CN115413791A - 一种复合胶原蛋白肽粉及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合胶原蛋白肽粉及其制备方法，该胶原蛋白肽粉包括如下组分：洋甘菊提取物、酪蛋白水解肽、γ‑氨基丁酸、鱼胶原蛋白肽粉、营养增强剂、植物乳杆菌。本发明通过添加多种具有改善睡眠作用的原料协同发挥改善睡眠的作用，无毒副作用，适合长期食用，不会产生依赖性；另外本发明采用植物乳杆菌进行后处理，提高了抗氧化因子的含量，表现出良好的抗氧化性能。
Description
技术领域
本发明涉及功能性食品技术领域，尤其涉及一种复合胶原蛋白肽粉及其制备方法。
背景技术
自由基(Free radical)又叫游离基，一般定义为在原子或分子轨道上含有一个或一个以上未配对电子的原子、分子或原子团，其主要是由于化合物中共价键的断裂形成，因为未配对的电子存在较高的活性，使得自由基易与其它物质反应生成新的自由基或氧化物。常见的活性氧自由基有·OH、O2 -·、H2O2等，二是脂类自由基及其过氧化物，主要包括L·、R·、LO·、Roo·和LOOH·等；三是半醌类自由基，该类自由基通常由苯醌的苯酚类化合物氧化而成，广泛产生于许多生命过程之中；四足氮氧自由基，由氮氧化物形成的自由基。
在生物体内，适宜的自由基含量具有重要的生物功能。在生物体正常的生理条件下，生物白身通过超氧化物歧化酶和谷胱甘肽氧化酶酶促抗氧化防御体系和Vc、Ve、微量元素、辅酶和辅助因子等非酶促抗氧化防御体系及时地清除体内过多的自由基。然而，当生物体细胞内自由基的产生和清除机制失衡时，过量积累的自由基就会攻击对细胞中DNA、蛋白质、碳水化合物、核酸、脂类和质膜等生物大分子，从而造成细胞死亡和组织的氧化性损伤。已有研究证实，自由基引发的氧化应激反应与心血管疾病、癌症、神经退行性疾病、糖尿病等多种病理状态密切相关。此时，就需要及时从体外补充抗氧化剂来清除过量的自由基，缓解自由基对机体造成的损伤。
CN 109567213 A涉及胶原蛋白肽粉，具体涉及一种复合胶原蛋白肽粉，其原料按重量份包括：胶原蛋白肽粉58-62份、蔗果三糖2-8份、食用葡萄糖8-12份、乳粉12-18份、复合酵素5-15份、食用玉米淀粉8-12份、麦芽糊精1-5份、增强剂0.01-1份。该发明具有强化体质耐力、改善胃肠道功能、美容养颜、促进细胞生长、抗衰老的作用。但是该发明提供的胶原蛋白肽粉的抗衰老作用主要是由于增强剂的作用，加工过程中依然存在抗氧化因子的分解，抗氧化性较低的问题。
发明内容
有鉴于现有技术中存在抗氧化性不足的问题，本发明所要解决的技术问题是提供一种无副作用、抗氧化性强、能够改善睡眠的药食同源的食品。
为实现上述目的，本发明提供了复合胶原蛋白肽粉及其制备方法，多种具有改善睡眠、提高抗氧化性作用的原料协同发挥改善睡眠的作用，用该方法制备的胶原蛋白肽粉具有较低的吸湿性和结块率，能够使胶原蛋白肽粉主基料中的有效成分得到保护，提高了抗氧化因子的含量，延长其保质期。
一种复合胶原蛋白肽粉的制备方法，包括如下步骤：
S1将洋甘菊提取物、酪蛋白水解肽、γ-氨基丁酸、鱼胶原蛋白肽粉、营养增强剂搅拌混合、挤出、粉碎、过筛得混合粉末；
S2将混合粉末经研磨、超微分级后得混合微粉；
S3将步骤S2制备的混合微粉加入水中制备成培养液，将植物乳杆菌接种到培养液中进行混合培养，得到功能培养液；对功能培养液进行蒸发、干燥、消毒、包装、密封得复合胶原蛋白肽粉。
优选的，所述复合胶原蛋白肽粉的制备方法，包括如下步骤，以重量份计：
S1按配方称取10-15份洋甘菊提取物、10-20份酪蛋白水解肽、5-10份γ-氨基丁酸、60-70份鱼胶原蛋白肽粉、3-6份营养增强剂混合搅拌，充分混合后通入挤出机，然后进行压平后粉碎，过筛网进行筛分得混合粉末；
S2将所述混合粉末送入球磨机，进行研磨，研磨后送入超微分级机中，分级出粉粒得混合微粉；
S3将步骤S2制备的混合微粉加入600-1000份水中制备成培养液，将0.1-0.3份植物乳杆菌接种到培养液中进行混合培养，在35-37℃下培养4-8h，得到功能培养液；对功能培养液在37-42℃水浴蒸发，将所述蒸发后得到的固体置于冷冻干燥箱中冷冻干燥后进行紫外线消毒，将杀菌后的微粉装入瓶装包装机中，包装后密封处理得到复合胶原蛋白肽粉。
所述步骤S1中搅拌时间为10-30min，挤出机的温度设置为70-120℃，挤出机的螺杆频率为120-350Hz，筛网的目数1500-2000。
所述步骤S2中混合微粉的大小为3000-4000目。
所述步骤S3中冷冻干燥温度为-20--40℃，冷冻干燥时间为2-4小时。
所述步骤S3中植物乳杆菌浓度为2×106-9×106CFU/g。
所述酪蛋白水解肽的制备方法如下：
1)将酪蛋白溶液经匀浆和均质，得到性质稳定的匀浆液；所述均质的压力为20-30MPa，均质时间为1-2h；
2)将所述匀浆液在温度40-50℃的条件下搅拌1-2h，用2-3mol/L碳酸氢钠水溶液调节pH值至7-8，得到预处理匀浆液；
3)向所述预处理匀浆液中加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶在30-50℃下加热1-2小时后升温至80-100℃灭酶10-15min，得到酶解液；所述胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:2-3；所述蛋白酶的加入量为预处理匀浆液的0.001-0.005倍；
4)将所述酶解液依次通过2000-3000Da陶瓷膜和1-2KD有机膜，收集膜下物，得到酪蛋白肽混合物；
5)用层析柱对上述酪蛋白肽混合物进行粗分离纯化，收集出峰时间为12-15min的组分，即为酪蛋白肽水解物。
酪蛋白是牛乳中的主要蛋白质，含量约占牛乳中蛋白成分的80％，牛乳酪蛋白的成分有αs1-、αs2-、β-和k-4酪蛋白，均含活性肽序列，酪蛋白水解物是酪蛋白经过酶制剂水解后的产物，酪蛋白水解物中具有生物活性的酪蛋白生物活性肽，同时还含有丰富的小分子肽和必需氨基酸，可发挥多种生理功能，提高睡眠质量，有改善睡眠的作用。
胶原蛋白肽是一类以富含胶原蛋白的新鲜动物组织(包括皮、骨、筋、腱、鳞等)为原料，经过提取、水解、精制生产的，相对分子质量低于10000Da的产品，比普通胶原蛋白分子量小，更易消化吸收。是针对人体衰老细胞分裂、衰竭、萎缩、微整形术后损伤、新细胞再生受阻、细胞生长变异、增生等多项细胞修复功能障碍问题研发的产品。胶原蛋白肽具有抑制血管紧张素转化酶活性、抗氧化性、消除自由基、减少膝关节或髋关节等骨关节炎患者的疼痛，增强骨密度，维持骨代谢平衡等。
洋甘菊，是菊科植物，也叫罗马洋甘菊、德国洋甘菊。洋甘菊花朵含天然精油，主要成分有母菊薁、α-甜没药萜醇与倍半萜烯、芹菜素、槲皮素、木犀草素等；内用可缓解消化不良、上腹胀痛、消化道受损、肠胃胀气、溃疡；外用可治疗皮肤粘膜的发炎；吸入使用可缓解普通感冒引起的呼吸道不适，洋甘菊精油具有镇静和清新的作用，有助于缓解紧张和焦虑、松弛神经、舒缓压力、改善睡眠，使内心平静安宁。
γ-氨基丁酸，是中枢神经系统的抑制性递质，是脑组织中最重要的神经递质之一，能降低神经元活性，抑制焦虑信息传入脑中枢，镇静神经而抗焦虑，具有安定精神、镇静作用，能改善神经性胃肠功能障碍、睡眠障碍、自律性神经失调等症状。
所述营养增强剂为蔗果四糖、麦芽糊精、微晶纤维素中的一种或两种及两种以上的混合；优选的，所述麦芽糊精为低吸湿性麦芽糊精；进一步优选的，所述营养增强剂为蔗果四糖、低吸湿性麦芽糊精、微晶纤维素按质量比为1-2:2-3:1混合均匀得到。
所述低吸湿性麦芽糊精的制备方法如下：
将马铃薯淀粉用水配置成30-40wt％的淀粉乳，将淀粉乳加热至60-80℃；用2-3wt％碳酸钠水溶液调节pH值至8-9；加入三偏磷酸钠，三偏磷酸钠的用量为马铃薯淀粉的5-10wt％；反应1-2h，用0.5-1mol/L盐酸调节溶液pH值为6-7；过滤，收集滤饼，滤饼用水洗2-3次置于50-70℃干燥箱中干燥10-12h；粉碎后过80-100目筛，得到所述低吸湿性麦芽糊精。
胶原蛋白肽粉暴露在空气中一段时间后会迅速板结，并可能形成带黏性的糊状物，使其失去流动性。发明人以马铃薯淀粉为原料制备得到低吸湿性麦芽糊精，可实现麦芽糊精分子内部重新排列，改变分子链的舒展度，除去不稳定的低分子糖降低了其粘度和吸湿性；蔗果四糖可以改善肠道菌群、减轻便秘症状、改善脂质代谢、抑制肠道腐败、促进胶原蛋白肽中钙镁等矿物质元素的吸收、增强免疫力，另外其还可以与胶原蛋白肽粉主基料颗粒竞争吸湿，减少主基料颗粒对水分的吸收；微晶纤维素具有高结晶度、高聚合度、比表面积大，具有较好的润滑作用；低吸湿性麦芽糊精和微晶纤维素可以覆盖包裹住胶原蛋白肽粉主基料颗粒，减少了胶原蛋白肽粉主基料颗粒对水分的吸收，使其保持好的流动性，显著降低了胶原蛋白肽粉的吸湿性和结块发生率，同时能使胶原蛋白肽粉主基料中的有效成分得到保护，延长其保质期。
由于植物乳杆菌能产生蛋白酶、肽酶、氨肽酶等水解酶，复合胶原蛋白肽粉中的水解肽达到了最佳水平。这些肽在源蛋白分子中是不活跃的，可以通过胃肠消化、用原分解发酵剂或通过蛋白分解酶水解而释放出来，植物乳杆菌的处理加速了酶的产生，更加充分的释放了活性物质，具有较高的超氧自由基清除活性，酪蛋白水解物对巨噬细胞中促炎细胞因子介质的生成具有抑制作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明制得的胶原蛋白肽粉采用天然原料、营养丰富，配方科学，多种具有改善睡眠作用的原料协同发挥改善睡眠的作用，整体原料成本低，无毒副作用，适合长期食用，不会产生依赖性。
2、本发明添加了特殊的营养增强剂，能显著降低胶原蛋白肽粉的吸湿性、结块率、延长其保质期。
3、本发明采用植物乳杆菌进行后处理，表现出良好的抗氧化和抗炎活性，以及超氧自由基清除活性。
具体实施方式
本发明中部分原料来源如下：
洋甘菊提取物，购买自陕西晨希生物科技有限公司，外观为棕黄色粉末，货号cx-21627。
酪蛋白，购买自广州龙德生物科技有限公司。
γ-氨基丁酸，购买自江苏恩鸣生物工程科技有限公司，含量为99％，pH值为6.5-7.5，熔点为197-204℃，性状为白色结晶粉末。
鱼胶原蛋白肽粉，购买自西安瑞尔丽生物工程有限公司，蛋白质含量≥90％，脂肪含量≤2％，水分≤6％，铅以Pb计≤1mg/kg，汞以Hg计≤0.3mg/kg，砷以As计≤0.5mg/kg。
麦芽糊精，购买自湖北精成化工有限公司，DE值为15-20，级别为食品级。
蔗果四糖，购买自上海惠诚生物科技有限公司，CAS号为13133-07-8，货号为HTZ004。
微晶纤维素，购买自深圳乐芙生物科技有限公司，有效物质含量为99％，货号为LF0902。
马铃薯淀粉，购买自济南超意兴化工有限公司，CAS号为9049-76-7，有效物质含量为99％。
胰蛋白酶，购买自成都万象宏润生物科技有限公司，酶活力为10-50万，酶活力保存率为99％。
木瓜蛋白酶，购买自安徽远征生物工程有限公司，酶活力为80万，酶活力保存率为80％。
植物乳杆菌：Lactobacillus plantarum，CICC 23941，来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
实施例1
一种复合胶原蛋白肽粉的制备方法，包括如下步骤：
S1按配方称取10g洋甘菊提取物、20g酪蛋白水解肽、10gγ-氨基丁酸、70g鱼胶原蛋白肽粉、4g营养增强剂混合搅拌30min，充分混合后通入挤出机，挤出机的温度设置为100℃，挤出机的螺杆频率为300Hz，然后进行压平后粉碎，过2000目筛网进行筛分得混合粉末；
S2将上述混合粉末送入球磨机，进行研磨，研磨后送入超微分级机中，分级出4000目粉粒得混合微粉；
S3将上述混合微粉置于-40℃冷冻干燥箱中冷冻干燥4h后进行紫外线消毒，将杀菌后的微粉装入瓶装包装机中，包装后密封处理得到复合胶原蛋白肽粉。
所述酪蛋白水解肽的制备方法如下：
1)将酪蛋白溶液经匀浆和均质，得到性质稳定的匀浆液；所述均质的压力为30MPa，均质时间为2h；
2)将所述匀浆液在温度50℃的条件下搅拌1h，用3mol/L碳酸氢钠水溶液调节pH值至8，得到预处理匀浆液；
3)向所述预处理匀浆液中加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶在40℃下加热2小时后升温至100℃灭酶10min，得到酶解液；所述胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:3；所述蛋白酶的加入量为预处理匀浆液的0.002倍；
4)将所述酶解液依次通过3000Da陶瓷膜和1KD有机膜，收集膜下物，得到酪蛋白肽混合物；
5)用Sephadex G-50层析柱对上述酪蛋白肽混合物进行粗分离纯化，收集出峰时间为14min的组分，即为酪蛋白肽水解物。
所述营养增强剂为麦芽糊精。
实施例2
一种复合胶原蛋白肽粉的制备方法，包括如下步骤：
S1按配方称取10g洋甘菊提取物、20g酪蛋白水解肽、10gγ-氨基丁酸、70g鱼胶原蛋白肽粉、4g营养增强剂混合搅拌30min，充分混合后通入挤出机，挤出机的温度设置为100℃，挤出机的螺杆频率为300Hz，然后进行压平后粉碎，过2000目筛网进行筛分得混合粉末；
S2将所述混合粉末送入球磨机，进行研磨，研磨后送入超微分级机中，分级出4000目粉粒得混合微粉；
S3将所述混合微粉置于-40℃冷冻干燥箱中冷冻干燥4h后进行紫外线消毒，将杀菌后的微粉装入瓶装包装机中，包装后密封处理得到复合胶原蛋白肽粉。
所述酪蛋白水解肽的制备方法如下：
1)将酪蛋白溶液经匀浆和均质，得到性质稳定的匀浆液；所述均质的压力为30MPa，均质时间为2h；
2)将所述匀浆液在温度50℃的条件下搅拌1h，用3mol/L碳酸氢钠水溶液调节pH值至8，得到预处理匀浆液；
3)将所述预处理匀浆液加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶在40℃下加热2小时后升温至100℃灭酶10min，得到酶解液；所述胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:3；所述蛋白酶的加入量为预处理匀浆液的0.002倍；
4)将所述酶解液依次通过3000Da陶瓷膜和1KD有机膜，收集膜下物，得到酪蛋白肽混合物；
5)用Sephadex G-50层析柱对上述酪蛋白肽混合物进行粗分离纯化，收集出峰时间为14min的组分，即为酪蛋白肽水解物。
所述营养增强剂为低吸湿性麦芽糊精。
所述低吸湿性麦芽糊精的制备方法如下：
将马铃薯淀粉用水配置成40wt％的淀粉乳，将淀粉乳加热至60℃；用3wt％碳酸钠水溶液调节pH值至8；加入三偏磷酸钠，三偏磷酸钠的用量为马铃薯淀粉的10wt％；反应2h，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为7；过滤，收集滤饼，滤饼用水洗3次置于60℃干燥箱中干燥10h；粉碎后过100目筛，得到所述低吸湿性麦芽糊精。
实施例3
一种复合胶原蛋白肽粉的制备方法，包括如下步骤：
S1按配方称取10g洋甘菊提取物、20g酪蛋白水解肽、10gγ-氨基丁酸、70g鱼胶原蛋白肽粉、4g营养增强剂混合搅拌30min，充分混合后通入挤出机，挤出机的温度设置为100℃，挤出机的螺杆频率为300Hz，然后进行压平后粉碎，过2000目筛网进行筛分得混合粉末；
S2将所述混合粉末送入球磨机，进行研磨，研磨后送入超微分级机中，分级出4000目粉粒得混合微粉；
S3将所述混合微粉置于-40℃冷冻干燥箱中冷冻干燥4h后进行紫外线消毒，将杀菌后的微粉装入瓶装包装机中，包装后密封处理得到复合胶原蛋白肽粉。
所述酪蛋白水解肽的制备方法如下：
1)将酪蛋白溶液经匀浆和均质，得到性质稳定的匀浆液；所述均质的压力为30MPa，均质时间为2h；
2)将所述匀浆液在温度50℃的条件下搅拌1h，用3mol/L碳酸氢钠水溶液调节pH值至8，得到预处理匀浆液；
3)向所述预处理匀浆液中加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶在40℃下加热2小时后升温至100℃灭酶10min，得到酶解液；所述胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:3；所述蛋白酶的加入量为预处理匀浆液的0.002倍；
4)将所述酶解液依次通过3000Da陶瓷膜和1KD有机膜，收集膜下物，得到酪蛋白肽混合物；
5)用Sephadex G-50层析柱对上述酪蛋白肽混合物进行粗分离纯化，收集出峰时间为14min的组分，即为酪蛋白肽水解物。
所述营养增强剂为蔗果四糖和低吸湿性麦芽糊精的混合，二者的质量比为1：2。
所述低吸湿性麦芽糊精的制备方法如下：
将马铃薯淀粉用水配置成40wt％的淀粉乳，将淀粉乳加热至60℃；用3wt％碳酸钠水溶液调节pH值至8；加入三偏磷酸钠，三偏磷酸钠的用量为马铃薯淀粉的10wt％；反应2h，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为7；过滤，收集滤饼，滤饼用水洗3次置于60℃干燥箱中干燥10h；粉碎后过100目筛，得到所述低吸湿性麦芽糊精。
实施例4
一种复合胶原蛋白肽粉的制备方法，包括如下步骤：
S1按配方称取10g洋甘菊提取物、20g酪蛋白水解肽、10gγ-氨基丁酸、70g鱼胶原蛋白肽粉、4g营养增强剂混合搅拌30min，充分混合后通入挤出机，挤出机的温度设置为100℃，挤出机的螺杆频率为300Hz，然后进行压平后粉碎，过2000目筛网进行筛分得混合粉末；
S2将所述混合粉末送入球磨机，进行研磨，研磨后送入超微分级机中，分级出4000目粉粒得混合微粉；
S3将所述混合微粉置于-40℃冷冻干燥箱中冷冻干燥4h后进行紫外线消毒，将杀菌后的微粉装入瓶装包装机中，包装后密封处理得到复合胶原蛋白肽粉。
所述酪蛋白水解肽的制备方法如下：
1)将酪蛋白溶液经匀浆和均质，得到性质稳定的匀浆液；所述均质的压力为30MPa，均质时间为2h；
2)将所述匀浆液在温度50℃的条件下搅拌1h，用3mol/L碳酸氢钠水溶液调节pH值至8，得到预处理匀浆液；
3)向所述预处理匀浆液中加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶在40℃下加热2小时后升温至100℃灭酶10min，得到酶解液；所述胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:3；所述蛋白酶的加入量为预处理匀浆液的0.002倍；
4)将所述酶解液依次通过3000Da陶瓷膜和1KD有机膜，收集膜下物，得到酪蛋白肽混合物；
5)用Sephadex G-50层析柱对上述酪蛋白肽混合物进行粗分离纯化，收集出峰时间为14min的组分，即为酪蛋白肽水解物。
所述营养增强剂为低吸湿性麦芽糊精和微晶纤维素的混合，二者的质量比为2:1。
所述低吸湿性麦芽糊精的制备方法如下：
将马铃薯淀粉用水配置成40wt％的淀粉乳，将淀粉乳加热至60℃；用3wt％碳酸钠水溶液调节pH值至8；加入三偏磷酸钠，三偏磷酸钠的用量为马铃薯淀粉的10wt％；反应2h，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为7；过滤，收集滤饼，滤饼用水洗3次置于60℃干燥箱中干燥10h；粉碎后过100目筛，得到所述低吸湿性麦芽糊精。
实施例5
一种复合胶原蛋白肽粉的制备方法，包括如下步骤：
S1按配方称取10g洋甘菊提取物、20g酪蛋白水解肽、10gγ-氨基丁酸、70g鱼胶原蛋白肽粉、4g营养增强剂混合搅拌30min，充分混合后通入挤出机，挤出机的温度设置为100℃，挤出机的螺杆频率为300Hz，然后进行压平后粉碎，过2000目筛网进行筛分得混合粉末；
S2将所述混合粉末送入球磨机，进行研磨，研磨后送入超微分级机中，分级出4000目粉粒得混合微粉；
S3将所述混合微粉置于-40℃冷冻干燥箱中冷冻干燥4h后进行紫外线消毒，将杀菌后的微粉装入瓶装包装机中，包装后密封处理得到复合胶原蛋白肽粉。
所述酪蛋白水解肽的制备方法如下：
1)将酪蛋白溶液经匀浆和均质，得到性质稳定的匀浆液；所述均质的压力为30MPa，均质时间为2h；
2)将所述匀浆液在温度50℃的条件下搅拌1h，用3mol/L碳酸氢钠水溶液调节pH值至8，得到预处理匀浆液；
3)向所述预处理匀浆液中加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶在40℃下加热2小时后升温至100℃灭酶10min，得到酶解液；所述胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:3；所述蛋白酶的加入量为预处理匀浆液的0.002倍；
4)将所述酶解液依次通过3000Da陶瓷膜和1KD有机膜，收集膜下物，得到酪蛋白肽混合物；
5)用Sephadex G-50层析柱对上述酪蛋白肽混合物进行粗分离纯化，收集出峰时间为14min的组分，即为酪蛋白肽水解物。
所述营养增强剂为蔗果四糖、低吸湿性麦芽糊精、微晶纤维素的混合，三者的质量比为1:2:1。
所述低吸湿性麦芽糊精的制备方法如下：
将马铃薯淀粉用水配置成40wt％的淀粉乳，将淀粉乳加热至60℃；用3wt％碳酸钠水溶液调节pH值至8；加入三偏磷酸钠，三偏磷酸钠的用量为马铃薯淀粉的10wt％；反应2h，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为7；过滤，收集滤饼，滤饼用水洗3次置于60℃干燥箱中干燥10h；粉碎后过100目筛，得到所述低吸湿性麦芽糊精。
实施例6
一种复合胶原蛋白肽粉的制备方法，包括如下步骤：
S1按配方称取10g洋甘菊提取物、20g酪蛋白水解肽、10gγ-氨基丁酸、70g鱼胶原蛋白肽粉、4g营养增强剂混合搅拌30min，充分混合后通入挤出机，挤出机的温度设置为100℃，挤出机的螺杆频率为300Hz，然后进行压平后粉碎，过2000目筛网进行筛分得混合粉末；
S2将所述混合粉末送入球磨机，进行研磨，研磨后送入超微分级机中，分级出4000目粉粒得混合微粉；
S3将步骤S2制备的混合微粉加入800g水中制备成培养液，将0.2g浓度为4×106CFU/g植物乳杆菌接种到培养液中进行混合培养，在36℃下培养6h，得到功能培养液；对功能培养液采用40℃水浴蒸发，将所述蒸发后得到的固体将所述混合微粉置于-40℃冷冻干燥箱中冷冻干燥4h后进行紫外线消毒，将杀菌后的微粉装入瓶装包装机中，包装后密封处理得到复合胶原蛋白肽粉。
所述酪蛋白水解肽的制备方法如下：
1)将酪蛋白溶液经匀浆和均质，得到性质稳定的匀浆液；所述均质的压力为30MPa，均质时间为2h；
2)将所述匀浆液在温度50℃的条件下搅拌1h，用3mol/L碳酸氢钠水溶液调节pH值至8，得到预处理匀浆液；
3)向所述预处理匀浆液中加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶在40℃下加热2小时后升温至100℃灭酶10min，得到酶解液；所述胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:3；所述蛋白酶的加入量为预处理匀浆液的0.002倍；
4)将所述酶解液依次通过3000Da陶瓷膜和1KD有机膜，收集膜下物，得到酪蛋白肽混合物；
5)用Sephadex G-50层析柱对上述酪蛋白肽混合物进行粗分离纯化，收集出峰时间为14min的组分，即为酪蛋白肽水解物。
所述营养增强剂为蔗果四糖、低吸湿性麦芽糊精、微晶纤维素的混合，三者的质量比为1:2:1。
所述低吸湿性麦芽糊精的制备方法如下：
将马铃薯淀粉用水配置成40wt％的淀粉乳，将淀粉乳加热至60℃；用3wt％碳酸钠水溶液调节pH值至8；加入三偏磷酸钠，三偏磷酸钠的用量为马铃薯淀粉的10wt％；反应2h，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为7；过滤，收集滤饼，滤饼用水洗3次置于60℃干燥箱中干燥10h；粉碎后过100目筛，得到所述低吸湿性麦芽糊精。
测试例1
吸湿性测试：在恒重的称量瓶中分别放入厚3mm的实施例1-6制得的复合胶原蛋白肽粉，精密称定其质量，然后将装有胶原蛋白肽粉的称量瓶放入装有氯化钠过饱和溶液的干燥器中，揭开称量瓶的盖子，在恒温恒湿条件下保存8h、24h、48h取出，精密称定各称量瓶的质量，吸湿率的计算公式如下所示：
吸湿率＝(吸湿后质量-吸湿前质量)/吸湿前质量×100％
测试结果如表1所示：
吸湿率的大小反应了产品的吸收空气中水分的能力，从表1的数据可以看出，实施例5制得的复合胶原蛋白肽粉具有较低的吸湿率，而实施例5相较于其他实施例的区别在于添加了以蔗果四糖、低吸湿性麦芽糊精、微晶纤维素为原料的营养增强剂，可能的原因在于蔗果四糖与胶原蛋白肽粉主基料颗粒竞争吸湿，减少主基料颗粒对水分的吸收；同时低吸湿性麦芽糊精和微晶纤维素可以覆盖包裹住胶原蛋白肽粉主基料颗粒，也减少了胶原蛋白肽粉颗粒主基料对水分的吸收，三者协同降低了胶原蛋白肽粉的吸湿性能。
测试例2
结块率测定：称取实施例1-6制备的复合胶原蛋白肽粉30g(m1)利用孔径为0.45mm(40目)的筛子进行筛分，称量筛网上留下的结块质量(m2)，结块率的计算方法如下：
结块率(％)＝m2/m1×100％
结块率测试结果如表2所示：
表2：结块率测试结果
| 结块率(％) | |
| 实施例1 | 6.4 |
| 实施例2 | 4.8 |
| 实施例3 | 3.4 |
| 实施例4 | 2.5 |
| 实施例5 | 1.2 |
| 实施例6 | 1.3 |
从表2的实验结果可知，实施例5具有较低的结块率，可能的原因是蔗果四糖、低吸湿性麦芽糊精、微晶纤维素三者的协同使胶原蛋白肽粉主基料具有较好的流动性，降低了其结块率。
测试例3
改善睡眠功能测试：
动物的品质与来源：ICR小鼠，清洁级6-8周龄，70只，体重18～22g，雌雄各半，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。
测试方法如下：
1、设置空白对照组，将小鼠随机分成7组，每组10只，空白对照组每天采用实验小鼠标准饲料早晚8点喂养两次，每次饲料为3g，同时喂入2mL蒸馏水；各实施例试验小鼠采用相同方式喂养，每次喂养都额外添加1g实施例1-6制备的复合胶原蛋白肽粉。
2、在温度23±3℃、相对温度60±5％、人工光照12小时及通风的环境中，喂养30天，喂养结束后，在小鼠腹腔注射戊巴比妥钠，注射量为0.1mL/10gBW，记录30min内入睡的小鼠数量(翻正反射达1min以上者)和小鼠睡眠时间，以没有翻正反射为睡眠标准，取多次测试计算小鼠睡眠时间平均值，测试结果见表3，各组数据之间具有统计学差异。
表3：小鼠睡眠功能测试结果
从表3的实验数据可知，本发明制备的复合胶原蛋白肽粉具有很好的改善睡眠的效果。而实施例5制备的复合胶原蛋白肽粉由于添加了以蔗果四糖、低吸湿性麦芽糊精、微晶纤维素为原料的营养增强剂，使得其吸湿性和结块率降低，很好地保护了胶原蛋白肽粉主基料中的改善睡眠的有效成分，提高了其改善睡眠的效果。
测试例4
羟自由基清除能力的测定：
羟自由基的测定采用水杨酸-乙醇溶液法。配制9.0mmol/L FeSO4溶液、9.0mmol/L水杨酸-乙醇溶液，分别取1mL于6支试管中。1号试管加去离子水12mL，8.8mmol/L H202 1mL：2号试管为1号试管的参比溶液，加去离子水13mL；将实施例5和实施例6的样品采用去离子水配置成浓度为1.0mg/mL的溶液；3号试管加实施例5样品溶液10mL，去离子水2mL，8.8mmol/L H202 1mL，4号试管加实施例5样品溶液10mL，去离子水3mL；5号试管加实施例6样品溶液10mL，去离子水2mL，8.8mmol/L H202 1mL，6号试管加实施例6样品溶液10mL，去离子水3mL；3、4、5、6号试管的参比溶液为去离子水。于37℃水浴15min，510nm下测吸光值。·OH清除率公式如下:
·OH清除率(％)＝[1-(Ax-Axo)/Ao]×100
式中，Ao为不加样品的空白的吸光值；
Ax为加样品后的吸光值；
Axo为水杨酸试剂空白(即不加显色剂的双氧水)的吸光值。
测试结果见表4
表4：羟自由基清除能力测试结果
实施例6的羟自由基清除率高于实施例5，可能原因在于，在后加工步骤中添加植物乳杆菌能产生蛋白酶、肽酶、氨肽酶等水解酶，复合胶原蛋白肽粉中的水解肽达到了最佳水平。这些肽在原蛋白分子中是不活跃的，可以通过胃肠消化、用原分解发酵剂或通过蛋白分解酶水解而释放出来，植物乳杆菌的处理加速了酶的产生，更加充分的释放了活性物质，具有较高的超氧自由基清除活性。
Claims (6)
1.一种复合胶原蛋白肽粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，以重量份计：
S1将10-15份洋甘菊提取物、10-20份酪蛋白水解肽、5-10份γ-氨基丁酸、60-70份鱼胶原蛋白肽粉、3-6份营养增强剂搅拌混合、挤出、粉碎、过筛得混合粉末；
S2将混合粉末经研磨、超微分级后得混合微粉；
S3将步骤S2制备的混合微粉加入600-1000份水中制备成培养液，将0.1-0.3份植物乳杆菌接种到培养液中进行混合培养，在35-37℃下培养4-8h，得到功能培养液；对功能培养液进行蒸发、干燥、消毒、包装、密封得复合胶原蛋白肽粉；
所述营养增强剂为蔗果四糖、低吸湿性麦芽糊精、微晶纤维素按质量比为1-2:2-3:1混合均匀得到。
2.如权利要求1所述的复合胶原蛋白肽粉，其特征在于，所述酪蛋白水解肽的制备方法如下：
1)将酪蛋白溶液经匀浆和均质，得到性质稳定的匀浆液；所述均质的压力为20-30MPa，均质时间为1-2h；
2)将所述匀浆液在温度40-50℃的条件下搅拌1-2h，用2-3mol/L碳酸氢钠水溶液调节pH值至7-8，得到预处理匀浆液；
3)向所述预处理匀浆液中加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶在30-50℃下加热1-2小时后升温至80-100℃灭酶10-15min，得到酶解液；所述胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:2-3；所述蛋白酶的加入量为预处理匀浆液的0.001-0.005倍；
4)将所述酶解液依次通过2000-3000Da陶瓷膜和1-2KD有机膜，收集膜下物，得到酪蛋白肽混合物；
5)用层析柱对上述酪蛋白肽混合物进行粗分离纯化，收集出峰时间为12-15min的组分，即为酪蛋白肽水解物。
3.如权利要求1所述的复合胶原蛋白肽粉，其特征在于，所述低吸湿性麦芽糊精的制备方法如下：
将马铃薯淀粉用水配置成30-40wt％的淀粉乳，将淀粉乳加热至60-80℃；用2-3wt％碳酸钠水溶液调节pH值至8-9；加入三偏磷酸钠，三偏磷酸钠的用量为马铃薯淀粉的5-10wt％；反应1-2h，用0.5-1mol/L盐酸调节溶液pH值为6-7；过滤，收集滤饼，滤饼用水洗2-3次置于50-70℃干燥箱中干燥10-12h；粉碎后过80-100目筛，得到所述低吸湿性麦芽糊精。
4.如权利要求1所述的复合胶原蛋白肽粉的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中植物乳杆菌浓度为2×106-9×106CFU/g。
5.如权利要求1所述的复合胶原蛋白肽粉的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中搅拌时间为10-30min，挤出机的温度设置为70-120℃，挤出机的螺杆频率为120-350Hz，筛网的目数1500-2000。
6.如权利要求1所述的复合胶原蛋白肽粉的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中混合微粉的大小为3000-4000目。
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