CN115372434A - 一种三明治结构传感器及其制法与应用 - Google Patents

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CN115372434A CN202211068110.2A CN202211068110A CN115372434A CN 115372434 A CN115372434 A CN 115372434A CN 202211068110 A CN202211068110 A CN 202211068110A CN 115372434 A CN115372434 A CN 115372434A
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任洪强
潘尧
杨旭东
丁丽丽
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Abstract

本发明公开了一种三明治结构传感器，包括工作电极、参比电极和对电极；工作电极依次包括金电极、导电分子印迹聚合物层和发光分子标记的抗体，导电分子印迹聚合物层内设置用于捕获阿奇霉素的孔，发光分子标记的抗体与阿奇霉素通过分子间作用力结合。本发明还公开了一种三明治结构传感器的制备方法，以及该三明治结构传感器在监测污水厂痕量浓度阿奇霉素中的应用。本发明利用阿奇霉素本身具有的叔胺结构，充当三联吡啶钌电致化学发光的共反应剂，获得较高的光响应，实现更低浓度的阿奇霉素的监测，检测灵敏度高、精度高；构建的传感器免除了样品测定过程中的预富集及纯化步骤，缩短了检测周期，且无需用到大型仪器。

Description

一种三明治结构传感器及其制法与应用
技术领域
本发明属于探测器及其制法，具体为一种三明治结构传感器及其制法与应用。
背景技术
近年来大环内酯类抗生素的大量使用带来较大健康风险，需要将其纳入监测列表。鉴于其稳定的电化学性质(无特征化学反应如氧化还原等)以及特征物化性质的缺失(特征显色基团、络合)，目前的监测方法主要依赖LC-MS。然而LC-MS作为一种金标准，其精度和可靠性优越的同时，存在检测周期长、前处理步骤繁琐以及必须异位监测等缺点。生物传感器刚好和其互补，其中电致化学发光作为一种高灵敏度、低背景噪音的信号转换、放大策略，被广泛用于痕量污染物的检测。
现有的研究中，电致化学发光夹心免疫传感器已有较多实例，然而此类发明均采用传统双抗夹心设计。申请号为201810745154.1中国专利公开了一种电化学发光免疫传感器用于制备严重发热伴血小板减少综合症病毒检测试剂盒的应用，以Fe3O4@SiO2为载体修饰一抗，以CdZnTeS量子点标记二抗，利用电致化学发光信号读出SFTSV的浓度。此方法特异性好，然而需要检测物对应的多种单克隆抗体，并且双抗作为生物大分子，其导电性欠佳，极大妨碍了电致化学发光反应中的电子传递。另一方面，此类发明中多使用一抗或核酸适配体捕获待测样品中目标物质，导致应用范围受限到类生理环境(抗体易失活)，无法在常见的污水系统中应用。
分子印迹作为一种制备简单、稳定性好的特异性识别技术已被用于多种电致化学发光传感器。将耐受范围广的分子印迹聚合物和生物元件结合可以提高夹心免疫传感器在实际水样监测中的稳定性，并且，导电聚合物的掺入可以简单地调节分子印迹膜导电能力，提高电致化学发光反应的效率。
目前夹心免疫的报道集中在双抗夹心的应用，即三明治结构的两端均为抗体，主要适用于生理条件下的目标物检测。污水及自然水样中波动的温度、pH、离子强度等容易导致抗体失活，影响传感器性能。另一方面，抗体的导电性欠佳，在传感器进行电致化学发光反应时，双抗均对电子传递效率有阻碍作用，影响了其灵敏度。此外，目前尚未有基于电致化学发光检测大环内酯类抗生素的分子印迹-抗体夹心免疫传感器报道。并且，现有分子印迹传感器的精度有待进一步提高。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明目的是提供一种电子转移效率高、检测限低的三明治结构传感器，本发明的另一目的是提供一种简单方便的三明治结构传感器的制备方法，本发明的再一目的是提供一种缩短检测周期的三明治结构传感器在监测污水厂痕量浓度阿奇霉素中的应用。
技术方案：本发明所述的一种三明治结构传感器，包括工作电极、参比电极和对电极；工作电极依次包括金电极、导电分子印迹聚合物层和发光分子标记的抗体，导电分子印迹聚合物层内设置用于捕获阿奇霉素的孔，发光分子标记的抗体与阿奇霉素通过分子间作用力结合。
进一步地，三明治结构传感器与电化学发光分析仪相连，参比电极为饱和银/氯化银电极，对电极为铂丝。
上述三明治结构传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，纯化发光分子标记的抗体，使用
Figure BDA0003827306020000021
pure蛋白分离纯化系统去除未结合的发光分子和杂质；
步骤二，取10～50μL功能单体、辅助单体的乙腈溶液滴涂于打磨好的金电极表面，室温静置60～180分钟，淋洗，完成自组装，在电极表面滴涂模板分子的乙腈DMF混合溶液，将处理后的电极插入交联单体的乙腈溶液中进行电聚合，随后在乙腈乙酸溶液中搅拌脱除模板分子；
步骤三，将步骤二所得电极浸入待测水样并以200～500rpm的速度搅拌10～60分钟后取出用去离子水温和淋洗，以去除未结合杂质；
步骤四，在步骤三所得电极的表面滴涂封闭剂，用去离子水或PBS溶液冲洗，随后在电极表面滴涂步骤一的发光分子标记的抗体，淋洗搅拌至去除未结合的抗体，得到三明治结构传感器。
进一步地，步骤一中，发光分子为二(2，2’-二联吡啶)-4，4’-二羧基二联吡啶-钌二(六氟磷酸盐)，抗体为鼠抗单克隆抗体，发光分子和抗体的初始摩尔比为5～25:1。纯化所用透析袋或分离柱规格为透过分子量不大于标记抗体分子量的1/3。
进一步地，步骤二中，对金电极进行打磨，用乙醇、超纯水交替超声清洗，直至在0.5mM硫酸溶液中进行CV扫描稳定。功能单体为对巯基苯硼酸，辅助单体为2-巯基噻吩或苯乙硫醇，模板分子为阿奇霉素，交联单体为3，4-乙烯二氧噻吩、苯胺、吡咯中的任意一种。乙腈DMF混合溶液中DMF的体积百分数为20％～90％。功能单体与模板分子的摩尔比例为1:1。
辅助单体优选为2-巯基噻吩，乙腈DMF混合溶液、乙腈溶液均为极性溶剂，能够保证所有功能单体、辅助单体的完全溶解以及溶剂间的良好混溶。不宜选择醇类溶剂，防止其与硼酸基团反应，降低功能单体和模板分子的结合效率。在功能单体和辅助单体浓度为1mM时，添加50vol％的DMF。
进一步地，步骤三中，乙酸乙腈混合溶液中，乙酸与乙腈的体积比为8～9:1。电聚合的电解质可选用四丁基高氯酸铵、四丁基六氟磷酸铵、高氯酸锂中的任意一种。聚合使用的对电极为铂丝，非水相参比电极为0.1M对应电解质的乙腈溶液中的银电极。
优选地，使用2mM的3，4-乙烯二氧噻吩作为交联单体、0.1M四丁基高氯酸铵为电解质时，聚合电位窗口选择-0.5～1.3V，循环伏安扫描圈数为5圈，扫速为100mV/s。
进一步地，步骤四中，搅拌优选为300rpm，30分钟。
进一步地，步骤五中，封闭剂为1～2wt％的牛血清白蛋白、酪蛋白、脱脂奶粉中的任意一种。在封闭前使用1wt％甲醇屏蔽未结合的硼酸键效果更佳。PBS溶液的pH＝7.2～7.4。步骤一的发光分子标记的抗体优选为40μg/mL，20μL。淋洗搅拌的转速为100～300rpm，优选为300rpm，5分钟。
上述三明治结构传感器在监测污水厂痕量浓度阿奇霉素中的应用。在包含0.05～0.2M三正丙胺以及0.5～2wt％吐温20的10倍PBS溶液中，构成三电极体系，使用电致化学发光分析仪监测并记录+0.9V的电流及光信号。
进一步地，优选为0.1M三正丙胺，2wt％吐温20。
工作原理：传感器利用分子印迹聚合物捕获待测水样中的目标分子(阿奇霉素)，再将电极表面非特异性结合位点封闭，随后利用三联吡啶钌衍生物标记的目标抗体与电极表面模板分子暴露的位点特异性结合，最后通过三联吡啶钌衍生物的电致化学发光信号来读取浓度。分子印迹聚合物膜中的功能单体利用硼酸基团和污染物的羟基结合的反应(B-O键能124kcal/mol)抓取目标污染物，巯基将功能单体不可逆组装到金电极表面，因此选择同时含有巯基和硼酸基的分子作为功能单体；为尽可能多地暴露用于和目标污染物结合的硼酸基，选择在单体的五元环或六元环对位修饰巯基和硼酸基。为避免功能单体间隔过小，导致组装过程中空间位阻过大，选择在自组装过程中掺入无硼酸基的含巯基单体进行调节；为保证电极表面单体在电聚合过程中有较强的活性，选择电子云密度较高的噻吩类或含苯环的单体。本设计采用电聚合的方式完成分子印迹聚合物的构建，其中交联单体选用导电聚合物的单体，以促进电子传递。作为被检物，阿奇霉素所含的叔胺结构可以作为共反应剂促进三联吡啶钌衍生物的电致化学发光反应，提升信号强度。样品中对应阿奇霉素浓度越高，电极表面抓取的浓度越高，则标记抗体的结合量越大，MIP-阿奇霉素-标记抗体的三明治结构在电致化学发光分析中光信号越强。根据光强和校准曲线，可读出浓度。
有益效果：本发明和现有技术相比，具有如下显著性特点：
1、利用阿奇霉素本身具有的叔胺结构，充当三联吡啶钌衍生物电致化学发光的共反应剂，获得较高的光响应，实现更低浓度的阿奇霉素的监测，检测灵敏度高、精度高；
2、构建的传感器免除了样品测定过程中的预富集及纯化步骤，缩短了检测周期，且无需用到大型仪器，有望用于原位监测污水厂痕量浓度阿奇霉素，具有很强的经济效益和实用价值，为多种高风险污染物多通道、同时监测提供了解决方案；
3、利用分子印迹聚合物替代传统三明治免疫传感器中的一抗，解决了生物识别元件在污水中容易受水质波动影响、失活的问题，极大提高了传感器的稳定性，拓宽了应用场景；
4、利用电致化学发光作为信号转换、放大策略，其背景噪声低，检测灵敏度较分子印迹电极-SWV电化学检测方法有较大提高，相较于传统夹心免疫传感器，在电极表面采用导电聚合物构建分子印迹网络，提高电子转移效率，检测下限降低。
附图说明
图1是本发明的制备流程图；
图2是本发明标记抗体的荧光光谱图，其中，A为发射光谱图，B为激发光谱图；
图3是本发明BCA法检测抗体中蛋白浓度的标曲；
图4是本发明荧光法检测标签浓度的标曲；
图5是本发明标记抗体的SDS-PAGE电泳结果；
图6是本发明
Figure BDA0003827306020000041
pure纯化抗体的出峰图；
图7是本发明电聚合分子印迹聚合物的循环伏安图；
图8是本发明聚合前后电极在铁氰化钾溶液中的SWV信号对比图；
图9是本发明传感器的结构示意图；
图10是本发明传感器的应用示意图；
图11是本发明传感器在共反应剂存在的情况下进行电致化学发光测试的电流-电压图；
图12是本发明传感器在共反应剂存在的情况下进行电致化学发光测试的光强-电压图；
图13是本发明传感器的电流-电压图，其中，A为无被检物，B为无共反应剂，C为无导电聚合物。
图14是本发明传感器的光强-电压图，其中，A为无被检物，B为无共反应剂，C为无导电聚合物；
图15是本发明恒电位沉积金纳米粒子的电流/电量-时间图；
图16是本发明传感器表面的扫描电镜图；
图17是本发明传感器表面的原子力显微镜照片；
图18是本发明传感器的校准曲线。
具体实施方式
以下各实施例中，所用到的原料性能如下：
二(2，2’-二联吡啶)-4，4’-二羧基二联吡啶-钌二(六氟磷酸盐)Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2，分子量MW＝947.57g/mol。
EDC：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，分子量MW＝155.24g/mol，密度0.877g/cm3。
NHS：N-羟基丁二酰亚胺，分子量MW＝115.09g/mol，密度1.65g/cm3。
DMF，密度0.945g/cm3。
10倍PBS溶液为直接购买，pH＝7.2～7.4，1倍PBS溶液由其稀释得到。
实施例1
如图1，一种三明治结构传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤A，抗体7标记：
(1)取25mg Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2溶解于1mL DMF，配成26.4mmol/L X溶液，混合均匀后置于4℃冰箱保存(注意防潮)。
(2)制冰。
(3)取0.31g EDC、0.12g NHS溶解于4mL DMF，得到Y溶液(新配)，其中EDC和NHS浓度分别为500mM及200mM，冰水浴降温。
(4)取190μL X溶液，100μL Y溶液，加入710μL DMF，得到5mM的【Ru-NHS】，冰水浴。在0℃下搅拌30分钟，随后在室温下放置5小时。
(5)将透析袋置于1mM的EDTA2Na(pH＝8)中煮沸10分钟，随后冷却，置于30％酒精溶液中，4℃冰箱保存。
(6)将抗体7从冰箱中取出，平衡至室温。用1倍PBS将抗体7稀释到1mg/mL。
(7)取室温5mM的【Ru-NHS】溶液30μL，加入1mL 1mg/mL的抗体7溶液中。包裹锡纸后室温振荡1小时。
(8)多余的【Ru-NHS】分100μL/份，在-20℃冻存，以防反复冻融带来污染。
(9)加入20μL、2M的甘氨酸并孵育15分钟以终止反应。
(10)将溶液加入透析袋，并用缓冲液稍微冲洗试管壁，随后用线扎紧，并夹上透析夹。将其放入1倍PBS缓冲液中，静置8小时，随后换水，再静置8小时。
(11)取出旋转过滤离心管，加入超纯水，水量完全过膜，冰浴或在冰箱里预冷几分钟，将水倒出。将透析袋内剩余的液体轻柔加入旋转过滤离心管中，液面不超过管顶的白线。离心管用1000×g离心3-5分钟。
(12)使用
Figure BDA0003827306020000061
pure蛋白纯化系统进一步纯化标记抗体7。使用分离柱为SuperdexTM 200Increase 10/300GL Prepacked TricornTM Columns，缓冲液为1倍PBS(pH＝7.4)，流速为0.075mL/min，同时检测280nm和455nm出的吸光度。
利用标记物Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2的荧光性质可以进行标签浓度的浓度测定。如图2，当激发光波长固定为290纳米时，该分子在655nm处有发射峰，发射荧光强度达到最大。使用微量BCA试剂盒检测标记抗体7的蛋白浓度，标准曲线如图3所示，荧光测定标签的标准曲线如图4所示。结合图5的蛋白电泳结果，标记抗体7的分子量约为190kDa，由此可以算出标记率(标签浓度/抗体浓度×100％)。
经
Figure BDA0003827306020000062
pure蛋白纯化系统进一步纯化的抗体7排除了未反应的发光分子以及蛋白多聚体等杂质的干扰，性能优越。如图6，取15、16、17号管流出液作为实验所用标记抗体7，分装后-20℃冻存备用。
步骤B，单体及模板分子预组装：
(1)金电极4预处理：依次使用金相砂纸、1μm、0.3μm、0.05μm的ɑ-Al2O3对金电极4进行打磨，随后使用乙醇、超纯水交替超声清洗3次，每次30秒，最后在0.5mM硫酸溶液中进行CV扫描直至稳定。
(2)单体自组装：配制组装液，其溶质为1mM对巯基苯硼酸(功能单体)、1mM2-噻吩硫醇(辅助单体)，溶剂为乙腈+DMF(体积比为1:1)，配制成组装液。取20μL组装液滴涂于金电极4表面，室温静置2小时。
(3)将步骤(2)组装好的电极在乙腈中搅拌5分钟，去除多余的单体。随后在电极表面滴涂30μL阿奇霉素8(模板分子)的乙腈/DMF溶液(体积比为2:1)，室温静置30分钟，随后插入乙腈中搅拌30分钟，去除未结合的模板分子。
步骤C，分子印迹膜制备：
(1)将简单淋洗后的金电极4作为工作电极1，铂丝为对电极3，填充液为0.1M四丁基高氯酸铵的银电极为参比电极2进行循环伏安电聚合，聚合液为含有0.1M四丁基高氯酸铵的2mM 3,4-乙烯二氧噻吩(EDOT)的乙腈溶液。参数设置为-0.5V～1.25V，扫描速度50mV/s。如图7，电极表面自组装的单体氧化产生自由基引发溶液中的EDOT聚合，随着扫描圈数增加、组装单体的消耗，电流值逐渐降低，电极表面发生的反应变少。基于图8，电极在铁氰化钾溶液中的方波伏安扫描结果表明其导电性略有增加，PEDOT成功聚合。在制备过程中，分别对金电极4、组装单体后的金电极4以及聚合PEDOT后的金电极4进行了水接触角测试，结果如下表1，可以看出组装单体使其表面疏水性增强(接触角变大)，而沉积PEDOT后其亲水性增强(接触角变小)，强于裸金电极4。
表1不同阶段金电极的水接触角
电极 金 组装单体后的金电极 组装单体、聚合PEDOT后的金电极
接触角/° 56.3±3.10 59.0±4.12 44.6±5.56
(2)使用去离子水和乙腈柔和冲洗聚合PEDOT后的电极，随后使用20mL 8:2的乙腈-乙酸溶液(V/V)中300rpm搅拌30分钟脱除模板分子。完成后弃去废液，重新加入20mL 8:2的乙腈-乙酸溶液(V/V)以确保模板脱除干净。
步骤D，样品中污染物选择性捕获：
将脱除完模板分子的电极浸入待测水样并以200rpm的速度搅拌60分钟后取出，以去离子水温和淋洗表面，以去除未结合杂质。
步骤E，三明治结构电极构建：
使用氮气吹干电极，在表面滴涂20μL 1％wt的牛血清白蛋白，室温孵育60分钟。使用1倍PBS溶液(pH＝7.2～7.4)轻柔冲洗后，在电极表面滴涂20μL 50μg/mL标记抗体7，在室温下孵育120分钟。简单淋洗后，将电极浸入1倍PBS中100rpm搅拌15分钟以除去未结合的抗体7，制得三明治结构传感器。
如图9，三明治结构传感器由下至上依次为金电极4、导电分子印迹聚合物层5、由三联吡啶钌6标记的抗体7，导电分子印迹聚合物层5内有用于捕获阿奇霉素8的孔9。
应用1
如图10，将实施例1制得的三明治结构传感器进行电致化学发光测定：
在包含0.2M三正丙胺以及1％吐温20的10倍PBS溶液中，以实施例1制得的传感器为工作电极1，铂丝为对电极3，饱和银/氯化银电极为参比电极2，构成三电极体系，溶液放置于电化学发光分析仪10的光采样器11上方，以获得最高光电转换效率。利用电致化学发光反应测定，检测限为亚nM级别。使用西安瑞迈电化学发光分析仪10进行循环伏安扫描，光电倍增管高压为800V，记录电流及光信号，结果如图11～12所示，可以看出，光信号在0.9V附近达到最大，0.5V的还原峰对应金的还原。
此外，实验中对比了不同条件下传感器的电致化学发光性能。如图13～14，在水样中不存在待测物质时光信号较弱(A)，在扫描溶液中不含共反应剂三丙胺时几乎没有光信号(B)，而在存在待测物质和共反应剂，但未聚合PEDOT的情况下，信号同样较弱(C)，说明导电聚合物显著增强了电子传递。
实施例2
一种三明治结构传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤A，与实施例1相同；
步骤B，单体及模板分子预组装：
(1)金电极4预处理：依次使用金相砂纸、1μm、0.3μm、0.05μm的ɑ-Al2O3对直径为3mm的玻碳电极进行打磨，随后使用乙醇、超纯水交替超声清洗3次，每次30秒，最后在0.5mM硫酸溶液中进行CV扫描直至稳定。在10mM铁氰化钾/亚铁氰化钾混合物的10倍PBS缓冲液中使用方波伏安法扫描0.5～0V，信号峰值达到250μA即表明打磨完成。扫描的参数设置为步长2mV，振幅为25mV、平衡时间60秒。扫描使用的对电极3为铂丝，参比电极2为饱和甘汞电极或饱和银/氯化银电极。
将打磨好的玻碳电极插入2mM四氯金酸的10倍PBS缓冲液中，以玻碳电极为工作电极1、饱和甘汞电极为参比电极2、铂丝为对电极3，使用计时库仑法在玻碳电极表面进行金沉积。如图15所示，控制电位为-0.2V，沉积电量为1mC。
(2)单体自组装：配制含有0.5mM对巯基苯硼酸(功能单体)、1mM苯乙硫醇(辅助单体)的组装液，溶剂为乙腈+DMF(体积比为1:1)。取20μL滴涂于金电极4表面，室温静置2小时。
(3)随后简单淋洗，使用20μL 0.5mM的巯基己醇孵育30分钟，封闭未反应的位点。随后在电极表面滴涂20μL 10mM阿奇霉素8的乙腈/DMF溶液(体积比为1:1)，静置2小时，使电极表面的功能单体充分抓取模板分子。随后将电极置入乙腈中以300rpm搅拌5分钟，去除未结合的模板分子。
步骤C，分子印迹膜制备：
(1)将清洗后的电极插入含有0.1M四丁基高氯酸铵和4mM EDOT的乙腈溶液中，以非水阴离子电极为参比进行+1.4V恒电位沉积，控制聚合电量为0.1mC。
(2)聚合完成后的电极在10mL 9:1的乙腈-醋酸溶液(V/V)中300rpm搅拌60分钟以脱除模板。至此，分子印迹聚合物电极制备完成，可用于检测分析。使用扫描电子显微镜和原子力显微镜对其表面形貌进行表征，如图16～17，电极表面纳米粒子直径约100纳米，分布均匀，增大了电极的比表面积。
步骤D，样品中污染物选择性捕获：
在去离子水中加入10μM阿奇霉素8储备液(水溶液，含有十万分之一的DMF助溶)，配置成一系列浓度的标准样品。取标准样品10mL，将制备好的电极浸入液面以下，室温下300rpm孵育30分钟，完成后用去离子水简单淋洗。
步骤E，三明治结构电极构建：
使用1％wt牛血清白蛋白孵育30分钟以封闭电极表面的非特异性结合位点。随后在电极表面滴涂20μL 40μg/mL的标记抗体7，在37℃下孵育60分钟。简单淋洗后，将电极浸入1倍PBS中300rpm搅拌5分钟以除去未结合的抗体7，制得三明治结构传感器。
应用2
将实施例2制得的三明治结构传感器进行电致化学发光测定：
以所得电极为工作电极1，铂丝为对电极3，饱和银/氯化银为参比电极2，在含有0.1M三正丙胺及2％吐温20的10倍PBS溶液中进行电致化学发光测试。程序设定为15个循环，每个循环包括0V 2s、-0.5V 2s、0V 5s以及+0.9V 10ms的恒电位脉冲，记录每个循环中+0.9V脉冲的最后3ms的光-电信号，其平均值为所得传感器的电致化学发光信号。经测试，该传感器在去离子水中的检出限为0.03nM，检测限为0.07nM，线性范围为0.1-10nM，校准曲线如图18所示。如下表2所示，该传感器选择性较好，类似物红霉素、克拉霉素、罗红霉素、卡马西平、双酚A对其检测干扰较小。
表2所得传感器对于干扰物的信号响应
污染物 投加量(nM) 检出量(nM) 回收率
阿奇霉素 10.00 10.48 104.8％
红霉素 10.00 1.81 18.1％
卡马西平 10.00 0.50 5.0％
罗红霉素 10.00 0.29 2.9％
克拉霉素 10.00 0.44 4.4％
双酚A 10.00 0.05 0.5％
实施例3
一种三明治结构传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤A，抗体7标记：
(1)取25mg Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2溶解于1mL DMF，配成26.4mmol/L X溶液，混合均匀后置于4℃冰箱保存(注意防潮)。
(2)制冰。
(3)取0.31g EDC、0.12g NHS溶解于4mL DMF，得到Y溶液(新配)，其中EDC和NHS浓度分别为500mM及200mM，冰水浴降温。
(4)取190μL X溶液，100μL Y溶液，加入710μL DMF，得到5mM的【Ru-NHS】，冰水浴。在0℃下搅拌30分钟，随后在室温下放置5小时。
(5)将透析袋置于1mM的EDTA2Na(pH＝8)中煮沸10分钟，随后冷却，置于30％酒精溶液中，4℃冰箱保存。
(6)将抗体7从冰箱中取出，平衡至室温。用1倍PBS将抗体7稀释到1mg/mL。
(7)取室温5mM的【Ru-NHS】溶液30μL，加入1mL 1mg/mL的抗体7溶液中。包裹锡纸后室温振荡1小时。
(8)多余的【Ru-NHS】分100μL/份，在-20℃冻存，以防反复冻融带来污染。
(9)加入20μL、2M的甘氨酸并孵育15分钟以终止反应。
(10)将溶液加入透析袋，并用缓冲液稍微冲洗试管壁，随后用线扎紧，并夹上透析夹。将其放入1倍PBS缓冲液中，静置8小时，随后换水，再静置8小时。
(11)取出旋转过滤离心管，加入超纯水，水量完全过膜，冰浴或在冰箱里预冷几分钟，将水倒出。将透析袋内剩余的液体轻柔加入旋转过滤离心管中，液面不超过管顶的白线。离心管用1000×g离心3-5分钟。
(12)使用
Figure BDA0003827306020000101
pure蛋白纯化系统进一步纯化标记抗体7。使用分离柱为SuperdexTM 200Increase 10/300GL Prepacked TricornTM Columns，缓冲液为1倍PBS(pH＝7.4)，流速为0.075mL/min。
步骤B，单体及模板分子预组装：
(1)金电极4预处理：依次使用金相砂纸、1μm、0.3μm、0.05μm的ɑ-Al2O3对金电极4进行打磨，随后使用乙醇、超纯水交替超声清洗3次，每次30秒，最后在0.5mM硫酸溶液中进行CV扫描直至稳定。
(2)单体自组装：配制组装液，其溶质为1mM对巯基苯硼酸(功能单体)、1mM2-噻吩硫醇(辅助单体)，溶剂为乙腈+DMF(体积比为8:2)，配制成组装液。取10μL组装液滴涂于金电极4表面，室温静置60分钟。
(3)将步骤(2)组装好的电极在乙腈中搅拌5分钟，去除多余的单体。随后在电极表面滴涂30μL阿奇霉素8(模板分子)的乙腈/DMF溶液(体积比为8:2)，室温静置30分钟，随后插入乙腈中搅拌120分钟，去除未结合的模板分子。
步骤C，分子印迹膜制备：
(1)将简单淋洗后的金电极4作为工作电极1，铂丝为对电极3，填充液为0.1M四丁基高氯酸铵的银电极为参比电极2进行循环伏安电聚合，聚合液为含有0.1M四丁基高氯酸铵的2mM 3,4-乙烯二氧噻吩(EDOT)的乙腈溶液。参数设置为-0.5V～1.25V，扫描速度50mV/s。
(2)使用去离子水和乙腈柔和冲洗聚合PEDOT后的电极，随后使用10mL 9:1的乙腈-醋酸溶液(V/V)中300rpm搅拌30分钟脱除模板分子。完成后弃去废液，重新加入10mL 9:1的乙腈-醋酸溶液(V/V)以确保模板脱除干净。
步骤D，样品中污染物选择性捕获：
将脱除完模板分子的电极浸入待测水样并以500rpm的速度搅拌10分钟后取出，以去离子水温和淋洗表面，以去除未结合杂质。
步骤E，三明治结构电极构建：
使用氮气吹干电极，在表面滴涂20μL 2％wt的牛血清白蛋白，室温孵育60分钟。使用1倍PBS溶液轻柔冲洗后，在电极表面滴涂20μL 50μg/mL标记抗体7，在室温下孵育120分钟。简单淋洗后，将电极浸入1倍PBS中100rpm搅拌15分钟以除去未结合的抗体7，制得三明治结构传感器。
应用3
将实施例3制得的三明治结构传感器进行电致化学发光测定：
以所得电极为工作电极1，铂丝为对电极3，饱和银/氯化银为参比电极2，在含有0.05M三正丙胺及0.5wt％吐温20的10倍PBS溶液中进行电致化学发光测试。
实施例4
一种三明治结构传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤A，抗体7标记：
(1)取25mg Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2溶解于1mL DMF，配成26.4mmol/L X溶液，混合均匀后置于4℃冰箱保存(注意防潮)。
(2)制冰。
(3)取0.31g EDC、0.12g NHS溶解于4mL DMF，得到Y溶液(新配)，其中EDC和NHS浓度分别为500mM及200mM，冰水浴降温。
(4)取190μL X溶液，100μL Y溶液，加入710μL DMF，得到5mM的【Ru-NHS】，冰水浴。在0℃下搅拌30分钟，随后在室温下放置5小时。
(5)将透析袋置于1mM的EDTA2Na(pH＝8)中煮沸10分钟，随后冷却，置于30％酒精溶液中，4℃冰箱保存。
(6)将抗体7从冰箱中取出，平衡至室温。用1倍PBS将抗体7稀释到1mg/mL。
(7)取室温5mM的【Ru-NHS】溶液6.25μL，加入1mL 1mg/mL的抗体7溶液中。包裹锡纸后室温振荡1小时。
(8)多余的【Ru-NHS】分100μL/份，在-20℃冻存，以防反复冻融带来污染。
(9)加入20μL、2M的甘氨酸并孵育15分钟以终止反应。
(10)将溶液加入透析袋，并用缓冲液稍微冲洗试管壁，随后用线扎紧，并夹上透析夹。将其放入1倍PBS缓冲液中，静置8小时，随后换水，再静置8小时。
(11)取出旋转过滤离心管，加入超纯水，水量完全过膜，冰浴或在冰箱里预冷几分钟，将水倒出。将透析袋内剩余的液体轻柔加入旋转过滤离心管中，液面不超过管顶的白线。离心管用1000×g离心3-5分钟。
(12)使用
Figure BDA0003827306020000121
pure蛋白纯化系统进一步纯化标记抗体7。使用分离柱为SuperdexTM 200Increase 10/300GL Prepacked TricornTM Columns，缓冲液为1倍PBS(pH＝7.4)，流速为0.075mL/min。
步骤B，单体及模板分子预组装：
(1)金电极4预处理：依次使用金相砂纸、1μm、0.3μm、0.05μm的ɑ-Al2O3对金电极4进行打磨，随后使用乙醇、超纯水交替超声清洗3次，每次30秒，最后在0.5mM硫酸溶液中进行CV扫描直至稳定。
(2)单体自组装：配制组装液，其溶质为1mM对巯基苯硼酸(功能单体)、1mM2-噻吩硫醇(辅助单体)，溶剂为乙腈+DMF(体积比为1:9)，配制成组装液。取50μL组装液滴涂于金电极4表面，室温静置120分钟。
(3)将步骤(2)组装好的电极在乙腈中搅拌5分钟，去除多余的单体。随后在电极表面滴涂30μL阿奇霉素8(模板分子)的乙腈/DMF溶液(体积比为1:9)，室温静置75分钟，随后插入乙腈中搅拌30分钟，去除未结合的模板分子。
步骤C，分子印迹膜制备：
(1)将简单淋洗后的金电极4作为工作电极1，铂丝为对电极3，填充液为0.1M四丁基高氯酸铵的银电极为参比电极2进行循环伏安电聚合，聚合液为含有0.1M四丁基高氯酸铵的2mM 3,4-乙烯二氧噻吩(EDOT)的乙腈溶液。参数设置为-0.5V～1.25V，扫描速度50mV/s。
(2)使用去离子水和乙腈柔和冲洗聚合PEDOT后的电极，随后使用20mL 8:1的乙腈-醋酸溶液(V/V)中300rpm搅拌30分钟脱除模板分子。完成后弃去废液，重新加入20mL 8:1的乙腈-醋酸溶液(V/V)以确保模板脱除干净。
步骤D，样品中污染物选择性捕获：
将脱除完模板分子的电极浸入待测水样并以300rpm的速度搅拌30分钟后取出，以去离子水温和淋洗表面，以去除未结合杂质。
步骤E，三明治结构电极构建：
使用氮气吹干电极，在表面滴涂20μL 1.5％wt的牛血清白蛋白，室温孵育60分钟。使用1倍PBS溶液轻柔冲洗后，在电极表面滴涂20μL 50μg/mL标记抗体7，在室温下孵育120分钟。简单淋洗后，将电极浸入1倍PBS中100rpm搅拌15分钟以除去未结合的抗体7，制得三明治结构传感器。
应用4
将实施例4制得的三明治结构传感器进行电致化学发光测定：
以所得电极为工作电极1，铂丝为对电极3，饱和银/氯化银为参比电极2，在含有0.2M三正丙胺及2wt％吐温20的10倍PBS溶液中进行电致化学发光测试。
实施例5
一种三明治结构传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤A，抗体7标记：
(1)取25mg Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2溶解于1mL DMF，配成26.4mmol/L X溶液，混合均匀后置于4℃冰箱保存(注意防潮)。
(2)制冰。
(3)取0.31g EDC、0.12g NHS溶解于4mL DMF，得到Y溶液(新配)，其中EDC和NHS浓度分别为500mM及200mM，冰水浴降温。
(4)取190μL X溶液，100μL Y溶液，加入710μL DMF，得到5mM的【Ru-NHS】，冰水浴。在0℃下搅拌30分钟，随后在室温下放置5小时。
(5)将透析袋置于1mM的EDTA2Na(pH＝8)中煮沸10分钟，随后冷却，置于30％酒精溶液中，4℃冰箱保存。
(6)将抗体7从冰箱中取出，平衡至室温。用1倍PBS将抗体7稀释到1mg/mL。
(7)取室温5mM的【Ru-NHS】溶液30μL，加入1mL 1mg/mL的抗体7溶液中。包裹锡纸后室温振荡1小时。
(8)多余的【Ru-NHS】分100μL/份，在-20℃冻存，以防反复冻融带来污染。
(9)加入20μL、2M的甘氨酸并孵育15分钟以终止反应。
(10)将溶液加入透析袋，并用缓冲液稍微冲洗试管壁，随后用线扎紧，并夹上透析夹。将其放入1倍PBS缓冲液中，静置8小时，随后换水，再静置8小时。
(11)取出旋转过滤离心管，加入超纯水，水量完全过膜，冰浴或在冰箱里预冷几分钟，将水倒出。将透析袋内剩余的液体轻柔加入旋转过滤离心管中，液面不超过管顶的白线。离心管用1000×g离心3-5分钟。
(12)使用
Figure BDA0003827306020000141
pure蛋白纯化系统进一步纯化标记抗体7。使用分离柱为SuperdexTM 200Increase 10/300GL Prepacked TricornTM Columns，缓冲液为1倍PBS(pH＝7.4)，流速为0.075mL/min。
步骤B，单体及模板分子预组装：
(1)金电极4预处理：依次使用金相砂纸、1μm、0.3μm、0.05μm的ɑ-Al2O3对金电极4进行打磨，随后使用乙醇、超纯水交替超声清洗3次，每次30秒，最后在0.5mM硫酸溶液中进行CV扫描直至稳定。
(2)单体自组装：配制组装液，其溶质为1mM对巯基苯硼酸(功能单体)、1mM2-噻吩硫醇(辅助单体)，溶剂为乙腈+DMF(体积比为1:1)，配制成组装液。取30μL组装液滴涂于金电极4表面，室温静置90分钟。
(3)将步骤(2)组装好的电极在乙腈中搅拌5分钟，去除多余的单体。随后在电极表面滴涂30μL阿奇霉素8(模板分子)的乙腈/DMF溶液(体积比为2:1)，室温静置100分钟，随后插入乙腈中搅拌30分钟，去除未结合的模板分子。
步骤C，分子印迹膜制备：
(1)将简单淋洗后的金电极4作为工作电极1，铂丝为对电极3，填充液为0.1M四丁基高氯酸铵的银电极为参比电极2进行循环伏安电聚合，聚合液为含有0.1M四丁基高氯酸铵的2mM 3,4-乙烯二氧噻吩(EDOT)的乙腈溶液。参数设置为-0.5V～1.25V，扫描速度50mV/s。
(2)使用去离子水和乙腈柔和冲洗聚合PEDOT后的电极，随后使用20mL 8:2的乙腈-醋酸溶液(V/V)中300rpm搅拌30分钟脱除模板分子。完成后弃去废液，重新加入20mL 8:2的乙腈-醋酸溶液(V/V)以确保模板脱除干净。
步骤D，在自来水、合成污水和生活污水处理厂二沉池出水中对投加的污染物选择性捕获：
将脱除完模板分子的电极浸入待测水样并以400rpm的速度搅拌40分钟后取出，以去离子水温和淋洗表面，以去除未结合杂质。
步骤E，三明治结构电极构建：
使用氮气吹干电极，在表面滴涂20μL 1％wt的牛血清白蛋白，室温孵育60分钟。使用1倍PBS溶液轻柔冲洗后，在电极表面滴涂20μL 50μg/mL标记抗体7，在室温下孵育120分钟。简单淋洗后，将电极浸入1倍PBS中100rpm搅拌15分钟以除去未结合的抗体7，制得三明治结构传感器。
应用5
将实施例5制得的三明治结构传感器进行电致化学发光测定：
以所得电极为工作电极1，铂丝为对电极3，饱和银/氯化银为参比电极2，在含有0.1M三正丙胺及1wt％吐温20的10倍PBS溶液中进行电致化学发光测试。
表3所得传感器在不同污水中的回收率
Figure BDA0003827306020000151
实施例6
本实施案例对所得传感器制备及使用过程中的关键参数进行优化。考虑到功能单体抓取污染物的关键基团为硼酸键，考虑使用含有羟基(甲醇、乙醇)或邻羟基(1,2-丙二醇)的小分子对其进行针对性封闭。
本实施例其余步骤与实施例1均相同，区别仅仅在于：取步骤C处理后的分子印迹聚合物电极，在其表面分别滴涂20μL 1％wt的甲醇、乙醇、丙二醇水溶液，随后进行抗体7孵育、电致化学发光测试。
结果如下表3所示，甲醇因最小的空间位阻展现出了最佳的封闭效果，乙醇次之，丙二醇最差。然而，由于电极表面大量非特异性结合位点的存在，其背景噪音仍需进一步控制。相比之下，1％wt牛血清白蛋白的封闭效果优越，并且先使用甲醇、后使用牛血清白蛋白封闭的传感器获得了更低的背景信号值，由此20μL 1％wt甲醇+20μL 1％wt牛血清白蛋白依次封闭为最佳方案。
表4不同封闭剂效果对比
封闭剂 甲醇 乙醇 1，2-丙二醇 牛血清白蛋白 甲醇+牛血清白蛋白
背景信号 3205 3836 4250 382 275
实施例7
检测过程中用到的标记抗体7的浓度也需要优化。抗体7浓度过低将导致信号微弱、响应不灵敏、线性范围窄等问题，而抗体7浓度过高将导致高的背景响应、高昂的检测成本以及较差的灵敏度，二者都将影响传感器的信噪比。
本实施例其余步骤与实施例1均相同，区别仅仅在于：分别取步骤C和D处理后的分子印迹聚合物电极，使用20μL 1％wt甲醇+20μL 1％wt牛血清白蛋白依次封闭。随后在其表面分别滴涂20μL 10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL以及200μg/mL的标记抗体7，37℃孵育60分钟后进行电致化学发光测试。其中，40μg/mL的标记抗体7展现出最佳的信噪比及经济性，所以将40μg/mL确定为最佳抗体7浓度。
实施例8
电致化学发光反应中共反应剂的浓度直接影响信号的强度。
本实施例其余步骤与实施例1均相同，区别仅仅在于：取步骤E处理后的分子印迹聚合物电极，在不同的三正丙胺浓度的溶液中进行测试。结果表明，低浓度的三正丙胺对信号强化效果较差，100mM时能显著增强光信号，相比之下200mM仅略有提升，故将100mM确定为最佳共反应试剂浓度。

Claims (10)

1.一种三明治结构传感器，其特征在于：包括工作电极(1)、参比电极(2)和对电极(3)；所述工作电极(1)依次包括金电极(4)、导电分子印迹聚合物层(5)和发光分子(6)标记的抗体(7)，所述导电分子印迹聚合物层(5)内设置用于捕获阿奇霉素(8)的孔(9)，所述发光分子(6)标记的抗体(7)与阿奇霉素(8)通过分子间作用力结合。
2.根据权利要求1所述的一种三明治结构传感器，其特征在于：与电化学发光分析仪(10)相连，所述参比电极(2)为饱和银/氯化银电极，所述对电极(3)为铂丝。
3.根据权利要求1所述的一种三明治结构传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，纯化发光分子(6)标记的抗体(7)，去除未结合的发光分子和杂质；
步骤二，取功能单体、辅助单体的乙腈溶液滴涂于打磨好的金电极(4)表面，室温静置60～180分钟，淋洗，完成自组装，在电极表面滴涂模板分子的乙腈DMF混合溶液，将处理后的电极插入交联单体的乙腈溶液中电聚合，随后在乙腈乙酸溶液中搅拌脱除模板分子；
步骤三，将步骤二所得电极浸入待测水样并以200～500rpm的速度搅拌10～60分钟后取出淋洗；
步骤四，在步骤三所得电极的表面滴涂封闭剂，用去离子水或PBS溶液冲洗，随后在电极表面滴涂步骤一的发光分子(6)标记的抗体(7)，淋洗搅拌至去除未结合的抗体(7)，得到三明治结构传感器。
4.根据权利要求3所述的一种三明治结构传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤一中，发光分子为二(2，2’-二联吡啶)-4，4’-二羧基二联吡啶-钌二(六氟磷酸盐)，抗体为鼠抗单克隆抗体，所述发光分子和抗体的初始摩尔比为5～25:1。
5.根据权利要求3所述的一种三明治结构传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤二中，对金电极进行打磨，用乙醇、超纯水交替超声清洗，直至在硫酸溶液中进行CV扫描稳定。
6.根据权利要求3所述的一种三明治结构传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤二中，功能单体为对巯基苯硼酸，辅助单体为2-巯基噻吩或苯乙硫醇，模板分子为阿奇霉素(8)。
7.根据权利要求3所述的一种三明治结构传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤二中，交联单体为3，4-乙烯二氧噻吩、苯胺、吡咯中的任意一种。
8.根据权利要求3所述的一种三明治结构传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤二中，乙腈乙酸溶液中，乙腈与乙酸的体积比为5～9:1。
9.根据权利要求3所述的一种三明治结构传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤五中，封闭剂为1～2wt％的牛血清白蛋白、酪蛋白、脱脂奶粉中的任意一种。
10.根据权利要求1所述的一种三明治结构传感器在监测污水厂痕量浓度阿奇霉素中的应用。
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