DMG-PEG5000、ALC-0159、C8-PEG、DOGPEG、神经酰胺PEG和DSPE-PEG、或其组合。
还考虑使用聚合物作为转移载体,无论是单独使用还是与其他转移载体组合使用。合适的聚合物可包括,例如,聚丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、藻酸盐、胶原、壳聚糖、环糊精和聚乙烯亚胺。基于聚合物的纳米颗粒可包括聚乙烯亚胺(PEI),例如支化的PEI。
载体的核壳结构也是另外一种具体的实施方式。在一些方式中,所述的疫苗试剂包括前述的核酸,该核酸可以翻译,表达冠状病毒的抗原或者抗原片段,这样的核酸被包含在多个多聚复合物或蛋白质核粒子内,并且其中所述多个多聚复合物或蛋白质核粒子本身被囊封在第一生物相容性脂质双层壳中。在一些方式中,所述多聚复合物或蛋白质核粒子含有至少第一带正电荷的聚合物或蛋白质。其中所述第一生物相容性脂质双层壳促进一种或多种哺乳动物抗原呈递细胞对所述多个多聚复合物或蛋白质核粒子的巨胞饮作用。在一些方式中,该疫苗试剂还包含囊封在所述生物相容性脂质双层内的选自CpG、聚(I:C)、明矾及其任何组合的佐剂。在一些方式中,疫苗试剂还包括含囊封在所述生物相容性脂质双层之间的空间内的免疫调节化合物,例如IL-12p70蛋白质、FLT3配体、或吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO-1)抑制剂。在一些方式中,其中所述吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO-1)抑制剂是GDC-0919、INCB24360或其组合。在一些方式中,其中所述带正电荷的聚合物或蛋白质包含鱼精蛋白、聚乙烯亚胺、聚(β-氨基酯)或其任何组合。在一些方式中,所述生物相容性脂质双层包含以下的一种或多种:1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(EDOPC);1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE);1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG);及其组合。在一些方式中,所述生物相容性脂质双层包含:(a)约30%至约70%的1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(EDOPC);(b)约70%至约30%的1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE);或(c)约0.5%至约5%的1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG)。在一些方式中,所述生物相容性脂质双层包含:(a)约45%至约55%的1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(EDOPC);(b)约55%至约45%的1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE);和(c)约1%至约2%的1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG)。
微针
微针是由硅、金属、大分子有机物或其他材料通过微电子制造技术或微铸模等技术制成的长度为几百微米到几毫米不等的细小的针。它能有效刺穿皮肤的角质层,通过在皮肤表面形成微小通道,药物可到达皮肤指定深度,被吸收进入血液而发挥作用,是一种集透皮贴片与皮下注射双重释药特点于一体的微经皮给药系统。微针主要的给药方式有贴针、蘸针、包衣微针、包囊药物微针和微针注射等,具有生物利用度高,无损伤性、剂量可控、稳定、无痛感的优点。主要用于大分子物质如蛋白质、核酸、疫苗等的经皮吸收,此外,在美容界也有广泛的用途,微针产生的微小通道可以使皮下腺产生的汗液更好的排出体外,使缓解毛孔堵塞性及油性皮肤得到缓解;另外,可增加皮肤用品如乳剂、凝胶和洗液等的吸收量,提高有效成分的利用率。
微针此前便凭借其无痛微创、方便使用、意外针刺风险低等优点和广阔的市场前景,受到了国际药企、学术机构的追捧。随着微加工技术的发展,我国医药研究投入比重的加大,微针给药系统的相关研究和应用也在不断增加,一定程度上推动了我国微针给药行业的发展。
微针可以定义为高10~2000、宽10~50/>的针,具有给药意义的装置是微针阵列,即许多微针以阵列的方式排列在给药载体上。微针的长度在几百微米到几毫米不等,它可以恰好穿过皮肤角质层而又不触及痛觉神经,在皮肤表面形成给药通道,使药物到达皮肤指定深度,并进入皮下的毛细管网被吸收,在起到促进药物渗透的同时又不引起痛感和皮肤损伤。因此,微针有助于提高药物的给药效率和改善病人的依从性。
虽然理论上微针的长度只需要15~20就可以刺穿人的皮肤角质层,但是由于皮肤具有良好的弹性及可伸缩性,而且不同年龄的人以及不同的皮肤部位的皮肤角质层厚度差异比较大,因此为了保证微针可以有效地刺穿不同类型的皮肤,实现有效的经皮给药,微针的长度要远长于20/>但是一般要小于1mm。微针的材料也由最初的金属微针逐渐发展为由可溶性材料制作的可溶解微针。
微针最重要的优势在于它可以使大分子穿透角质层,并且相对于注射给药,它几乎无损伤性、无痛感,相当于皮下给药,易被患者接受。另外,通过微针给药,药物的剂量比较稳定且可控制。使用微针贴剂的感受就好比在脸上贴了一片创可贴,患者没有任何不适感。所以,微针也被称为是一种革命性的新剂型和新的给药方式。外用药、化妆品、生物制剂、部分化药等都可以进行微针贴剂化改造,市场空间非常可观。
微针透皮给药应用广泛,可用于小分子、生物制剂、疫苗、细胞内DNA/RNA等透皮递送,疫苗、糖尿病、皮肤病、医美是微针在现阶段的主要研究方向。
随着20世纪90年代微纳米加工技术的发展,微针在药学领域的运用逐渐成为可能,并先后开发出了金属微针(主要材料有不锈钢、钛合金、镍、钯等)、硅及二氧化硅微针、玻璃微针、聚合物微针等类型。在实际运用中,可根据中心是否有微型通道将微针分为实心微针和空心微针。实心微针按给药方式不同又可分为可溶性载药微针、不可溶性药物涂层微针、组织预处理微针。此外,还可分为生物微针与人造微针、异面微针与同面微针等。
空心微针是使用微加工技术制作的长度小于1mm的中空针头,用来将液体疫苗制剂通过针头注射入皮肤从而实现经皮给药。最早使用的空心微针是McAllister等人在二十世纪八十年代使用硅制作的长度约150的微针。
实心微针在疫苗的经皮给药应用中主要有两种方式:“poke and patch”和“coatand poke”。最初的实心微针是由钛、硅、不锈钢、玻璃等材料制作而成,但是在使用中由于存在微针折断残留在皮肤中的风险,而且这些材料都无法在皮肤中被降解成无毒物质。因此在随后的研究中,开始使用可降解但不易溶于水的高分子聚合物材料制作出可适用于经皮给药的实心微针,如PLGA、PGA、PLA等材料。实心微针的形状主要为金字塔形或是圆锥形,微针长度在150~1000微米之间。
poke and patch是实心微针最早应用于经皮给药时的使用方法,简单说就是将微针预处理皮肤后取走,然后将含有药物的凝胶贴片或者液体制剂敷到微针预处理区域,使制剂中药物通过皮肤上微针预处理后留下的针孔扩散渗透入皮肤中完成药物的经皮给药。缺点,不好精确控制给药剂量。
coat and poke是用含有疫苗的涂布液,将疫苗涂布在微针阵列针尖表面制作得到涂布针,当涂布针作用于皮肤后,针尖表面载有的药物将迅速溶解释放到皮肤内。与pokeand patch方法相比,coat and poke方法可以相对精确地控制在经皮给药过程中的给药剂量,而且使用更简单,给药时间也缩短至几分钟。但是缺点是,针尖载药量容易受微针形状及微针阵列中微针数量的影响。
poke and release(自溶性微针)是指由水溶性材料为基质制作而成的仅在微针针体含有疫苗的微针贴片。既可以提高载药量,又可以根据材料将微针设计为快速给药或者缓释给药方式。现在常用的水溶性高分子材料主要有:CMC、PVP、PVA/PVP混合材料、蚕丝蛋白、硫酸软骨素、透明质酸钠以及多糖等材料。
自溶性微针是指由实心微针的基底部与其前端的可溶性针状结构结合而成的一类微针,由可溶性或生物可降解基质构成,这类微针的基质在插入皮肤后能溶解,具有良好的生物相容性。通常,这类型的微针阵列由糖、碳水化合物或合成聚合物组成,可用于承载胰岛素、低分子量肝素、卵清蛋白、腺病毒载体、疫苗抗原、光敏剂和前体等物质。自溶性微针具有以下优点:只能一次性使用,可避免传播感染性疾病;可溶部分负载的药物不用经皮被动吸收;基底部作为实心微针使用可进一步给药,tmax和持续时间均优于传统皮下注射法;自溶性微针还有药物缓释作用,可根据治疗需求制作不同降解速度的自溶性微针。
水凝胶微针由溶胀材料和药物储集层组成。水凝胶微针阵列中的溶胀材料和药物储集层可通过肿胀的微投射吸收间隙液来解除药物的溶解,这一点与自溶性微针不同,因此将其单独分为一类。水凝胶微针有两种载药方式:一种是微针基底部承载药物,针体刺入皮肤后水凝胶吸收细胞间液膨胀,形成凝胶通道,基底部的药物通过凝胶通道渗入人体,渗入速度由水凝胶的交联密度决定;另一种是水凝胶微针基底部及针体均由药物与聚合物混合制备,刺入皮肤后体液渗入,针体溶胀,药物释出。水凝胶微针制备时其材料不存在降解物残留问题,因此可大量生产。
本发明提供的微针注射试剂适用于任意一种微针。
尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试,但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用整体并入。本文引用的参考文献不被认为是要求保护的发明的现有技术。另外,材料、方法和实施例仅是说明性的,而不是限制性的。
附图说明
图1为微针皮内给药的示意图;
图2为实施例1中Ribogreen试剂盒进行包封率的测量过程中96孔黑板进行样品添加方式示意图;
图3为实施例4中不同LNP的细胞水平表达效果比较示意图;
图4为实施例5中不同给药方式在小鼠体内Fluc-mRNA表达情况BLT成像结果;
图5为实施例5中不同给药方式在小鼠体内注射部位的光学信号强度分析结果示意图;
图6为实施例5中不同给药方式在肝脏的光学信号强度分析结果示意图;
图7为实施例5中不同剂量下Fluc-mRNA在注射部位和肝脏的光学强度变化结果示意图,其中上左图为不同剂量下Fluc-mRNA在注射部位的光学强度变化,上右图为不同剂量下Fluc-mRNA在肝脏的光学强度变化,下图为不同剂量下Fluc-mRNA的总光学强度变化;
图8为实施例5中不同给药方式在注射部位、肝脏的光学信号强度变化结果示意图,其中上左图为不同给药方式时Fluc-mRNA在注射部位的表达情况对比,上右图为不同给药方式时Fluc-mRNA在肝脏的表达情况对比,下图为不同给药方式时Fluc-mRNA的总的表达情况对比;
图9为实施例5中不同给药方式下48h后在注射部位、肝脏的光学信号强度分析结果示意图,其中上图为48h后Fluc-mRNA在注射部位的表达情况对比,下图为48h后Fluc-mRNA的总的表达情况对比;
图10为实施例5中不同给药方式下小鼠体内不同部位BLT成像结果示意图;
图11为实施例5中不同给药方式下小鼠体内不同部位的荧光强度分析图;
图12为实施例6中小鼠给药和血样采集流程图;
图13为实施例6中小鼠血清中新型冠状病毒S蛋白的表达量检测结果示意图;
图14和图15为实施例6中小鼠血清中SARS-CoV-2 S Protein抗体滴度检测结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述,需要指出的是,以下所述实施例旨在便于对本发明的理解,而对其不起任何限定作用。
以下实施例中采用的实验试剂、耗材及实验仪器如下:
实验试剂及耗材:无水乙醇(Sigma-Aldrich,E7023-500 mL)、胆固醇(Sigma-Aldrich,C8667-5G)、DSPC(Avanti,SKU:850365P-1g)、可电离阳离子脂质SM-102(朗旭生物,Batch No:20210401)、DMG-PEG2000(朗旭生物,Batch No:20200601)、DEPC水(Invitrogen,REF:750023)、三水乙酸钠(Sigma-Aldrich,32318-500G-R)、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Roche,REF:10812846001)、氨基丁三醇(Sigma-Aldrich,76687-100G)、冰乙酸(MACKLIN,A801295-500mL)、S protein-mRNA(合肥阿法纳生物技术有限公司;Cat:S_mRNA_2P_01;Lot:2011092101)、超滤离心管15 mL 10K(MilLipore,REF:UFC901096)、Ribogreen试剂盒(Invitrogen,REF:R11490)、Fluc-mRNA(Hongene Biotech,FLUC mRNA (N1-Me-pseudo U);Lot:FLUCMPH1B;简称 Fluc-mRNA;已上市销售,购买的序列中已经含有UTR序列、启动子等,可经递送后在体外细胞水平和生物体内表达)、HEK 293T细胞(COBIOER)
实验仪器:微流控纳米药物制备系统(迈安纳,型号:INano L)、高速冷冻离心机(Thermo Scientific,型号:Sorvall ST 16R)、超微量分光光度计(Thermo Scientific,型号:Nanodrop One)、激光粒度仪(丹东百特仪器,型号:BT-90 +)、精密天平(Sartorius,型号:SQP Quintix124-1CN)、pH计(METTLER TOLEDO,型号:S210)、微针注射头(铭安康,多针CC-XW-04)、1ml注射器(康得莱,0.45*16mm RWLB)、流式细胞仪(安捷伦)、细胞计数板(WATSON)
实施例1 微针注射新型冠状病毒mRNA疫苗的制备
本实施例采用的新型冠状病毒mRNA为S protein-mRNA(表达新型冠状病毒的S蛋白的序列)购自合肥阿法纳生物技术有限公司(Cat:S_mRNA_2P_01;Lot:2011092101),已上市销售,购买的序列中已经含有UTR序列、启动子等,可经递送后在体外细胞水平和生物体内表达。
本实施例提供的微针注射新型冠状病毒mRNA疫苗的制备方法包括如下步骤:
1、水相溶液和脂质溶液的配制
配置水相溶液及脂质混合溶液,其中4X水相溶液和脂质溶液母液的配制按照表1所述方式进行:
表1、4X水相溶液和脂质溶液母液配方
配置方案如下:
(1)水相溶液的配制:分别精密称取氨基丁三醇、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、三水乙酸钠及乙酸并用DEPC水溶解成储液后备用,使用时再通过DEPC水稀释至1X的溶液使用,稀释后的水相溶液经pH计检测pH为7.4,随后再通过冰醋酸调节pH为5.5;取S protein-mRNA适量通过1X的水相溶液稀释成200的水相mRNA溶液。
(2)脂质溶液的配制:精密称取四种脂质并分别加入如表1所示的4mL无水乙醇溶解储存备用,制备LNP时按照1:1:1:1的比例吸取、混合均匀即可配置成最终浓度为15.44mg/mL的脂质混合溶液。
、微流控纳米药物制备系统制备新型冠状病毒mRNA疫苗S protein-mRNA-LNP
(1)按照水相mRNA溶液:有机相脂质溶液=3:1的比例,12mL/min的流速,4mL的制备体积,初始废液0.3mL,终端废液0.05mL的参数,通过微流控纳米药物制备系统制备Sprotein-mRNA-LNP。
(2)制备得到的LNP立即用pH 7.4的1X的水相溶液20倍稀释,通过超滤离心管进行离心浓缩(离心条件2500g,4℃,10min),弃掉超滤离心管下部溶液,直至超滤管上部体积接近初始制备的LNP体积。此时再补加10倍体积的1X的水相溶液继续超滤离心,以期进一步降低乙醇浓度,最终超滤离心得到的样品即为最终S protein-mRNA-LNP样品,其体积应接近于初始制备的LNP体积,4℃保存备用。
、检测分析
按照步骤1和2制备S protein-mRNA-LNP样品,一共进行三次制备实验,每隔一周进行一次制备,分别检测其粒度、PDI(分散性系数)、包封率和载药量。
(1)检测粒度及PDI。
将制得的S protein-mRNA-LNP样品通过粒度仪进行粒度及PDI的检测,其中粒度的检测方法为将1mL样品放入样品池,相应样品分散在样品池中,通过波长671nm激光照射到样品上,通过APD光电检测器在90°角检测样品颗粒布朗运动造成的散射光强随时间的波动,再通过相关器进行自相关运算得出样品的自相关曲线,结合数学方法就可以得到颗粒的扩散系数,进一步利用Stockes-Einstein方程得到样品的粒度分布结果,即流体力学直径DH及其分布。颗粒分布信息经系统计算得为PDI;经检测,平均粒度为213.5nm,PDI为0.15。
(2)通过Ribogreen试剂盒进行包封率的测量,并计算载药量。
包封率的检测方法为:
a. 通过无菌无酶水将20X的TE buffer稀释制得适量1X TE buffer。例如:10 mL20X TE buffer加190 mL无菌无酶水,充分混匀;
b. 制备Triton buffer,例如向100mL的TE buffer中加入2mL的Triton X-100,搅拌15min以混匀;
表2、标曲溶液的配制
f. 所有样品孔加入显色液后,于酶标仪上进行荧光检测。根据标曲计算得到包封率结果。
随后按照包封率的计算公式(包载的药物与投入总药物的比值)进行计算得到包封率数据。而包载的mRNA量由于涉及到包封率测量时的稀释,所以要乘回相应的稀释倍数。
再根据未包载药物(S protein-mRNA)量和药物(S protein-mRNA)总量,计算载药量,载药量=(总药物量-(未被有效包封)游离药物量)/体积。
三次S protein-mRNA-LNP制备实验结果比较稳定,粒度性状一致,包封率和载药量稳定。
实施例2 不同缓冲液pH对制备S protein-mRNA-LNP的影响
按照实施例1提供的方法配制水相溶液及脂质混合溶液,其中的水相溶液配制中:分别精密称取氨基丁三醇、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、三水乙酸钠三种盐及冰乙酸并用DEPC水溶解后备用,使用时再通过DEPC水稀释至1X的溶液使用。稀释后的水相溶液经pH计检测pH为7.4,随后再通过冰乙酸调节pH配置出pH4.0和pH5.5的水相溶液。分别用不同pH的水相溶液稀释S protein-mRNA母液至200μg/mL的浓度。详细配置方案如表3所示,并以空白LNP(不含有S protein-mRNA)进行对照,分析制备得到的S protein-mRNA-LNP的粒度、PDI、包封率、载药量,粒度、PDI、包封率、载药量按照实施例1提供的方法进行检测,结果汇总如表3所示。
表3、不同缓冲液pH对制备S protein-mRNA-LNP的影响
经多次重复实验,S protein-mRNA-LNP在不同pH缓冲液中制备的结果都基本一致,只是粒径的细微变化,可能与测试仪器有关,包封率和载药量基本一致。
由表3可以看出,采用不同pH的缓冲液制备得到的S protein-mRNA-LNP粒度结果差别较大,载药量完全不同;pH为4.0时包封率和pH5.5时包封率差别不大,但是测得pH5.5下总mRNA载药量特别高(157.75),也就是说单位体积的LNP中含有更多的mRNA,而且稳定性也非常好。可见维持水相溶液合适的pH值,也能显著提升新型冠状病毒mRNA疫苗的载药量,若将pH调至4~6等偏酸性范围内,能使脂质体中负载的S protein-mRNA含量显著提升,并在特定pH条件下,即pH5.5时达到最优。其原因可能是,在制备时,在偏酸环境可以使得可电离阳离子脂质带正电荷,同等条件下可以吸附更多核酸分子(如mRNA等,本身带负电荷),且这种最优是在水相溶液为pH5.5时体现,相比于pH7.4或pH4等条件下的缓冲液,pH5.5时可以更加有效荷载核酸分子,达成相对稳定的可用制剂,因此载药量更高。从而使该新型冠状病毒mRNA疫苗可用于微针注射,满足微针注射时不超过50微升的用量,用量更少,毒副作用更小,免疫效果更好,特别适于微针给药。
实施例3 脂质溶液中的脂质含量对制备S protein-mRNA-LNP的影响
本实施例按照实施例1提供的方法配制配置水相溶液及脂质混合溶液从而制备Sprotein-mRNA-LNP,水相溶液为pH5.5,其中脂质溶液母液的配制分别按照表4和表5两种方式进行:
表4、低脂质含量的微针注射试剂配方
表5、高脂质含量的微针注射试剂配方
制备得到的不同脂质含量的S protein-mRNA-LNP的分别检测粒度、PDI、包封率、载药量,考察不同脂质含量对制备S protein-mRNA-LNP的影响。粒度、PDI、包封率、载药量按照实施例1提供的方法进行检测。检测结果如表6所示。
表6、不同脂质含量对制备S protein-mRNA-LNP的影响
由表6可见,当提高脂质溶液中的脂质含量时,能显著提升S protein-mRNA-LNP的载药量,从而使新型冠状病毒mRNA疫苗中的辅料用量更少,毒副作用更小,仅需更少的剂量就能达到更好的免疫效果,同时稳定性也非常好,更适于微针给药。
实施例4 Fluc-mRNA-LNP的细胞水平表达效果
在96孔板内,通过在对HEK 293T细胞(COBIOER)进行转染实验,Culture Medium:DMEM+10%FBS,采用按照实施例1提供的方法制备LNP,为了方便观察和检测,将其中的Sprotein-mRNA换成Fluc-mRNA (Hongene Biotech,FLUC mRNA (N1-Me-pseudo U);Lot:FLUCMPH1B;简称 Fluc-mRNA;已上市销售,购买的序列中已经含有UTR序列、启动子等,可经递送后在体外细胞水平和生物体内表达),可以更直观地通过荧光表征mRNA的细胞水平表达效果。
制备的Fluc-mRNA-LNP体系进行细胞转染实验;同时以PBS作为空白对照;设置的未包裹的Fluc-mRNA为阴性对照组;另使用Lipofectamine®2000 Reagent (invitrogen #11668-027,简称 Lipo)转染Fluc-mRNA 作阳性对照组;使用的96 孔板(96 Well OpaqueAssay Plate, Jingan Biology, J09601)培养HEK 293T细胞,种板细胞密度:2*104个/孔,种板24小时候后,细胞密度为60~70%时转染使用,细胞中转染的mRNA量为0.1μg/well;转染48h后,添加荧光底物工作液(D-Luciferin, Sodium Salt D-荧光素钠盐,YeasenBiotechnology (Shanghai) Co., Ltd.,40901ES01),37°C孵育5~10min后读板分析,结果如图3所示。
由图3可以看出,采用未包裹脂质体的Fluc-mRNA进行细胞转染时,Fluc-mRNA难以表达;而采用脂质体包裹以后,则可以显著提高细胞水平的表达;其中Lipofectamine 2000的荧光读数为2800GLU左右,制备的Fluc-mRNA-LNP的荧光读数为6500GLU左右,相比Lipofectamine 2000提高了2倍多,其原因主要是因为Lipofectamine 2000的水性溶液pH不合适,且脂质含量较低,载药量偏低,即使转染药物量一致(转染药物用量一致并非是用药体积一致,而是用药中的mRNA含量一致,都为等量的Fluc-mRNA)的情况下,由于辅料较多,也难以实现好的表达效果;而本实施例制备的Fluc-mRNA-LNP载药量更高,辅料含量少,而且更稳定,在同样的转染药物用量情况下,能够激发更多的细胞水平表达,实现更好的递送和表达效果,高效地实现生物学功能。
实施例5 Fluc-mRNA-LNP在动物水平的表达效果
本实施例采用按照实施例1提供的方法制备LNP,为了方便观察和检测,将其中的Sprotein-mRNA换成Fluc-mRNA(Hongene Biotech,FLUC mRNA (N1-Me-pseudo U);Lot:FLUCMPH1B,简称 Fluc-mRNA;已上市销售,购买的序列中已经含有UTR序列、启动子等,可经递送后在体外细胞水平和生物体内表达),可以更直观地通过荧光表征mRNA的动物水平表达效果。
在动物水平上,本实施例观察了不同给药方式下Fluc-mRNA-LNP的表达水平以及组织分布情况。具体的实验设计如表7,利用小动物成像(多模式动物活体成像仪,广州博路腾生物科技有限公司)的方法,比较了尾静脉给药、肌肉给药、皮下给药、常规皮内给药和三针头微针给药四种不同的给药方式后,Fluc的表达量以及持续时间的差异。
表7、不同给药方式
采用Balb/c小鼠,级别为SPF级,6-8周龄,雌性,数量为30只,根据体重将小鼠随机分成实验需要的组,每组3只小鼠,随后给药一次。注射时间点定义为0h;最后一个成像时间结束后,后续观察暂定1周,具体待定;Fluc-mRNA的实际浓度为71.92。(注射10实际注射量为140μL/注射,3.6/>实际注射量为50μL)。G9为没有LNP包裹的裸Fluc-mRNA。给药后从6h起开始进行小动物成像,成像方法如下,成像前对小鼠进行脱毛处理。
成像结果如图4,从图像结果来看,Fluc-mRNA-LNP注射之后,所有给药方式均呈现出信号,证明Fluc-mRNA-LNP的核酸递药系统具备良好的性能,同时Fluc-mRNA-LNP主要表达在小鼠的注射部位和肝脏,具体的其它内脏也有少量表达需要从组织分布结果来分析。本实施例分别对小鼠的注射部位和肝脏的光学信号强度进行分析,并考察了注射部位、肝脏与微针给药剂量之间的关系,以及不同注射方式与总表达量之间的关系。
、不同给药方式在注射部位的光学信号强度分析
不同给药方式在注射部位的光学信号强度分析结果见图5,具体强度数据见表8,从图5和表8可以看出,所有注射方式中Fluc在注射部位的表达随着时间的推移而降低;MN(微针)组相较于其它组,持续表达的时间最久,在96h时依旧可以检测到较高的表达量;G5和G6组在6h时信号最强,但之后迅速下降;6h之后,MN组每个时间点的信号均强于其他组,且可在120h时还有5.42E+07的信号量。G9组的MN注射剂量下降至3.6,仍然能持续较长时间的高表达量。可见微针注射能够提高在注射部位的mRNA表达,同时还能延长表达时间。
表8、不同给药方式在小鼠注射部分的信号强度结果
2、不同给药方式在肝脏的光学信号强度分析
不同给药方式在肝脏的光学信号强度分析结果见图6,具体强度数据见表9。
表9、不同给药方式在小鼠肝脏的信号强度结果
从图6和表9可以看出,IV组(尾静脉注射)与IM组(肌肉注射)相较于其它组,在肝脏处的表达速度快且量最高,IV组于6h之后信号开始快速降低,IM组于12h之后信号开始快速降低;MN组在肝脏部位的表达明显低于IV和IM组;相对于SC(皮下注射)和ID(皮内注射)组,在前24或48h时,MN组在肝脏的表达也依然较低,之后随着时间延续,表达逐渐下降后,MN组与SC(皮下注射)或ID(皮内注射)组相差不大或略有上升,其原因可能是由于微针能够延长mRNA的表达时间,但总的表达强度依然低于SC(皮下注射)和ID(皮内注射)组。可见微针注射mRNA能够降低在肝脏部位的表达。
、注射部位、肝脏与微针给药剂量关系的影响
利用微针分别注射10、3.6/>的Fluc-mRNA,考察不同剂量下,Fluc-mRNA在注射部位和肝脏的光学强度变化,结果如图7所示,其中图7上左图为不同剂量下Fluc-mRNA在注射部位的光学强度变化,上右图为不同剂量下Fluc-mRNA在肝脏的光学强度变化,下图为不同剂量下Fluc-mRNA的总光学强度变化。
由图7可以看出,从总体的表达量来看,两组呈现出很明显的剂量依赖趋势;其中,注射部位的光学信号强度呈现明显的剂量依赖趋势;而肝脏部位,在24h之前,也呈现出剂量依赖的趋势,后续信号均呈现出降低趋势;可见微针给药时,注射部位对剂量反应较明显,持续高表达的时间较长;而肝脏部位表达较少,即使稍大剂量,肝脏的表达也会迅速下降;因此微针给药时,mRNA表达主要集中在注射部位,能够提高在皮肤、肌肉的表达,却能降低在肝脏的表达。
、不同给药方式与注射部位、肝脏及总表达量之间的关系分析
分别采用SC(皮下注射)、ID(皮内注射)和MN(微针注射)三种给药方式注射,注射10μg的Fluc-mRNA-LNP,注射次数为1次,不同给药方式在注射部位、肝脏的光学信号强度,以及总表达量分析结果见图8,其中图8上左图为不同给药方式时Fluc-mRNA在注射部位的表达情况对比,上右图为不同给药方式时Fluc-mRNA在肝脏的表达情况对比,下图为不同给药方式时Fluc-mRNA的总的表达情况对比。
由图8可以看出,MN(微针注射)组的总表达量和注射部位表达量在12h以后都明显高于SC和ID组,而且MN组的下降趋势比其他两组更平缓,能够持续更长时间;而在肝脏部位,MN组在12h后表达量迅速下降,明显低于SC和ID组,下降趋势更陡,可见其能显著降低肝脏部位的表达量,增加注射部位的表达量。
、48小时后不同给药方式与注射部位、肝脏及总表达量之间的关系分析
综合考察不同给药方式情况下,在48h后在注射部位、肝脏的光学信号强度,以及总表达量分析结果见图9,其中图9上图为48h后Fluc-mRNA在注射部位的表达情况对比,下图为48h后Fluc-mRNA的总的表达情况对比。
由图9可以看出,在注射部位表达量以及总表达量来看,48h后MN组的表达量明显高于其他组,甚至3.6注射量时(G8组),就可以达到其他给药方式的表达量,而且能显著延长表达时间;而在肝脏部位,48h后MN组的表达量偏低,而且下降幅度最快。
、不同给药方式下Fluc-mRNA在小鼠体内不同部位分布情况分析
在动物水平上,本实施例分别采用如表10所示的4种不同给药方式,并在给药之后6h、24h后通过解剖小鼠、观察内脏中的Fluc表达强度。BLT成像结果见图10,小鼠各个部位的具体强度分析图11。
表10、实验方案
由图11可见,在6h时,MN与SC组Fluc mRNA表达之后主要分布的部位集中在注射部位上,尤其是MN组,在皮肤以及肌肉均有表达;而IM组主要分布于肝脏和脾上;在24h时,MN组在肝脏处有表达,但信号弱于IM组和SC组;而皮肤和肌肉上的信号仍保持有高信号,且MN>SC>IM。为见微针给药后,主要促进在皮肤和肌肉上的表达,而减少在肝脏处的表达,具有明显的减毒增效的作用。
实施例6 S protein-mRNA-LNP在动物水平的表达效果
本实施例采用Balb/c小鼠,级别为SPF级,6-8周龄,雌性,数量为60只,根据体重将小鼠随机分成六组,每组6只小鼠,按照表11所示的实验方案,于Day0开始给药。
表11、实验方案
在给药前和给药后的Day-7,Day7,Day14,Day21,Day28眼眶采血。血清采集过程为:根据实验设计,所有组别的小鼠按照耳标顺序选取每次每组6只小鼠分别在6个时间点进行血清的采集,每只小鼠的血样均采集。5个时间点分别是:第一次给药之前7天,第一次给药后7天,第二次给药时,第二次给药之后7天以及第二次给药之后14天(流程如图12所示)。通过眼眶收集血液样本,室温静置半小时后,3000rpm离心20min收集血清样品,收集的血清-80℃保存用于后续检测。采血体积100左右,检测小鼠血清中的抗S蛋白的抗体水平来评价此mRNA疫苗的体液免疫效果。
每次采血后进行血清中的进行SARS-CoV-2 S Protein抗体滴度检测,并在Day1时进行新型冠状病毒S蛋白表达检测,同时,该检测方法所需试剂均购买于Acro(北京百普赛斯生物科技股份有限公司)。
其中SARS-CoV-2 S Protein抗体滴度的检测方法为:1、配制1×Washing Buffer:取50 mL 10 × Washing Buffer,用超纯水/去离子水稀释并定容至500mL,配制PositiveControl工作液和Negative Control工作液;样本稀释:用于抗体滴度检测;2、在对应板孔内加入100μL稀释后的待检样品,Positive Control工作液、Negative Control或参考品工作液,对于空白对照,在孔中加入100 Dilution Buffer;3、孵育:用封板膜封板,放置37℃恒温培养箱孵育1.0h;4、洗板;5、加HRP酶标物;6、显色:每孔加入100/>SubstrateSolution,用封板膜封板,放置37℃恒温培养箱避光孵育20min;7、每孔加入50 />StopSolution,轻轻震荡酶标板至混合均匀;8、用酶标仪测定各孔在450nm和630nm处波长的吸光值。
S蛋白的检测方法为:1、用Dilution Buffer对SARS-CoV-2 Spike Protein进行2倍梯度稀释,稀释区间为0.195-12.5ng/mL;2、在对应板孔内加入100稀释后的样本以及100/>配制好的标准曲线。空白对照孔加入100/> Dilution Buffer。用封板膜封板,轻轻震荡混匀,放置37℃孵育1.0h;3、取50mL 10×Washing Buffer,用超纯水/去离子水稀释并定容至500mL。弃去孔中液体,拍干酶标板,用1×Washing Buffer洗板,300/>/孔浸泡30s,拍干酶标板,进行下一次清洗,共洗板3次;4、用Dilution Buffer将Biotin-Anti-SARS-CoV-2 Spike Protein Antibody稀释至0.5/>,每孔加入100/>,用封板膜封板,放置37℃孵育1.0h,现用现配;5、弃去孔中液体,拍干酶标板,用1×Washing Buffer洗板,300μL/孔浸泡30s,拍干酶标板,进行下一次清洗,共洗板3次;6、用Dilution Buffer将Streptavidin-HRP稀释至0.1/>,每孔加入100/>,用封板膜封板,放置37℃孵育1.0h,现用现配;7、弃去孔中液体,拍干酶标板,用1×Washing Buffer洗板,300/>/孔浸泡30s,拍干酶标板,进行下一次清洗,共洗板3次;8、每孔加入100/> Substrate Solution,用封板膜封板,放置37℃避光孵育20min;9、每孔加入50/>Stop Solution,轻轻震荡酶标板至混合均匀;10、用酶标仪测定各孔在450nm和630nm波长的吸光值,请在终止3分钟内读数。
血清中新型冠状病毒S蛋白的表达量检测结果见图13(由左至右依次为G1~G8),SARS-CoV-2 S Protein抗体滴度检测结果见图14和图15。
由图13可以看出,在注射S protein-mRNA-LNP 24h时,血清里能够检测出S蛋白;G4&G5&G6与空白组比较都有显著性差异,ID&IM表达量约125ng/ml,MN约为100ng/ml,G6&G7&G8,有量效关系,存在剂量依赖性;此检测为血清中蛋白的表达,而MN更多的表达是在注射部位,且入血能力不强,故比其它组的表达量低,但其抗体滴度并不低(如图14)。
由图14、图15可以看出,S protein-mRNA-LNP使用IM(肌肉注射)、ID(皮内注射)、MN(微针注射),在Day7时滴度大致为105;在Day14时没有明显下降,Day21和Day28因为在第二次加强针后有了一定升高,并保持稳定;另外,微针注射设置了三个剂量,但是抗体滴度并没有呈现统计学差异,且微针注射量仅为1.2时,可达到与三种给药方式注射10/>一样的效果,这为临床上降低疫苗用量来增加安全性提供了可能性,进一步说明微针注射可使用低剂量达到相同的抗体滴度,为疫苗的低剂量使用提供了支持,进而具有提高疫苗安全性的潜力。
虽然本发明披露如上,但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员,在不脱离本发明的精神和范围内,均可作各种更动与修改,因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
Claims (1)
1.pH5.5的缓冲液在制备高载药量的微针注射mRNA疫苗中的用途,其特征在于,所述mRNA疫苗由水相溶液和脂质溶液组成,脂质溶液用于包裹水相溶液的物质;其中,水相溶液由用于编码抗原的mRNA和缓冲液组成,缓冲液由氨基丁三醇、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、冰乙酸、三水乙酸钠和DEPC水组成;所述缓冲液中的氨基丁三醇:三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐:冰乙酸:三水乙酸钠:DEPC水的质量比为99.2:377.6:13.76:64:40;所述脂质溶液中的脂质含量为10~20mg/mL,所述脂质由SM-102、胆固醇、DSPC和DMG-PEG2000组成,所述脂质中的SM-102:胆固醇:DSPC:DMG-PEG2000的质量比为141.36:59.26:31.44:14.97;所述编码抗原的mRNA为编码新型冠状病毒的S蛋白的mRNA。
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