CN115427070A - 抗猪肺炎支原体疫苗 - Google Patents

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Abstract

公开了一种包含与猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)菌苗缔合的纳米颗粒的疫苗，其中这些纳米颗粒包含阳离子多糖和阴离子磷脂。

Description

抗猪肺炎支原体疫苗
技术领域
本发明涉及包含与猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)菌苗缔合的纳米颗粒的疫苗，以及该疫苗用于预防猪感染的用途。
背景技术
猪肺炎支原体(在下文中还称为Mhyo)是一种细胞壁缺陷型细菌，并且是猪地方性肺炎(一种猪传染性和慢性疾病)的病原体。Mhyo感染猪的呼吸道，并在气管、支气管和细支气管上繁殖。它附着并最终杀伤肺上皮细胞的纤毛，导致肺损伤和继发性感染，例如由其他支原体种类的感染，例如猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)和絮状支原体(Mycoplasmaflocculare)以及PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征病毒)和PCV2(猪2型病毒)的感染。
该疾病通过被感染猪的肺中排出的经空气传播的Mhyo病原体在猪之间传播。
特别是，Mhyo感染导致体重增加减少，饲料转化变差，并因此导致商业养猪场的显著经济损失。
由于Mhyo细菌缺少细胞壁，大多数常见的抗生素是无效的，因为它们集中于细胞壁合成。
用于抗Mhyo病原体使用的疫苗是已知的，并且是可商购的，例如，
Figure BDA0003893243820000011
(Zoetis)、
Figure BDA0003893243820000012
M.hyo、和
Figure BDA0003893243820000013
(Boehringer Ingelheim)、
Figure BDA0003893243820000014
(Merial)、
Figure BDA0003893243820000015
Mycoplasma(Elanco Animal Health)、
Figure BDA0003893243820000021
PCV MH(Zoetis)和
Figure BDA0003893243820000022
以及
Figure BDA0003893243820000023
Mhyo(均可商购自MSD Animal Health)。
这些疫苗都含有经典佐剂，含有非自身化合物作为佐剂，诸如矿物油和植物油、非天然聚合物和氢氧化铝，以增强免疫应答并任选地还稳定Mhyo抗原。非自身化合物增强免疫应答，但也可能产生不需要的位点效应(site effect)。特别是猪对赋形剂(诸如矿物油、明矾颗粒和其他非自身化合物)非常敏感。本发明的一个目的是提供一种有效但不诱导典型地与经典佐剂相关联的位点效应的疫苗。
此外，本发明的一个目的是提供用于在预防猪肺炎支原体感染中使用的方便、安全且有效的疫苗。
另外，商业疫苗通常作为两次注射方案进行施用，即通过初始疫苗接种，然后在第一次施用后2或3周内进行加强疫苗接种，以确保成功免疫。然而，这种两次注射应用就效率和成本而言是不利的。
因此，本发明的另一个目的是提供在一次注射方案中有效的疫苗。
此外，由于必须确保所有疫苗组分的安全性和稳定性，组合疫苗的开发是繁杂的，并且组合疫苗的开发并不简单。特别是减毒活疫苗和菌苗的组合对于稳定性是有害的，并且难以选择稳定这两种抗原的赋形剂。
因此，本发明的另一个目的是提供使用安全和/或稳定的组合疫苗。
发明内容
这些目的已经通过本发明的以下方面令人惊讶地得到解决：
根据本发明的组合物包含与猪肺炎支原体菌苗缔合的纳米颗粒，其中这些纳米颗粒包含阳离子多糖和阴离子磷脂。
令人惊讶地发现，包含Mhyo菌苗和上述含有多糖(常见膳食化合物)和磷脂(受试者自己的化合物，即自身化合物)的纳米颗粒的疫苗提供了用于预防猪肺炎支原体感染的稳定且有效的疫苗，同时不诱导不需要的位点效应。
因此，本发明还涉及用于在预防猪的猪肺炎支原体感染中使用的疫苗。在下文中，该疫苗还可以被称为根据本发明的疫苗。
本发明还涉及包括第一疫苗、第二疫苗和说明书的套件药剂盒，其中所述第一疫苗是根据本发明的疫苗，并且所述第二疫苗包含减毒活猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。
在另一方面，本发明涉及用于预防猪的猪肺炎支原体感染的方法，该方法包括施用有效量的疫苗。
在又另一方面，本发明涉及本发明疫苗在制备用于预防猪的猪肺炎支原体感染的药物中的用途。
在又另一方面，本发明涉及在小瓶中包含第一疫苗和第二疫苗的混合物的组合疫苗，其中所述第一疫苗是根据本发明的疫苗，并且所述第二疫苗包含减毒活猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。组合疫苗可以是所谓的RTU(即用型)疫苗，因此以制造商生产的混合形式递送至终端用户，或者可以是例如在向受试动物施用之前进行混合的疫苗(例如通过将PRRS病毒溶解在Mhyo疫苗中)。
具体实施方式
以下定义与本发明的实施方案相关。
术语“疫苗”涉及药物组合物。所述组合物能够在动物中诱导针对病原微生物(“病原体”)的保护性免疫，即诱导针对病原体感染和/或作为该感染结果的障碍或疾病的有效预防性治疗。
抗原通常涉及在宿主动物中诱导特异性免疫应答的任何物质，并且可以包括整个生物体(杀伤的、减毒的或活的)、生物体的亚单位或部分、含有编码免疫原的多核苷酸的重组载体、蛋白质、多肽、肽、表位、半抗原或其任何组合。菌苗是特异性抗原。术语“菌苗”是指杀伤细菌的悬浮液，例如通过浓缩细菌培养物获得，该细菌培养物随后用化学药剂(诸如二乙烯亚胺(BEI)、氯甲酚、福尔马林)灭活，或例如通过UV光或不针对细胞裂解的其他类型灭活。与菌苗相反，裂解物是抗原，其中灭活的细菌在细胞裂解或破坏过程(例如像冻融循环、超声处理、弗氏压碎、珠磨法等)中被明确处理。
“纳米颗粒”是具有粒度在nm范围内的颗粒，即，平均体积粒径(D50)在1和1000nm之间。在实施方案中，纳米颗粒具有1至500nm的平均体积粒径(D50)。例如，平均体积粒径在10和400nm之间，诸如在20和300nm之间和在30和200nm之间。通常，平均体积粒径在35和150nm之间。可以通过激光衍射测定平均体积粒径。在优选的实施方案中，使用MalvernAutosizerTM 4700(Malvern Instruments S.A.，英国)，通过动态光散射测量粒径。优选地，用488nm激光束，以90°的固定角进行测量。优选地将15mMol NaCl的水溶液用作分散剂，其中将纳米颗粒按0.5mg/ml浓缩。优选测量一式三份进行。
术语“ζ电势”是指分散介质和分散颗粒的稳定层之间的电荷。因此，ζ电势是颗粒的表面电荷，界面处的任何吸附层和周围悬浮介质的性质和组成的函数。在优选的实施方案中，使用zetasizer nano ZS(Malvern Instruments，法国)，通过光子相关光谱法测定ζ电势。优选地，在作为介质的水中进行测量。优选一式三份进行测量。
术语对感染的“有效预防性治疗”或“预防”应理解为涵盖预防、改善或减轻治疗后感染或由治疗后感染引起的疾病或障碍。
用于在预防中使用的疫苗的术语“一次注射”或“单剂量”施用涉及不需要第二次或“加强”疫苗接种，并且在提供保护性免疫方面仍然有效的疫苗接种。应注意，该术语不排除单剂量作为同时施用的两个或更多个分开的剂量施用。
术语“包含(comprising)”的含义应解释为涵盖所有具体提及的特征以及任选的、另外的、未指定的特征，而术语“由······组成(consisting of)”仅包括指定的那些特征。因此，“包含(comprising)”作为限制性情况包括由“由······组成(consisting of)”指定的组合物。
如本文所用，术语“猪(pig)”是指仔猪(piglet)、生猪(swine)、猪(pig)、猪(porcine)、母猪(sow)、小母猪(gilt)、阉猪(barrow)、野猪(boar)，即猪科的所有成员。
除非另有说明，否则术语“wt.-％”是指基于疫苗总重量的特定组分的重量。
根据本发明的优选的实施方案在下文中定义。优选的实施方案优选单独或组合使用。此外，应理解以下优选的实施方案是指本发明的所有方面，即疫苗、所使用的疫苗、套件药剂盒、治疗方法、用于制备药物的用途以及组合疫苗。
在实施方案中，本发明涉及包含与猪肺炎支原体菌苗缔合的纳米颗粒的疫苗，其中这些纳米颗粒包含阳离子多糖和阴离子磷脂。
本发明的纳米颗粒是已知的，并且用于获得所述颗粒的方法描述特别在Paillard等人,Pharm.Res.2010,第27卷,第126-133页,WO 2014/041427和WO 2018/104762,以及其中的参考文献中。
在优选的实施方案中，可以通过将相应的多糖(例如，麦芽糖糊精在2N氢氧化钠水溶液中)溶解，并且添加交联剂(例如，表氯醇)，随后添加阳离子配体(例如，缩水甘油基-三甲基氯化铵；羟胆碱)来制备阳离子多糖。然后可以优选用乙酸来中和pH值，并且优选在压力下剪切混合物以获得阳离子多糖纳米颗粒。
随后将获得的阳离子多糖加载阴离子磷脂，优选地通过在合适的溶剂(例如，乙醇，例如，持续约1小时)中将阳离子生物聚合物和阴离子磷脂(例如，二棕榈酰基-磷脂酰甘油)混合。
在实施方案中，阳离子多糖是多孔的阳离子多糖。
纳米颗粒可以是多孔的纳米颗粒，即在颗粒的“主体”中具有空隙，使得液体或空气可以进入颗粒中。因此阳离子多糖可以是多孔的，使得阴离子磷脂可以填充孔，并且阴离子磷脂至少部分地存在于纳米颗粒的核心中。
通常，(多孔的)颗粒具有至少0.1m2/g、至少0.5m2/g、5m2/g、至少10m2/g或至少20m2/g的BET(比表面积)。优选地，纳米颗粒的BET为至少5m2/g。通过将样品置于不同压力下的氮气/氦气气氛中进行比表面积的测定。冷却样品导致氮分子在颗粒表面上冷凝。通过氮/氦混合物的热导率的变化来确定冷凝的氮量，并且使用氮的面积要求来确定样品的表面积。使用该值和样品重量计算比表面积。比表面积可通过使用BET吸附计，诸如MonosorbTM,Fa.Quantachrome，随后使用DIN ISO 9277(于2014年1月出版)获得。
在实施方案中，纳米颗粒包含重量比为40:1至1:20、或20:1至1:10、或10:1至1:3的阳离子多糖和阴离子磷脂。在优选的实施方案中，纳米颗粒包含重量比为10:1至1:3的阳离子多糖和阴离子磷脂。
在实施方案中，纳米颗粒具有在0和70mV之间、在5和65mV之间或在10和50mV之间的ζ电势。优选地，纳米颗粒具有在10和50mV之间的ζ电势。
纳米颗粒具有外部部分(即表面)和内部部分(即核)。在具体的实施方案中，特别可以从纳米颗粒的ζ电势推断外部部分基本上不含阴离子磷脂。因此，外部部分基本上由阳离子多糖组成，并且核心含有阴离子磷脂。在优选的实施方案中，阳离子多糖是多孔的。在该实施方案中，阴离子磷脂优选地填充孔。因此，在优选的实施方案中，阴离子磷脂存在于纳米颗粒的内部，即核心。在优选的实施方案中，纳米颗粒形成核心，其中阴离子磷脂存在于核心内。在实施方案中，纳米颗粒不包含围绕核心的磷脂层。磷脂层是包含磷脂的层。
Mhyo菌苗是可商购的，并且用于获得菌苗的方法对于技术人员是已知的，例如，通过培养Mhyo细胞并随后使这些细胞失活。
在实施方案中，疫苗具有的纳米颗粒与Mhyo菌苗的重量比为1:10至10:1、或1:5至5:1或1:2至2:1。在优选的实施方案中，纳米颗粒与Mhyo菌苗的重量比为1:1至1:3，例如像1:1。
Mhyo菌苗和纳米颗粒是缔合的，即它们形成组合物，其中菌苗通过分子间力(诸如范德华力和静电力)与颗粒结合。据信Mhyo菌苗与纳米颗粒的外部缔合。在实施方案中，与Mhyo菌苗缔合的纳米颗粒具有的观察D50值(使用激光衍射方法)在200和1500nm之间、或300和1200nm之间或400和1100nm之间(观察值主要取决于测量方法)。
优选地，阳离子多糖可从选自淀粉、葡聚糖和麦芽糖糊精的多糖获得。更优选地，阳离子多糖核心是通过将多糖(选自淀粉、葡聚糖和麦芽糖糊精)和配体(选自伯胺、仲胺和叔胺以及季铵盐)进行反应获得的交联聚合物。交联剂是技术人员已知的，并且优选的交联剂是表氯醇(1-氯-2,3-环氧丙烷)。
在实施方案中，阴离子磷脂选自二酰基磷脂酰甘油、二酰基磷脂酰丝氨酸和二酰基磷脂酰肌醇，其中在每种情况下酰基可以衍生自羧酸。在优选的实施方案中，阴离子磷脂是二棕榈酰基-磷脂酰甘油(DPPG)。
通过将多糖核心和阴离子磷脂混合，阳离子多糖核心可以加载阴离子磷脂。应当理解，术语“加载的”是指阴离子磷脂和阳离子多糖的混合物。
在实施方案中，阳离子多糖是阳离子聚麦芽糖糊精，可通过将交联的麦芽糖糊精与缩水甘油基-三甲基铵进行反应而获得。
在实施方案中，疫苗包含药学上可接受的溶剂，从而提供作为所谓的即用型疫苗的疫苗。优选地，溶剂包含水，并且将菌苗以仍保持其有效性的这样的方式进行稀释。在优选的实施方案中，溶剂包括盐水溶液和/或磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)。在另一个实施方案中，可以提供在施用前作为与药学上可接受的溶剂混合的冻干物的疫苗。
在实施方案中，疫苗基本上不含经典佐剂，诸如油和/或氢氧化铝，和/或皂苷和/或卡波普。
“基本上不含”是指基于疫苗的总组合物低于0.1％(v/v)的浓度。
佐剂通常可以根据它们诱导的免疫学事件进行分类。第一类，包括例如ISCOM(免疫刺激复合物)、皂苷(或其级分和衍生物，诸如Quil A)、氧化铝、脂质体、共螯合物、聚乳酸/乙醇酸，通过APC(抗原呈递细胞)促进抗原摄取、转运和呈递收。第二类，包括例如油乳液、凝胶、聚合物微球、非离子嵌段共聚物和最可能地还有氢氧化铝，提供贮库效应。第三类，特别包括富含CpG的基序、单磷酰脂质A、分枝杆菌(胞壁酰二肽)、酵母提取物、霍乱毒素，是基于对保守微生物结构的识别，所谓的病原体相关微生物模式(PAMP)，定义为信号0。第四类，特别包括油乳液、表面活性剂、氢氧化铝、低氧因子，是基于刺激免疫系统在危险和无害(其不必与自身和非自身相同)之间的区分能力。第五类，特别包括细胞因子，是基于共刺激分子(信号2)在APC上的上调。佐剂有助于提供足够的免疫应答。尽管目前的纳米颗粒不能清楚地确定属于这些类别之一，但似乎在一些特定的群集中仍可获得佐剂效应。
疫苗可以任选地包含辅助物质，诸如润湿剂、pH缓冲剂、粘度增强添加剂和防腐剂。合适的辅助物质例如披露于Mark Gibson的“Pharmaceutical Preformulation andFormulation”，第2版。
应当理解，疫苗含有处于免疫学有效量的Mhyo菌苗。这样的量可以基于公知常识容易地确定，并且可以例如是如存在于商业产品Porclis Mhyo ID ONCE(MSD AnimalHealth)中的Mhyo菌苗或市场上可获得的任何其他菌苗产品的量。
在实施方案中，将疫苗以0.1和3ml/剂量之间，优选0.2和2ml/剂量之间的体积向靶动物施用。在实施方案中，疫苗含有2μg至10mg、10μg至5mg、20μg至2000μg或200μg至2000μg纳米颗粒/剂量疫苗。通常，疫苗含有在1和5mg之间的纳米颗粒/剂量疫苗。
在实施方案中，疫苗用于预防猪的猪肺炎支原体感染。
在实施方案中，将所使用的疫苗在第1周和第5周之间，例如在猪生命(出生后)的第2周和第4周之间进行施用。在另一个实施方案中，将所使用的疫苗在生命的第1周和第5周之间作为一次注射方案进行施用。
在另一个实施方案中，将疫苗全身施用。与局部给药(例如像鼻内或胃内)相反，全身施用是指将疫苗在受试者的循环系统中递送，并因此固有地影响其全身。全身施用的示例包括肌肉内(IM)、静脉内(IV)、皮内(ID)、透皮(TD)和皮下(SC)。
在实施方案中，将疫苗皮内施用。优选地，通过使用IDALTM(液体的皮内应用)注射系统，通过无针注射施用疫苗。IDAL是基于压力的应用系统(来自MSD Animal Health)。
在实施方案中，所使用的疫苗作为单剂量施用。因此，与多次施用(例如，包括初始疫苗接种和加强疫苗接种的两次注射应用)相反，疫苗作为一次注射施用进行施用。
在优选的实施方案中，将所使用的疫苗作为单剂量皮内施用于靶动物。
通常，疫苗用于减少由于猪肺炎支原体感染引起的肺损伤。发现与模拟疫苗接种的对照猪相比，肺损伤降低了10％至100％，并且甚至降低了50％至100％。
与未经处理的对照猪相比，使用普通评分系统的肺损伤评分(LLS)可以降低10％至100％，通常降低了50％至100％。
如实施例1中更详细描述的，在挑战三周后测量LLS。肺损伤和LLS的降低是指用本发明的疫苗处理的猪与未经处理的猪相比的比较。LLS是关于疫苗的免疫有效性的有用指标。可以通过测量肺损伤的百分比并将其转化为Goodwin与Whittlestone评分(Goodwin等人Veterinary Record,“The detection of enzootic pneumonia in pig herds.I.Eightyears general experience with a pilot control scheme”)来确定LLS，产生LLS。
在实施方案中，本发明涉及包括第一疫苗、第二疫苗和说明书的套件药剂盒，其中所述第一疫苗是根据本发明的疫苗，并且所述第二疫苗包含减毒活猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。说明书包含使用说明书。套件药剂盒可以进一步包括针头和/或注射器。
减毒活病原体是具有毒力降低的病原体的活的、能复制形式。减毒过程利用感染性病原体并改变它，使得它变得无害或毒力较低，例如通过使病原体通过细胞系统的多次传代或通过对病原体进行基因修饰。
在实施方案中，本发明涉及包含第一疫苗和第二疫苗的混合物的组合疫苗，其中所述第一疫苗是根据本发明的疫苗，并且所述第二疫苗包含减毒活猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。
作为同时施用的替代方案，还可以将第一和第二疫苗作为联合的非混合疫苗提供，用于共同施用。因此，疫苗在施用之前不混合，而是在1小时的时间框架内，优选在30min、25min、20min、15min、10min、9min、8min、7min、6min、5min、4min、3min、2min或1min内单独施用于猪。
然而，两种疫苗的组合通常有利于使向每只猪施用的注射量最小化，并另外提高效率。然而，在当将两种或多种疫苗混合时，稳定性问题是常见的，因为每种疫苗可能需要不同的赋形剂，因此导致其中一种疫苗的不稳定性、活性降低和/或降解。令人惊讶地，在本发明纳米颗粒的存在下，减毒活PRRSV的稳定性增加。
在实施方案中，将根据本发明的组合疫苗预防Mhyo感染和预防PRRSV感染。
在实施方案中，本发明涉及包含根据本发明的疫苗或根据本发明的组合疫苗的小瓶。优选地，小瓶为PET小瓶。优选地，这些小瓶含有2ml、20ml、50ml、100ml、200ml或500ml疫苗或组合疫苗。
现在将使用以下实施例进一步解释本发明。
实施例
实施例1：肺损伤评分
挑战材料：
使用以1ml等分试样冷冻，并且储存在<-50℃下的菌苗猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae)菌株98。
挑战材料的制备：
将猪肺炎支原体菌株98在FRIIS+20％SPF血清中稀释2000倍。将该培养物在37℃(50RPM)下孵育四至五天。在孵育4天和5天后，取该培养物的样品进行挑战。在挑战之前和之后，通过用0.5ml培养物接种4.5ml FRIIS肉汤+20％ SPF(无特定病原体)血清，混合，并将0.5ml培养物从一个试管转移到另一个试管，直到10-10来进行活菌计数。将CCU(颜色变化单位)试管在37℃下孵育3周。
挑战程序：
将72只、3周(±3天)龄的SPF猪分配到6个组，每组12只动物。将每组的4只动物加入到组1-4，每组总共16只动物。在连续两天使用具有10ml纯培养物的导管对所有动物进行气管内挑战。
剂量和施用：
疫苗包含加载二棕榈酰基-磷脂酰甘油的多孔阳离子麦芽糖糊精纳米颗粒，具有D50值为37nm，并且ζ电势为+37mV，按2.9mg颗粒/0.4ml剂量。用Mhyo菌苗和Mhyo裂解物制备测试疫苗，当与现有技术中的纳米颗粒一起使用时，后者类型的抗原通常更有效。通过将颗粒与菌苗配制品(BEI灭活的Mhyo细菌)按重量比为1:1(颗粒:Mhyo抗原)混合，并且使混合物静置24小时以沉降，从而实现颗粒和抗原的缔合来制备菌苗疫苗。因此制备裂解物疫苗，不同之处在于使菌苗经受超声处理以裂解细胞。在与Mhyo抗原缔合后，颗粒的ζ电势为+14.9mV(对于菌苗疫苗)和+15.6mV(对于裂解物疫苗)。
在3周龄和5周龄时，根据表1，对仔猪在颈部进行局部(鼻内)或全身(使用
Figure BDA0003893243820000141
疫苗接种器，将疫苗部分沉积在真皮中，并且部分沉积在肌肉组织中)疫苗接种。作为阳性对照，根据制造商的说明书使用商业产品
Figure BDA0003893243820000142
Mhyo ID ONCE。
新颖的疫苗不诱导不需要的位点效应并且被认为是安全的。在挑战后第21天对猪实施安乐死，以确定由于肺炎导致的肺损伤评分。在尸体剖检期间，确定肺损伤的百分比，并将评分转化为Goodwin&Whittlestone评分(同上)，得到肺损伤评分。结果显示在表1中。
表1肺损伤评分中位数
Figure BDA0003893243820000143
*NP＝纳米颗粒；IN＝鼻内；ID＝皮内；w/o＝无
如可以从表1中推断，如与局部应用相比，包含Mhyo菌苗和纳米颗粒的疫苗的全身施用显著降低肺损伤评分。而且，菌苗疫苗比Mhyo裂解物明显更有效。这与现有技术相比是令人惊讶的，在目前，纳米颗粒通常应用于使用裂解物作为抗原的局部疫苗接种。
实施例2：单剂量与双剂量施用
类似于上述实施例1，确定四组猪的LLS，每组包含20只猪。
在组1中(一次注射ID)，用单剂量(一次注射)疫苗接种的0.2mL疫苗，在第4周对猪进行皮内疫苗接种。在组2中(两次注射ID)，在第1周，用0.2mL初始疫苗接种，随后在第4周用0.2mL加强疫苗接种来对猪进行皮内疫苗接种。在组3中，在第4周，用单剂量(一次注射)0.4mL疫苗对猪进行皮内疫苗接种。在第4组中，没有发生疫苗接种。在组1至3中的疫苗是同一的，并且包含纳米颗粒和Mhyo菌苗(重量比1:1)，其中0.2ml的每个剂量包含2.18mg纳米颗粒。配制颗粒的ζ电势为+15.2mV。
结果显示在下面的表2中。
表2：疫苗接种之后的LLS
Figure BDA0003893243820000151
如表可以看出，与两次注射施用相比，十分令人惊讶地，单剂量施用不会导致LLS增加。甚至更强地，LLS似乎进一步降低。这意味着使用目前的疫苗，可以使用单剂量疫苗接种以获得针对Mhyo的有效保护。
实施例3：PRRSV疫苗的稳定性
为确定在存在和不存在纳米颗粒的情况下减毒活PRRSV疫苗的稳定性，将PRRSV在含有和不含纳米颗粒的普通疫苗稀释剂Diluvac
Figure BDA0003893243820000161
(MSD Animal Health)中混合。在0、45、90和150min处，确定PRRSV在MARC细胞上的TCID50(组织培养感染剂量50)。TCID50对应于PRRSV抗原的效力。对于该实验，在每种情况下，将1.67mg纳米颗粒(参见实施例1)添加至eppendorf管，向该管中添加在稀释剂中的一定剂量的活PRRS病毒，目标为约7.2*10^5TCID50/试管。如可以从下表3和在每个测量时间间隔的TCID50值(*10^5)中看出，与不含纳米颗粒的配制品相比，在纳米颗粒的存在下PRRSV的稳定性增加。
表3 PRRSV的稳定性
Figure BDA0003893243820000162
*NP＝纳米颗粒；TCID50＝组织培养感染剂量50
如从表3中描述的结果可以看出，在纳米颗粒的存在下，稀释剂中PRRSV的稳定性令人惊讶地增加，这意味着组合疫苗对PRRSV组分的效力也增加。

Claims (16)

1.一种包含与猪肺炎支原体菌苗缔合的纳米颗粒的疫苗，其中所述纳米颗粒包含阳离子多糖和阴离子磷脂。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述阳离子多糖是多孔的多糖。
3.根据权利要求1或2所述的疫苗，其中所述阴离子磷脂选自二酰基磷脂酰甘油、二酰基磷脂酰丝氨酸和二酰基磷脂酰肌醇。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的疫苗，其中所述阳离子多糖通过将交联的麦芽糖糊精与缩水甘油基-三甲基铵进行反应可获得。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的疫苗，所述疫苗包含药学上可接受的溶剂。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗基本上不含油和/或氢氧化铝和/或皂苷类和/或卡波普。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的疫苗，用于在预防猪的猪肺炎支原体感染中使用。
8.根据权利要求7所述使用的疫苗，其中将所述疫苗全身施用。
9.根据权利要求7或8所述使用的疫苗，其中将所述疫苗皮内施用。
10.根据权利要求7至9中任一项所述使用的疫苗，其中将所述疫苗作为单剂量施用。
11.根据权利要求7至10中任一项所述使用的疫苗，用于在减少由于猪肺炎支原体感染引起的肺损伤中使用。
12.一种包括第一疫苗、第二疫苗和说明书的套件药剂盒，其中所述第一疫苗是根据权利要求1至6中任一项所述的疫苗，并且所述第二疫苗包含减毒活猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。
13.一种用于预防猪的猪肺炎支原体感染的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求1至6中任一项所述的疫苗。
14.根据权利要求1至6中任一项所述的疫苗在制备用于预防猪的猪肺炎支原体感染的药物中的用途。
15.一种包含第一疫苗和第二疫苗的混合物的组合疫苗，其中所述第一疫苗是根据权利要求1至6中任一项所述的疫苗，并且所述第二疫苗包含减毒活猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。
16.一种小瓶，所述小瓶包含根据权利要求1至6中任一项所述的疫苗或根据权利要求15所述的组合疫苗。
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