CN115340597A - 一种长效植入级ⅱ型胶原蛋白的制备方法 - Google Patents

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CN115340597A CN202211000724.7A CN202211000724A CN115340597A CN 115340597 A CN115340597 A CN 115340597A CN 202211000724 A CN202211000724 A CN 202211000724A CN 115340597 A CN115340597 A CN 115340597A
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李贤明
陈文洁
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Abstract

本发明揭示了长效植入级Ⅱ型胶原蛋白的制备方法包括：（1）、制备温度不高于4℃的包括表面活性剂及挥发性的不完全溶于水的有机溶剂的溶液，即油相；（2）、制备温度不高于4℃的包括Ⅱ型胶原蛋白和谷氨酰内肽酶的水溶液，即水相；（3）、上述水溶液制备完成后30分钟内把上述水溶液与上述有机溶剂的溶液混合，并使它们形成油包水型乳液，温度保持4℃至‑4℃24小时以上，使胶原蛋白交联；（4）、上述胶原蛋白交联后滤去上述乳液中粒径大于25μm及小于0.5μm的微粒，保留粒径位于0.5μm与25μm间的微粒；（5）、上述保留的微粒洗涤后低温冷冻法除去其中溶剂。上述Ⅱ型胶原蛋白植入剂有长效且效期波动小、通针性好等优势。

Description

一种长效植入级Ⅱ型胶原蛋白的制备方法
技术领域
一种长效植入级Ⅱ型胶原蛋白的制备方法。具体来说，涉及一种性能优异的一种长效微粒胶原蛋白植入剂。
技术背景
Ⅱ型胶原蛋白是一种高分子蛋白质，丝状的胶原蛋白纤维与弹性蛋白及多糖蛋白相互交织形成网状结构，产生一定的机械强度，是承托人体曲线，体现挺拔体态和健康肌肤的物质基础。
Ⅱ型胶原蛋白是一种高分子蛋白质，丝状的胶原蛋白纤维与弹性蛋白及多糖蛋白相互交织形成网状结构，产生一定的机械强度.
Ⅱ型胶原蛋白是生物体内透明软骨的主要结构成分，占据了关节软骨干重的 50-80%。它在软骨基质中形成的纤维直径较细小，这些细小的原纤维在软骨中形成纤细的网状结构，使胶原能最大限度地分布在蛋白多糖中，从而增强软骨的机械稳定性及负重能力，并赋予软骨弹性和减震特性。有研究表明 II 型胶原蛋白可以抑制类风湿性关节炎并且可以作为膳食补充剂来保护健康关节。并且在组织工程领域，II 型胶原蛋白作为生物支架材料的研究备受瞩目。
虽然，现有一些Ⅱ型胶原蛋白制备技术，例如：
专利CN202110396599.5涉及一种植入级Ⅱ型胶原蛋白的制备方法。该发明采用碱处理的步骤代替了盐酸胍去除蛋白多糖的步骤，完全避免了盐酸胍导致的胶原蛋白变性问题；采用本发明的方法能够制备得到非变性、保持良好三重螺旋结构的Ⅱ型胶原蛋白，且制备Ⅱ型胶原蛋白纯度达到95％以上，内毒素含量低于0.5Eu/mL，多糖含量低于0.01mg/mL，达到医用植入级标准；可用于制备软骨损伤修复药品、医疗器械、保健食品等。
但是，上述II 型胶原蛋白有在体内存留时间短等重大不足。
此外，II 型胶原蛋白的制剂基本为凝胶剂，因其水分散体系粘度高在生产使用中造成诸多不便，如剂量分装不准，注射时通针性不好。
因此，现实中需要一种植入级Ⅱ型胶原蛋白，其具有效期长、粘度低、通针性好等优势。
发明内容
本发明的目的就是提供一种效期长、粘度低、通针性好的植入级Ⅱ型胶原蛋白的制备方法。
本发明人发现，通过谷氨酰内肽酶把普通Ⅱ型胶原蛋白改性成大小基本均匀的微粒交联Ⅱ型胶原蛋白，不仅可以延长其在体内的作用时间，还使其水分散体系的粘度下降，解决其上述诸多问题，如准确分装剂量，使注射时通针性较好；此外，还可以减少有害物质的混入、使反应条件温和、降低工过程中胶原蛋白的损失、提高特异性、不产生副产物、提高催化效率和提高产率等。
谷氨酰内肽酶 (glutamyl endoproteinase,EC 3.4.21.19) 是一种活性中心为丝氨酸残基的类胰凝乳蛋白酶。该酶专一性酶切蛋白质多肽链C-末端的谷氨酸与天冬氨酸残基α 羧基形成的肽键，对蛋白起到疏水性修饰作用，从而促进蛋白凝聚。
基于此，完成了本发明。
本发明涉及一种效期长、粘度低、通针性好的植入级Ⅱ型胶原蛋白，及其制备方法，该方法包括：
（1）、制备温度不高于4℃的包括表面活性剂及挥发性的不完全溶于水的有机溶剂的溶液，即油相；
（2）、制备温度不高于4℃的包括Ⅱ型胶原蛋白和谷氨酰内肽酶的水溶液，即水相；
（3）、上述水溶液制备完成后30分钟内把上述水溶液与上述有机溶剂的溶液混合，并使它们形成油包水型乳液，温度保持4℃至-4℃24小时以上，较佳地48小时以内，使Ⅱ型胶原蛋白基本交联；
（4）、上述Ⅱ型胶原蛋白基本交联后滤去上述乳液中粒径大于25μm及小于0.5μm的微粒，保留粒径位于0.5μm与25μm间的微粒；
（5）、上述保留的微粒洗涤后低温冷冻法除去其中溶剂。
具体实施方式
较佳地，上述水性溶液，即水相中Ⅱ型胶原蛋白的质量浓度为0.1%-10%，更佳地0.5%-5%；较佳地，上述谷氨酰内肽酶的用量与Ⅱ型胶原蛋白的用量的比例为1-10U/g，较佳地4-8U/g，更佳地5-6U/g。
上述Ⅱ型胶原蛋白为类人胶原蛋白，更佳地为人源化胶原蛋白。
上述有机溶剂包括但不限于C1～C6酸与C1～C6醇形成的酯，如乙酸乙酯、乙酸甲酯、丙酸乙酯、乙酸丁酯、戊酸戊酯、异戊酸异戊酯等；C1～C6醇与C1～C6醇形成的醚，如乙醚，甲乙醚；C3～C6酮，如丙酮。
上述表面活性剂包括但不限于亲油性表面活性剂，特别是HLB值为3～8的亲油性表面活性剂，其实例如司盘类表面活性剂，如span20 、40、60或 80，糖酯类表面活性剂，如C12～C18酸葡萄糖酯；C12～C18酸丙二醇酯；C12～C18酸丙三醇（甘油）酯；以共它们的组合。
上述亲油性表面活性剂可与其重量比0.1～5%的亲水性表面活性剂合用，如TWEEN80。
谷氨酰内肽酶应在油包水型乳液形成前加入水相中，不应在油包水型乳液形成前或后加入油相中，否则Ⅱ型胶原蛋白植入剂性能下降或消失。
上述油相与上述水相的体积比为2.5～10，较佳为3～6。
上述水性溶液制备完成后应在30分钟内把上述水性溶液与油性溶液混合，较佳10分钟内，最佳地5分钟内。
较佳地，过滤上述乳液过程中，滤去粒径大于25μm及小于5μm的微粒，保留粒径位于5μm与25μm间的微粒；最佳地，滤去粒径大于25μm及小于10μm的微粒或滤去粒径大于15μm及小于5μm的微粒，保留粒径位于10μm与25μm间的微粒或保留粒径位于5μm与15μm间的微粒。
低温冷冻法包括冷冻干燥法及喷雾冷冻干燥法。
本发明工艺中了采用酶法交联Ⅱ型胶原蛋白，与化学交联工艺和物理交联工艺相比，有较大优势：
反应条件温和、不产生副产物、高特异性以及高催化效率和产率。
此外，酶温和的反应条件减少了加工过程中Ⅱ型胶原蛋白的损失。
实施例
下非选择性实施例，即植入剂的制备方法，进一步描述了本发明范围内的优选实施例。在本发明的范围内这些实施例还可有许多变化。
实施例1
（1）、制备温度4℃的含2%的表面活性剂：SPAN 80的乙酸乙酯的溶液，即得油相；
（2）、制备温度4℃的含5%的Ⅱ型胶原蛋白和谷氨酰内肽酶的水溶液，上述谷氨酰内肽酶的用量与Ⅱ型胶原蛋白的用量的比例为7U/g，即得水相；
（3）、上述水溶液制备完成后20至30分钟内把上述水溶液与上述油相混合，并强力搅拌30分钟使它们形成油包水型乳液，温度保持4℃至0℃ 24小时，使Ⅱ型胶原蛋白基本交联，上述油相与上述水相的体积比为2.5；
（4）、上述Ⅱ型胶原蛋白基本交联后用滤膜滤去上述乳液中粒径大于25μm及小于0.5μm的微粒，保留粒径位于0.5μm与25μm间的微粒；
（5）、上述保留的微粒用10-30%乙醇水溶液洗涤后在真空冷冻干燥机中-60--80℃冷冻干燥48小时除去其中溶剂，即得。
同法制作13批次。
实施例2
（1）、制备温度0℃的含5%的表面活性剂：油酸葡萄糖酯的乙醚的溶液，即得油相；
（2）、制备温度1℃的含3%的Ⅱ型胶原蛋白和谷氨酰内肽酶的水溶液，上述谷氨酰内肽酶的用量与Ⅱ型胶原蛋白的用量的比例为3U/g，即得水相；
（3）、上述水溶液制备完成后5至10分钟内把上述水溶液与上述油相混合，并强力搅拌60分钟使它们形成油包水型乳液，温度保持0℃至-4℃ 48小时，使Ⅱ型胶原蛋白基本交联，上述油相与上述水相的体积比为3.5；
（4）、上述Ⅱ型胶原蛋白基本交联后用滤膜滤去上述乳液中粒径大于5μm及小于0.5μm的微粒，保留粒径位于0.5μm与5μm间的微粒；
（5）、上述保留的微粒用10-30%乙醇水溶液洗涤后在真空冷冻干燥机中-60--80℃冷冻干燥48小时除去其中溶剂，即得。
同法制作13批次。
实施例3
（1）、制备温度0℃的含10%的表面活性剂：C12酸（月桂酸）甘油酯的丙酮的溶液，即得油相；
（2）、制备温度1℃的含8%的Ⅱ型胶原蛋白和谷氨酰内肽酶的水溶液，上述谷氨酰内肽酶的用量与Ⅱ型胶原蛋白的用量的比例为10U/g，即得水相；
（3）、上述水溶液制备完成后1至5分钟内把上述水溶液与上述油相混合，并强力搅拌40分钟使它们形成油包水型乳液，温度保持0℃至-4℃ 48小时，使Ⅱ型胶原蛋白基本交联，上述油相与上述水相的体积比为8；
（4）、上述Ⅱ型胶原蛋白基本交联后用滤膜滤去上述乳液中粒径大于25μm及小于5μm的微粒，保留粒径位于5μm与25μm间的微粒；
（5）、上述保留的微粒用10-30%乙醇水溶液洗涤后在真空冷冻干燥机中-60--80℃冷冻干燥48小时除去其中溶剂，即得。
同法制作13批次。
实施例4
（1）、制备温度0℃的含10%的表面活性剂：硬脂（C18）酸丙二醇酯及0.1%的TWEEN80的异戊酸异戊酯的溶液，即得油相；
（2）、制备温度1℃的含5%的Ⅱ型胶原蛋白和谷氨酰内肽酶的水溶液，上述谷氨酰内肽酶的用量与Ⅱ型胶原蛋白的用量的比例为8U/g，即得水相；
（3）、上述水溶液制备完成后5至25分钟内把上述水溶液与上述油相混合，并强力搅拌60分钟使它们形成油包水型乳液，温度保持0℃至-4℃ 48小时，使Ⅱ型胶原蛋白基本交联，上述油相与上述水相的体积比为10；
（4）、上述Ⅱ型胶原蛋白基本交联后用滤膜滤去上述乳液中粒径大于15μm及小于5μm的微粒，保留粒径位于5μm与15μm间的微粒；
（5）、上述保留的微粒用10-30%乙醇水溶液洗涤后在真空冷冻干燥机中-60--80℃冷冻干燥48小时除去其中溶剂，即得。
同法制作13批次。
实施例5
（1）、制备温度0℃的含10%的表面活性剂：SPAN 20的乙酸丁酯的溶液，即得油相；
（2）、制备温度1℃的含5%的Ⅱ型胶原蛋白和谷氨酰内肽酶的水溶液，上述谷氨酰内肽酶的用量与Ⅱ型胶原蛋白的用量的比例为4U/g，即得水相；
（3）、上述水溶液制备完成后5至25分钟内把上述水溶液与上述油相混合，并强力搅拌20分钟使它们形成油包水型乳液，温度保持0℃至-4℃ 48小时，使Ⅱ型胶原蛋白基本交联，上述油相与上述水相的体积比为5；
（4）、上述Ⅱ型胶原蛋白基本交联后用滤膜滤去上述乳液中粒径大于25μm及小于5μm的微粒，保留粒径位于5μm与25μm间的微粒；
（5）、上述保留的微粒用10-30%乙醇水溶液洗涤后在真空冷冻干燥机中-60--80℃冷冻干燥48小时除去其中溶剂，即得。
同法制作13批次。
实施例6
（1）、制备温度0℃的含6%的表面活性剂：软酯酸（C16酸）蔗糖酯及0.1%的TWEEN 80的乙酸甲酯的溶液，即得油相；
（2）、制备温度1℃的含2%的Ⅱ型胶原蛋白和谷氨酰内肽酶的水溶液，上述谷氨酰内肽酶的用量与Ⅱ型胶原蛋白的用量的比例为5U/g，即得水相；
（3）、上述水溶液制备完成后5至25分钟内把上述水溶液与上述油相混合，并强力搅拌50分钟使它们形成油包水型乳液，温度保持0℃至-4℃ 48小时，使Ⅱ型胶原蛋白基本交联，上述油相与上述水相的体积比为8；
（4）、上述Ⅱ型胶原蛋白基本交联后用滤膜滤去上述乳液中粒径大于25μm及小于5μm的微粒，保留粒径位于5μm与25μm间的微粒；
（5）、上述保留的微粒用10-30%乙醇水溶液洗涤后在真空冷冻干燥机中-60--80℃冷冻干燥48小时除去其中溶剂，即得。
同法制作13批次。
实施例7
（1）、制备温度0℃的含5%的表面活性剂：油酸葡萄糖酯的乙醚的溶液，即得油相；
（2）、制备温度1℃的含3%的Ⅱ型胶原蛋白和谷氨酰内肽酶的水溶液，上述谷氨酰内肽酶的用量与Ⅱ型胶原蛋白的用量的比例为3U/g，即得水相；
（3）、上述水溶液制备完成后5至10分钟内把上述水溶液与上述油相混合，并强力搅拌60分钟使它们形成油包水型乳液，温度保持0℃至-4℃ 48小时，使Ⅱ型胶原蛋白基本交联，上述油相与上述水相的体积比为3.5；
（4）、上述Ⅱ型胶原蛋白基本交联后用滤膜滤去上述乳液中粒径大于25μm及小于10μm的微粒，保留粒径位于10μm与25μm间的微粒；
（5）、上述保留的微粒用10-30%乙醇水溶液洗涤后在真空冷冻干燥机中-60--80℃冷冻干燥48小时除去其中溶剂，即得。
同法制作13批次。
对照例1～7-1
除不滤去粒径大于25μm或5μm或10μm或15μm或20μm（该值与各自对应的实施例相同）及小于0.5μm或5μm或10μm 或15μm（该值与各自对应的实施例相同）的微粒外，其他均与各自对应的实施例相同。
对照例1～7-2
除不滤去粒径大于25μm或5μm或10μm或15μm或20μm（该值与各自对应的实施例相同）微粒外，其他均与各自对应的实施例相同。
对照例1～7-3
除不滤去粒径小于0.5μm或5μm或10μm 或15μm（该值与各自对应的实施例相同）的微粒外，其他均与各自对应的实施例相同。
对照例1～7-4
除谷氨酰内肽酶不（直接）加入水相中，而是加入油相中外，其他均与各自对应的实施例相同。
对照例1～7-5
除不添加表面活性剂、不滤去粒径大于25μm或5μm或10μm或15μm或20μm（该值与各自对应的实施例相同）及小于0.5μm或5μm或10μm 或15μm（该值与各自对应的实施例相同）的微粒外，其他均与各自对应的实施例相同。
对照例1～7-6 制备方法
未交联的Ⅱ型胶原蛋白；
测试例1 通针性能测试
原理：
通针性能越好，相同量的混悬液在同一条件下通过同一针头所需时间越少。
方法：
取相同重量（100mg）的上述实施例及对照例加入用相同量(2ml)的医用注射用生理盐水经相同时间相同方式（如同一振摇方法）复溶（重构）成混悬液，取相同量混悬液装于同一注射器（针头也不变）中，用同等的恒定压力推注射器使其中混悬液排完，测定所需时间。最后分别计算上述实施例及对照例1～5测得的时间与用上述方法测得的对照例6的时间的比值，以该比值衡量上述实施例及对照例1～5的通针性能，该比值越小，通针性能越强，该比值越大，通针性能越弱。
测试结果见表1～7。
测试例2
体外降解时间测试
取相同重量Ⅱ型胶原蛋白（35mg）的上述实施例、对照例加入用相同量(100ml，浓度0.035%)的医用注射用生理盐水（pH值7.0）经相同时间相同方式复溶成混悬液。上述混悬液中均加入相同量的胶原蛋白水解酶（蜡样芽孢杆菌蛋白酶,从蜡样芽孢杆菌纯化分离），上述胶原蛋白水解酶用量与上述Ⅱ型胶原蛋白重量比为4U/mg，之后均置入温度37℃、相对湿度70%的恒温恒湿的环境中，于0hr、1 hr、3 hr、5 hr、7 hr、9 hr、11 hr 、13 hr、15 hr、17 hr、……取样,直至下述所述的吸光度值A基本稳定（波动范围小于2%），该稳定吸光度值A的平均值表示为A0。
取样后，立刻90℃灭酶10min，待降至室温，4000r /min 离心10min，得到澄清的水解液。取5mL上述水解液样品溶液，加入5mL 15% ( W/W) 三氯醋酸( TCA) 水溶液，混匀后静置10min，4 000r /min离心10min，上清液稀释至1 ～ 10mg /mL 浓度的溶液，取稀释液1mL 加入4mL 双缩脲试剂，混匀，静置30min。在波长540nm 处测定吸光度值A。按线性回归方程可计算降解产生的多肽浓度C( mg /mL)（参见文献1：肉类工业. 2011,(11)，总第367期，第21-24页，刘丽莉、杨协力，胶原蛋白酶酶解牛骨胶原蛋白的动力学研究）。
上述吸光度值A（或降解产生的多肽浓度C）反映样品溶液中己降解的胶原蛋白的量，上述吸光度值A0-A（或C0-C，C0表示吸光度值A基本稳定后的平均值A0求得的降解产生的多肽浓度，即胶原蛋白完全降解产生的多肽浓度,反应初始胶原蛋白的量）反映样品溶液中残留的胶原蛋白的量，由依米氏方程可知蛋白质酶降解在较低浓度时呈一级反应特征（参见上文献1），故可用 ln（A0-A）（或ln（C0-C））的值与时间t作图，求其降解斜率k，通过该斜率k及公式T0.99=ln100/k计算出胶原蛋白完全降解（降解99%或残留1%, t=ln( C0＇/ C＇)/k, tC＇/ C0＇=0.01，其中C0＇与 C＇分别表示初始胶原蛋白的量及残留胶原蛋白的量）的时间T0.99。
最后分别计算上述实施例及对照例1～5测得的胶原蛋白完全降解的时间T0.99与对照例6测得的胶原蛋白完全降解的时间T0.99（以其平均值计）的比值，以该比值衡量上述实施例及对照例1～5的相对体内存留性能，该比值越大，体内存留（长效）性能越强，该比值越小，体内存留（长效）性能越弱。该比值波动越小，胶原蛋白在体内存留（长效）性能变化越小；该比值波动越大，胶原蛋白在体内存留（长效）性能变化越大。
测试结果见表1～7。
表1
实施例1 对照例1-1 对照例1-2 对照例1-3 对照例1-4 对照例1-5
通针性能 0.21 0.47 0.53 0.23 - -
降解时间比 4.1±1.0 5.3±3.2 6.8±4.6 3.2±2.1 1.3±0.4 8.9±7.0
表2
实施例2 对照例2-1 对照例2-2 对照例2-3 对照例2-4 对照例2-5
通针性能 0.15 0.36 0.48 0.17 - -
降解时间比 2.3±0.5 3.8±2.2 4.9±3.3 1.7±0.9 1.1±0.2 7.9±5.4
表3
实施例3 对照例3-1 对照例3-2 对照例3-3 对照例3-4 对照例3-5
通针性能 0.29 0.47 0.56 0.32 - -
降解时间比 5.6±1.5 7.5±4.8 8.9±6.4 4.3±2.5 1.4±0.2 11.6±7.8
表4
实施例4 对照例4-1 对照例4-2 对照例4-3 对照例4-4 对照例4-5
通针性能 0.22 0.39 0.46 0.21 - -
降解时间比 3.5±1.1 5.6±3.7 6.8±4.7 2.8±1.7 1.3±0.2 9.4±6.8
表5
实施例5 对照例5-1 对照例5-2 对照例5-3 对照例5-4 对照例5-5
通针性能 0.32 0.49 0.58 0.30 - -
降解时间比 5.6±1.4 7.1±5.0 9.5±7.2 3.8±2.5 1.3±0.2 11.7±8.8
表6
实施例6 对照例6-1 对照例6-2 对照例6-3 对照例6-4 对照例6-5
通针性能 0.29 0.47 0.59 0.27 - -
降解时间比 5.3±1.2 7.8±5.4 9.2±7.1 3.9±2.5 1.5±0.3 12.3±8.9
表7
实施例7 对照例7-1 对照例7-2 对照例7-3 对照例7-4 对照例7-5
通针性能 0.34 0.59 0.67 0.35 - -
降解时间比 6.7±1.6 9.5±7.2 11.7±8.5 4.8±2.6 1.6±0.4 13.5±9.9
结果显示：
1）、实施例较未交联的Ⅱ型胶原蛋白有更慢的酶水解速率，显著更长的体内存留（长效）性能；
2）、实施例较不添加表面活性剂的对照例有更好的体内存留（长效）性能，该对照例体内存留（长效）性能波动性极大；
3）、实施例较谷氨酰内肽酶不（直接）加入水相中，而是加入油相中的对照例有更好的体内存留（长效）性能，该对照例体内存留（长效）性能极弱；
4）、实施例较不滤除较大及较小的颗粒的对照例有更好的体内存留（长效）性能，更小的波动性，该对照例体内存留（长效）性能波动很大；
5）、实施例较不滤除较大颗粒的仅滤除较小颗粒的对照例有更好的体内存留（长效）性能，更小的波动性，该对照例体内存留（长效）性能波动较大；
6）、实施例较不滤除较小颗粒的仅滤除较大颗粒的对照例有更好的体内存留（长效）性能，更长的体内存留（长效）性，更小的波动性，该对照例体内存留（长效）性能较短，变波动性也较大；
7）、实施例较未交联的Ⅱ型胶原蛋白、不滤除较大及较小的颗粒的对照例及不滤除较大颗粒的仅滤除较小颗粒的对照例有更好的通针性能；实施例与不滤除较小颗粒的仅滤除较大颗粒的对照例有基本一致的通针性能。

Claims (9)

1.一种效期长、粘度低、通针性好的植入级Ⅱ型胶原蛋白，其制备方法包括：
（1）、制备温度不高于4℃的包括表面活性剂及挥发性的不完全溶于水的有机溶剂的溶液，即油相；
（2）、制备温度不高于4℃的包括Ⅱ型胶原蛋白和谷氨酰内肽酶的水溶液，即水相；
（3）、上述水溶液制备完成后30分钟内把上述水溶液与上述有机溶剂的溶液混合，并使它们形成油包水型乳液，温度保持4℃至-4℃24小时以上，使Ⅱ型胶原蛋白交联；
（4）、上Ⅱ型述胶原蛋白交联后滤去上述乳液中粒径大于25μm及小于0.5μm的微粒，保留粒径位于0.5μm与25μm间的微粒；
（5）、上述保留的微粒洗涤后低温冷冻法除去其中溶剂。
2.根据权利要求1的胶原蛋白，其特征在于所述水性溶液中Ⅱ型胶原蛋白的质量浓度为0.1%-10%。
3.根据权利要求1的胶原蛋白，其特征在于所述谷氨酰胺转氨酶的用量与Ⅱ型胶原蛋白的用量的比例为1-10U/g。
4.根据权利要求1的胶原蛋白，其特征在于所述有机溶剂包括C1～C6酸与C1～C6醇形成的酯、C1～C6醇与C1～C6醇形成的醚、C3～C6酮，及它们的组合。
5.根据权利要求1的胶原蛋白，其特征在于所述表面活性剂选自HLB值为3～8的亲油性表面活性剂。
6.根据权利要求1的胶原蛋白，其特征在于所述油相与所述水相的体积比为2.5～10。
7.根据权利要求1的胶原蛋白，其特征在于包括滤去粒径大于25μm及小于5μm的微粒，保留粒径位于5μm与25μm间的微粒。
8.根据权利要求1的胶原蛋白，其特征在于包括滤去粒径大于25μm及小于10μm的微粒，保留粒径位于10μm与25μm间的微粒。
9.根据权利要求1的胶原蛋白，其特征在于所述低温冷冻法包括冷冻干燥法或喷雾冷冻干燥法。
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