CN115368470A

CN115368470A - 靶向b7-h3的嵌合受体及其用途

Info

Publication number: CN115368470A
Application number: CN202110558851.8A
Authority: CN
Inventors: 王恩秀; 孙明; 汪晨
Original assignee: Nanjing Cart Medical Technologies Ltd; Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nanjing Cart Medical Technologies Ltd; Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2021-05-21
Filing date: 2021-05-21
Publication date: 2022-11-22

Abstract

本公开涉及一种靶向B7‑H3的嵌合受体及其用途。所述嵌合抗原受体其包含第一融合肽和第二融合肽，其中：所述第一融合肽包含B7‑H3抗原结合结构域和跨膜结构域；所述第二融合肽包含跨膜结构域、胞质结构域和共刺激结构域。本公开的嵌合抗原受体对B7‑H3表达阳性实体瘤细胞的具有良好的杀伤活性。

Description

靶向B7-H3的嵌合受体及其用途

技术领域

本公开涉及肿瘤细胞治疗领域，更具体地，涉及表达包含DAP12和共刺激信号分子信号域的靶向B7-H3的嵌合受体、其免疫效应细胞、包含其的组合物、其制备方法及用途。

背景技术

B7-H3也称为CD276，是一种I型跨膜蛋白，属于B7-CD28超家族。B7-H3胞外区包含两个串联的IgV-IgC结构域(4Ig-B7-H3，即IgV–IgC–IgV–IgC)，与鼠源B7-H3(2Ig-B7-H3)显示具有类似的功能。最初人们认为B7-H3作为一种共刺激分子，对CD4和CD8 T细胞的增殖具有协同刺激作用，在TCR信号的存在下，选择性地增强干扰素的产生。然而，近年来的多数研究结果表明，B7-H3是一种抑制性分子，如B7-H3可抑制由抗TCR或同种异体抗原呈递细胞的抗体介导的T细胞增殖，这种抑制作用可能通过NFAT、NFkB和AP-1因子来控制。

B7-H3在肿瘤相关上皮细胞也有表达，通常高表达水平对应恶化程度高，有研究将B7-H3的表达水平作为乳腺癌诊断指标。最近有研究将B7-H3单克隆抗体标记212Pb，应用于卵巢癌治疗，临床前研究证明了B7-H3单克隆抗体可同时靶向肿瘤和肿瘤血管内皮细胞，显示出初步疗效和良好的安全性。另外，偶联pyrrolobenzodiazepine的B7-H3 抗体也同时作用于B7-H3阳性肿瘤细胞和肿瘤血管内皮系统。B7-H3在肿瘤血管内皮系统中的高表达可能有助于肿瘤转移前微环境的形成并促进转移，有报道可溶性B7-H3介导肿瘤细胞中血管内皮生长因子的表达。

近年来，尽管放疗、化疗及手术治疗等常规肿瘤治疗方法可以起到一定的治疗效果，但肿瘤的转移、复发及患者生存率低等问题仍未得到妥善解决。随着肿瘤免疫学理论和技术的发展，免疫细胞在肿瘤治疗中的作用日益受到重视。其中，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)技术是近年来发展非常迅速的一种细胞治疗技术。

目前国内外CAR结构设计主要包括传统的二代、三代CAR。二代CAR为scFv-41BB-CD3ζ或scFv-CD28-CD3ζ，三代CAR为scFv-41BB-CD28-CD3ζ或scFv-CD28-41BB-CD3ζ，目前临床应用最多的是传统二代CAR，且在血液瘤中疗效显著。

CN107580628A公开了用于过继免疫疗法的具有嵌合受体的靶向细胞毒性细胞，其中采用了DAP12/KIRS2作为CAR结构的胞内信号域。然而，由于缺乏共刺激信号分子，导致其存在可持续性不佳的技术问题，实验中与肿瘤细胞共培养时，DAP12/KIRS2 CAR-T的IL-2分泌量很低，且在临床治疗中导致治疗无效。

因此，需要新的策略以增强临床疗效，以实现CAR-T细胞治疗的潜力最大化。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本公开将共刺激信号分子4-1BB和新发现的抗B7-H3的单链抗体引入到 DAP12/KIRS2中，形成了新的抗B7-H3抗原的CAR结构B7-H3-DAP12/KIRS2-4-1BB，并且验证了基于该CAR结构的体外药效学(杀伤，细胞因子分泌，增殖等)，证明了该CAR结构对B7-H3表达阳性的实体瘤细胞具有有效的杀伤作用。

因此，在一方面，本公开提供了一种靶向B7-H3的嵌合抗原受体。

在一方面，本公开提供了编码如前述嵌合抗原受体的核酸。

在一方面，本公开提供了包含前述核酸的载体。

在一方面，本公开提供了包含前述载体的细胞。

在一方面，本公开提供了包含前述嵌合抗原受体、其核酸和/或细胞以及药学上可接受的载体的药物组合物。

在一方面，本公开提供了将前述核酸或载体导入免疫效应细胞制备细胞方法。

在一方面，本公开提供了前述嵌合抗原受体、核酸、载体、细胞和/或药物组合物在制备用于治疗和/或预防疾病或病症的药物中的用途。

在一方面，本公开提供了一种在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的包含前述的嵌合抗原受体、核酸、载体、细胞和/或药物组合物。

在一方面，本公开提供了一种治疗患有疾病或病症的哺乳动物的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的前述的嵌合抗原受体、核酸、载体、细胞和/或药物组合物。

附图说明

图1示出了B7-H3-DAP12/KIRS2 CAR结构设计。

图2示出了三种B7-H3CAR-T细胞的扩增和体积变化。

图3示出了三种B7-H3CAR-T的阳性率。

图4示出了三种B7-H3CAR-T细胞分化亚型检测结果。

图5示出了三种B7-H3CAR-T细胞及NTD对靶细胞裂解率。

图6示出了三种B7-H3CAR-T细胞IL-2和IFN-γ检测结果。

图7示出了CAR-T增殖流式检测结果。

图8示出了B7H3 CAR-T细胞在动物体内的抗肿瘤活性。

具体实施方式

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文使用的和除非另作说明，术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的加或减10％之内。在需要整数的情况下，该术语是指在给定值或范围的加或减10％之内、向上或向下舍入到最接近的整数。

“嵌合抗原受体”或“CAR”，如该术语在本文所用，是指与来自例如T细胞或NK细胞的细胞免疫功能受体或衔接分子共享结构和功能特性的嵌合多肽。在实施方案中，CAR包含结合同源抗原(例如本文所述的肿瘤抗原)的抗原结合结构域。在结合同源抗原后，CAR可以活化或失活其所处的细胞毒性细胞，或调节细胞的抗肿瘤活性或调节细胞的免疫应答。

本文所用的术语“抗体”是指来源于与靶抗原特异性结合的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是来源于天然来源或来自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体可以是多克隆或单克隆，多链或单链或完整的免疫球蛋白，并且可以来自天然来源或来自重组来源。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本文所述的抗体分子可以多种形式存在，其中抗体的抗原结合部分表达为连续多肽链的一部分，包括例如单结构域抗体片段(sdAb)，单链抗体(scFv)和人源化或人抗体，例如，如本文所述。

就抗体链多肽序列而言，短语“基本相同”可理解为表现出与参照多肽序列至少60％、65％、70％、75％、80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的抗体链。就核酸序列而言，该术语可理解为表现出与参照核酸序列至少大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列。

序列“相同性”或“同一性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列相同性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列相同性。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的相同性的方法，但是术语“相同性”是技术人员公知的。

“取代型”变体是天然序列中至少一个氨基酸残基被除去并被不同的氨基酸插入其相同位置的变体。所述取代可为单个的，其中该分子中仅有一个氨基酸被取代；或可为多个的，其中该相同分子有两个或更多的氨基酸被取代。多个取代可位于连续的位点。同样，一个氨基酸可被多个残基取代，其中这样的变体包括取代和插入二者。“插入型”变体是一个或多个氨基酸被插入到紧邻一段天然序列某个特定位置处的氨基酸的变体。紧邻氨基酸意指与该氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团连接。“缺失型”变体是天然氨基酸序列中一个或多个氨基酸被除去的变体。通常情况下，缺失型变体在其分子的特定区域内有一个或两个氨基酸被缺失。

就抗体的可变结构域而言，术语“可变”系指抗体之间有广泛序列差异的相关分子的某些部分，且被用于针对其特异靶的特定抗体的特异识别和结合。但是，可变性在抗体的整个可变结构域内不是均匀分布的。可变性集中在被称为互补决定区域(CDRs；即CDR1、CDR2和CDR3)或超变区的三个区段，它们均位于轻链和重链的可变结构域内。可变结构域内保守程度更高的部分被称为构架(FR)区或构架序列。天然重链和轻链的每个可变结构域均包括四个FR区，其主要采用β-折叠构型，它们籍三个CDRs连接起来，CDRs形成环，所述环连接β-折叠结构并在某些情形下形成部分的β-折叠结构。每条链的CDRs通常被FR区在邻近连接起来，并且借助于来自其它链的CDR，有助于抗体靶结合位点(表位或决定簇)的形成。正如本文所使用，免疫球蛋白氨基酸残基的编号是依据Kabat等人的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统而进行的，除非另有说明。一个CDR可具有特异结合关联表位的能力。

术语抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分，其少于全长，但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个CDR和/或一个或多个抗体结合位点)，并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异性结合能力。因此，抗原结合片段指包含与衍生抗体片段的抗体结合相同抗原的抗原结合部分的抗体片段。抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及合成产生的衍生物，例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')₂、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd'片段以及其他片段，包括修饰的片段。所述片段可以包括连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/ 或通过肽接头。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸，并且典型至少或约200个氨基酸。抗原结合片段包括任何抗体片段，其在被插入抗体框架(例如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合(即表现出至少或至少约 10⁷-10⁸M-1的Ka)抗原的抗体。“功能片段”是可防止或实质降低所述受体结合配体或启动信号转导的能力的片段或类似物。正如本文所使用，功能片段一般与“抗体片段″含义相同，且就抗体而论，可指能防止或实质降低所述受体结合配体或启动信号转导的能力的片段，例如Fv、Fab、F(ab')₂等等。“Fv”片段由一条重链的可变结构域和一条轻链的可变结构域籍非共价结合方式而形成的二聚体(V_H-V_L二聚体)组成。在该构型中，每个可变结构域的三个CDRs 相互作用，以确定V_H-V_L二聚体表面上的靶结合位点，与完整抗体的情况一样。所述六个CDRs共同赋予完整抗体的靶结合特异性。但是，即使是单个可变结构域(或仅包括3个靶特异的CDRs的Fv的一半)，仍可具有识别和结合靶的能力。

术语“单克隆抗体”指相同抗体的群体，表示单克隆抗体群体中的每个单独的抗体分子与其他抗体分子相同。这种特性与抗体的多克隆群体的特性相反，所述抗体的多克隆群体包含具有多种不同序列的抗体。单克隆抗体可以通过许多公知的方法来制备。例如，单克隆抗体可以通过永生化B细胞来制备，例如通过与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系或者通过用诸如EBV的病毒感染B细胞。重组技术还可以用来在体外通过用携带编码抗体的核苷酸的人工序列的质粒转化宿主细胞来从宿主细胞的克隆群体制备抗体。

术语全长抗体是具有两条全长重链(例如VH-CH1-CH2-CH3或VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和两条全长轻链 (VL-CL)和铰链区的抗体，例如通过抗体分泌B细胞天然产生的抗体以及合成产生的具有相同结构域的抗体。

术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列源自一个物种，恒定区序列源自另一物种，如其中可变区序列源自小鼠抗体及恒定区序列源自人抗体的抗体。

“人源化”抗体是指非人(例如小鼠)抗体形式，其是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或者其片段(如Fv、Fab、 Fab'、F(ab')₂或者抗体的其它抗原结合亚序列)，含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中接受者抗体的互补决定区(CDR)的残基由来自具有希望的特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或者兔的CDR残基置换。

此外，在人源化中，还可能对VH和/或VL的CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，由此改善抗体的一或多种结合特性(例如亲和性)。可进行例如PCR介导的突变引入突变，其对抗体结合或其它功能特性的影响可利用本文所述的体外或体内测试评估。通常，引入保守性突变。此类突变可为氨基酸取代、添加或缺失。另外，CDR内的突变通常不超过一个或两个。因此，本发明所述人源化抗体还涵盖CDR内包含1或2两个氨基酸突变的抗体。

术语“CDR”指互补决定区(complementarity-determining region)，已知抗体分子的每个重链和轻链具有3个CDR。 CDR也称作高变区，且存在于抗体的每个重链和轻链的可变区中，在CDR的一级结构中具有非常高的变异性位点。本说明书中，重链的CDR由来自重链的氨基端序列的氨基端的CDR1、CDR2、CDR3表示，轻链的CDR由来自轻链的氨基端序列的氨基端的CDR1、CDR2、CDR3表示。这些位点在三级结构中彼此临近，并决定抗体所结合的抗原的特异性。

术语“表位”指抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常包含分子的化学活性表面分型，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。

术语关于抗体或其抗原结合片段的“特异性结合”或“免疫特异性地结合”在本文中可交换使用，并且指抗体或抗原结合片段通过抗体和抗原的抗体结合位点之间的非共价相互作用与同种抗原形成一个或多个非共价键的能力。所述抗原可以是分离的抗原或存在于肿瘤细胞。通常，免疫特异性地结合(或特异性结合)抗原的抗体是以约或 1×10⁷M^-1或1x10⁸M^-1或更大的亲和常数Ka(或者1x10^-7M或1×10^-8M或更低的解离常数(Kd))结合所述抗原。亲和常数可以通过抗体反应的标准动力学方法来测定，例如，免疫测定、表面等离子共振(SPR)、等温滴定量热法(ITC)或本领域已知的其他动力学相互作用测定；还参见描述用于计算抗体的结合亲和力的示例性SPR和ITC 方法的美国专利第7，229，619号。用于实时检测和监测结合速率的仪器和方法是已知的，并且可商购。

术语“多核苷酸”和“核酸分子”指包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物，包括通常通过磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。如本文所使用，术语“核酸分子”意欲包括 DNA分子及RNA分子。核酸分子可为单链或双链，且可为cDNA。

如本文所用，分离的核酸分子是从存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。诸如cDNA 分子的“分离的”核酸分子可以在通过重组技术制备时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学成分。本文所提供的示例性分离的核酸分子包括编码所提供的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。

如本文所用，关于核酸序列、区域、元件或结构域的“可操作地连接”表示核酸区域互相功能相关。例如，启动子可以可操作地连接至编码多肽的核酸，从而所述启动子调控或介导所述核酸的转录。

亦提供本文所述序列表中所述序列的“保守序列修饰”，即不消除由核苷酸序列编码或含有氨基酸序列的抗体与抗原的结合的核苷酸及氨基酸序列修饰。这些保守序列修饰包括保守核苷酸及氨基酸取代以及核苷酸及氨基酸添加及缺失。例如，可通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变及PCR介导的诱变)将修饰引入本文所述的序列表中。保守序列修饰包括保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被替换为具有类似侧链的氨基酸残基。具有类似侧链的氨基酸残基的家族是本领域中已有定义的。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分枝侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。鉴定不消除抗原结合的核苷酸及氨基酸保守取代的方法为本领域所熟知。

术语“表达”指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。多肽的表达水平可以利用本领域已知的任何方法来评价，包括例如测定从宿主细胞产生的多肽的量的方法。这类方法可以包括但不限于通过ELISA定量细胞裂解物中的多肽，凝胶电泳之后考马斯蓝染色，Lowry蛋白测定以及Bradford蛋白测定。

术语“宿主细胞”是用于接受、保持、复制和扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达载体所编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体中所含的核酸复制，从而扩增核酸。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。合适的宿主细胞包括但不限于CHO细胞、各种COS细胞、HeLa细胞、HEK细胞例如HEK 293细胞。

术语“载体”是可复制的核酸，当载体转化入适当的宿主细胞时，可以从该载体表达一种或多种异源蛋白。关于载体包括那些通常通过限制酶切消化和连接可以将编码多肽或其片段的核酸引入其中的载体。关于载体还包括那些包含编码多肽的核酸的载体。载体用来将编码多肽的核酸引入宿主细胞，用于扩增核酸或者用于表达/展示核酸所编码的多肽。载体通常保持游离，但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。还考虑人工染色体的载体，例如酵母人工载体和哺乳动物人工染色体。这类媒介物的选择和用途是本领域技术人员公知的。

如本文所用，载体还包括“病毒载体”或“病毒的载体”。病毒的载体是工程化的病毒，其可操作地连接至外源基因以将外源基因转移(作为媒介物或穿梭(shuttle))入细胞。

术语“表达载体”包括能够表达DNA的载体，所述DNA与诸如启动子区的能够影响这类DNA片段表达的调控序列可操作地连接。这类额外的片段可以包括启动子和终止子序列，并且任选地可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体一般来源于质粒或病毒DNA，或者可以包含这两者的元件。因此，表达载体指重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，当引入适当的宿主细胞时，导致克隆DNA的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的，并且包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的表达载体以及保持游离的表达载体或者整合入宿主细胞基因组的表达载体。

术语“刺激”指的是通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合体)与其同源配体结合，从而介导信号转导事件的初次应答，诸如，但由不限于，经TCR/CD3复合体的信号转导。刺激可介导某些分子的改变的表达，例如TGF-β的下调，和/或细胞骨架结构的重组等。

术语“刺激性分子”是指由T细胞表达的提供一级细胞质信号传导序列的分子，该信号传导序列以刺激性方式调节用于T细胞信号传导途径的至少一些方面的TCR复合体的一级活化。在一个方面，一级信号是通过例如 TCR/CD3复合体与负载有肽的MHC分子的结合启动，并且其导致介导T细胞应答，包括，但不限于增殖、活化、分化等。以刺激方式起作用的一级细胞质信号传导序列(也称为“一级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。特别地用于本发明的含有ITAM的一级细胞质信号传导序列的实例包括，但不限于来源于下述的那些:TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、 CD278(也称作“ICOS”)、FcεRI、CD66d、DAP10和DAP12。在本发明的特异性CAR中，在本发明的任一个或更多个CAR中的胞内信号传导结构域包括细胞内信号传导序列。

术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指其表面上呈递与主要组织相容性复合体(MHC的)复合的外来抗原的免疫系统细胞，比如辅助细胞(例如，B-细胞、树突细胞等)。T-细胞可以使用其T-细胞受体(TCR)识别这些复合体。APC 加工抗原且将其呈递给T-细胞。

术语“胞内信号传导结构域”，是指分子的细胞内部分。胞内信号传导结构域可以产生促进含CAR细胞(例如 CAR-T细胞或表达CAR的NK细胞)的免疫效应子功能的信号。免疫效应子功能的实例(例如在CAR-T细胞或表达 CAR的NK细胞中)包括细胞溶解活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。在实施方案中，细胞内信号结构域转导效应子功能信号并指导细胞进行特化功能。虽然可以使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不必使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，此类截短部分可用于代替完整链，只要其转导效应子功能信号即可。术语胞内信号传导结构域因此意在包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。

在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包括一级胞内信号传导结构域。示例性的一级胞内信号传导结构域包括来源于负责初次刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包括共刺激胞内结构域。示例性的共刺激胞内信号传导结构域包括来源于负责共刺激信号或抗原独立的刺激的分子的那些。例如，在表达CAR的免疫效应细胞，例如CAR-T细胞或表达CAR的NK细胞的情况下，一级胞内信号传导结构域可以包含T细胞受体的细胞质序列，并且共刺激胞内信号传导结构域可以包含来自共同受体或共刺激性分子的细胞质序列。

一级胞内信号传导结构域可以包括被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有ITAM 的一级细胞质信号传导序列的实例包括，但不限于来源于下述的那些:CD3ζ，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD5，CD22， CD79a，CD79b，CD278(“ICOS”)，FcεRI，CD66d，DAP10和DAP12。

术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合从而介导T细胞的共刺激反应，例如但不限于增殖。共刺激分子是有效免疫应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子，TNF受体蛋白，免疫球蛋白样蛋白，细胞因子受体，整联蛋白，信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)，激活NK细胞受体，BTLA，Toll配体受体，OX40，CD2，CD7，CD27，CD28，CD30，CD40， CDS，ICAM-1，LFA-1(CD11a/CD18)，4-1BB(CD137)，B7-H3，CDS，ICAM-1，ICOS(CD278)，GITR，BAFFR，LIGHT，HVEM(LIGHTR)，KIRDS2，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，NKp44，NKp30，NKp46，CD19，CD4，CD8α， CD8β，IL2Rβ，IL2Rγ，IL7Rα，ITGA4，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD， CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2， CD18，LFA-1，ITGB7，NKG2D，NKG2C，TNFR2，TRANCE/RANKL，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244，2B4)， CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRTAM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，CD69， SLAMF6(NTB-A，Ly108)，SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，LAT， GADS，SLP-76，PAG/Cbp，CD19a和与CD83特异性结合的配体。

共刺激胞内信号传导结构域是指共刺激分子的细胞内部分。胞内信号传导结构域可以包括分子的全部细胞内部分或全部天然胞内信号传导结构域、或其功能片段。

术语“4-1BB”是指具有如GenBank Acc.No.AAA62478.2提供的氨基酸序列的TNFR超家族的成员，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基；并且“4-1BB共刺激结构域”被定义为GenBank Acc.No..AAA62478.2的氨基酸残基214-255，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”为如SEQ ID NO:5提供的序列或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。

术语“免疫效应细胞”，是指参与免疫应答，例如，促进免疫效应子应答的细胞。免疫效应细胞的实例包括T 细胞，例如，α/β的T细胞和γ/δT细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓源性吞噬细胞。

术语“免疫效应子功能或免疫效应子应答”是指免疫效应细胞，例如增强或促进靶细胞的免疫攻击的功能或反应。例如，免疫效应子功能或应答是指促进靶细胞的杀伤或者抑制生长或增殖的T细胞或NK细胞的属性。在T细胞的情况下，一级刺激和共刺激是免疫效应子功能或应答的实例。

在一些实施方案中，细胞群体(例如收获的细胞群体)包含例如处于不同分化阶段的T细胞或T细胞群体。T细胞分化阶段从最少到最多分化包括幼稚T细胞、干中央记忆T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞和末端效应T细胞。抗原暴露后，幼稚T细胞增殖并分化成记忆T细胞，例如干中央记忆T细胞和中央记忆T细胞，然后分化成效应记忆T细胞。记忆T细胞在接受适当的T细胞受体、共刺激和炎症信号后，进一步分化成末端效应T 细胞。

幼稚T细胞(TN)由以下细胞表面标志物的表达模式表征：CCR7+、CD62L+、CD45RO-、CD95-。干细胞中央记忆T细胞(TSCM)的特征在于以下细胞表面标志物的表达模式：CCR7+、CD62L+、CD45RO-、CD95+。中央记忆 T细胞(TCM)的特征在于细胞表面标志物的以下表达模式：CCR7+、CD62L+、CD45RO+、CD95+。效应记忆T细胞(TEM)的特征在于以下细胞表面标志物的表达模式：CCR7-、CD62L-、CD45RO+、CD95+。末端效应T细胞(TEff) 的特征在于细胞表面标志物的以下表达模式：CCR7-、CD62L-、CD45RO-、CD95+。

来自健康供体的新鲜T细胞通常基于CD45RA和CD62L表达分为四个亚组：1)幼稚T细胞(CD45RA+CD62L+，称为Tn)，2)中央记忆T细胞(CD45RA-CD62L+，称作Tcm)，3)效应记忆T细胞(CD45RA-CD62L-，称为Tem)和 4)CD45RA阳性效应T细胞(CD45RA+CD62L-，简称Temra)。然后进一步评估每个亚组CCR7、CD27、CD28和CD95 的表达。在慢病毒转导后CD95表达显著上调。后三种T细胞亚群对CD95阳性，而仅有一小部分Tn表达CD95(CD4+ 中为3.6±1.4％，CD8+T细胞中为3.7±1.3％)。这个小群体也共表达CD27、CD28和CCR7，被认为是记忆干细胞(Tscm)。

术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是溶细胞活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。

术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。此类载体或稀释剂的优选示例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％的人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性载体，例如固定化油。将此类介质和试剂用于药物活性物质是本领域熟知的。除去任何常规的介质或试剂与嵌合抗原受体不相容之外，设想其在组合物中的用途。

术语“治疗”患有疾病或疾病状况的个体表示所述个体的症状部分或全部缓解，或者在治疗后保持不变。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防指防止潜在疾病和/或防止症状恶化或疾病发展。治疗还包括所提供的任何嵌合抗原受体以及本文所提供的组合物的任何药学用途。

术语“疗效”表示由个体的治疗所导致的效果，其改变、通常改良或改善疾病或疾病状况的症状，或者治愈疾病或疾病状况。

术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。

术语“预防有效量”或“预防有效剂量”指在施用于对象时会具有预期的预防效果的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量，例如，防止或延迟疾病或症状的发生或复发，减少疾病或症状发生或复发的可能性。完全预防有效剂量不必通过施用一个剂量发生，并且可以仅在施用一系列剂量之后发生。因此，预防有效量可以在一次或多次施用中施用。

术语“患者”是指哺乳动物，例如人。

在一方面，本公开一种靶向B7-H3的嵌合抗原受体，其包含第一融合肽和第二融合肽，其中：

所述第一融合肽包含B7-H3抗原结合结构域和跨膜结构域；

所述第二融合肽包含跨膜结构域、胞质结构域和共刺激结构域；

在一些实施方案中，所述第二融合肽的跨膜结构域通过电荷相互作用与第一融合肽的跨膜结构域相互作用，或所述第二融合肽通过胞质结构域内的磷酸化ITAM序列与信号分子相互作用。

根据前一方面的嵌合抗原受体，所述第二融合肽的跨膜结构域通过电荷相互作用与第一融合肽的跨膜结构域相互作用，或所述第二融合肽通过胞质结构域内的磷酸化ITAM序列与信号分子相互作用。

在一些实施方案中，所述第一融合肽的跨膜结构域是KIR跨膜结构域；优选地，所述KIR跨膜结构域选自 KIR2DS2、KIR2DL3、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS3、KIR2DS4、 KIR2DS5、KIR3DL1、KIR3DS1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1和KIR3DP1；更优选地，所述KIR跨膜结构域是KIRS2或KIR2DS2；优选地，所述KIRS2包含与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述KIRS2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；优选地，所述KIR2DS2包含与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述KIR2DS2 的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在一些实施方案中，所述第一融合肽包含信号肽，所述信号肽为CD8α信号肽；优选地，所述CD8α信号肽包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。

在一些实施方案中，所述第二融合肽的跨膜结构域是DAP12跨膜结构域；优选地，所述DAP12的跨膜结构域包含与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述DAP12 的跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

在一些实施方案中，所述胞质结构域为DAP12胞质结构域或KIR胞质结构域；优选地，所述胞质结构域为 DAP12的胞质结构域；优选地，所述DAP12的胞质结构域包含与SEQID NO:6所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有 98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述DAP12的胞质结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

在一些实施方案中，所述共刺激结构域是4-1BB；优选地，所述4-1BB包含与SEQ IDNO:9所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

在一些实施方案中，所述第二融合肽包含DAP12跨膜结构域、DAP12胞质结构域和共刺激结构域4-1BB，或包含截短的DAP12跨膜结构域、DAP12胞质结构域和共刺激结构域4-1BB；优选地，所述DAP12跨膜结构域和 DAP12胞质结构域包含与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述DAP12跨膜结构域和DAP12胞质结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；优选地，所述截短的DAP12 跨膜结构域和DAP12胞质结构域包含与SEQ ID NO:8所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述截短的DAP12跨膜结构域和DAP12胞质结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

在一些实施方案中，所述第二融合肽包含信号肽，所述信号肽为DAP12信号肽或CD8α信号肽；优选地，所述DAP12信号肽包含与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述DAP12信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；优选地，所述CD8α信号肽包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述CD8α信号肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO:1所示。

在一些实施方案中，其中，所述抗原结合结构域包含抗体或其抗原结合片段；优选地，所述抗原结合结构域包含抗体的重链可变区和轻链可变区；优选地，所述抗原结合结构域包含Fab、Fab'、F(ab')2、单链Fv(scFv)、Fv、 dsFv、双抗体、Fd和Fd'片段。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下列的重链和轻链的CDR组合：

(1)分别包含SEQ ID NO:11-13的重链CDR1、CDR2及CDR3序列或其任何变体的重链CDR1、CDR2及 CDR3，和/或分别包含SEQ ID NO:15-17的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列或其任何变体的轻链CDR1、CDR2 及CDR3；

(2)分别包含SEQ ID NO:20-22的重链CDR1、CDR2及CDR3序列或其任何变体的重链CDR1、CDR2及 CDR3，和/或分别包含SEQ ID NO:24-26的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列或其任何变体的轻链CDR1、CDR2 及CDR3；

(3)分别包含SEQ ID NO:29-31的重链CDR1、CDR2及CDR3序列或其任何变体的重链CDR1、CDR2及 CDR3，和/或分别包含SEQ ID NO:33-35的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列或其任何变体的轻链CDR1、CDR2 及CDR3。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下列的重链和轻链的可变区组合：

(i)SEQ ID NO:14或其任何变体的重链可变区，和SEQ ID NO:18或其任何变体的轻链可变区；

(ii)SEQ ID NO:23或其任何变体的重链可变区，和SEQ ID NO:27或其任何变体的轻链可变区；

(iii)SEQ ID NO:32或其任何变体的重链可变区，和SEQ ID NO:36或其任何变体的轻链可变区。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:19所示的B7-H3 scFv1、SEQ ID NO:28 所示的B7-H3 scFv2和SEQ ID NO:37所示的B7-H3 scFv3。

在一些实施方案中，所述第一融合肽包含B7-H3 scFv和KIRS2，或包含B7-H3 scFv和KIR2DS2。

在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体为B7H3 scFv1-KIRS2/Dap12-BB嵌合抗原受体，所述B7H3 scFv1-KIRS2/Dap12-BB嵌合抗原受体由融合蛋白经T2A肽切割后形成，所述融合蛋白包含DAP12信号肽、DAP12 (包括跨膜结构域和胞质结构域)、4-1BB、T2A切割位点、CD8α信号肽、B7H3 scFv1和KIRS2；优选地，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:38所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、 96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示。

在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体为B7H3 scFv2-KIRS2/Dap12-BB嵌合抗原受体，所述B7H3 scFv2-KIRS2/Dap12-BB嵌合抗原受体由融合蛋白经T2A肽切割后形成，所述融合蛋白包含CD8α信号肽、截短的 DAP12(tDap-12，包括截短的跨膜结构域和胞质结构域)、4-1BB、T2A切割位点、CD8α信号肽、B7H3 scFv2和 KIRS2；优选地，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:39所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示。

在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体为B7H3 scFv3-KIRS2/Dap12-BB嵌合抗原受体，所述B7H3 scFv3-KIRS2/Dap12-BB嵌合抗原受体由融合蛋白经T2A肽切割后形成，所述融合蛋白包含DAP12信号肽、DAP12 (包括跨膜结构域和胞质结构域)、4-1BB、T2A切割位点、CD8α信号肽、B7H3 scFv3和KIRS2；优选地，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:40所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、 96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示。

在一些实施方案中，所述T2A切割位点包含与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述T2A切割位点的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

在一方面，本公开提供了编码前述嵌合抗原受体的核酸；优选地，所述核酸包含与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO:18所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；优选地，所述核酸选自： SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43所示的核酸；更优选地，所述编码核酸为SEQ ID NO:43所示的核酸。

在一方面，本公开提供了包含前述核酸的载体。

在一方面，本公开提供了包含前述核酸或载体的细胞。

在一方面，本公开提供了一种组合物，其包含前述的嵌合抗原受体、核酸、载体和/或细胞以及药学上可接受的载体。

在一方面，本公开提供了一种制备细胞方法，所述方法包括将前述的核酸、载体导入免疫效应细胞。

在一方面，本公开提供了前述的嵌合抗原受体、核酸、载体、细胞和/或组合物在制备治疗和/或预防疾病或病症的药物中的用途。

在一些实施方案中，可将所述嵌合抗原受体用作治疗剂。此类试剂将通常用于治疗、缓解和/或预防受试者的与异常B7-H3表达、活性和/或信号传导相关的疾病或病理。可使用标准方法通过鉴定受试者，例如患有(或处于风险或发展)与异常B7-H3表达、活性和/或信号传导相关的疾病或障碍，例如癌症或其它赘生性障碍的人患者来实施治疗方案。将抗体制剂，优选对其靶抗原有高特异性和高亲和性的抗体制剂施用给受试者并且将通常因其与靶标结合而产生效应。施用的嵌合抗原受体可消除或抑制或妨碍靶标(例如B7-H3)的表达、活性和/或信号传导功能。施用的嵌合抗原受体可消除或抑制或妨碍靶标(例如B7-H3)与其所天然结合的内源性的配体结合。例如，嵌合抗原受体与靶标结合并调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和、或以其它方式妨碍B7-H3表达、活性和/或信号传导。在一些实施方案中，为治疗与异常B7-H3表达相关的疾病或障碍，可将具有重链和轻链CDR的嵌合抗原受体施用给受试者。在一个实施方案中，与异常B7-H3表达相关的疾病或障碍可为癌症。

作为非限制性示例，与异常B7-H3表达、活性和/或信号传导相关的疾病或障碍包括血液学癌症和/或实体瘤。血液学癌症包括例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。作为非限制性示例，某些形式的白血病包括急性淋巴细胞性白血病 (ALL)；急性髓性白血病(AML)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；慢性髓细胞性白血病(CML)；骨髓增生性疾病/赘生物(MPDS)；和骨髓增生异常综合征。作为非限制性示例，某些形式的淋巴瘤包括霍奇金氏淋巴瘤、低度恶性和侵袭性非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、以及滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)。作为非限制性示例，某些形式的骨髓瘤包括多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞性骨髓瘤、重链骨髓瘤和轻链或Bence-Jones骨髓瘤。实体瘤包括例如乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、黑色素瘤、结直肠肿瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、膀胱肿瘤、食管肿瘤、肝肿瘤和肾瘤。

与癌症及其它赘生性障碍相关的症状包括例如发炎、发烧、全身不适、发烧、疼痛、经常局部发炎、食欲不振、体重减轻、浮肿、头痛、疲乏、皮疹、贫血、肌无力、肌肉疲劳和腹部症状例如腹痛、痢疾或便秘。

在一方面，本公开提供了一种在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的包含前述的嵌合抗原受体、核酸、载体和/或细胞。

在一方面，本公开提供了一种治疗患有疾病或病症的哺乳动物的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的前述的嵌合抗原受体、核酸、载体和/或细胞。

将所述实施方案的药物组合物配制成与其预期施用途径相容。给药途径的示例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如吸入)、经皮(即局部的)、经粘膜和直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括以下组分：注射用无菌稀释剂例如水、盐溶液、固定油、聚乙二醇类、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐、以及调节渗透压的试剂，例如氯化钠或右旋糖。pH可用酸或碱进行调节，例如盐酸或氢氧化钠。可将肠胃外制剂包装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制多剂量小瓶内。

适于注射用途的药物组合物包括无菌水性溶液(在此是水溶性的)或分散体以及用于即时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的药学上可接受的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF， Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应当为流动性达到易于注射的程度。其在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须能防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，及其适宜的混合物。例如通过利用涂层例如卵磷脂，在分散体情况下维持所需颗粒尺寸，以及利用表面活性剂，可以保持适宜的流动性。对微生物作用的防止可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨醇)、氯化钠。注射用组合物的延长吸收可通过在所述组合物中包含延缓吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来达到。

根据需要，可以通过将嵌合抗原受体以所需量掺入具有上文所列成分中的一种或组合(按需要)的合适溶剂中来制备无菌注射溶液，然后过滤消毒。一般来讲，通过将嵌合抗原受体掺入含有碱性分散介质和上文所列那些中的所需其它成分的无菌载体中来制备分散体。就用于制备无菌注射溶液的无菌粉末而言，制备方法是获得粉末的真空干燥和冷冻干燥，该粉末包含活性成分和任何另外的期望成分，它们来自前述的这些成分的无菌过滤溶液。

对于吸入给药，从包含合适推进剂如二氧化碳等气体的加压容器或分配器或者喷雾器以气溶胶喷雾形式递送化合物。

还可以通过经粘膜或透皮方式全身给药。对于经粘膜或透皮给药，在制剂中使用适于渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常在本领域是通常所知的，并且包括如用于经粘膜给药的去污剂、胆盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用喷鼻剂或栓剂来实现。对于透皮给药，可将一种或多种所述嵌合抗原受体配制成如本领域通常所知的膏剂、软膏、凝胶、或霜膏。

还可将化合物以栓剂(例如，具有常规栓剂基质，如可可脂或其它甘油酯)或滞留性灌肠剂形式进行制备以用于经直肠递送。

在一个实施方案中，所述嵌合抗原受体可用防止其不被身体迅速消除的载体制备，例如缓释/控释制剂，包括植入体和微胶囊化递送体系。可使用可生物降解、可生物相容的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。

尤其有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于施用和剂量的一致性。如本文所用，剂量单位形式是指用于待治疗的受试者，适合作为单位剂量的物理上可分离的单位；每个单位含有经计算与所需药物载体结合产生期望治疗效果的预定量的一种或多种所述嵌合抗原受体。所述实施方案的剂量单位形式的规格由以下指示并直接取决于：嵌合抗原受体的独特特征和待实现的具体治疗效果，和用于治疗个体的此类嵌合抗原受体的调配领域中固有的局限性。

所述药物组合物可与给药说明书一起放于容器、包装、或分配器中。

本文所述制剂还可根据要治疗的具体情况而包含多于一种所述嵌合抗原受体，优选具有互补活性但对彼此无负面影响的那些。另选地或除此之外，组合物可例如包含增强其功能的试剂，诸如细胞毒素试剂、细胞因子、化学治疗剂、或生长抑制剂。此类分子以对预期目的有效的量适当地联合存在。例如，可以在试剂盒中联合存在，也可以在使用中联合存在。

在一个实施方案中，细胞因子IL-6的产生被降低或抑制。在另一个实施方案中，细胞因子IL-10的产生被降低或抑制。

在一个实施方案中，对细胞因子释放综合征进行分级。在另一个实施方案中，等级1描述了这样的细胞因子释放综合征，其中症状不危及生命且仅需要对症治疗，例如发烧、恶心、乏力、头痛、肌痛、不适。在另一个实施方案中，等级2的症状需要并响应中度干预，例如对于低血压的供氧、液体或血管加压药。在另一个实施方案中，等级3的症状需要并响应积极干预。在另一个实施方案中，等级4的症状是危及生命的症状，需要呼吸机且患者表现出器官毒性。

在一个实施方案中，一种或多种所述嵌合抗原受体可在联合治疗中施用，即与其它试剂例如治疗剂(其可用于治疗病理学病症或障碍，例如各种形式的癌症、自身免疫性障碍和炎性疾病)联合。术语“联合”在本文中是指将试剂基本上同步地，同时地或顺次地给予。如果顺次给予，则在开始施用第二种化合物时，两种化合物中的第一种仍优选在治疗位点处以有效浓度被检测到。在一种情况下，“联合”也可以是在试剂盒中同时包含本公开的嵌合抗原受体和其他治疗剂。

例如，联合治疗可包含本文所述一种或多种嵌合抗原受体与一种或多种附加治疗剂(例如一种或多种细胞因子和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、和/或细胞毒素或细胞生长抑制剂，如下更详述的)共同配制和/或共同施用。此类联合治疗可有利地利用较低剂量的施用的治疗剂，因而避免了与各种单一疗法相关的可能毒性或并发症。

本公开通过DAP12串联41BB增加共刺激信号分子元件，链接不同的抗B7-H3的scFV抗体，设计出抗B7-H3 表达阳性的实体肿瘤的嵌合抗原受体，形成包含抗原结合结构域和跨膜结构域的融合肽与包含跨膜结构域、胞质结构域和共刺激结构域的另一融合肽并联的嵌合抗原受体结构。所述嵌合抗原受体对B7-H3表达阳性实体瘤细胞具有良好的杀伤活性，并能够促进细胞因子的分泌(包括IL-2和INFγ)。本公开的B7-H3-KIRS2/DAP12-4-1BB分子组合的CAR结构预期在针对CAR-T临床治疗实体瘤的低有效性问题方面，可以大幅度提高CAR-T细胞用于B7-H3 阳性实体瘤临床应用治疗效果。

为了达到清楚和简洁描述的目的，本文中作为相同的或分开的一些实施方案的一部分来描述特征，然而，将要理解的是，本发明的范围可包括具有所描述的所有或一些特征的组合的一些实施方案。

实施例

实施例1：靶向B7H3的嵌合抗原受体的结构设计

本实施例设计了以下三种靶向B7H3的嵌合抗原受体(B7H3 CAR)(图1)：

(1)B7H3 scFv1-KIRS2/Dap12-BB嵌合抗原受体

如图1(A)所示，所述B7H3 scFv1-KIRS2/Dap12-BB嵌合抗原受体包含第一融合肽B7-H3 scFv1-KIRS2和第二融合肽Dap12-BB，其中：

所述第一融合肽B7H3 scFv1-KIRS2包含抗原结合结构域和跨膜结构域，所述抗原结合结构域为B7-H3 scFv1，所述跨膜结构域为KIRS2跨膜结构域；

所述第二融合肽Dap12-BB包含DAP12跨膜结构域、DAP12胞质结构域和共刺激结构域4-1BB。

所述B7H3 scFv1-KIRS2/Dap12-BB嵌合抗原受体由pKT075蛋白经T2A肽切割后形成，所述pKT075融合蛋白包含DAP12信号肽、DAP12(包括跨膜结构域和胞质结构域)、4-1BB、T2A切割位点、CD8α信号肽、B7H3 scFv1 和KIRS2，所述pKT075融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:38所示，其编码核酸如SEQ ID NO:41所示。

pKT075：DAP12信号肽+DAP12+4-1BB+T2A+CD8α信号肽+B7H3 scFv1+KIRS2

(2)B7H3 scFv2-KIRS2/Dap12-BB嵌合抗原受体

如图1(B)所示，所述B7H3 scFv2-KIRS2/Dap12-BB嵌合抗原受体包含第一融合肽B7-H3 scFv2-KIRS2和第二融合肽Dap12-BB，其中：

所述第一融合肽B7H3 scFv2-KIRS2包含抗原结合结构域和跨膜结构域，所述抗原结合结构域为B7-H3 scFv2，所述跨膜结构域为KIRS2跨膜结构域；

所述B7H3 scFv2-KIRS2/Dap12-BB嵌合抗原受体由pKT094蛋白经T2A肽切割后形成，所述pKT075KT094 融合蛋白包含DAP12信号肽、DAP12(包括跨膜结构域和胞质结构域)、4-1BB、T2A切割位点、CD8α信号肽、 B7H3 scFv2和KIRS2，所述pKT075KT094融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，其编码核酸如SEQ ID NO: 42所示。

pKT075KT094：DAP12信号肽+DAP12+4-1BB+T2A+CD8α信号肽+B7H3 scFv2+KIRS2

(3)B7H3 scFv3-KIRS2/Dap12-BB嵌合抗原受体

如图1(C)所示，所述B7H3 scFv3-KIRS2/Dap12-BB嵌合抗原受体包含第一融合肽B7-H3 scFv3-KIRS2和第二融合肽Dap12-BB，其中：

所述第一融合肽B7H3 scFv3-KIRS2包含抗原结合结构域和跨膜结构域，所述抗原结合结构域为B7-H3 scFv3，所述跨膜结构域为KIRS2跨膜结构域；

所述B7H3 scFv3-KIRS2/Dap12-BB嵌合抗原受体由pKT075KT095蛋白经T2A肽切割后形成，所述 pKT075KT095融合蛋白包含DAP12信号肽、DAP12(包括跨膜结构域和胞质结构域)、4-1BB、T2A切割位点、 CD8α信号肽、B7H3 scFv3和KIRS2，所述pKT075KT095融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示，其编码核酸如SEQ ID NO:43所示。

pKT075KT095：DAP12信号肽+DAP12+4-1BB+T2A+CD8α信号肽+B7H3 scFv3+KIRS2

其中：

CD8α信号肽的氨基酸序列如下：

MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO 1)

KIRS2的氨基酸序列如下：

SKTGNPRHLHVLIGTSVVKIPFTILLFFLLHRWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTVNSEDSDEQDHQEVSYA(SEQ ID NO 2)

KIR2DS2的氨基酸序列如下：

HEGVHRKPSLLAHPGPLVKSEETVILQCWSDVRFEHFLLHREGKYKDTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMQDLA GTYRCYGSVTHSPYQLSAPSDPLDIVITGLYEKPSLSAQPGPTVLAGESVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHER RFSAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFRDSPYEWSNSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRH LHVLIGTSVVKIPFTILLFFLLHRWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTVNSEDSDEQDHQEVSYA(SEQ ID NO3)

DAP12信号肽的氨基酸序列如下：

MGGLEPCSRFLLLPLLLAVSG(SEQ ID NO 4)

DAP12跨膜结构域的氨基酸序列如下：

GVLAGIVMGDLVLTVLIALAV(SEQ ID NO 5)

DAP12胞质结构域的氨基酸序列如下：

YFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK(SEQ ID NO 6)

DAP12的氨基酸序列包含DAP12跨膜结构域和DAP12胞质结构域序列，具体序列如下：

LRPVQVQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQ GQRSDVYSDLNTQRPYYK(SEQ ID NO 7)

DAP12的截短氨基酸序列包含截短的DAP12跨膜结构域和DAP12胞质结构域，具体序列如下：

CSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSD LNTQRPYYK(SEQ ID NO 8)

4-1BB的氨基酸序列如下：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO 9)

T2A切割位点的氨基酸序列如下：

EGRGSLLTCGDVEENPG(SEQ ID NO 10)

B7-H3 scFv1重链CDR1的氨基酸序列如下：

GFTFSSFGMS(SEQ ID NO 11)

B7-H3 scFv1重链CDR2的氨基酸序列如下：

TINSGDNYSYSPDSVKG(SEQ ID NO 12)

B7-H3 scFv1重链CDR3的氨基酸序列如下：

ARPHIFYYGSPAWFAY(SEQ ID NO 13)

B7-H3 scFv1重链可变区的氨基酸序列如下：

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVATINSGDNYSYSPDSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPHIFYYGSPAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 14)

B7-H3 scFv1轻链CDR1的氨基酸序列如下：

RSRQSLVHSNKNTYLH(SEQ ID NO 15)

B7-H3 scFv1轻链CDR2的氨基酸序列如下：

KVSNRFS(SEQ ID NO 16)

B7-H3 scFv1轻链CDR3的氨基酸序列如下：

SQSTHVPLT(SEQ ID NO 17)

B7-H3 scFv1轻链可变区的氨基酸序列如下：

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSRQSLVHSNKNTYLHWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGT DFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO 18)

B7-H3 scFv1氨基酸序列如下：

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSRQSLVHSNKNTYLHWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGT DFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLS CAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVATINSGDNYSYSPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY CARPHIFYYGSPAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 19)

B7-H3 scFv2重链CDR1的氨基酸序列如下：

GFTFSSFGMS(SEQ ID NO 20)

B7-H3 scFv2重链CDR2的氨基酸序列如下：

TINSGDNASYSPDSVKG(SEQ ID NO 21)

B7-H3 scFv2重链CDR3的氨基酸序列如下：

ARPHIFYYGSPAWFAY(SEQ ID NO 22)

B7-H3 scFv2重链可变区的氨基酸序列如下：

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVATINSGDNASYSPDSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPHIFYYGSPAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 23)

B7-H3 scFv2轻链CDR1的氨基酸序列如下：

RSRQSLVHSNANTYLH(SEQ ID NO 24)

B7-H3 scFv2轻链CDR2的氨基酸序列如下：

KVSNRFS(SEQ ID NO 25)

B7-H3 scFv2轻链CDR3的氨基酸序列如下：

SQSTHVPLT(SEQ ID NO 26)

B7-H3 scFv2轻链可变区的氨基酸序列如下：

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSRQSLVHSNANTYLHWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGT DFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO 27)

B7-H3 scFv2氨基酸序列如下：

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVATINSGDNASYSPDSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPHIFYYGSPAWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLS LPVTLGQPASISCRSRQSLVHSNANTYLHWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCSQSTHVPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO 28)

B7-H3 scFv3重链CDR1的氨基酸序列如下：

GFTFSDYGIH(SEQ ID NO 29)

B7-H3 scFv3重链CDR2的氨基酸序列如下：

YISSGSNTIYYADTVKG(SEQ ID NO 30)

B7-H3 scFv3重链CDR3的氨基酸序列如下：

ATMVTRWFYYAMDY(SEQ ID NO 31)

B7-H3 scFv3重链可变区的氨基酸序列如下：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSNTIYYADTVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATMVTRWFYYAMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO 32)

B7-H3 scFv3轻链CDR1的氨基酸序列如下：

SASSSVSYMY(SEQ ID NO 33)

B7-H3 scFv3轻链CDR2的氨基酸序列如下：

DTSKLAS(SEQ ID NO 34)

B7-H3 scFv3轻链CDR3的氨基酸序列如下：

QQWSSNPPT(SEQ ID NO 35)

B7-H3 scFv3轻链可变区的氨基酸序列如下：

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMYWYQQKPGQAPRRLIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDYTLTI SSLEPEDFAVYYCQQWSSNPPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO 36)

B7-H3 scFv3氨基酸序列如下：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSNTIYYADTVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATMVTRWFYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLS LSPGERATLSCSASSSVSYMYWYQQKPGQAPRRLIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYY CQQWSSNPPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO 37)

pKT075的氨基酸序列如下：

MGGLEPCSRFLLLPLLLAVSGLRPVQVQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGA AEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKDIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFP EEEEGGCELSRVEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPRMALPVTALLLPLALLLHAARPGSDVVMTQSPLSLPVTLG QPASISCRSRQSLVHSNKNTYLHWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCSQSTHVPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMSWV RQAPGKGLEWVATINSGDNYSYSPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPHIFYYGSPAWFAYWGQGTLVTVSSASGGGGSGGGGSSPTEPSSKTGNPRHLHVLIGTSVVKIPFTILLFFLLHRWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTVNSEDSDEQDHQEVSYA(SEQ ID NO 38)

pKT094的氨基酸序列如下：

MGGLEPCSRFLLLPLLLAVSGLRPVQVQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGA AEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKDIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFP EEEEGGCELSRVEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPRMALPVTALLLPLALLLHAARPGSEVQLVESGGGLVKPGG SLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVATINSGDNASYSPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAED TAVYYCARPHIFYYGSPAWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSR QSLVHSNANTYLHWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPLTFGGGTKVEIKASGGGGSGGGGSSPTEPSSKTGNPRHLHVLIGTSVVKIPFTILLFFLLHRWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTVNSEDSDEQDHQEVSYA(SEQ ID NO 39)

pKT095的氨基酸序列如下：

MGGLEPCSRFLLLPLLLAVSGLRPVQVQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGA AEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKDIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFP EEEEGGCELSRVEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPRMALPVTALLLPLALLLHAARPGSEVQLVESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSNTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAED TAVYYCATMVTRWFYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSS VSYMYWYQQKPGQAPRRLIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPPTFGQGTKLEIKASGGGGSGGGGSSPTEPSSKTGNPRHLHVLIGTSVVKIPFTILLFFLLHRWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTVNSEDSDEQDHQEVSYA(SEQ ID NO 40)

pKT075的核酸序列如下：

atggggggacttgaaccctgcagcaggttcctgctcctgcctctcctgctggctgtaagtggtctccgtcctgt ccaggtccaggcccagagcgattgcagttgctctacggtgagcccgggcgtgctggcagggatcgtgatgggag acctggtgctgacagtgctcattgccctggccgtgtacttcctgggccggctggtccctcgggggcgaggggct gcggaggcagcgacccggaaacagcgtatcactgagaccgagtcgccttatcaggagctccagggtcagaggtc ggatgtctacagcgacctcaacacacagaggccgtattacaaagatatcaaacggggcagaaagaaactcctgt atatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgtctagagtcgagggcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatg cggtgacgtggaggagaatcccggccctaggatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgc tgctccacgccgccaggccgggatccgatgtggtcatgacccagtcccccttgagcctgcccgtgaccctggga cagccagcttctattagctgtagatctaggcagtctctggtgcatagcaataagaatacatatcttcattggtt tcagcagagacctggacagtctccaagactgctgatctataaagtgtctaatagattcagcggagtgcctgata gattcagcggctctggctctggcactgatttcacactgaagattagtagagtggaggctgaggatgtgggcgtg tactactgcagccagagcacccatgtgcccctgaccttcggcggcggcaccaaggtggagatcaagggcggcgg cggctccggcggcggcggcagcggcggcggcgggagcgaggtgcagctggtggagagcggcgggggactggtga agcccggcggcagcctgagactgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagctcattcggcatgtcctgggtg aggcaggcccctggcaagggcctggagtgggtggccaccatcaacagcggcgacaactacagctacagccccga cagcgtgaagggcagattcaccatcagcagagacaacgccaagaacagcctgtacctgcagatgaacagcctgc gggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaccccacatcttctactacggcagccccgcctggttcgcc tactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgctagcggtggcggaggttctggaggtgggggttcctc acccactgaaccaagctccaaaaccggtaaccccagacacctgcatgttctgattgggacctcagtggtcaaaa tccctttcaccatcctcctcttctttctccttcatcgctggtgctccaacaaaaaaaatgctgctgtaatggac caagagcctgcagggaacagaacagtgaacagcgaggattctgatgaacaagaccatcaggaggtgtcatacgc a(SEQ ID NO 41)

pKT094的核酸序列如下：

atggggggacttgaaccctgcagcaggttcctgctcctgcctctcctgctggctgtaagtggtctccgtcctgt ccaggtccaggcccagagcgattgcagttgctctacggtgagcccgggcgtgctggcagggatcgtgatgggag acctggtgctgacagtgctcattgccctggccgtgtacttcctgggccggctggtccctcgggggcgaggggct gcggaggcagcgacccggaaacagcgtatcactgagaccgagtcgccttatcaggagctccagggtcagaggtc ggatgtctacagcgacctcaacacacagaggccgtattacaaagatatcaaacggggcagaaagaaactcctgt atatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgtctagagtcgagggcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatg cggtgacgtggaggagaatcccggccctaggatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgc tgctccacgccgccaggccgggatccgaggtgcagctggtggagagcgggggggggctggtgaagccaggagga agcctgaggctgagctgcgccgcctccgggtttacattctctagctttggcatgtcctgggtgcggcaggcccc cggcaagggactggagtgggtcgcaactatcaactcaggagataacgcaagttactcacccgactccgtgaagg gccggttcaccatttctagggataacgccaagaactccctgtacctgcagatgaacagcctgcgggccgaggat accgccgtgtactactgcgcccggccccacatcttctactacggctcccccgcctggttcgcctattgggggca gggcaccctggtgaccgtgagcagcgggggcggcggcagcgggggggggggcagcggcggcggcggctccgacg tcgtgatgacccagagccccctcagcctgcccgtgacactgggccagcccgcctcgatcagctgccggagcagg cagagcctggtgcactcaaacgccaacacatacctgcattggttccagcagcggcccggccagtcccccaggct gctgatctacaaggtgagcaacaggttcagcggcgtgcccgataggtttagcgggagcggctccggcacagact tcacactgaagatcagcagggtggaggccgaggacgtcggggtgtactactgcagccagagcacccacgtgcca ctgacattcgggggcgggaccaaggtggagattaaggctagcggtggcggaggttctggaggtgggggttcctc acccactgaaccaagctccaaaaccggtaaccccagacacctgcatgttctgattgggacctcagtggtcaaaa tccctttcaccatcctcctcttctttctccttcatcgctggtgctccaacaaaaaaaatgctgctgtaatggac caagagcctgcagggaacagaacagtgaacagcgaggattctgatgaacaagaccatcaggaggtgtcatacgc a(SEQ ID NO 42)

pKT095的核酸序列如下：

atggggggacttgaaccctgcagcaggttcctgctcctgcctctcctgctggctgtaagtggtctccgtcctgt ccaggtccaggcccagagcgattgcagttgctctacggtgagcccgggcgtgctggcagggatcgtgatgggag acctggtgctgacagtgctcattgccctggccgtgtacttcctgggccggctggtccctcgggggcgaggggct gcggaggcagcgacccggaaacagcgtatcactgagaccgagtcgccttatcaggagctccagggtcagaggtc ggatgtctacagcgacctcaacacacagaggccgtattacaaagatatcaaacggggcagaaagaaactcctgt atatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgtctagagtcgagggcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatg cggtgacgtggaggagaatcccggccctaggatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgc tgctccacgccgccaggccgggatccgaggtgcagctggtggagagcggcggggggctggtgcagcccggaggg agcctgaggctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagcgactacgggattcactgggtgaggcaggcccc cggcaagggcctggagtgggtgagctacatcagcagcggcagcaacacaatctactacgccgatacagtgaagg ggcggttcaccatcagccgggataacgccaagaacagcctgtacctgcagatgaacagcctgagggccgaggat acagccgtgtactactgcgccacaatggtgacccggtggttctactacgccatggactactgggggcaggggac aacagtgaccgtgagcagcggcggcggcggcagcggcgggggggggagcggcgggggcggcagcgagatcgtgc tgacccagagccccgccacactgtccctgtcacccggcgagagggccacactctcctgcagcgcctcctccagc gtgagctacatgtactggtaccagcagaagcccggccaggcccccaggcggctgatctacgacacctccaagct cgcttcaggagtccctgccaggttttccgggagtggcagcggcactgactatacactgaccattagcagcctgg aacctgaggatttcgccgtctactactgccagcagtggtcaagtaatcctccaaccttcgggcaggggactaag ctggagattaaggctagcggtggcggaggttctggaggtgggggttcctcacccactgaaccaagctccaaaac cggtaaccccagacacctgcatgttctgattgggacctcagtggtcaaaatccctttcaccatcctcctcttct ttctccttcatcgctggtgctccaacaaaaaaaatgctgctgtaatggaccaagagcctgcagggaacagaaca gtgaacagcgaggattctgatgaacaagaccatcaggaggtgtcatacgca(SEQ ID NO 43)

实施例2：慢病毒的制备

(1)293T细胞隔天传代

每个T150细胞瓶种植5×10⁶个细胞。48小时后，细胞数目应该达到20-25百万/瓶。

(2)293T细胞铺瓶

a)以1个T150细胞培养瓶为例，用约15ml的1×PBS轻柔地洗细胞两次。

b)加入3ml 0.25％胰酶-2.21mM EDTA

c)等到细胞脱落，加入12ml 10％(wt)FBS(购自Gibico)的DMEM培养基(购自corning)至已经脱落的细胞中。

d)收集并将细胞转移至无菌离心管，1000rpm，离心10分钟。

e)吸掉上清，将沉淀重悬于10ml 10％(wt)FBS的DMEM培养液中。

f)细胞计数，根据细胞浓度计算12×10⁶个细胞所需要的体积。

g)将细胞和25ml的10％(wt)FBS的DMEM培养液合并，放入T150细胞瓶中，轻摇，使得细胞均匀分布到细胞瓶底，37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。

(3)细胞转染

观察细胞，细胞密度大约达到80％-90％，此时开始转染。

a)在转染前30-60分钟，轻柔吸掉培养液。

b)混合质粒DNA和氯化钙溶液，以一个T150瓶为例，需要28μg pRSV.rev(购自Invitrogen公司)，28μg pGAG-Pol(购自Invitrogen公司)，11μg pVSVG(购自Invitrogen公司)，23μg慢病毒表达质粒(质粒pKT075， pKT094，pKT095，上海生工合成)，将慢病毒表达质粒分别加入到1.5ml氯化钙溶液中，混匀。

c)将1.5ml硼酸盐缓冲液溶液加入到15ml无菌离心管中，用1ml枪头把DNA-氯化钙溶液混匀后滴加到硼酸盐缓冲液溶液中，迅速混匀15-20下，室温孵育25-30分钟。

d)用5ml移液管把DNA-氯化钙-硼酸盐缓冲液混合物(购自上海碧云天生物技术有限公司)均匀逐滴加到T150 瓶中。在含5％二氧化碳的37℃细胞培养箱内培养，6h换液。

e)6h后换液。轻轻晃动培养板数次以充分悬浮一些磷酸钙沉淀，吸去含磷酸钙沉淀的培养液，加入20ml新鲜的5％(wt)FBS的DMEM培养液，继续培养。

(4)初次收集病毒上清

a)将前一天转染的293T细胞培养上清收集到离心管，1000rpm离心5分钟，标记，暂存于4℃冰箱。

b)将事先预热的20ml 5％(wt)FBS的DMEM培养基加入细胞瓶中，37℃细胞培养箱继续培养过夜。

(5)第二次收集病毒上清液(48h/第四天)。

(6)过滤上清

将两次收集的上清液集中在一起，用0.45μm的滤膜过滤去除细胞碎片。

(7)病毒浓缩

4℃，12000-24000rpm离心过夜。

(8)病毒储存

离心后，倾倒全部上清，加入新鲜5％(wt)FBS的DMEM培养基重悬，进行病毒分装(记为慢病毒pKT075， pKT094，pKT095)，迅速存放于-80℃冰箱备用。

实施例3：B7H3 CAR-T体外功能测试

(1)细胞制备

从新鲜血样分离血浆(灭活备用)，血细胞悬液用淋巴细胞分离液分出PBMC，获得的PBMC用T细胞分选试剂盒进行T细胞分选。T细胞加Dynabeads CD3/CD28(按细胞:Dynabeads＝1:1添加)进行激活，用活化培养基 (X-VIVO15，5％血浆，300IU/ml IL-2)，调整细胞终浓度为1×10⁶/ml，于37℃，5％CO₂培养。24h后加实施例2 制备的CAR慢病毒(病毒pKT075，pKT094，pKT095)转染T细胞，感染48h后去除慢病毒。第4天(D4)开始每1-2天观察细胞补液培养，维持细胞密度在0.8×10⁶细胞/mL。第4-5天(D4-D5)使用活化培养基，第5天(D5) 后使用扩增培养基(X-VIVO15，300IU/ml IL-2)。连续培养至第11天(D11)天，即获得三种靶向B7H3的CAR-T 细胞(CAR-T细胞pKT075，pKT094，pKT095)。

三种不同CAR结构的T细胞激活扩增无明显差异(图2A)；三种CAR-T细胞在培养的过程中一直处于扩增状态，体积在前4天逐渐增大，之后都逐渐降低(图2B)。

(2)CAR-T细胞阳性率检测

取第8天(D8)的pKT075、pKT094、pKT095三种CAR-T细胞，添加抗人Fab抗体(PE)一抗和链霉亲和素(Streptavidin)-PE二抗孵育，未转导T细胞同方式孵育作为对照，流式检测CAR-T细胞的阳性率。检测三种B7-H3 CAR-T细胞的阳性率，第8天三种CAR-T的阳性率表达差异不大(图3)。

(3)T细胞分化亚群检测

CAR-T细胞亚群检测抗体：抗-人CD3(APC-Cy7)，抗-人CCR7抗体(BV421)，抗-人CD45RO抗体(APC)， CD4-BB515，CD8-BV510，CD45RA(PE-Cy7)，CD62L-PE。

在41BB-CD3ζ(经典的二代CAR结构)、pKT075、pKT094、pKT095四种CAR-T细胞培养的第12天取样加CAR-T细胞亚群检测抗体进行流式检测。检测CAR-T细胞分型，包括CD4+和CD8+T细胞中Tn、Teff、Tcm、Tem、 Tem比例。四种CAR-T(41BB-CD3ζ、pKT075、pKT094、pKT095)的T细胞分化亚型显示，与41BB-CD3ζ(Tcm 比例为8.37％)相比，pKT075(69.00％)、pKT094(84.02％)、pKT095(高达88.11％)的记忆群细胞更多(图4)。本发明能够实现CAR-T更低的分化状态，在体内会更持久并具备记忆活性。

(4)靶细胞培养

U251与HEPG2细胞培养均使用DMEM培养基(DMEM+10％FBS+1％青霉素/链霉素(Penicillin/Streptomycine))；H1299培养使用1640培养基(1640+10％FBS+1％青霉素/链霉素)。

(5)CAR-T特异性杀伤

a、靶细胞消化计数，用培养液(DMEM或1640+10％FBS)调成密度为2×10⁵细胞/ml的靶细胞悬液；

b、向Eplate板中加入50μl细胞培养基，将Eplate放入DP监测槽，准备测量基线。

c、基线测量结束后，取出Eplate，每孔加入1×10⁴(50μl)靶细胞，室温放置30min。

d、将加有细胞悬液的E-plate板放回对应的监测槽，开始进行监测。

e、18h后，计数CAR-T和NTD细胞，按下表的效靶比(E：T)，调整效应细胞至相应的密度。

E:T	靶细胞数目	细胞密度及每孔加入体积
			0:1	0	50μl培养液
1:1	1×10<sup>4</sup>	2×10<sup>5</sup>细胞/ml,50μl
			5:1	5×10<sup>4</sup>	1×10<sup>6</sup>细胞/ml,50μl
10:1	1×10<sup>5</sup>	2×10<sup>6</sup>细胞/ml,50μl

f、暂停所有检测槽的数据采集；

g、将放置过夜的E-plate板取出，每孔加入50μl相应的效应细胞；

h、将E-plate板放回对应的监测槽，继续实时无标记动态细胞分析技术(RTCA)系统的数据采集；

i、效应细胞加入后，监测时间不超过48h。

检测pKT075、pKT094、pKT095三种B7-H3 CAR-T细胞及未转导T细胞(NTD)对肿瘤细胞HEPG2、U251、 H1299的杀伤效果，比较含有抗B7-H3不同scFV的CAR-T细胞的杀伤能力(图5)。结果表明，NTD对H1299、HEPG2和U251细胞没有杀伤作用；在效靶比(E：T)为0:1，1:1，5:1，10:1的情况下，三种CAR-T细胞都在5:1 和10:1两种效靶比时表现出了对HEPG2、U251和H1299的明显杀伤作用。pKT075、pKT094两种CAR-T细胞对靶细胞的裂解率没有显著的差别，而pKT095(分别最高为：93.4％、99.9％和96.4％)相比pKT075、pKT094对靶细胞的裂解率更高。

(6)细胞因子分泌检测

按照E:T＝2：1，将pKT075、pKT094、pKT095 CAR-T分别与HEPG2和U251共培养24h；收集细胞上清，ELISA 检测IL-2和IFN-γ。

分析3种CAR-T细胞和NTD与HEPG2、U251细胞共培养24小时后取上清液，用ELISA方法检测细胞因子，三种CAR-T与阳选靶细胞共培养后都分泌IFN-γ和IL2，并且pKT095 CAR-T细胞的IFN-γ(分别为：2432.3和2320.2 pg/ml)、IL2(分别为：1010.6和3411.0pg/ml)的分泌量显著高于其他CAR-T组(图6)。综合来看，在肿瘤抗原的刺激下pKT095 CAR-T细胞分泌的IFN-γ和IL-2最优。

(7)抗原刺激增殖

a、CAR-T细胞培养到第8天(D8)去磁珠，并使用不含IL-2的培养基继续培养2天；

b、第10天(D10)，计数效应细胞(CAR-T)和NTD；

c、取所需的CAR-T细胞(5×10⁶/ml)，PBS洗2遍，最后加入500μl PBS重悬细胞使浓度为1×10⁷/ml；

d、加入荧光染料CFSE(购自BD生物科学，原始浓度为5mM)，使CFSE终浓度为5μM，放入培养箱孵育 10min；

e、加入9倍孵育体积的PBS，离心；

f、弃掉上清后，加入10ml含10％FBS的培养基重悬，离心，弃上清；

g、用5ml培养基(10％FBS，300UI/ml IL-2)重悬至1×10⁶/ml，待用；

h、计数靶细胞(HEPG2和U251)，用培养液(DMEM或1640+10％FBS+300UI/ml IL-2)调成密度为1×10⁶/ml 的细胞悬液，备用；

i、按相应的效靶比(E:T)，每孔加入1ml CAR-T细胞，置于37℃，5％CO₂培养箱培养，1-2天离心换液。

j、第五天(D5)进行流式检测。

三种CAR-T(pKT075、pKT094、pKT095)的CFSE荧光强度流式检测结果显示(图7)，相对于NTD对照组，经过B7-H3阳性靶细胞刺激后，三种CAR-T的CFSE的荧光强度左移减弱，证实阳性靶细胞能够性刺激这三种CAR-T的增殖。

实施例4：B7H3 CAR-T体内功能测试

小鼠：NCG小鼠

肿瘤细胞：U251(1×10⁷细胞)

成瘤方式：皮下成瘤

给药组：NTD、pKT095

给药剂量：1×10⁷CAR-T

体内药效：

对NTD和pKT095在动物体内的抗肿瘤活性进行进一步的验证(图8)。实验结果表明NTD组小鼠肿瘤体积增长较快，很快达到实验终点；pKT095注射使得肿瘤在第20天消退，第25天完全消退，且能带来持久的疗效(第 40天仍无复发)。

序列表

<110> 南京卡提医学科技有限公司

南京圣和药业股份有限公司

<120> 靶向B7-H3的嵌合受体及其用途

<130> MTI21124

<160> 43

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 2

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Ser Lys Thr Gly Asn Pro Arg His Leu His Val Leu Ile Gly Thr Ser

1 5 10 15

Val Val Lys Ile Pro Phe Thr Ile Leu Leu Phe Phe Leu Leu His Arg

20 25 30

Trp Cys Ser Asn Lys Lys Asn Ala Ala Val Met Asp Gln Glu Pro Ala

35 40 45

Gly Asn Arg Thr Val Asn Ser Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp His Gln

50 55 60

Glu Val Ser Tyr Ala

65

<210> 3

<211> 283

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

His Glu Gly Val His Arg Lys Pro Ser Leu Leu Ala His Pro Gly Pro

1 5 10 15

Leu Val Lys Ser Glu Glu Thr Val Ile Leu Gln Cys Trp Ser Asp Val

20 25 30

Arg Phe Glu His Phe Leu Leu His Arg Glu Gly Lys Tyr Lys Asp Thr

35 40 45

Leu His Leu Ile Gly Glu His His Asp Gly Val Ser Lys Ala Asn Phe

50 55 60

Ser Ile Gly Pro Met Met Gln Asp Leu Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr

65 70 75 80

Gly Ser Val Thr His Ser Pro Tyr Gln Leu Ser Ala Pro Ser Asp Pro

85 90 95

Leu Asp Ile Val Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Lys Pro Ser Leu Ser Ala

100 105 110

Gln Pro Gly Pro Thr Val Leu Ala Gly Glu Ser Val Thr Leu Ser Cys

115 120 125

Ser Ser Arg Ser Ser Tyr Asp Met Tyr His Leu Ser Arg Glu Gly Glu

130 135 140

Ala His Glu Arg Arg Phe Ser Ala Gly Pro Lys Val Asn Gly Thr Phe

145 150 155 160

Gln Ala Asp Phe Pro Leu Gly Pro Ala Thr His Gly Gly Thr Tyr Arg

165 170 175

Cys Phe Gly Ser Phe Arg Asp Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Asn Ser Ser

180 185 190

Asp Pro Leu Leu Val Ser Val Thr Gly Asn Pro Ser Asn Ser Trp Pro

195 200 205

Ser Pro Thr Glu Pro Ser Ser Lys Thr Gly Asn Pro Arg His Leu His

210 215 220

Val Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Lys Ile Pro Phe Thr Ile Leu Leu

225 230 235 240

Phe Phe Leu Leu His Arg Trp Cys Ser Asn Lys Lys Asn Ala Ala Val

245 250 255

Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asn Arg Thr Val Asn Ser Glu Asp Ser

260 265 270

Asp Glu Gln Asp His Gln Glu Val Ser Tyr Ala

275 280

<210> 4

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Phe Leu Leu Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ala Val Ser Gly

20

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu

1 5 10 15

Ile Ala Leu Ala Val

20

<210> 6

<211> 52

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala

1 5 10 15

Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu

20 25 30

Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg

35 40 45

Pro Tyr Tyr Lys

50

<210> 7

<211> 92

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

Leu Arg Pro Val Gln Val Gln Ala Gln Ser Asp Cys Ser Cys Ser Thr

1 5 10 15

Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met Gly Asp Leu Val Leu

20 25 30

Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro

35 40 45

Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr

50 55 60

Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val

65 70 75 80

Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr Lys

85 90

<210> 8

<211> 79

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met Gly Asp

1 5 10 15

Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu Gly Arg

20 25 30

Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg Lys Gln

35 40 45

Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg

50 55 60

Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr Lys

65 70 75

<210> 9

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser

1 5 10

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

Thr Ile Asn Ser Gly Asp Asn Tyr Ser Tyr Ser Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 13

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

Ala Arg Pro His Ile Phe Tyr Tyr Gly Ser Pro Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10 15

<210> 14

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Asn Ser Gly Asp Asn Tyr Ser Tyr Ser Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Pro His Ile Phe Tyr Tyr Gly Ser Pro Ala Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 15

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

Arg Ser Arg Gln Ser Leu Val His Ser Asn Lys Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu Thr

1 5

<210> 18

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Arg Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Lys Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 19

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Arg Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Lys Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly

145 150 155 160

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

165 170 175

Thr Ile Asn Ser Gly Asp Asn Tyr Ser Tyr Ser Pro Asp Ser Val Lys

180 185 190

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

195 200 205

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

210 215 220

Arg Pro His Ile Phe Tyr Tyr Gly Ser Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245 250

<210> 20

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 20

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser

1 5 10

<210> 21

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 21

Thr Ile Asn Ser Gly Asp Asn Ala Ser Tyr Ser Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 22

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 22

Ala Arg Pro His Ile Phe Tyr Tyr Gly Ser Pro Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10 15

<210> 23

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 23

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Asn Ser Gly Asp Asn Ala Ser Tyr Ser Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Pro His Ile Phe Tyr Tyr Gly Ser Pro Ala Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 24

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 24

Arg Ser Arg Gln Ser Leu Val His Ser Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 25

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 26

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu Thr

1 5

<210> 27

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 27

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Arg Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 28

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 28

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Asn Ser Gly Asp Asn Ala Ser Tyr Ser Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Pro His Ile Phe Tyr Tyr Gly Ser Pro Ala Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln

130 135 140

Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser

145 150 155 160

Cys Arg Ser Arg Gln Ser Leu Val His Ser Asn Ala Asn Thr Tyr Leu

165 170 175

His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

180 185 190

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

210 215 220

Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu Thr

225 230 235 240

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

245 250

<210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 29

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Ile His

1 5 10

<210> 30

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 30

Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 31

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 31

Ala Thr Met Val Thr Arg Trp Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 32

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 32

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Met Val Thr Arg Trp Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 33

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 33

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr

1 5 10

<210> 34

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 34

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 35

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 35

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

1 5

<210> 36

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 36

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 37

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 37

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Met Val Thr Arg Trp Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro

130 135 140

Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser

145 150 155 160

Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ala Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly

180 185 190

Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu

195 200 205

Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln

210 215 220

Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys

<210> 38

<211> 543

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 38

Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Phe Leu Leu Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Pro Val Gln Val Gln Ala Gln Ser Asp

20 25 30

Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met

35 40 45

Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu

50 55 60

Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg

65 70 75 80

Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly

85 90 95

Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr

100 105 110

Lys Asp Ile Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

115 120 125

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

130 135 140

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Ser Arg Val

145 150 155 160

Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val

165 170 175

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu

180 185 190

Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Asp Val

195 200 205

Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro

210 215 220

Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Arg Gln Ser Leu Val His Ser Asn Lys

225 230 235 240

Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg

245 250 255

Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg

260 265 270

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg

275 280 285

Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His

290 295 300

Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly

305 310 315 320

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln

325 330 335

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg

340 345 350

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser

355 360 365

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile

370 375 380

Asn Ser Gly Asp Asn Tyr Ser Tyr Ser Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg

385 390 395 400

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met

405 410 415

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro

420 425 430

His Ile Phe Tyr Tyr Gly Ser Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

435 440 445

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

450 455 460

Gly Gly Gly Ser Ser Pro Thr Glu Pro Ser Ser Lys Thr Gly Asn Pro

465 470 475 480

Arg His Leu His Val Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Lys Ile Pro Phe

485 490 495

Thr Ile Leu Leu Phe Phe Leu Leu His Arg Trp Cys Ser Asn Lys Lys

500 505 510

Asn Ala Ala Val Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asn Arg Thr Val Asn

515 520 525

Ser Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp His Gln Glu Val Ser Tyr Ala

530 535 540

<210> 39

<211> 543

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 39

Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Phe Leu Leu Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Pro Val Gln Val Gln Ala Gln Ser Asp

20 25 30

Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met

35 40 45

Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu

50 55 60

Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg

65 70 75 80

Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly

85 90 95

Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr

100 105 110

Lys Asp Ile Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

115 120 125

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

130 135 140

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Ser Arg Val

145 150 155 160

Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val

165 170 175

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu

180 185 190

Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Glu Val

195 200 205

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu

210 215 220

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met

225 230 235 240

Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr

245 250 255

Ile Asn Ser Gly Asp Asn Ala Ser Tyr Ser Pro Asp Ser Val Lys Gly

260 265 270

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln

275 280 285

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290 295 300

Pro His Ile Phe Tyr Tyr Gly Ser Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly

305 310 315 320

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

325 330 335

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro

340 345 350

Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg

355 360 365

Ser Arg Gln Ser Leu Val His Ser Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp

370 375 380

Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val

385 390 395 400

Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

405 410 415

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val

420 425 430

Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly

435 440 445

Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

450 455 460

Gly Gly Gly Ser Ser Pro Thr Glu Pro Ser Ser Lys Thr Gly Asn Pro

465 470 475 480

Arg His Leu His Val Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Lys Ile Pro Phe

485 490 495

Thr Ile Leu Leu Phe Phe Leu Leu His Arg Trp Cys Ser Asn Lys Lys

500 505 510

Asn Ala Ala Val Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asn Arg Thr Val Asn

515 520 525

Ser Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp His Gln Glu Val Ser Tyr Ala

530 535 540

<210> 40

<211> 535

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 40

Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Phe Leu Leu Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Pro Val Gln Val Gln Ala Gln Ser Asp

20 25 30

Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met

35 40 45

Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu

50 55 60

Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg

65 70 75 80

Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly

85 90 95

Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr

100 105 110

Lys Asp Ile Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

115 120 125

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

130 135 140

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Ser Arg Val

145 150 155 160

Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val

165 170 175

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu

180 185 190

Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Glu Val

195 200 205

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

210 215 220

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Ile

225 230 235 240

His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr

245 250 255

Ile Ser Ser Gly Ser Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly

260 265 270

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln

275 280 285

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr

290 295 300

Met Val Thr Arg Trp Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

305 310 315 320

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

325 330 335

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr

340 345 350

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser

355 360 365

Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

370 375 380

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro

385 390 395 400

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile

405 410 415

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

420 425 430

Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

435 440 445

Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro Thr Glu

450 455 460

Pro Ser Ser Lys Thr Gly Asn Pro Arg His Leu His Val Leu Ile Gly

465 470 475 480

Thr Ser Val Val Lys Ile Pro Phe Thr Ile Leu Leu Phe Phe Leu Leu

485 490 495

His Arg Trp Cys Ser Asn Lys Lys Asn Ala Ala Val Met Asp Gln Glu

500 505 510

Pro Ala Gly Asn Arg Thr Val Asn Ser Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp

515 520 525

His Gln Glu Val Ser Tyr Ala

530 535

<210> 41

<211> 1629

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 41

atggggggac ttgaaccctg cagcaggttc ctgctcctgc ctctcctgct ggctgtaagt 60

ggtctccgtc ctgtccaggt ccaggcccag agcgattgca gttgctctac ggtgagcccg 120

ggcgtgctgg cagggatcgt gatgggagac ctggtgctga cagtgctcat tgccctggcc 180

gtgtacttcc tgggccggct ggtccctcgg gggcgagggg ctgcggaggc agcgacccgg 240

aaacagcgta tcactgagac cgagtcgcct tatcaggagc tccagggtca gaggtcggat 300

gtctacagcg acctcaacac acagaggccg tattacaaag atatcaaacg gggcagaaag 360

aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 420

gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gtctagagtc 480

gagggcggcg gagagggcag aggaagtctt ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc 540

ggccctagga tggccttacc agtgaccgcc ttgctcctgc cgctggcctt gctgctccac 600

gccgccaggc cgggatccga tgtggtcatg acccagtccc ccttgagcct gcccgtgacc 660

ctgggacagc cagcttctat tagctgtaga tctaggcagt ctctggtgca tagcaataag 720

aatacatatc ttcattggtt tcagcagaga cctggacagt ctccaagact gctgatctat 780

aaagtgtcta atagattcag cggagtgcct gatagattca gcggctctgg ctctggcact 840

gatttcacac tgaagattag tagagtggag gctgaggatg tgggcgtgta ctactgcagc 900

cagagcaccc atgtgcccct gaccttcggc ggcggcacca aggtggagat caagggcggc 960

ggcggctccg gcggcggcgg cagcggcggc ggcgggagcg aggtgcagct ggtggagagc 1020

ggcgggggac tggtgaagcc cggcggcagc ctgagactga gctgcgccgc cagcggcttc 1080

accttcagct cattcggcat gtcctgggtg aggcaggccc ctggcaaggg cctggagtgg 1140

gtggccacca tcaacagcgg cgacaactac agctacagcc ccgacagcgt gaagggcaga 1200

ttcaccatca gcagagacaa cgccaagaac agcctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg 1260

gccgaggaca ccgccgtgta ctactgcgcc agaccccaca tcttctacta cggcagcccc 1320

gcctggttcg cctactgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgagcagcgc tagcggtggc 1380

ggaggttctg gaggtggggg ttcctcaccc actgaaccaa gctccaaaac cggtaacccc 1440

agacacctgc atgttctgat tgggacctca gtggtcaaaa tccctttcac catcctcctc 1500

ttctttctcc ttcatcgctg gtgctccaac aaaaaaaatg ctgctgtaat ggaccaagag 1560

cctgcaggga acagaacagt gaacagcgag gattctgatg aacaagacca tcaggaggtg 1620

tcatacgca 1629

<210> 42

<211> 1629

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 42

atggggggac ttgaaccctg cagcaggttc ctgctcctgc ctctcctgct ggctgtaagt 60

ggtctccgtc ctgtccaggt ccaggcccag agcgattgca gttgctctac ggtgagcccg 120

ggcgtgctgg cagggatcgt gatgggagac ctggtgctga cagtgctcat tgccctggcc 180

gtgtacttcc tgggccggct ggtccctcgg gggcgagggg ctgcggaggc agcgacccgg 240

aaacagcgta tcactgagac cgagtcgcct tatcaggagc tccagggtca gaggtcggat 300

gtctacagcg acctcaacac acagaggccg tattacaaag atatcaaacg gggcagaaag 360

aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 420

gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gtctagagtc 480

gagggcggcg gagagggcag aggaagtctt ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc 540

ggccctagga tggccttacc agtgaccgcc ttgctcctgc cgctggcctt gctgctccac 600

gccgccaggc cgggatccga ggtgcagctg gtggagagcg ggggggggct ggtgaagcca 660

ggaggaagcc tgaggctgag ctgcgccgcc tccgggttta cattctctag ctttggcatg 720

tcctgggtgc ggcaggcccc cggcaaggga ctggagtggg tcgcaactat caactcagga 780

gataacgcaa gttactcacc cgactccgtg aagggccggt tcaccatttc tagggataac 840

gccaagaact ccctgtacct gcagatgaac agcctgcggg ccgaggatac cgccgtgtac 900

tactgcgccc ggccccacat cttctactac ggctcccccg cctggttcgc ctattggggg 960

cagggcaccc tggtgaccgt gagcagcggg ggcggcggca gcgggggggg gggcagcggc 1020

ggcggcggct ccgacgtcgt gatgacccag agccccctca gcctgcccgt gacactgggc 1080

cagcccgcct cgatcagctg ccggagcagg cagagcctgg tgcactcaaa cgccaacaca 1140

tacctgcatt ggttccagca gcggcccggc cagtccccca ggctgctgat ctacaaggtg 1200

agcaacaggt tcagcggcgt gcccgatagg tttagcggga gcggctccgg cacagacttc 1260

acactgaaga tcagcagggt ggaggccgag gacgtcgggg tgtactactg cagccagagc 1320

acccacgtgc cactgacatt cgggggcggg accaaggtgg agattaaggc tagcggtggc 1380

ggaggttctg gaggtggggg ttcctcaccc actgaaccaa gctccaaaac cggtaacccc 1440

agacacctgc atgttctgat tgggacctca gtggtcaaaa tccctttcac catcctcctc 1500

ttctttctcc ttcatcgctg gtgctccaac aaaaaaaatg ctgctgtaat ggaccaagag 1560

cctgcaggga acagaacagt gaacagcgag gattctgatg aacaagacca tcaggaggtg 1620

tcatacgca 1629

<210> 43

<211> 1605

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 43

atggggggac ttgaaccctg cagcaggttc ctgctcctgc ctctcctgct ggctgtaagt 60

ggtctccgtc ctgtccaggt ccaggcccag agcgattgca gttgctctac ggtgagcccg 120

ggcgtgctgg cagggatcgt gatgggagac ctggtgctga cagtgctcat tgccctggcc 180

gtgtacttcc tgggccggct ggtccctcgg gggcgagggg ctgcggaggc agcgacccgg 240

aaacagcgta tcactgagac cgagtcgcct tatcaggagc tccagggtca gaggtcggat 300

gtctacagcg acctcaacac acagaggccg tattacaaag atatcaaacg gggcagaaag 360

aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 420

gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gtctagagtc 480

gagggcggcg gagagggcag aggaagtctt ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc 540

ggccctagga tggccttacc agtgaccgcc ttgctcctgc cgctggcctt gctgctccac 600

gccgccaggc cgggatccga ggtgcagctg gtggagagcg gcggggggct ggtgcagccc 660

ggagggagcc tgaggctgag ctgcgccgcc agcggcttca ccttcagcga ctacgggatt 720

cactgggtga ggcaggcccc cggcaagggc ctggagtggg tgagctacat cagcagcggc 780

agcaacacaa tctactacgc cgatacagtg aaggggcggt tcaccatcag ccgggataac 840

gccaagaaca gcctgtacct gcagatgaac agcctgaggg ccgaggatac agccgtgtac 900

tactgcgcca caatggtgac ccggtggttc tactacgcca tggactactg ggggcagggg 960

acaacagtga ccgtgagcag cggcggcggc ggcagcggcg ggggggggag cggcgggggc 1020

ggcagcgaga tcgtgctgac ccagagcccc gccacactgt ccctgtcacc cggcgagagg 1080

gccacactct cctgcagcgc ctcctccagc gtgagctaca tgtactggta ccagcagaag 1140

cccggccagg cccccaggcg gctgatctac gacacctcca agctcgcttc aggagtccct 1200

gccaggtttt ccgggagtgg cagcggcact gactatacac tgaccattag cagcctggaa 1260

cctgaggatt tcgccgtcta ctactgccag cagtggtcaa gtaatcctcc aaccttcggg 1320

caggggacta agctggagat taaggctagc ggtggcggag gttctggagg tgggggttcc 1380

tcacccactg aaccaagctc caaaaccggt aaccccagac acctgcatgt tctgattggg 1440

acctcagtgg tcaaaatccc tttcaccatc ctcctcttct ttctccttca tcgctggtgc 1500

tccaacaaaa aaaatgctgc tgtaatggac caagagcctg cagggaacag aacagtgaac 1560

agcgaggatt ctgatgaaca agaccatcag gaggtgtcat acgca 1605

Claims

1.一种靶向B7-H3的嵌合抗原受体，其包含第一融合肽和第二融合肽，其中：

所述第一融合肽包含B7-H3抗原结合结构域和跨膜结构域；

优选地，所述第二融合肽的跨膜结构域通过电荷相互作用与第一融合肽的跨膜结构域相互作用，或所述第二融合肽通过胞质结构域内的磷酸化ITAM序列与信号分子相互作用。

2.权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中，所述第一融合肽的跨膜结构域是KIR跨膜结构域；优选地，所述KIR跨膜结构域选自KIR2DS2、KIR2DL3、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DL1、KIR3DS1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1和KIR3DP1；更优选地，所述KIR跨膜结构域是KIRS2或KIR2DS2；优选地，所述KIRS2包含与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述KIRS2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；优选地，所述KIR2DS2包含与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述KIR2DS2的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示；

优选地，所述第一融合肽包含信号肽，所述信号肽为CD8α信号肽；优选地，所述CD8α信号肽包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其中，所述第二融合肽的跨膜结构域是DAP12跨膜结构域；优选地，所述DAP12的跨膜结构域包含与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述DAP12的跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

优选地，所述胞质结构域为DAP12胞质结构域或KIR胞质结构域；优选地，所述胞质结构域为DAP12的胞质结构域；优选地，所述DAP12的胞质结构域包含与SEQ ID NO:6所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述DAP12的胞质结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

优选地，所述共刺激结构域是4-1BB；优选地，所述4-1BB包含与SEQ ID NO:9所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；

优选地，所述第二融合肽包含DAP12跨膜结构域、DAP12胞质结构域和共刺激结构域4-1BB，或包含截短的DAP12跨膜结构域、DAP12胞质结构域和共刺激结构域4-1BB；优选地，所述DAP12跨膜结构域和DAP12胞质结构域包含与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述DAP12跨膜结构域和DAP12胞质结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；优选地，所述截短的DAP12跨膜结构域和DAP12胞质结构域包含与SEQ ID NO:8所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述截短的DAP12跨膜结构域和DAP12胞质结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；

优选地，所述第二融合肽包含信号肽，所述信号肽为DAP12信号肽或CD8α信号肽；优选地，所述DAP12信号肽包含与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述DAP12信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；优选地，所述CD8α信号肽包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述B7-H3抗原结合结构域包含B7-H3抗体或其抗原结合片段；优选地，所述B7-H3抗原结合结构域包含B7-H3抗体的重链可变区和轻链可变区；优选地，所述B7-H3抗原结合结构域包含Fab、Fab'、F(ab')2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd'片段；

优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下列的重链和轻链的CDR组合：

(1)分别包含SEQ ID NO:11-13的重链CDR1、CDR2及CDR3序列或其任何变体的重链CDR1、CDR2及CDR3，和/或分别包含SEQ ID NO:15-17的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列或其任何变体的轻链CDR1、CDR2及CDR3；

(2)分别包含SEQ ID NO:20-22的重链CDR1、CDR2及CDR3序列或其任何变体的重链CDR1、CDR2及CDR3，和/或分别包含SEQ ID NO:24-26的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列或其任何变体的轻链CDR1、CDR2及CDR3；

(3)分别包含SEQ ID NO:29-31的重链CDR1、CDR2及CDR3序列或其任何变体的重链CDR1、CDR2及CDR3，和/或分别包含SEQ ID NO:33-35的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列或其任何变体的轻链CDR1、CDR2及CDR3；

优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下列的重链和轻链的可变区组合：

(iiii)SEQ ID NO:32或其任何变体的重链可变区，和SEQ ID NO:36或其任何变体的轻链可变区；

优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:19所示的B7-H3 scFv1、SEQID NO:28所示的B7-H3scFv2和SEQ ID NO:37所示的B7-H3 scFv3。

5.权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述第一融合肽包含B7-H3 scFv和KIRS2，或包含B7-H3scFv和KIR2DS2；

优选地，所述嵌合抗原受体为B7H3 scFv1-KIRS2/Dap12-BB嵌合抗原受体，所述B7H3scFv1-KIRS2/Dap12-BB嵌合抗原受体由融合蛋白经T2A肽切割后形成，所述融合蛋白包含DAP12信号肽、DAP12(包括跨膜结构域和胞质结构域)、4-1BB、T2A切割位点、CD8α信号肽、B7H3 scFv1和KIRS2；优选地，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:38所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示；

优选地，所述嵌合抗原受体为B7H3 scFv2-KIRS2/Dap12-BB嵌合抗原受体，所述B7H3scFv2-KIRS2/Dap12-BB嵌合抗原受体由融合蛋白经T2A肽切割后形成，所述融合蛋白包含CD8α信号肽、截短的DAP12(tDap-12，包括截短的跨膜结构域和胞质结构域)、4-1BB、T2A切割位点、CD8α信号肽、B7H3 scFv2和KIRS2；优选地，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:39所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示；

优选地，所述嵌合抗原受体为B7H3 scFv3-KIRS2/Dap12-BB嵌合抗原受体，所述B7H3scFv3-KIRS2/Dap12-BB嵌合抗原受体由融合蛋白经T2A肽切割后形成，所述融合蛋白包含DAP12信号肽、DAP12(包括跨膜结构域和胞质结构域)、4-1BB、T2A切割位点、CD8α信号肽、B7H3 scFv3和KIRS2；优选地，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:40所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示；

优选地，所述T2A切割位点包含与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述T2A切割位点的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

6.编码权利要求1-5任一项所述的嵌合抗原受体的核酸；优选地，所述核酸包含与SEQID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；优选地，所述核酸选自：SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:42和SEQ ID NO:43所示的核酸；更优选地，所述编码核酸为SEQ ID NO:43所示的核酸。

7.包含权利要求6所述核酸的载体。

8.包含权利要求6所述的核酸或权利要求7所述载体的细胞。

9.一种组合物，其包含权利要求1-5任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求6所述的核酸、权利要求7所述的载体和/或权利要求8所述的细胞以及药学上可接受的载体。

10.一种制备细胞方法，所述方法包括将权利要求6所述的核酸、权利要求7所述的载体导入免疫效应细胞。

11.权利要求1-5任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求6所述的核酸、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的细胞和/或权利要求9所述的组合物在制备治疗和/或预防与异常B7-H3表达、活性和/或信号传导相关的疾病或障碍的药物中的用途；

优选地，所述与异常B7-H3表达、活性和/或信号传导相关的疾病或障碍包括血液学癌症和/或实体瘤；

优选地，所述血液学癌症选自白血病、淋巴瘤和骨髓瘤；

优选地，白血病选自急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、骨髓增生性疾病/赘生物(MPDS)、和骨髓增生异常综合征；

优选地，淋巴瘤选自霍奇金氏淋巴瘤、低度恶性和侵袭性非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、以及滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)；

优选地，骨髓瘤选自多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞性骨髓瘤、重链骨髓瘤和轻链或Bence-Jones骨髓瘤；

优选地，实体瘤选自乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、黑色素瘤、结直肠肿瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、膀胱肿瘤、食管肿瘤、肝肿瘤和肾瘤。

12.一种在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的包含权利要求1-5任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求6所述的核酸、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的细胞和/或权利要求9所述的组合物。

13.一种治疗患有疾病或病症的哺乳动物的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的包含权利要求1-5任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求6所述的核酸、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的细胞和/或权利要求9所述的组合物。