CN115349493B - 一种可操控的小鼠肺损伤模型的构建方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可操控的小鼠肺损伤模型的构建方法和用途，该方法包括取OT I、OTII或WT小鼠的脾脏和淋巴结，研磨制备单细胞悬液，分离纯化，获得静息态T细胞或B细胞；将所述静息态T细胞或B细胞通过尾静脉注射入Rag1‑/‑小鼠体内，隔天，对Rag1‑/‑小鼠进行OVA‑Alum免疫，激活小鼠免疫系统，构建出CD4+T介导的、CD4+T+B介导的或CD8+T介导的小鼠肺损伤模型。该模型可操控，可用于评估靶向作用于后天免疫细胞引起肺损伤的药物功效或者活性物质的生物学功能，可根据实验需求调整过继的细胞亚群和比例，控制小鼠肺损伤轻重情况。
Description
技术领域
本发明涉及动物模型构建技术领域，具体涉及一种可操控的小鼠肺损伤模型的构建方法和用途。
背景技术
呼吸道哮喘、细菌/病毒性肺炎、急性呼吸窘迫综合征等导致的免疫性肺损伤均是临床棘手的医学问题，到目前为止仍有很多的肺损伤相关疾病仅能临床缓解，无法完全治愈。肺组织通过呼吸道与外界相连，同时也是血管丰度最高的组织之一，肺组织中存在大量的不同类型的免疫细胞，在外界抗原的急性/反复性刺激下，诱发免疫系统过度激活，释放出的细胞因子极易产生炎症，诱导免疫性肺损伤。但是何种免疫细胞发挥最为关键的作用，免疫细胞层层级联激活的模式如何评估等等问题，依然是尚未解决的问题，这也限制了靶向治疗肺损伤药物的研发。其原因之一是缺乏一个快速有效的、可操控观察某种免疫细胞亚群激活、分化和趋化等功能的小鼠模型。
现阶段常用的肺损伤模型有内毒素(LPS)诱导的肺损伤模型、抗原(尘螨、花粉、卵清蛋白)反复刺激诱导的呼吸道过敏/哮喘模型、细菌或病毒感染所致肺损伤模型等。然而，LPS诱导的肺损伤模型仅能观察到固有免疫系统激活，无法评估适应性免疫细胞发挥的功能；呼吸道过敏/哮喘模型仅能评估Th2-B细胞-肥大细胞的免疫轴的生物学功能，且周期较长；细菌或病毒感染需要专业的生物安全实验室，无法广泛使用。此外，以上模型均存在一个共同的缺陷：仅能观察到肺组织的损伤，以及不同种类免疫细胞的动态变化，但无法建立起何种免疫细胞主导肺损伤的直接关联，更无法评估单一免疫细胞亚群的激活能否直接或协同导致肺损伤的产生。机体免疫体系错综复杂，明确肺损伤中多种免疫细胞亚群如何互作，寻找有效的药物研发的免疫靶点，这依赖于可操控观察的肺损伤模型的建立。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此，根据本发明的实施例，本发明在一方面提出了一种可操控的小鼠肺损伤模型的构建方法，其包括以下步骤：
取OT I、OT II或WT小鼠的脾脏和淋巴结，研磨制备单细胞悬液，分离纯化，获得静息态T细胞或B细胞；
将所述静息态T细胞或B细胞通过尾静脉注射入Rag1-/-小鼠体内，隔天，对Rag1-/-小鼠进行OVA-Alum免疫，激活小鼠免疫系统，构建出CD4+T介导的、CD4+T+B介导的或CD8+T介导的小鼠肺损伤模型。
根据本发明实施例的一种可操控的小鼠肺损伤模型的构建方法，该方案选用后天免疫系统缺失的转基因免疫缺陷的Rag1-/-小鼠为基底，通过向Rag1-/-小鼠体内过继后天免疫细胞(CD4+T细胞、CD8+T细胞及B细胞)特异性的重赋Rag1-/-小鼠免疫系统，构建在体的、可操控的、T/B细胞介导的肺损伤模型，用于评估靶向作用于后天免疫细胞引起肺损伤的药物功效或者活性物质的生物学功能。通过检测OVA蛋白特异性识别并激活、分化的T细胞受体转基因小鼠OT II小鼠的CD4+T细胞、OT I小鼠的CD8+T细胞、B细胞和天然免疫细胞的比例以及细胞数，分析各种免疫细胞亚群释放细胞因子的比例，评估该模型肺损伤的情况及主要作用的细胞亚群。该模型主要呈现出可操控的优势，可根据实验需求调整过继的细胞亚群和比例，控制小鼠肺损伤轻重情况，且实验周期短，具有良好的应用前景。
另外，根据本发明上述实施例提出的一种可操控的小鼠肺损伤模型的构建方法，还可以具有如下附加的技术特征：
可选地，分离纯化采用anti-biotin microbeads吸附进行磁珠阴性分选。
可选地，静息态T细胞或B细胞包括CD4+T细胞、CD4+T+B细胞、CD8+T细胞。
进一步地，所述CD4+T细胞为CD4+CD62L+的Naive CD4+T细胞；所述CD4+T+B细胞为CD4+CD62L+的Naive T细胞以及B细胞；所述CD8+T细胞为CD8+CD62L+的Naive CD8+T细胞。
可选地，在尾静脉注射过程，给予每只Rag1-/-小鼠1×106个细胞。
可选地，还包括在第8～10天对Rag1-/-小鼠进行每天OVA滴鼻刺激，诱导小鼠产生T/B细胞特异性介导的肺损伤症状。
根据本发明的实施例，本发明在第二方面提出了一种上述的可操控的小鼠肺损伤模型制得的小鼠损伤模型的用途，该模型用于筛选或鉴定能够缓解或治疗肺损伤的药物。
可选地，在第8～10天对Rag1-/-小鼠进行每天OVA滴鼻刺激，同时对Rag1-/-小鼠进行药物干预。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为根据本发明实施例1中OTII CD4+T细胞介导的小鼠肺损伤模型构建的模式图；
图2为根据本发明实施例1的肺损伤表观图及炎症因子释放图；
图3为根据本发明实施例1的肺部淋巴细胞中的天然免疫细胞比例图；
图4为根据本发明实施例2的OTII CD4+T+B cell介导的小鼠肺损伤模型构建的模式图；
图5为根据本发明实施例2的肺损伤表观图及炎症因子释放图；
图6为根据本发明实施例2的肺部淋巴细胞中的天然免疫细胞比例图；
图7为根据本发明实施例3的OTI CD8+T细胞介导的小鼠肺损伤模型构建的模式图；
图8为根据本发明实施例3的肺损伤表观图及炎症因子释放图；
图9为根据本发明实施例3的肺部淋巴细胞中的天然免疫细胞比例图；
图10为根据本发明实施例4的小檗碱对CD4+T细胞介导的小鼠肺损伤表观图；
图11为根据本发明实施例4的两组肺部淋巴细胞中的天然免疫细胞比例图；
图12为根据本发明实施例4的肺部淋巴细胞的炎症因子的释放图和外周淋巴细胞因子的释放图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1 CD4+T细胞介导的小鼠肺损伤模型
如图1所示，构建CD4+T细胞介导的小鼠肺损伤模型。
在Day0天，从OT II小鼠体内取得脾脏和淋巴结，制成单细胞悬液，通过加入相应的biotin-antibody cocktail，利用anti-biotin microbeads吸附，磁珠阴性分选获得CD4+CD62L+的Naive CD4+T细胞。
选择5～8周的成年Rag1-/-小鼠(体内不含T细胞和B细胞，仅存在天然免疫细胞)随机分为两组，即空白组和过继组(每组5只)；第0天，在过继组小鼠中按照每只小鼠1×106个细胞进行尾静脉注射CD4+CD62L+的Naive CD4+T细胞至小鼠体内。
在Day1天对两组小鼠进行腹腔注射200μL/只OVA-Alum溶液进行免疫，过继组在Day8～10天进行每天OVA滴鼻刺激(25mg/mL，左右鼻各20μL)，诱导小鼠产生T/B细胞特异性介导的肺损伤症状。
Day11天将两组Rag1-/-小鼠安乐死，解剖获得小鼠的肺及肺淋巴结，对比两组小鼠左上肺叶组织，拍照并进行HE染色，直观分析小鼠肺组织的损伤情况；选取小鼠右肺叶组织，提取其中浸润分布的免疫细胞，进一步分析肺组织中过继免疫细胞的细胞因子释放情况，判断模型中肺损伤的情况。
结果如图2所示，相对于正常对照组，CD4+T介导的OVA过继组小鼠有着较为严重的炎症，伴随着红肿现象；免疫细胞数达到4.3～6.0×106；对部分的肺部组织进行HE染色，染色结果显示，PBS组肺泡结构清晰，无明显融合现象，OVA+OTII组肺泡结构破坏明显，肺泡壁水肿；对提取肺部组织的T淋巴细胞进行刺激，检测相关炎症因子的表达情况，过继组小鼠肺部免疫细胞释放炎症因子IFN-γ的比例为12.9％，释放IL-4的比例为4.61％。
对肺部淋巴细胞进行天然免疫细胞的分类情况检测，如图3所示，利用Siglec-F，Gr-1，F4/80抗体进行表面染色，结果发现OVA处理组小鼠肺部的天然免疫细胞(嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)数量远远高于正常对照组，分别达到4～6×105、10～15×105和11～15×105。过继组通过炎症因子的释放以及天然免疫细胞的增加，导致了小鼠肺损伤。
实施例2 CD4+T+B细胞介导的小鼠肺损伤模型
如图4所示，构建CD4+T+B细胞介导的小鼠肺损伤模型。
在Day0天，从OT II小鼠体内取得脾脏和淋巴结，制成单细胞悬液，通过加入相应的biotin-antibody cocktail，利用anti-biotin microbeads吸附，磁珠阴性分选获得CD4+CD62L+的Naive T细胞以及B细胞。按照Naive T细胞：B细胞＝1：4的比例进行混合。
选择5～8周的成年Rag1-/-小鼠(体内不含T细胞和B细胞，仅存在天然免疫细胞)随机分为两组，即空白组和过继组(每组5只)；第0天，在过继组小鼠中按照每只小鼠1×106个细胞进行尾静脉注射上述比例混合的Naive T细胞和B细胞至小鼠体内。
在Day1天对两组小鼠进行腹腔注射200μL/只OVA-Alum溶液进行免疫，过继组在Day8～10天进行每天OVA滴鼻刺激(25mg/mL，左右鼻各20μL)，诱导小鼠产生T/B细胞特异性介导的肺损伤症状。
Day11天将两组Rag1-/-小鼠安乐死，解剖获得小鼠的肺及肺淋巴结，对比两组小鼠左上肺叶组织，拍照并进行HE染色，直观分析小鼠肺组织的损伤情况；选取小鼠右肺叶组织，提取其中浸润分布的免疫细胞，进一步分析肺组织中过继免疫细胞的细胞因子释放情况，判断模型中肺损伤的情况。
结果如图5所示，相对于正常对照组，CD4+T+B介导的OVA过继组小鼠有着较为严重的炎症，伴随着红肿现象；免疫细胞数达到4.6～5.7×106；对部分的肺部组织进行HE染色，染色结果显示，过继组小鼠肺泡中有大量的炎性细胞聚集，肺泡结构遭到破坏，部分肺泡壁显著增厚破坏明显；对提取肺部组织的T淋巴细胞进行刺激，检测相关炎症因子的表达情况，过继组小鼠肺部免疫细胞释放炎症因子IFN-γ的比例为12.7％。
通过分析天然免疫细胞的分类情况，结果发现过继组小鼠肺部的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞细胞数远远高于PBS组，分别达到3～6×105、15～18×105和14～17×105(图6)。过继组通过炎症因子的释放以及天然免疫细胞的增加，导致了小鼠肺损伤。
实施例3 CD8+T细胞介导的小鼠肺损伤模型
如图7所示，构建CD8+T细胞介导的小鼠肺损伤模型。
在Day0天，从OT I小鼠体内取得脾脏和淋巴结，制成单细胞悬液，通过加入相应的biotin-antibody cocktail，利用anti-biotin microbeads吸附，磁珠阴性分选获得CD8+CD62L+的Naive T细胞，经过分选后，93.8％的细胞是CD8+CD62L+的Naive CD8+T细胞。
选择5～8周的成年Rag1-/-小鼠(体内不含T细胞和B细胞，仅存在天然免疫细胞)随机分为两组，即空白组和过继组(每组5只)；第0天，在过继组小鼠中按照每只小鼠1×106个细胞进行尾静脉注射上述CD8+CD62L+的Naive CD8+T细胞至小鼠体内。
在Day1天对两组小鼠进行腹腔注射200μL/只OVA-Alum溶液进行免疫，过继组在Day8～10天进行每天OVA滴鼻刺激(25mg/mL，左右鼻各20μL)，诱导小鼠产生T/B细胞特异性介导的肺损伤症状。
Day11天将两组Rag1-/-小鼠安乐死，解剖获得小鼠的肺及肺淋巴结，对比两组小鼠左上肺叶组织，拍照并进行HE染色，直观分析小鼠肺组织的损伤情况；选取小鼠右肺叶组织，提取其中浸润分布的免疫细胞，进一步分析肺组织中过继免疫细胞的细胞因子释放情况，判断模型中肺损伤的情况。
结果如图8所示，相对于PBS组，CD8+T细胞介导的OVA过继组小鼠肺部有着较为严重的红肿现象；免疫细胞数达到4.2～5.3×106；由HE染色结果可以看出，过继组的小鼠肺泡间隔具有一定程度增厚，肺结构不清晰，并且伴随着大量炎性细胞聚集；过继组小鼠肺部免疫细胞释放炎症因子IFN-γ的比例达到26.4％之多。
利用流式细胞术分析小鼠肺部的天然免疫细胞比例，结果如图9所示，CD8+T细胞介导的OVA过继组小鼠肺部的中性粒细胞和巨噬细胞均显著高于PBS组，分别达到12～17×105和14～15×105之多，而嗜酸性粒细胞数量却低于PBS组，由此可以推测，机体肺损伤的嗜酸性粒细胞主要由CD4+T细胞募集所致，而与CD8+T细胞关系不大。过继组通过炎症因子的释放以及天然免疫细胞的增加，导致了小鼠肺损伤。
实施例4小檗碱(berberine，BBR)对CD4+T细胞介导的小鼠肺损伤的治疗作用
在Day0天，从OT II小鼠体内取得脾脏和淋巴结，制成单细胞悬液，通过加入相应的biotin-antibody cocktail，利用anti-biotin microbeads吸附，磁珠阴性分选获得CD4+CD62L+的Naive T细胞，经过分选后，98％的细胞是表达CD4+CD44-CD62L+的Naive T细胞。
选择5～8周的成年Rag1-/-小鼠(体内不含T细胞和B细胞，仅存在天然免疫细胞)随机分为两组，即OVA+PBS组和OVA+BBR组，每组5只；第0天，在OVA+PBS组和OVA+BBR组小鼠中按照每只小鼠1×106个细胞进行尾静脉注射上述CD4+CD62L+的Naive T细胞至小鼠体内。
在Day1天对OVA组和OVA+BBR组进行腹腔注射200μL/只OVA-Alum溶液进行免疫，在Day8～10天对OVA+PBS组和OVA+BBR组进行每天OVA滴鼻刺激(25mg/mL，左右鼻各20μL)，同时对OVA+BBR组进行BBR灌胃治疗，剂量为50～60mg/kg。
Day11天将两组Rag1-/-小鼠安乐死，解剖获得小鼠的肺及肺淋巴结，对比两组小鼠左上肺叶组织，拍照并进行HE染色，直观分析小鼠肺组织的损伤情况；选取小鼠右肺叶组织，提取其中浸润分布的免疫细胞，进一步分析肺组织中过继免疫细胞的细胞因子释放情况，判断模型中肺损伤的情况。
结果如图10所示，相比于OVA+BBR组，观察到OVA+PBS组的肺部损伤较为严重，伴随着红肿现象；HE染色结果观察到OVA+PBS组肺泡中有大量炎性细胞的聚集，肺部结构不清晰。OVA+BBR组的肺部淋巴细胞数极其显著低于OVA+PBS组，OVA+PBS组肺部的淋巴细胞数高达7～10x106。
提取肺部组织的免疫细胞进行表面染色，分析天然免疫细胞的分类情况，利用Siglec-F，F4/80，Gr-1抗体进行表面染色分别检测小鼠肺部的天然免疫细胞如嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和中性粒细胞细胞，如11所示，OVA+BBR组的嗜酸性粒细胞和巨噬细胞的比例为11.8％和28.2％，显著低于OVA+PBS组，另外嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和中性粒细胞细胞的细胞数量皆低于OVA+PBS组，结果说明BBR可以通过对天然免疫细胞的降低来减缓小鼠肺部的损伤。
利用流式细胞术检测肺部的T淋巴细胞浸润情况，检测到OVA+PBS组的免疫细胞的炎症因子的释放率在20.2％左右，OVA+BBR组的炎症因子的释放率在17.2％左右，OVA+BBR组的炎症因子的比例低于OVA+PBS组，并且呈极其显著(图12)。另外对肺部周围的淋巴组织的细胞流式检测OVA+PBS组的淋巴细胞的炎症因子的释放高达41.2％，极其显著高于OVA+BBR组(26.0％)(图12)。结果说明BBR减少肺部组织中的炎症因子，减轻肺部的炎症反应，保护肺部免受损伤。
综上，本发明实施例的一种可操控的小鼠肺损伤模型的构建方法，是成功建立了在体内可操控的、T/B细胞介导的肺损伤模型。通过对肺部组织的表观分析损伤情况、相关免疫细胞数的测定以及检测炎症因子释放的情况用于评估靶向作用于后天免疫细胞引起肺损伤的药物功效或者活性物质的生物学功能；该模型呈现出可操控的优势，可根据实验需求调整过继的细胞亚群和比例，控制小鼠肺损伤轻重情况；并且实验周期短，可以快速有效的观察到小鼠模型中相关免疫细胞亚群激活、分化和趋化等功能，具有良好的应用前景。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (3)
1.一种可操控的小鼠肺损伤模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
取OT I、OT II或WT小鼠的脾脏和淋巴结，研磨制备单细胞悬液，分离纯化，获得静息态T细胞或B细胞；分离纯化采用anti-biotin microbeads吸附进行磁珠阴性分选；所述静息态T细胞或B细胞包括CD4+T细胞、CD4+T+B细胞、CD8+T细胞；所述CD4+T细胞为CD4+CD62L+的Naive CD4+T细胞；所述CD4+T+B细胞为CD4+CD62L+的Naive T细胞以及B细胞；所述CD8+T细胞为CD8+CD62L+的Naive CD8+T细胞；
将所述静息态T细胞或B细胞通过尾静脉注射入Rag1-/-小鼠体内，隔天，对Rag1-/-小鼠进行OVA-Alum免疫，激活小鼠免疫系统，构建出CD4+T介导的、CD4+T+B介导的或CD8+T介导的小鼠肺损伤模型；
在第8～10天对Rag1-/-小鼠进行每天OVA滴鼻刺激，诱导小鼠产生T/B细胞特异性介导的肺损伤症状。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在尾静脉注射过程，给予每只Rag1-/-小鼠1×106个细胞。
3.一种如权利要求1和2所述的可操控的小鼠肺损伤模型制得的小鼠损伤模型的用途，其特征在于，该模型用于筛选或鉴定能够缓解或治疗肺损伤的药物；在第8～10天对Rag1-/-小鼠进行每天OVA滴鼻刺激，同时对Rag1-/-小鼠进行药物干预。
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| 哮喘免疫预防与急性肺损伤免疫机制的研究;闫百灵;《吉林大学博士论文》;20 * |
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