CN115418406A - 用于预测肺炎克雷伯菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法 - Google Patents
用于预测肺炎克雷伯菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115418406A CN115418406A CN202211147291.8A CN202211147291A CN115418406A CN 115418406 A CN115418406 A CN 115418406A CN 202211147291 A CN202211147291 A CN 202211147291A CN 115418406 A CN115418406 A CN 115418406A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- klebsiella pneumoniae
- gyra
- drug
- phenotype
- characteristic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims abstract description 88
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 88
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 66
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 title claims abstract description 61
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 title claims abstract description 17
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 50
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 claims abstract description 25
- GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N Levofloxacin Chemical compound C([C@@H](N1C2=C(C(C(C(O)=O)=C1)=O)C=C1F)C)OC2=C1N1CCN(C)CC1 GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N 0.000 claims abstract description 23
- 229960003376 levofloxacin Drugs 0.000 claims abstract description 23
- 101150070420 gyrA gene Proteins 0.000 claims description 49
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 42
- 101100139872 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) ramR gene Proteins 0.000 claims description 24
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 24
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 claims description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 12
- 101150013736 gyrB gene Proteins 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 101150012629 parE gene Proteins 0.000 claims description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 claims description 4
- 101100523287 Escherichia coli qnrB4 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 abstract 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 16
- 108010041052 DNA Topoisomerase IV Proteins 0.000 description 11
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 3
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N quinolin-2-ol Chemical compound C1=CC=C2NC(=O)C=CC2=C1 LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012549 training Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 229940127266 GyrB and ParE Drugs 0.000 description 1
- 206010061259 Klebsiella infection Diseases 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/22—Klebsiella
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于预测肺炎克雷伯菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法,通过检测特征组合中的基因的存在与否判断肺炎克雷伯菌对环丙沙星和左氧氟沙星药敏表型。本发明提供的特征组合预测药敏表型的准确率高,有利于临床开展对肺炎克雷伯菌相关感染的精准治疗。
Description
技术领域
本发明涉及基因测序技术,具体说,是一种用于预测肺炎克雷伯菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法。
背景技术
肺炎克雷伯菌是临床常见条件致病菌之一,可引起尿路感染、呼吸道感染、心内膜炎、脑膜炎和败血症等。在临床治疗中,喹诺酮类抗生素由于其抗菌活性强、使用方便等优势被广泛使用,如环丙沙星、左氧氟沙星等。同时,细菌对此类药物的耐药性也成蔓延趋势,耐药细菌种类不断增多,耐药程度也趋加重。临床精准治疗需根据药敏检测结果和耐药基因表型检测结果选用抗菌药物。因此,建立准确、快速的检测方法对肺炎克雷伯菌进行耐药表型预测,对指导临床治疗十分重要。
肺炎克雷伯菌对环丙沙星和左氧氟沙星产生耐药主要通过靶位结构基因突变、获得可转移的耐药基因、主动外排等机制介导。目前多项研究已经证实耐喹诺酮类抗菌药物的主要耐药基因有QnrB,主要突变基因有gyrA、parC、gyrB、parE 4种,但不同基因及基因变异类型对不同抗菌药物的耐药性存在差异。
目前针对肺炎克雷伯菌耐药性检测的方法可分为表型检测和基因型检测。在表型检测方面,临床的主要方法是微生物培养+药敏实验,该方法存在培养时间长,培养阳性率低等局限性,而无法完全满足临床精准治疗的需求。在基因检测方面,主要是针对特定耐药基因进行检测,但该检测内容较单一,并不能反应真实的药敏结果。因此急需寻找一种快速,不依赖于培养且一次全面检测临床常用抗生素药敏表型的方法以指导临床精准治疗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是,提供一种用于筛选肺炎克雷伯菌对两种常用的喹诺酮类抗生素(环丙沙星和左氧氟沙星)药敏表型的特征基因组合、试剂盒及用途,可一次性分析左氧氟沙星和环丙沙星2种抗生素耐药情况,具有较好的敏感性和特异性。
为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:一种用于预测肺炎克雷伯菌对抗生素药敏表型的特征基因组合,抗生素为环丙沙星和左氧氟沙星中的一种或两种组合,
预测肺炎克雷伯菌对环丙沙星药敏表型的特征基因突变位点和特征基因组合包括gyrA:248(C->T)、gyrA:2479(A->G)、gyrA:248(C->A)、gyrA:259(G->T)、gyrA:260(A->G)、gyrA:259(G->A)、ramR:415(AAAGAGATAT)、parC:239(G->T)、QnrB1、QnrB17,同时进行检测,若检测结果均为阴性,推测为敏感;若任一基因检测结果为阳性,推测为耐药;和/或
预测肺炎克雷伯菌对左氧氟沙星药敏表型的特征基因突变位点和特征基因组合包括ramR:319(C->T)、ramR:7(C->A)、gyrB:1401(A->C)、parE:1375(T->A)、gyrA:260(A->C)、gyrA:248(C->T)、gyrA:248(C->A)、gyrA:259(G->A)、gyrA:260(A->G)、gyrA:259(G->T),同时进行检测,若检测结果均为阴性,推测为敏感;若任一基因检测结果为阳性,推测为耐药。
所述预测肺炎克雷伯菌对环丙沙星药敏表型的特征基因突变位点和特征基因组合还包括ramR:175(T->C)、ramR:7(C->A)、ramR:319(C->T)、gyrB:1401(A->C)、QnrS1、QnrB4、QnrB20。
所述预测肺炎克雷伯菌对左氧氟沙星药敏表型的特征基因突变位点和特征基因组合还包括ramR:415(AAAGAGATAT)、parC:239(G->T)、gyrB:1394(C->T)、parE:619(G->A)、QnrB4。
上述用于预测肺炎克雷伯菌对抗生素药敏表型的特征基因组合检测试剂的试剂盒。
上述试剂盒对肺炎克雷伯菌进行药敏表型的测序方法,采用全基因组测序方法或宏基因组测序方法。
本发明的有益效果是:本发明是基于核酸分子检测耐药的方法,可不依赖于临床培养,直接针对临床标本进行检测鉴定病原菌种及耐药基因携带情况,从而根据预测模型预测其耐药表型,具有检测周期短,检测灵敏度高的特点。
附图说明
图1为本发明中肺炎克雷伯菌环丙沙星耐药基因组合对环丙沙星耐药表型预测的模型性能ROC图(A为训练集的模型预测性能ROC图,B为测试集的模型预测性能ROC图)。
图2是用于环丙沙星药敏表型预测的特征基因在公共数据库下载的肺炎克雷伯菌菌株中的检出结果(左半)与实际药敏表型结果和预测药敏表型结果之间的对应关系(右半)图。
图3为本发明中肺炎克雷伯菌左氧氟沙星耐药基因组合对环丙沙星耐药表型预测的模型性能ROC图(A为训练集的模型预测性能ROC图,B为测试集的模型预测性能ROC图)。
图4是用于左氧氟沙星药敏表型预测的特征基因在公共数据库下载的肺炎克雷伯菌菌株中的检出结果(左半)与实际药敏表型结果和预测药敏表型结果之间的对应关系(右半)图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述;显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例,基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明的用于预测肺炎克雷伯菌对抗生素药敏表型的特征基因组合,抗生素为环丙沙星和左氧氟沙星中的一种或两种组合,
预测肺炎克雷伯菌对环丙沙星药敏表型的特征基因突变位点和特征基因组合包括gyrA:248(C->T)、gyrA:2479(A->G)、gyrA:248(C->A)、gyrA:259(G->T)、gyrA:260(A->G)、gyrA:259(G->A)、ramR:415(AAAGAGATAT)、parC:239(G->T)、QnrB1、QnrB17,同时进行检测,若检测结果均为阴性,推测为敏感;若任一基因检测结果为阳性,推测为耐药;和/或
预测肺炎克雷伯菌对左氧氟沙星药敏表型的特征基因突变位点和特征基因组合包括ramR:319(C->T)、ramR:7(C->A)、gyrB:1401(A->C)、parE:1375(T->A)、gyrA:260(A->C)、gyrA:248(C->T)、gyrA:248(C->A)、gyrA:259(G->A)、gyrA:260(A->G)、gyrA:259(G->T),同时进行检测,若检测结果均为阴性,推测为敏感;若任一基因检测结果为阳性,推测为耐药。
所述预测肺炎克雷伯菌对环丙沙星药敏表型的特征基因突变位点和特征基因组合还包括ramR:175(T->C)、ramR:7(C->A)、ramR:319(C->T)、gyrB:1401(A->C)、QnrS1、QnrB4、QnrB20。
所述预测肺炎克雷伯菌对左氧氟沙星药敏表型的特征基因突变位点和特征基因组合还包括ramR:415(AAAGAGATAT)、parC:239(G->T)、gyrB:1394(C->T)、parE:619(G->A)、QnrB4。
上述用于预测肺炎克雷伯菌对抗生素药敏表型的特征基因组合检测试剂的试剂盒。
上述试剂盒对肺炎克雷伯菌进行药敏表型的测序方法,采用全基因组测序方法或宏基因组测序方法。
实施例1用特征组合对公共数据库中肺炎克雷伯菌的药敏表型进行预测
1.1数据收集:从公共数据库(NCBI NDARO数据库和PATRIC数据库)及国内合作医院收集整理了3196株肺炎克雷伯菌的基因组其对应抗生素药敏表型数据。其中环丙沙星(CIP)的耐药菌株2187株,敏感菌株479株;左氧氟沙星(LEV)的耐药菌株1812株,敏感菌株472株。
1.2耐药基因及突变检测:用ncbi-blast(v2.9.0+)软件将组装好的基因组序列与耐药数据库进行比对(参数:-evalue 1e-5-outfmt 0-num_alignments 10000),进行上述耐药基因和突变位点检测。对于基因有无特征,与该耐药基因的参考序列的比对一致率高于90%且覆盖率高于60%,则认为有该耐药基因检出。对于基因突变特征,若比对上该耐药基因的序列支持该突变位点,则认为有该突变检出。
1.3统计各肺炎克雷伯菌的菌株中耐药基因和突变的检出情况。
1.4药敏结果预测:对于某一株菌的任一种抗生素的药敏预测,检测出特征组合中的任一种特征,则认为该菌株对该抗生素表型耐药;否则,则判断为敏感。如图2和图4所示,环丙沙星和左氧氟沙星两种模型中,通过各菌株中的检出的特征预测得到的药敏结果,和实际药敏表型高度一致。另外,图1和图3的ROC结果也说明,环丙沙星和左氧氟沙星两个模型的预测性能较高,训练集和验证集的模型AUC值均达到0.97以上。预测性能如表1所示,特征组合预测环丙沙星和左氧氟沙星的药敏表型准确率分别为0.964、0.966,特异性和敏感度也在较高的水平。上述结果说明,利用上述特征组合,对肺炎克雷伯菌表型耐药和表型敏感有较好的区分效果。
表1.特征组合预测公共数据库来源菌株的药敏表型性能
表2.特征基因和突变在公共数据库来源的菌株中的检出频数
实施例2用特征组合对临床标本分离的肺炎克雷伯菌菌株的药敏表型进行预测
2.1样本采集:从某医院采集临床标本中分离的肺炎克雷伯菌菌株88例,并收集相应的药敏结果。其中左氧氟沙星耐药菌株51例,敏感(S)菌株23例;环丙沙星耐药(R)菌株61例,敏感(S)菌株20例。
2.2样本全基因组测序:对样本进行核酸提取、通过Qubit检测,确认DNA可以满足后续测序要求,对提取的核酸进行文库建库及高通量测序(Illumina Novaseq6000PE150)。
2.3测序数据质量控制:使用fastp(v0.19.5)软件对得到的原始fastq序列数据进行过滤(参数设置:-q 15-u 40-l read_length*0.67),去除低质量和短序列;同时使用komplexity(v0.3.6)软件计算序列信息复杂度(参数设置:-F-t 0.4),并过滤掉低复杂度的序列。
2.4耐药基因检测:使用blastn(版本2.9.0+)软件将reads序列与耐药基因参考序列进行比对。参考序列的比对一致率高于90%的reads大于1条,则认为有该耐药基因检出。
2.5药敏表型结果判定:对于某一株菌的任一种抗生素的药敏预测,检测出特征组合中的任一种特征,则认为该菌株对该抗生素表型耐药;否则,则判断为敏感。将上述药敏预测结果与同时收集到的临床标本实际药敏测试结果进行对比,准确率(AUC),阳性符合率(PPV),阴性符合率(NPV),敏感度,特异性来均在0.9以上,检出结果总结于表2。以上结果说明,对实际收集的从临床标本中分离的肺炎克雷伯菌,利用相应特征组合也有着较高的准确率、敏感度和特异性,说明本发明有较高的实用价值。
表3收集菌株预测结果统计表
实施例3用优选的重要特征组合对公共数据库中肺炎克雷伯菌的药敏表型进行预测
3.1综合实施例1中各特征的检出频率、阳性预测值和特征间共同检出关系,选择gyrA:248(C->T)、gyrA:2479(A->G)、gyrA:248(C->A)、gyrA:259(G->T)、gyrA:260(A->G)、gyrA:259(G->A)、ramR:415(AAAGAGATAT)、parC:239(G->T)、QnrB1、QnrB17基因有无作为环丙沙星的重要特征组合,选择ramR:319(C->T)、ramR:7(C->A)、gyrB:1401(A->C)、parE:1375(T->A)、gyrA:260(A->C)、gyrA:248(C->T)、gyrA:248(C->A)、gyrA:259(G->A)、gyrA:260(A->G)、gyrA:259(G->T)基因有无作为左氧氟沙星的重要特征组合。
3.2针对实施例1中下载的肺炎克雷伯菌菌株,根据1.2得出的特征检出结果,对3.1所述优选特征进行统计。
3.3检测出优选特征组合中的任一种特征,则认为该菌株对该抗生素表型耐药;否则,则判断为敏感。如表4所示,利用优选的耐药特征预测药敏表型有着较好的准确率、灵敏度和特异性。可见,利用优选的特征组合也可以较好的预测公共数据库中下载的肺炎克雷伯菌的药敏表型。
表4.利用优选特征组合预测公共数据库来源菌株的药敏表型的性能
实施例4用优选的重要特征组合对临床标本内的肺炎克雷伯菌进行药敏表型预测
4.1针对实施例2中从医院收集的肺炎克雷伯菌菌株,根据2.4得出的特征检测结果,对3.1中优选的重要特征进行统计。
4.2检测出优选特征组合中的任一种特征,则认为该菌株对该抗生素表型耐药;否则,则判断为敏感。如表5所示,利用优选的耐药特征预测药敏表型有着较好的准确率、灵敏度和特异性。可见,利用优选的特征组合也可以较好的预测从临床标本中分离的肺炎克雷伯菌的药敏表型。
表5.利用优选特征组合预测医院收集的菌株的药敏表型的性能
实施例5用优选的重要特征组合对临床标本中的肺炎克雷伯菌进行药敏表型预测
5.1样本采集:从某医院采集了培养结果为肺炎克雷伯菌阳性,且进行了药敏测试的临床标本169例,包括痰液,肺泡灌洗液,脑脊液。
5.2样本高通量测序测序:对样本进行DNA提取、通过Qubit检测,确认DNA质量可以满足后续测序要求,对提取的DNA进行文库建库及高通量测序(Illumina Nextseq550SE75)。
5.3测序数据指控:使用fastp(v0.19.5)软件对得到的原始fastq序列数据进行过滤(参数设置:-q 15-u 40-l read_length*0.67),去除低质量序列和过短序列;同时使用komplexity(v0.3.6)软件计算序列信息复杂度(参数设置:-F-t 0.4),并过滤掉低复杂度的序列。
5.4人源序列去除:将质控过滤得到的clean序列,使用bowtie2(v2.3.4.3)软件进行与人参考基因组序列(human_38)进行比对(参数设置:--mm--very-sensitive-k 1),以过滤掉人源序列。
5.5物种注释:使用minimap2软件(v2.17)将Illumina reads序列与以上设定的目标病原参考基因组序列库(来源于NCBI genome数据库)进行比对(比对参数:-x sr-a--secondary=no-L)),并采用LCA算法进行物种注释统计,最后统计检出肺炎克雷伯菌的序列数和基因组覆盖度。
5.6耐药特征检测:使用blastn(版本2.9.0+)软件将reads序列与耐药基因参考序列进行比对。对于基因有无特征,参考序列的比对一致率高于90%的reads大于1条,则认为有该耐药基因检出。对于耐药基因突变特征,针对某一突变位点,如果支持该突变位点的reads比例大于0.2,则认为有该突变检出。
5.7药敏表型预测:用3.1所述的各抗生素的重要特征组合对临床标本中肺炎克雷伯菌对各抗生素的药敏表型进行预测。针对某一个抗生素,有任一重要特征检出,则认为肺炎克雷伯菌对该抗生素耐药;否则,肺炎克雷伯菌对该药敏感。当检出的基因组覆盖度小于一定比例且没有耐药特征检出时,由于不能确定该特征是否存在(特征可能存在于未覆盖的区域),因此无法给出预测。表6为部分临床标本统计结果:
表6.部分临床标本的检测信息
“/”表示在当前基因组覆盖度下,无法对药敏表型进行预测。
基因组覆盖度表示在宏基因组测序得到的数据中,归属于肺炎克雷伯菌的reads比对上的参考基因组的碱基数和参考基因组全碱基数的比率。由表7可见,通过宏基因组测序方法,利用上述优选的特征组合,可预测绝大部分临床标本中的肺炎克雷伯菌对两种抗生素的药敏表型,且准确率高,说明本发明在辅助肺炎克雷伯菌感染的治疗中有较高的应用价值。
表7.利用优选特征组合预测临床标本中的肺炎克雷伯菌的药敏表型的性能
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点,其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施,不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围,即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰,仍落在本发明的专利范围内。
Claims (5)
1.一种用于预测肺炎克雷伯菌对抗生素药敏表型的特征基因组合,其特征在于,抗生素为环丙沙星和左氧氟沙星中的一种或两种组合,
预测肺炎克雷伯菌对环丙沙星药敏表型的特征基因突变位点和特征基因组合包括gyrA:248(C->T)、gyrA:2479(A->G)、gyrA:248(C->A)、gyrA:259(G->T)、gyrA:260(A->G)、gyrA:259(G->A)、ramR:415(AAAGAGATAT)、parC:239(G->T)、QnrB1、QnrB17,同时进行检测,若检测结果均为阴性,推测为敏感;若任一基因检测结果为阳性,推测为耐药;和/或
预测肺炎克雷伯菌对左氧氟沙星药敏表型的特征基因突变位点和特征基因组合包括ramR:319(C->T)、ramR:7(C->A)、gyrB:1401(A->C)、parE:1375(T->A)、gyrA:260(A->C)、gyrA:248(C->T)、gyrA:248(C->A)、gyrA:259(G->A)、gyrA:260(A->G)、gyrA:259(G->T),同时进行检测,若检测结果均为阴性,推测为敏感;若任一基因检测结果为阳性,推测为耐药。
2.根据权利要求1所述用于预测肺炎克雷伯菌对抗生素药敏表型的特征基因组合,其特征在于,所述预测肺炎克雷伯菌对环丙沙星药敏表型的特征基因突变位点和特征基因组合还包括ramR:175(T->C)、ramR:7(C->A)、ramR:319(C->T)、gyrB:1401(A->C)、QnrS1、QnrB4、QnrB20。
3.根据权利要求1所述用于预测肺炎克雷伯菌对抗生素药敏表型的特征基因组合,其特征在于,所述预测肺炎克雷伯菌对左氧氟沙星药敏表型的特征基因突变位点和特征基因组合还包括ramR:415(AAAGAGATAT)、parC:239(G->T)、gyrB:1394(C->T)、parE:619(G->A)、QnrB4。
4.含有权利要求书1-3任一项所述用于预测肺炎克雷伯菌对抗生素药敏表型的特征基因组合检测试剂的试剂盒。
5.采用权利要求4所述试剂盒对肺炎克雷伯菌进行药敏表型的测序方法,其特征在于,采用全基因组测序方法或宏基因组测序方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211147291.8A CN115418406B (zh) | 2022-09-19 | 2022-09-19 | 用于预测肺炎克雷伯菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211147291.8A CN115418406B (zh) | 2022-09-19 | 2022-09-19 | 用于预测肺炎克雷伯菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115418406A true CN115418406A (zh) | 2022-12-02 |
CN115418406B CN115418406B (zh) | 2023-11-10 |
Family
ID=84204716
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211147291.8A Active CN115418406B (zh) | 2022-09-19 | 2022-09-19 | 用于预测肺炎克雷伯菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115418406B (zh) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107475421A (zh) * | 2017-09-08 | 2017-12-15 | 中国人民解放军总医院 | 肺炎致病菌耐药基因快速识别基因芯片 |
CN114990241A (zh) * | 2022-06-07 | 2022-09-02 | 天津金匙医学科技有限公司 | 用于预测鲍曼不动杆菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法 |
-
2022
- 2022-09-19 CN CN202211147291.8A patent/CN115418406B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107475421A (zh) * | 2017-09-08 | 2017-12-15 | 中国人民解放军总医院 | 肺炎致病菌耐药基因快速识别基因芯片 |
CN114990241A (zh) * | 2022-06-07 | 2022-09-02 | 天津金匙医学科技有限公司 | 用于预测鲍曼不动杆菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法 |
Non-Patent Citations (5)
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN115418406B (zh) | 2023-11-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Lieberman et al. | Genetic variation of a bacterial pathogen within individuals with cystic fibrosis provides a record of selective pressures | |
Tavares et al. | Identification of Streptococcus pneumoniae by a real-time PCR assay targeting SP2020 | |
Sheka et al. | Oxford nanopore sequencing in clinical microbiology and infection diagnostics | |
CN111705118B (zh) | 一种基于靶基因高通量测序的血流感染检测试剂盒 | |
CN114333987A (zh) | 一种基于宏基因组测序的预测耐药表型的数据分析方法 | |
Saeb | Current Bioinformatics resources in combating infectious diseases | |
CN109082479A (zh) | 从样本中鉴定微生物物种的方法和装置 | |
Lepuschitz et al. | Analytical performance validation of next-generation sequencing based clinical microbiology assays using a K-mer analysis workflow | |
WO2017012653A1 (en) | Genetic testing for predicting resistance of gram-negative proteus against antimicrobial agents | |
Ellis et al. | Rapid infectious disease identification by next-generation DNA sequencing | |
CN115305292A (zh) | 用于预测金黄色葡萄球菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法 | |
CN114990241A (zh) | 用于预测鲍曼不动杆菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法 | |
CN115651990B (zh) | 用于预测大肠埃希菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法 | |
Westaway et al. | Methods for exploring the faecal microbiome of premature infants: a review | |
CN115418406A (zh) | 用于预测肺炎克雷伯菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法 | |
WO2017017044A1 (en) | Genetic testing for predicting resistance of enterobacter species against antimicrobial agents | |
CN106701979A (zh) | 一种用于结核分枝杆菌分型snp位点的试剂盒及其应用 | |
CN114891908A (zh) | 用于预测屎肠球菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法 | |
CN115323067B (zh) | 用于预测阴沟肠杆菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法 | |
Arora et al. | Genotyping Mycobacterium tuberculosis isolates with few copies of IS6110: Value of additional genetic markers | |
Vasudeva et al. | High-throughput sequencing technologies in metagenomics | |
CN117219157B (zh) | 预测铜绿假单胞菌碳青霉烯类药物药敏表型的特征基因、试剂盒及应用 | |
CN108588198A (zh) | 一种用于副猪嗜血杆菌分子分型的全基因组测序方法 | |
CN114277164B (zh) | 一种肺炎链球菌的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 | |
CN113674801B (zh) | 一种基于Nanopore测序仪进行结核分枝杆菌耐药检测分析系统及其构建方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |