CN115335042A

CN115335042A - 包含胶原蛋白、白藜芦醇和虾青素的多成分组合物及其用于治疗肌腱病的应用

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Publication number: CN115335042A
Application number: CN202080093020.1A
Authority: CN
Inventors: V·柯蒂; R·P·佩特雷利; M·曼特拉
Original assignee: Colin Pharmaceuticals
Current assignee: Colin Pharmaceuticals
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2040-12-18
Also published as: US20230024304A1; EP4076414A1; WO2021124253A1; CN115335042B; IT201900024907A1

Abstract

本发明涉及包含胶原蛋白、白藜芦醇、虾青素和维生素C的组合物。此外，本发明涉及所述组合物用于治疗肌腱病和影响关节或肌肉骨骼系统的疾病的应用。

Description

包含胶原蛋白、白藜芦醇和虾青素的多成分组合物及其用于治疗肌腱病的应用

本发明涉及含有混合物的组合物，所述混合物包含以下成分或者由以下成组成：(a)胶原蛋白；(b)至少一种抗炎剂，该抗炎剂选自(b-i)白藜芦醇和/或(b-ii)至少一种类姜黄素；(c)至少一种抗氧化剂，该抗氧化剂选自(c-i)虾青素和/或(c-ii)表没食子儿茶素没食子酸酯；并且，任选地，所述组合物包含(d)维生素C和/或至少一种可接受的药学或食品级添加剂/或赋形剂。此外，本发明涉及所述组合物或混合物用于治疗肌腱病以及与所述肌腱病相关的疾病、症状或病症(例如，影响关节或肌肉骨骼系统的病症)的应用。

肌腱由连接骨骼肌和骨骼的致密结缔组织组成，并且它传递运动产生的力量。肌腱还具有稳定关节、吸收冲击、保护肌肉不受损伤的功能。肌腱富含胶原纤维，其以肌腱干重的约65％至80％存在。最常见的胶原蛋白是I型(95％)，但III、V和X型胶原蛋白也以少量存在。胶原蛋白具有为肌腱提供承受高负荷的强度的功能。其他肌腱成分例如蛋白聚糖(例如，饰胶蛋白聚糖(decorin))、糖蛋白和弹性蛋白等形成肌腱基质。这些特定成分赋予肌腱以弹性和生物力学稳定性。

肌腱病(tendinopathy)(或肌腱疾病)是一种常见的肌肉骨骼系统疾病，以疼痛、肿胀和功能受限为特征。肌腱病可分为：

·附着点病(enthesopathy)，肌腱插入点的疾病；

·腱周围炎(peritendinitis)，围绕肌腱的鞘的炎症；

·肌腱变性(tendinosis)，肌腱退行性变性；

·肌腱断裂(tendon rupture)；

·腱鞘炎(tenosynovitis)，肌腱囊发炎。

若干因素可能导致肌腱疾病，它们可以分为两大类：外在因素和内在因素。

在外在因素中，超负荷被认为是主要因素之一。

它与体育活动及其相关损伤有关。

内在因素包括年龄、性别、解剖学异常、全身性疾病(例如高脂血症)和遗传疾病。

20％的对全科医生的主要咨询是因肌肉骨骼问题而起。其中，30％与肌腱有关，它们被称为肌腱病。

大多数损伤发生在关节附近的区域，例如肩、肘、膝和髋。有些肌腱更容易出现肌腱病，例如：冈上肌腱、肱二头肌肌腱、前臂伸屈肌腱、髌韧带、跟腱和胫后肌腱。伴有部分或全部肌腱撕裂的关节损伤在所有肌肉骨骼损伤中占比高达45％。此外，在所有损伤中，肌腱损伤的发生频率估计为30％到50％，并且可包括意外或运动创伤。

近年来，炎症在肌腱变性及其修复中的作用一直是深入研究和争论的主题。越来越多的证据将炎症归为疾病进展中的根本因素。据假设，慢性炎症可以在断裂前引导变性，并且在愈合过程中可能导致纤维血管瘢痕形成，因此，阻断炎症级联反应是治疗干预的主要目标。据发现，以其促炎作用著称的转录因子NF-kB在早期肌腱病的临床样本中增加。此外，已发现IKK在患有肩袖问题的患者中过度表达，IKK是一种在降解时(在炎性刺激的情况下)允许NF-kB进入细胞核从而发挥促炎能力的蛋白质。此外，研究揭示，接受肩袖修复手术的患者肩胛下肌腱中的NF-kB信号翻译通路增加(Abraham等，Science TranslationalMedicine,2019)。对早期肌腱病包括肩胛下肌的研究揭示出NF-kB和由后者转录的下游蛋白质的表达增加以及免疫系统细胞的激活。这种炎症持续存在于肩峰下减压治疗后患有慢性疼痛的患者中。具体地，已经表明存在于受损肌腱微环境中的成纤维细胞即使在治疗后4年也具有记忆，因为它们对体外刺激的IL-1β更敏感，并且在停止刺激后也不会降低IL-6和IL-8的表达。这意味着促炎刺激持续存在，因此有必要确定能够减少或消除这种退化过程的组合物。因此，通过减少或淬灭NF-kB转录因子来解决炎症对于肌腱疾病结果的成功可能是其关键和根本。NF-kB上游的蛋白质(即，IKK)受到关注，如果其被激活，会导致IKa的泛素化，从而导致NF-kB的核转位。因此，抑制NF-kB核转位是一个积极的事件，因为它决定着炎症的负调节。关于IL-1β，最近的研究表明，IL-1β导致肌腱的干/祖细胞体外表型的丧失，而这与肌腱相关基因的表达降低有关，例如scleraxis(译者注：一种碱性螺旋环螺旋转录因子)和腱调节蛋白(tenomodulin)。同时，胶原蛋白、双糖链蛋白聚糖和纤维调节蛋白的表达被亚调节。这些数据表明，IL-1β抑制肌腱的修复能力。

除了传播炎症以外，炎症级联反应还刺激其他分子的产生，这些分子的作用会对肌腱疾病产生负面影响，例如COX-2、金属蛋白酶2(MMP-2)和前列腺素E2(PGE2)的合成。已知所有这些分子都与肌腱退化有关。此外，炎症会导致P物质的产生，这是一种参与神经源性炎症的分子。在肌腱中，小的外周感觉神经元和肌腱细胞能够表达P物质。疼痛刺激和机械负荷能激活P物质的释放。

此外，氧化应激在肌腱变性及其修复中的作用近年来一直是深入研究和争论的主题。肌腱损伤会导致自由基如过氧化氢的形成，以及炎症介质如TNF-a、IL-1B和IL-6等的释放。自由基可以激活MMP并增加PGE2的表达，这会降解肌腱胶原蛋白基质。这种炎症过程可以激活生长因子例如TGF-B的释放，这诱导肌腱细胞和成纤维细胞的浸润，从而导致胶原蛋白的广泛重组。相对于I型胶原的形成，III型胶原形成得更多，这是由于PGE2对I型胶原合成的抑制作用，同时III型胶原的表达增加。此外，氧化应激会干扰愈合过程。III型胶原的增殖增加，而胶原纤维之间的交联成熟度变小。胶原蛋白成分将趋于变得纤维化、刚性，其特征是承重分布不均匀。这些事件导致肌腱机械成分减少多达约45％，使它们变得脆弱并容易断裂。

迄今为止，非甾体类抗炎药(NSAID)通常被开方用于治疗肌腱病，以减少炎症并由此减少随后的组织损伤。然而，非甾体抗炎药的使用与许多不良事件(副作用)有关，包括抑制蛋白聚糖合成和细胞增殖。此外，单独使用抗炎药并不能有效地治疗受疾病影响的肌腱的愈合，更不用说将受损的肌腱恢复到健康状态。换言之，不能将抗炎药的使用视为针对肌腱病的预防性或治愈性治疗的靶向治疗。

专利文献WO2014/184246A1公开了一种用于治疗骨关节炎和由骨关节炎引起的关节炎症的膳食补充剂，其包含水解的胶原蛋白、姜黄素和绿茶多酚，包括表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。

因此，急需提供有效地预防性和/或治愈性治疗肌腱病(或肌腱疾病)和与所述肌腱病相关的疾病、症状或病症(例如，影响关节或肌肉骨骼系统的疾病)的组合物或混合物，它们比抗炎药更好和/或可用于减少抗炎药的用量，并因此减少抗炎药的不良作用。

此外，需要提供用于有效地预防性和/或治愈性治疗肌腱病和与所述肌腱病相关的疾病、症状或病症的组合物或混合物，其相对于现有技术中目前可获得的产品是替代性或改进性的。

此外，需要提供用于有效地预防性和/或治愈性治疗肌腱病和与所述肌腱病相关的疾病、病症或症状的组合物或混合物，其能够使受损肌腱的功能快速且几乎完全地恢复，并且因此使所述肌腱损伤所涉及的关节和/或肌肉骨骼系统部分快速且几乎完全地恢复，其可以由所有类别的受试者(例如，男女运动员、老年人和健康状况正常的成年人)使用并且无显著副作用。

最后，需要提供用于有效地预防性和/或治愈性治疗肌腱病和与所述肌腱病相关的疾病、病症或症状的组合物或混合物，其易于制备且成本低廉。

经深入的研究和开发之后，申请人通过提供包含混合物(简称本发明的混合物)的组合物(简称本发明的组合物)来应对和解决由本说明书引起的上述和其他需求，所述混合物包含以下成分或者由其组成：

(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽，优选水解的胶原蛋白肽，更优选酶促水解的胶原蛋白肽；

(b)至少一种抗炎剂，该抗炎剂选自：(b-i)白藜芦醇，优选来自虎杖(Polygunumcuspidatum)的白藜芦醇，或者来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵物的白藜芦醇，和/或(b-ii)至少一种类姜黄素，优选包含类姜黄素的姜黄(Curcuma longa)提取物；

(c)至少一种抗氧化剂，该抗氧化剂选自：(c-i)虾青素，优选包含虾青素的雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)提取物，和/或(c-ii)表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate)；

并且，任选地，包含(d)维生素C和/或至少一种可接受的药学或食品级赋形剂-添加剂。

本发明的组合物和混合物主题在治愈性和/或预防性治疗肌腱病(或肌腱病理)和与所述肌腱病相关的疾病、症状或病症(例如，影响关节或肌肉骨骼系统的疾病、症状或病症)中非常有效，并且它们可以是相对于采用现有技术的抗炎剂或产品的治疗的改进，和/或可用于减少所使用的抗炎剂的量。

本发明的组合物和混合物的所述高功效归因于存在于组合物和混合物中的活性成分的选择和特定结合和/或它们的协同作用，特别是涉及(a)胶原蛋白、(b)白藜芦醇和/或类姜黄素、(c)虾青素和/或表没食子儿茶素没食子酸酯以及任选的(d)维生素C，优选涉及包含(a)胶原蛋白、(b)白藜芦醇、(c)虾青素和(d)维生素C的混合物。

如临床数据所证明，鉴于肌腱的再生能力弱，抗炎和止痛药方法不足对组织的自我修复其作用。如在本发明的组合物或混合物主题中那样，向抗炎成分中添加结构性成分例如胶原蛋白和抗氧化剂成分等会有效且快速地支持肌腱和/或关节的恢复作用。事实上，用于肌腱病的产品的主要目标应该是恢复肌腱功能，从而恢复其主要结构性成分，即胶原蛋白。

此外，与现有技术中存在的组合物相比，本发明的组合物和混合物主题的所述高功效可导致对有需要的受试者施用的有效剂量降低，所述现有技术中存在的组合物显示出比本发明的组合物更低的有效性。结果，与所述现有技术中存在的组合物相比，本发明的组合物或混合物因此可以具有经济优势和/或潜在的更少量的副作用。

此外，与现有技术中存在的组合物相比，考虑到对有需要的受试者施用相同量或浓度的组合物或混合物，本发明的组合物和混合物主题的所述高功效能够导致实现更大的效果。

特别地，本发明的组合物和混合物中存在的活性成分(即(a)、(b)、(c)和(d))的结合和/或协同作用使所述组合物和混合物在预防肌腱病、治疗急性期的肌腱病以及预防所述肌腱病的复发(或再发)且因此成为慢性病方面特别有效。

相对于现有技术的产品，本发明的组合物和混合物的所述高功效还能使得所述组合物和混合物在施用于有需要的受试者之后的起效期减少。

在本发明的上下文中，术语“起效期(onset)”用于表示组合物/产品的施用与其药理效果之间的潜伏时间。换言之，起效期是从施用组合物/产品到部分或完全药理效果所经过的时间。

此外，从化学/物理和感官的角度而言，本发明的组合物和混合物主题随着时间推移保持稳定。

此外，本发明的组合物和混合物没有显著的副作用，它们具有良好的耐受性，因此可以施用于所有受试者，特别是也可施用于男、女运动员和老年受试者。

最后，本发明的组合物和混合物易于制备且具有成本效益。

有赖于本说明书中报道和所附权利要求中要求保护的技术特征，通过本发明的混合物和组合物实现了这些和其它目的，这将从下文的详细描述中变得明显。

附图说明

图1示出了在存在和不存在浓度C4的过氧化氢下的处理之间的荧光比较(表5)。缩写：cel＝对照，Ast＝虾青素，Col＝胶原蛋白，Res＝白藜芦醇，和Vit＝维生素C。符号颜色：白色：对照；灰色：各个处理；黑色：Mix(混合物)。滴度中的“有/无”表示可能的用过氧化氢的处理。

图2描绘了浓度C4的各个处理相对于混合物中的四种处理的响应差异(MIX，C1-C4)。缩写：Ast＝虾青素，Col＝胶原蛋白，Res＝白藜芦醇，和Vit＝维生素C。符号颜色：橙色：各个处理；黑色：MIX(混合物)。

图3示出了在存在和不存在IL-1β的情况下的对照与在存在IL-1β下的使用浓度为C4的各个活性物质的处理(表5)以及其混合物的处理(1:8MIX)之间的吸光度(IL-6表达指数)的比较。缩写：Asx＝虾青素，Coll＝胶原蛋白，Res＝白藜芦醇，和Vit C＝维生素C。符号颜色：白色：对照；灰色：各个处理；黑色：MIX(混合物)。

图4示出了在存在和不存在IL-1β的情况下的对照与在存在IL-1β下的使用浓度为C4的各个活性物质的处理(表5)以及其混合物的处理(1:8MIX)之间的吸光度(MMP-2表达指数)的比较。缩写和颜色：同图3。

具体实施方式

构成本发明的一个目的的是一种组合物(简称本发明的组合物)，该组合物包含(I)和任选的(d)和/或(II)，其中(I)是混合物M(简称本发明的混合物M)，该混合物M包含以下成分或者由其组成：

(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽；

(b)至少一种抗炎剂，所述抗炎剂选自包含以下或由以下组成的组：(b-i)白藜芦醇，(b-ii)至少一种类姜黄素及其混合物；

(c)至少一种抗氧化剂，所述抗氧化剂选自包含以下或由以下组成的组：(c-i)虾青素，(c-ii)表没食子儿茶素没食子酸酯及其混合物；

其中，(d)是L-抗坏血酸；并且其中(II)是至少一种可接受的药学或食品级添加剂和/或赋形剂。

在本发明的组合物主题的优选实施方式中，所述混合物M包含以下成分或者由以下成分组成：(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽；(b-i)白藜芦醇；(c-i)虾青素；优选地，所述混合物M包含以下成分或者由以下成分组成：(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽；(b-i)白藜芦醇；(c-i)虾青素和(d)L-抗坏血酸。

在本发明的一个实施方式中，本发明的组合物包含所述混合物M，所述混合物M包含以下成分或者由以下成分组成：(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽；(b-i)白藜芦醇；(c-i)虾青素；此外，所述组合物包含(d)L-抗坏血酸和任选的(II)。

在本发明的一个优选实施方式中，本发明的组合物包含所述混合物M，所述混合物M包含以下成分或者由其组成：

(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽，优选水解的胶原蛋白肽；更优选酶促水解的胶原蛋白肽，进而更优选如下的酶促水解的胶原蛋白肽，其平均分子量为0.3kDa至10kDa(例如，0.5kDa、1kDa、2kDa、4kDa、6kDa或8kDa，其中kDa指千道尔顿)、优选1kDa至5kDa、更优选1.5kDa至3kDa(例如约2kDa)，和/或蛋白质含量以百分比计为70％至99％(例如75％、80％、85％或90％)、优选80％至98％、更优选约91％至95％(相对于胶原蛋白的总重量的重量％)；

(b-i)选自(b-i.i)和(b-i.ii)的白藜芦醇，其中(b-i.i)是滴定为白藜芦醇的虎杖提取物，优选为如下滴定为白藜芦醇的虎杖提取物，其中白藜芦醇以百分比计滴定为80％至99.5％(例如，85％、90％或95％)、优选90％至99.5％、更优选至约98％(相对于提取物总重量的重量％)，进而更优选虎杖的干燥根提取物；并且其中(b-i.ii)是来自酿酒酵母发酵物的白藜芦醇，优选地，白藜芦醇以百分比计滴定为70％至99.5％(例如，75％、80％、85％或90％)、优选85％至95％，更优选至约90％(相对于发酵产物总重量的重量％)；(c-i)虾青素，优选(c-i.i)雨生红球藻提取物的形式的虾青素，更优选如下的雨生红球藻提取物，其中虾青素以百分比计滴定为0.1％至10％(例如，0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、6％、7％、8％或9％)、优选0.5％至7.5％、更优选1％至5％(例如，约2.5％)(相对于提取物总重量的重量％)；并且，任选地，所述组合物还包含(d)和/或(II)。

在本发明的一个更优选的实施方式中，本发明的组合物包含所述混合物M，所述混合物M包含以下成分或者由以下成分组成：

(a)酶促水解的胶原蛋白肽，进而更优选如下的酶促水解的胶原蛋白肽，其平均分子量为1kDa至5kDa、优选1.5kDa至3kDa(例如约2kDa)，和/或蛋白质含量以百分比计为80％至98％、更优选约91％至95％(相对于胶原蛋白总重量的重量％)；

(b-i.i)虎杖提取物，其中滴定的白藜芦醇以百分比计为80％至99.5％、优选90％至99.5％、更优选至约98％(相对于提取物总重量的重量％)，进而更优选虎杖的干燥根提取物；

(c-i.i)雨生红球藻提取物，其中滴定的虾青素以百分比计为0.1％至10％、优选0.5％至7.5％、更优选1％至5％(例如约2.5％)(相对于提取物总重量的重量％)；

并且，任选地，所述组合物还包含(d)和/或(II)。

在本发明的一个更优选的替代实施方式中，本发明的组合物包含所述混合物M，所述混合物M包含以下成分或者由以下成分组成：

(a)酶促水解的胶原蛋白肽，进而更优选酶促水解的胶原蛋白肽，其平均分子量为1kDa至5kDa、优选1.5kDa至3kDa(例如约2kDa)，和/或蛋白质含量以％计为80％至98％、更优选约90％至91％(相对于胶原蛋白总重量的重量％)；

(b-i.ii)来自酿酒酵母发酵物的白藜芦醇，优选滴定的白藜芦醇以％计为70％至99.5％、优选85％至95％、更优选至约90％(相对于发酵产物的白藜芦醇的总重量的重量％)；

(c-i.i)雨生红球藻提取物，其中滴定的虾青素以％计为0.1％至10％、优选0.5％至7.5％、更优选1％至5％(例如约2.5％)(相对于提取物总重量的重量％)。

胶原蛋白是动物结缔组织的主要蛋白质。

在一个实施方式中，所述(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽作为水解的胶原蛋白肽存在于本发明的组合物或混合物(包含(a)、(b)，例如(b-i)和/或(b-ii)、(c)，例如(c-i)和/或(c-ii)和任选地(d)和/或(e))中；更优选酶促水解的胶原蛋白肽，进而更优选以下酶促水解的胶原蛋白肽，其平均分子量为0.3kDa至10kDa、优选1kDa至5kDa、更优选1.5kDa至3kDa(例如约2kDa)，并且蛋白质含量以％计为70％至99％、优选80％至98％、更优选约91％至95％(相对于胶原蛋白总重量的重量％)。其实例是由Gelita AG(德国)制造的商业产品

B，该产品具有实验部分中报告的特性。

可以根据本领域技术人员已知的和/或文献中报道的标准程序获得可用于本发明情况中的胶原蛋白或胶原蛋白肽。

白藜芦醇(3,5,4'-三羟基-反式-芪；IUPAC名称5-[(E)-2-(4-羟基苯基)乙烯基]苯-1,3-二酚，CAS 501-36-0)是一种由多种植物物种天然产生以抵御细菌或真菌等病原体的非类黄酮酚。

除了抗氧化和抗血栓形成特性外，白藜芦醇还具有高抗炎性。

特别地，对于人肌腱细胞的文献研究调查了白藜芦醇对IL-1β介导的炎性信号的影响，并证明白藜芦醇能够以剂量和时间依赖性方式抑制IL-1β诱导的NF-kB和PI-3K的激活。

特别地，以白藜芦醇进行治疗促进基质成分如I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、腱调节蛋白和腱原性转录因子scleraxis等的产生，同时抑制与炎症和细胞凋亡有关的基因产物的合成，由此发挥抗炎作用。

在优选实施方式中，所述(b-i)白藜芦醇作为(b-i.i)虎杖提取物(Siebold&Zucc.)存在于本发明的组合物或混合物(包含(a)、(b)，例如(b-i)和/或(b-ii)、(c)，例如(c-i)和/或(c-ii)、和任选地(d)和/或(e))中，所述虎杖提取物的滴定的白藜芦醇以百分比计为80％至99.5％、优选90％至99.5％、更优选至约98％(相对于提取物总重量的重量％)，进而更优选虎杖(Polygonum cuspidatum，多年生草本植物，属于蓼(Polygonum)属)的干燥根提取物。

可以在本发明的上下文中使用的包含白藜芦醇的所述虎杖提取物有利地是根据本领域技术人员已知的和/或文献中报道的标准程序获得和滴定的提取物，例如使用HPLC方法滴定的干性水醇提取物。其实例是由Quimdis制造的商业产品Resveratrol98％，该产品具有实验部分中报告的特性。

在优选的替代实施方式中，所述(b-i)白藜芦醇作为(b-i.ii)来自酿酒酵母发酵物的白藜芦醇存在于本发明的组合物或混合物(包含(a)、(b)，例如(b-i)和/或(b-ii)、(c)，例如(c-i)和/或(c-ii)，、和任选地(d)和/或(e))中，优选地所述酿酒酵母发酵物的滴定的白藜芦醇以百分比计为70％至99.5％、优选85％至95％、更优选至约90％(相对于发酵产物总重量的重量％)。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Meyen ex E.C.Hansen，1883)是一种嗜高渗单细胞生物，属于真菌界酵母菌科。

可在本发明的上下文中使用的来自酿酒酵母发酵物的白藜芦醇根据本领域技术人员已知的和/或文献中报道的标准程序获得。其实例是由Evolva(瑞士)制造的商业产品90％的Resveratrol CWD90，该产品具有实验部分中报告的特征。

虾青素(c-i)是一种类胡萝卜素，其具有高抗氧化性和抗炎性。

在肌腱损伤期间使用如虾青素等抗氧化剂能有助于减少由于形成ROS引起的氧化应激。

已知虾青素对MMP、PGE和TGF-B的表达具有抑制作用；所述抑制可导致纤维化过程的减少。

此外，虾青素的使用被认为可以降低III型：I型胶原蛋白纤维的比例，并在愈合过程中增加肌腱的拉伸强度。

虾青素最重要的动物来源是磷虾(Euphausia superba)油，而虾青素最重要的植物来源是淡水单细胞藻类(微藻)：雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)。

当环境条件诱发氧化应激时，雨生红球藻会自主产生含有天然虾青素的脂质。这发生在存在盐水或强光辐射的情况下。

在优选的实施方式中，所述(c-i)虾青素作为(c-i.i)雨生红球菌提取物存在于本发明的组合物或混合物(包含(a)、(b)，例如(b-i)和/或(b-ii)、(c)，例如(c-i)和/或(c-ii)，和任选地(d)和/或(e))中，更优选为如下的雨生红球菌提取物，其中滴定的虾青素以百分比计为0.1％至10％、优选0.5％至7.5％、更优选1％至5％(例如约2.5％)(相对于提取物总重量的重量％)。

可在本发明的上下文中使用的来自雨生红球藻的虾青素可以根据本领域技术人员已知的和/或文献中报道的标准程序获得。

其实例是由AstaReal制造的商业产品

EL25，该产品具有实验部分中报告的特征。

在本发明的更优选的实施方式中，所述组合物包含混合物M，所述混合物M包含以下成分或者由以下成分组成：

(a)酶促水解的胶原蛋白肽，进而更优选酶促水解的胶原蛋白肽，其平均分子量为1kDa至5kDa、优选1.5kDa至3kDa(例如约2kDa)，并且蛋白质含量以％计为80％至98％、更优选约91％至95％(相对于胶原蛋白总重量的重量％)；

(b-i.i)虎杖提取物，其中滴定的白藜芦醇以％计为80％至99.5％、优选90％至99.5％、更优选至约98％(相对于提取物的总重量的重量％)，进而更优选虎杖的干燥根提取物；

(c-i.i)雨生红球藻提取物，其中滴定的虾青素以％计为0.1％至10％、优选0.5％至7.5％、更优选1％至5％(例如约2.5％)(相对于提取物总重量的重量％)；

此外，所述组合物或混合物包含(d)L-抗坏血酸，并且任选地，所述组合物包含(II)。

L-抗坏血酸或抗坏血酸(也称维生素C，IUPAC名称：(5R)-[(1S)-1,2-二羟乙基]-3,4-二羟基呋喃-2(5H)-酮，实例CAS No.50-81-7)是一种具有抗氧化特性的天然有机化合物。

肌肉骨骼系统受损后，产生大量对微环境和愈合过程产生负面影响的ROS，影响细胞活力和胶原蛋白生成性细胞的增殖。作为强力抗氧化剂，维生素C能够中和ROS，缓解炎症引起的氧化应激。

在本发明的上下文中，术语“L-抗坏血酸”、“抗坏血酸”和“维生素C”是同义词并且可互换使用。

有利地，按每日摄入量或每单个剂量单位计，本发明的组合物或混合物主题包含以下量的活性成分：

(a)水解胶原蛋白肽，含量为500mg至6,500mg，优选1,000mg至6,000mg，更优选2,000mg至5,500mg(例如2,500mg或5,000mg)；

(b-i)白藜芦醇，含量为10mg至600mg，优选30mg至400mg，更优选50mg至250mg(例如，100mg或200mg)；

(c-i)虾青素，含量为0.5mg至40mg，优选1mg至20mg，更优选2mg至10mg(例如3mg或4mg或者6mg或8mg)；

并且，如果存在，(d)L-抗坏血酸，含量为100mg至1,500mg，优选250mg至1,200mg，更优选400mg至1,100mg(例如，500mg或1,000mg)。

所述“每日摄入量”可以配制成单一剂量单位(例如胶囊、小袋中的粉末或颗粒、小瓶中的悬浮液或溶液)，或者可以配制成两个或三个以上剂量单位(例如，2个胶囊、2小袋、2小瓶)。

有利地，按每日摄入量或每单个剂量单位计，本发明的组合物或混合物主题包含的活性成分的相对于组合物(即，活性成分和添加剂/赋形剂的混合物)的总重量的重量百分比如下：

(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽(优选水解的胶原蛋白肽)以百分比计为10％至75％，优选15％至70％，更优选20％至60％(例如，25％或55％)；

(b)白藜芦醇以百分比计为0.1％至6.5％，优选0.25％至5.5％，更优选0.5％至4％(例如，0.75％或1％或1.65％或2％)；

(c)虾青素以百分比计为0.01％至0.5％，优选0.02％至0.25％，更优选0.03％至0.15％(例如，0.040％或0.090％)；且

(d)L-抗坏血酸以百分比计为2％至18％，优选3％至16.5％，更优选4％至15％(例如，5％或13％)。

有利地，按每日摄入量或每单个剂量单位计，本发明的组合物或混合物主题包含的活性成分的相对于活性成分(即(a)、(b)、(c)和(d))的混合物的总重量的重量百分比如下：

(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽(优选水解的)以百分比计为50％至90％(例如约60％、70％、80％、90％或95％)，优选75％至85％(例如约80％)；

(b)白藜芦醇以百分比计为0.5％至8％(例如约1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、5％、6％或7％)，优选2％至4％(例如约3.1％至3.3％或2.3％至2.4％)；

(c)虾青素以百分比计为0.05％至2％(例如约0.1％、0.15％、0.20％、0.30％、0.50％、0.80％、1％、或1.5％)，优选为0.05％至0.5％(例如约0.09％至0.1％或0.12％至0.14％)；

和(d)L-抗坏血酸以百分比计为5％至30％(例如约8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％或25％)，优选12％至18％(例如约15.5％至16.5％)。

有利地，按每日摄入量或每单个剂量单位计，本发明的混合物或组合物包含的活性成分的重量比(或重量份)限定如下：[(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽500至50]：[(b)白藜芦醇5至0.5]：[(c)虾青素0.25至0.025]：[(d)L-抗坏血酸50至5]；优选地，[(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽200至50]：[(b)白藜芦醇2至0.5]：[(c)虾青素0.1至0.025]：[(d)L-抗坏血酸20至4]；例如，大约为：[(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽100]：[(b)白藜芦醇1]：[(c)虾青素0.05]：[(d)L-抗坏血酸8.5至9]。

类姜黄素(curcuminoid)或姜黄素(curcumin)被定义为形成从姜黄(Curcumalonga)中提取的色素、其天然和合成来源的类似物或衍生物的化合物。姜黄素具有抗炎和抗氧化特性。

在本发明的组合物或混合物(包含(a)、(b)，例如(b-i)和/或(b-ii)、(c)，例如(c-i)和/或(c-ii)，和任选地(d)和/或(e))的一个实施方式中，在(b-i)之外或作为(b-i)的替代，所述(b)包含所述(b-ii)至少一种类姜黄素(根据欧洲指令的E100)或者由其组成。

优选地，所述(b-ii)至少一种类姜黄素是姜黄(L.，1753)(另称为姜黄(curcuma)或印度藏红花或姜黄根粉)的提取物，其中相对于提取物的总重量，滴定的类姜黄素(例如，姜黄素、去甲氧基姜黄素(DMC)和双去甲氧基姜黄素(BDMC))以重量％计为15％至95％、优选20％至70％、更优选25％至45％(例如约35％)。

其实例是Spiceuticals生产的商业产品CurQfen NF，例如姜黄提取物和富含可溶性膳食纤维的去菌胡芦巴粉，具有以下技术特征：形式：粉末，粒度：>90％通过60目筛；溶解度：在水中0.03g/L；密度0.30g/ml至0.70g/ml(堆积密度)，0.40g/ml至0.80g/ml(振实密度)；含量：总类姜黄素(姜黄素、DMC、BDMC)NLT 35％(HPLC)、胡芦巴纤维NLT 30％(基于AOAC法的内部方法)；水分含量NMT 5％(USP 29<921>KF)。

有利地，当本发明的组合物或混合物(包含(a)、(b)，例如(b-i)和/或(b-ii)、(c)，例如(c-i)和/或(c-ii)和任选地(d)和/或(e))包含所述(b-ii)类姜黄素(例如，包含重量百分比为25％至45％、优选35％的类姜黄素的化合物)时，以每日摄入量或剂量单位计，(b-ii)的含量为30mg至300mg、优选40mg至250mg、更优选50mg至200mg。

表没食子儿茶素没食子酸酯(简称EGCG)是一种儿茶素(实例CAS号989-51-5)，富含于茶、尤其是绿茶中，具有高抗氧化特性。

在本发明的组合物或混合物(包含(a)、(b)，例如(b-i)和/或(b-ii)、(c)，例如(c-i)和/或(c-ii)，和任选地(d)和/或(e)的一个实施方式中，在(c-i)之外或作为(c-i)的替代，所述(c)包含所述(c-ii)表没食子儿茶素没食子酸酯或由其组成。

本发明中使用的所述(c-ii)可以是含有表没食子儿茶素没食子酸酯的茶植物的提取物，优选茶树(Camelia sinensis(L.)Kuntze)的提取物，其包含相对于提取物的总重量以重量百分比计为10％至95％、优选20％至80％、更优选25％至50％(例如约30％)的EGCG。

有利地，可以在本发明的上下文中使用的所述包含EGCG的茶树提取物是根据本领域技术人员已知的和/或文献中报道的标准程序获得和滴定的提取物，例如，使用水醇提取溶剂(例如，乙醇/水)并借助光谱方法(例如HPLC)以EGCG滴定的茶树干燥叶提取物。

其实例是EPO Istituto Farmochimico Fitoterapico S.r.l.Italia制造的商业产品“绿茶95％多酚/65％儿茶素”(CAS号：84650-60-2)，其通过用提取溶剂：乙醇70/水30提取茶树的叶制造并具有以下特征：赋形剂：麦芽糖糊精，不少于90％的粒径通过300微米；滴定度：儿茶素(HPLC方法)>＝65.0％w/w，表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)：>＝30.0％w/w，咖啡因：<＝5.0％w/w，表儿茶素没食子酸酯(ECG)：>＝8.0％w/w；滴定度：总多酚(Folin-ciocalteau分光光度法)>＝95.0％w/w；相对密度：350g/l至650g/l；干燥损失：<＝5.0％w/w；pH：3.0至6.0。

有利地，当本发明的组合物或混合物(包含(a)、(b)，例如(b-i)和/或(b-ii)、(c)，例如(c-i)和/或(c-ii)，和任选地(d)和/或(e))包含所述(c-ii)表没食子儿茶素没食子酸酯时，以每日摄入量或剂量单位计，(c-ii)的含量为50mg至300mg，优选100mg至250mg，更优选150mg至200mg。

最后，在包含(a)、(b)，例如(b-i)和/或(b-ii)、(c)，例如(c-i)和/或(c-ii)和任选地(d)的本发明的组合物或混合物的一个实施方式中，所述组合物或混合物还包含(e)没药。

没药是一种从橄榄科(Burseraceae)没药属(Commiphora)的树木或灌木中提取的芳香树胶树脂。文献研究表明，没药是倍半萜家族的强力镇痛部分，倍半萜类分子的作用机制与大麻素相同。

本发明的组合物(包含所述混合物M(即，(a)+(b)+(c))和任选地(d)和/或(e))可以包含(II)至少一种可接受的药学或食品级添加剂和/或赋形剂，即适用于药物或食品用途的不具备治疗活性的物质。在本发明的上下文中，用于药物或食品用途的可接受的添加剂和/或赋形剂包括本领域技术人员已知的所有用于制备固体、半固体或液体形式的组合物的辅助物质，例如，稀释剂、溶剂(包括水)、增溶剂、酸化剂、增稠剂、甜味剂、增味剂、着色剂、甜味剂、润滑剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、pH稳定缓冲剂及其混合物。优选地，所述至少一种可接受的药学或食品级添加剂和/或赋形剂选自：硬脂酸镁、二氧化硅、磷酸二钙、微晶纤维素和/或成膜剂。

下面报道了本发明组合物的实施方式(简称FR)，所述组合物包含如本说明书所报道的活性成分(a)、(b-i)(例如(b-i.i)或(b-i.ii))、(b-ii)、(c)(例如(c-i.i))、(c-ii)、(d)和(e)：

FRa：(a)、(b-i)、(c-i)和任选地(d)和/或(e)；

FRb：(a)、(b-ii)、(c-i)和任选地(d)和/或(e)；

FRc：(a)、(b-i)、(b-ii)、(c-i)和任选地(d)和/或(e)；

FRd：(a)、(b-ii)、(c-i)和任选地(d)和/或(e)；

FRe：(a)、(b-ii)、(c-ii)和任选地(d)和/或(e)；

FRf：(a)、(b-i)、(b-ii)、(c-ii)和任选地(d)和/或(e)；

FRg：(a)、(b-i)、(b-ii)、(c-i)、(c-ii)和任选地(d)和/或(e)；

FRh：(a)、(b-i)、(c-i)、(c-ii)和任选地(d)和/或(e)；

FRi：(a)、(b-ii)、(c-i)、(c-ii)和任选地(d)和/或(e)。

根据一个实施方式，本发明的组合物或混合物M主题不包含具有抗氧化和/或抗炎性质的非维生素类型的活性成分，其特征在于所述成分含有至少一种类苯乙醇(phenylethanoid)，其中所述类苯乙醇含有阿克替苷(acteoside)和/或异阿克替苷(isoacteoside)中的至少一种。

根据一个实施方式，本发明的组合物或混合物M主题不包含菠萝蛋白酶和/或乳香(Boswellia(Roxb.ex Colebr.))的提取物，乳香是属于橄榄科的植物。

本发明的组合物或混合物M主题可以是液体形式，例如溶液、双相液体系统、固体在液体中的分散液或悬浮液(例如在使用时形成)，可以是半固体形式，例如凝胶、乳膏或泡沫，或者可以是固体形式，例如粉末、颗粒、微粒、薄片、片剂或胶囊。

优选地，本发明的组合物或混合物被配制成适合口服(或胃肠)、舌下、颊部施用的形式，例如液体形式、本身的固体形式或口溶性(或口分散性，在口腔中溶解)固体形式。

在本发明的优选实施方式中，本发明的组合物或混合物为固体形式，优选为用于口服悬浮液(例如在使用时形成)的颗粒或粉末形式或是口溶性的(例如，包装成含有粉末或颗粒的小袋)。

在本发明的优选替代实施方式中，本发明的组合物或混合物为口服使用的液体形式(例如，包装为单剂量可饮用小瓶)。

根据任何所描述的实施方式的包含本发明的所述混合物主题的本发明的组合物可以是药物组合物、医疗器械组合物或膳食补充剂。

在本发明的上下文中，表述“医疗器械”以根据日期为1997年2月24日的意大利第46号法令或根据新的医疗器械法规(EU)2017/745(MDR)的含义使用。

构成本发明的一个目的的是本发明的任何一个实施方式的本发明的组合物和本发明的混合物M(包含(a)、(b)，例如(b-i)和/或(b-ii)、(c)，例如(c-i)和/或(c-ii)和任选地(d)和/或(e)和/或添加剂/赋形剂)，其用作药物。

构成本发明的一个目的的是本发明的组合物和本发明的混合物M(包含(a)、(b)，例如(b-i)和/或(b-ii)、(c)，例如(c-i)和/或(c-ii)和任选地(d)和/或(e)和/或添加剂/赋形剂，根据本发明的任何一个实施方式)，其用于在有需要的受试者中预防性和/或治愈性治疗肌腱病和/或与所述肌腱病相关的疾病、病症或症状的方法中，其中所述治疗方法提供对所述受试者施用有效剂量的本发明的组合物或混合物M主题。

有利地，所述肌腱病选自：附着点病、腱周围炎、肌腱变性、肌腱断裂、腱鞘炎以及与它们相关的疾病、病症或症状。

此外，与所述肌腱病相关的疾病、病症或症状可以选自：

-影响关节的疾病、病症或症状，优选关节炎症和/或关节疼痛；

-影响肌肉骨骼系统的疾病、病症或症状。

构成本发明的一个目的的是预防性和/或治愈性治疗有需要的受试者的肌腱病和/或与所述肌腱病相关的疾病或症状的方法，其中所述治疗方法提供对所述受试者施用治疗有效量的本发明的组合物或混合物M主题。

构成本发明的一个目的的是本发明的组合物和混合物M在健康受试者中的非治疗应用。

为了清楚起见，为了实现本发明的主题，本发明组合物的成分(或活性成分)(a)、(b)、(c)、(d)和(e)可以同时或以任何顺序分开施用(优选以5分钟至60分钟的时间间隔)；优选将(a)、(b)、(c)、(d)和(e)同时施用于受试者，进而更优选以单一组合物的形式施用以获得更快速的效果并且易于施用。

当本发明的活性成分以单一组合物施用时，所述单一组合物对应于本发明的组合物。

在本发明的上下文中，术语“受试者”用来指人类或动物受试者，优选哺乳动物(例如宠物，例如狗、猫、马、羊或牛)。优选地，本发明的组合物用在人类受试者的治疗方法中。

除非另有说明，表述组合物或混合物等包含的成分的量“处于x至y的范围”用来指所述成分可以以该范围中存在的所有量(即使是未指定的)存在于组合物或混合物等中，该范围的极值也包括在内。

除非另有说明，组合物或混合物中成分的含量是指该成分相对于组合物或混合物总重量的重量百分比。

除非另有说明，组合物或混合物等“包含”一种或多种成分的指示是指除该成分或那些特别指明的成分之外还可以存在其他成分，而组合物或混合物等“由”确定的成分“组成”的称述意味着排除其他组件的存在。

本发明的方面(实施方式FRa)报告如下：

FRa1.一种组合物，该组合物包含

(I)混合物M，该混合物M包含以下成分或由以下成分组成：

(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽；

并且，任选地，所述组合物包含(II)至少一种可接受的药学或食品级添加剂和/或赋形剂。

FRa2.根据FRa1所述的组合物，其中所述混合物M包含以下成分或由以下成分组成：(a)胶原蛋白肽，优选水解的胶原蛋白肽；(b-i)白藜芦醇；(c-i)虾青素。

FRa3.根据FRa1或FRa2所述的组合物，其中所述(a)胶原蛋白肽是水解的胶原蛋白肽；优选(a)平均分子量为0.3kDa至10kDa，优选1kDa至5kDa，更优选1.5kDa至3kDa的酶促水解的胶原蛋白肽。

FRa4.根据FRa1至FRa3中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含(d)抗坏血酸；优选地，其中所述组合物包含(d)抗坏血酸和所述混合物M，所述混合物M包含以下成分或由以下成分组成：(a)水解胶原蛋白肽，(b-i)白藜芦醇，(c-i)虾青素。

FRa5.根据FRa1至FRa4中任一项的组合物，其中所述(b-i)白藜芦醇选自：

-(b-i.i)虎杖提取物，其滴定的白藜芦醇相对于提取物的总重量以重量％计为80％至99.5％、优选90％至99.5％、更优选约98％；优选地，其中所述(b-i.i)是虎杖的干燥根提取物；和

-(b-i.ii)来自酿酒酵母发酵物的白藜芦醇，其包含的白藜芦醇相对于总重量以％计为70％至99.5％、优选85％至95％、更优选约90％。

FRa6.根据FRa1至FRa5中任一项所述的组合物，其中所述(c-i)虾青素由以下组成：(c-i.i)雨生红球藻提取物，其滴定的虾青素相对于提取物的总重量以重量％计为0.1％至10％，优选为0.5％至7.5％，更优选为1％至5％。

FRa7.根据FRa1至FRa6中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于口服应用；优选为粉末状或粒状固体形式，或者为悬浮液或溶液的液体形式。

FRa8.根据FRa1至FRa7中任一项所述的组合物，其中所述组合物用作药物。

FRa9.根据FRa8所述应用的组合物，其中所述组合物用于在有需要的受试者中预防性和/或治愈性治疗肌腱病和/或与所述肌腱病相关的疾病、病症或症状的方法；

优选地，其中所述肌腱病选自：附着点病、腱周围炎、肌腱变性、肌腱断裂和/或腱鞘炎。

FRa10.根据FRa9所述应用的组合物，其中与所述肌腱病相关的所述疾病、病症或症状选自：

-影响肌肉骨骼系统的疾病、病症或症状。

本发明的其他实施方式(FRb)报告如下：

FRb1.一种组合物，该组合物包含

(I)混合物M，该混合物M包含以下成分或由以下成分组成：

(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽；

(b-i)白藜芦醇；

(c-i)虾青素；

(d)抗坏血酸；

并且，任选地，所述组合物包含

(II)至少一种药学或食品级添加剂和/或赋形剂。

FRb2.根据FRb1所述的组合物，其中所述(a)胶原蛋白肽是水解的胶原蛋白肽；优选(a)酶促水解的胶原蛋白肽。

FRb3.根据FRb1或FRb2所述的组合物，其中所述(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽的平均分子量为0.3kDa至10kDa，优选1kDa至5kDa，更优选1.5kDa至3kDa。

FRb4.根据FRb1至FRb3中任一项所述的组合物，其中所述(b-i)白藜芦醇由(b-i.i)虎杖提取物组成，其中相对于提取物的总重量，所述虎杖提取物中的滴定的白藜芦醇以重量百分比计为80％至99.5％，优选为90％至99.5％，更优选为约98％；优选地，所述(b-i.i)是虎杖干燥根提取物。

FRb5.根据FRb1至FRb3中任一项所述的组合物，其中所述(b-i)白藜芦醇由(b-i.ii)来自酿酒酵母发酵物的白藜芦醇组成，其中相对于来自发酵物的白藜芦醇的总重量，所包含的白藜芦醇以百分比计为70％至99.5％，优选为85％至95％，更优选至约90％。

FRb6.根据FRb1至FRb5中任一项所述的组合物，其中所述(c-i)虾青素由以下组成：(c-i.i)雨生红球藻提取物，其中相对于提取物的总重量，所述提取物中的滴定的虾青素以重量百分比计为0.1％至10％，优选0.5％至7.5％，更优选为1％至5％。

FRb7.根据FRb1至FRb6中任一项所述的组合物，相对于由(a)、(b)、(c)和(d)组成的所述混合物M的总重量，所述混合物M以重量百分比计包含：

(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽，以百分比计为50％至90％，优选为75％至85％；

(b)白藜芦醇，以百分比计为0.5％至8％，优选为2％至4％；

(c)虾青素，以百分比计为0.05％至2％，优选为0.05％至0.5％；和

(d)L-抗坏血酸，以百分比计为5％至30％，优选为12％至18％。

FRb8.根据FRb1至FRb7中任一项所述的组合物，其中所述组合物的剂量单位以以下重量比包含：[(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽500至50]:[(b)白藜芦醇5至0.5]:[(c)虾青素0.25至0.025]:[(d)L-抗坏血酸50至5]；

优选地，[(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽200至50]:[(b)白藜芦醇2至0.5]:[(c)虾青素0.1至0.025]:[(d)L-抗坏血酸20至4]；

更优选地，[(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽100]:[(b)白藜芦醇1]:[(c)虾青素0.05]:[(d)L-抗坏血酸8.5至9]。

FRb9.根据FRb1至FRb8中任一项所述的组合物，其中所述组合物配制用于口服应用。

FRb10.根据FRb9所述的组合物，其中所述组合物是粉末状或颗粒的固体形式，或者是悬浮液或溶液的液体形式。

FRb11.根据FRb1至FRb10中任一项所述的组合物，该组合物用作药物。

FRb12.根据FRb1至FRb10中任一项所述的组合物，该组合物应用于预防性和/或治愈性治疗有需要的受试者中的肌腱病、附着点病、腱周围炎、肌腱变性、肌腱断裂、腱鞘炎和/或与它们相关的症状的方法中。

FRb13.根据FRb12所述应用的组合物，其中与所述肌腱病相关的所述症状选自关节炎症和/或关节疼痛。

实验部分(I)

材料

(I)用于口服悬浮剂(袋剂)的粉末或颗粒固体形式的组合物

组合物1和2是配制为用于口服悬浮剂(以袋剂包装)的粉末或颗粒固体形式的用于口服应用的根据本发明的组合物，如表1和表2所报告。

成分	mg/剂(1至2袋)
		水解的胶原蛋白肽	2500mg-5000mg
白藜芦醇(98％)	100mg-200mg
		虾青素	3mg或4mg 6mg或8mg
维生素C(抗坏血酸)<sup>*</sup>	500mg-1000mg
		添加剂和/或赋形剂	q.s.
总重量	45000mg-9000mg

表1^{*VNR％/1袋＝1250}

成分	mg/剂(1至2袋)
		水解的胶原蛋白肽	2500mg-5000mg
白藜芦醇(90％)	75mg-150mg
		虾青素	3mg或4mg 6mg或8mg
维生素C(抗坏血酸)<sup>*</sup>	500mg-1000mg
		添加剂和/或赋形剂	q.s.
总重量	45000mg-9000mg

表2*VNR％/1袋＝1250

表1、2、3和4中的添加剂和/或赋形剂为例如，至少一种酸化剂、抗结块剂、甜味剂、增味剂、着色剂和增甜剂。

混配物1和2的具体实例分别由混配物1a(表1a)和2a(表2a)表示，其中：

-虾青素以雨生红球藻的形式存在，其滴定为约2.5％的虾青素(例如，AstaReal的

EL25)。

-白藜芦醇以如下形式存在：

i)提取自虎杖(Siebold&Zucc.)的白藜芦醇(例如，由法国Quimdis s.a.s.制造的Resveratrol 98％)，或ii)提取自酿酒酵母发酵物的白藜芦醇(或反式白藜芦醇)(例如，由Evolva制造的RESVERATOLO CWD90)；

-水解胶原蛋白肽，其平均分子量约为2kDa，通过胶原蛋白的酶促水解的获得(例如，由Gelita AG制造的

B)。

上述商品的技术特征如下所示。

EL25(由AstaReal制造)是一种自由流动的红色粉末，含有2.5％天然虾青素。该粉末是通过将

L10封装在改性淀粉中制成的。

L10是一种富含虾青素的油，通过在没有溶剂的情况下用超临界二氧化碳提取绿色微藻雨生红球藻的粉碎和喷雾干燥的无孢子体而产生。

组成：变性淀粉：73.5％；

L10：25％；虾青素：2.5％至2.7％(总类胡萝卜素2.6％至2.9％)，包括单酯1.9％、二酯0.5％和游离形式0.1％。

法国Quimdis s.a.s.生产的Resveratrol 98％(例如，从虎杖中提取的白藜芦醇)具有以下技术特点：CAS号501-36-0；粒径：>95％通过80目筛；溶解度：在水中0.03g/L；密度>0.40g/ml(堆积密度)，>0.050g/ml(振实密度)；含量>98％(HPLC)；干燥损失<5％(CP)；水醇提取(例如EtOH：H₂O)。

Evolva公司生产的RESVERATROLO CWD 90(例如，来自酿酒酵母发酵物的白藜芦醇)具有以下技术特征：组成：90％的通过发酵产生的反式白藜芦醇和10％的赋形剂；形态：可分散于冷水中的粉末；分散：560mg在100ml水中分散通过720微米筛；滴定度(无水)>90.0％；红外识别：>90％与内标对应；粒度：小于10微米的颗粒>＝10.00％；平均粒径<50.00μm；中值粒度<45μm。

B(德国GelitaAG生产的特定Bioactive Collagen

)具有以下技术特征：高生物活性胶原蛋白肽为约2000g/mol(约2kDa)；通过酶促水解进行水解的胶原蛋白；蛋白质含量91％至95％(技术：Kjeldahl(N×5.55))；干物质(105℃，16小时)90％至96％(技术：GME)；灰分(550℃)≤1.5％(技术：USP/GME)；pH(10％,室温)5.5至6.5(技术：电位器)；粘度(10％，25℃)1.10至2.00mPa·s(技术：GELITA法)。

B是纯胶原蛋白，矿物质含量极低，不含脂肪、胆固醇、碳水化合物和膳食纤维。

表1a

表2a

(II)悬浮液液体形式的组合物(小瓶)

组合物3和4是配制为水悬浮液液体形式(以小瓶包装)的用于口服应用的根据本发明的组合物，如表3和表4所报告。

成分	mg/剂(1至2小瓶)
		水解的胶原蛋白肽	2500mg-5000mg
白藜芦醇(98％)	100mg-200mg
		虾青素	3mg或4mg 6mg或8mg
维生素C(抗坏血酸)<sup>*</sup>	500mg-1000mg
		添加剂和/或赋形剂	q.s.
纯净水	q.s.
		总重量	3830mg/10ml-7660mg/20ml

表3*VNR％/1小瓶＝1250

成分	mg/剂(1至2小瓶)
		水解的胶原蛋白肽	2500mg-5000mg
白藜芦醇(90％)	75mg-150mg
		虾青素	3mg或4mg 6mg或8mg
维生素C(抗坏血酸)<sup>*</sup>	500mg-1000mg
		添加剂和/或赋形剂	q.s.
纯净水	q.s.
		总重量	3800mg/10ml-7600mg/20ml

表4*VNR％/1小瓶＝1250

混配物3和4的具体实例分别以混配物3a(表3a)和4a(表4a)为代表，其中虾青素、白藜芦醇和水解胶原蛋白肽具有与表1a和2a产品相同的技术特性。

表3a

表4a

实验部分(II)

本项目的目的是研究包含胶原蛋白、虾青素、反式白藜芦醇和维生素C的根据本发明的混配物(简言之，4种物质的混合物或MIX)在体外肌腱病模型中的抗氧化和抗炎效果。

该模型基于使用从跟腱分离获得的原代人肌腱细胞，该细胞从Zen-Bio(TEN-F)购买，根据供应商的说明进行培养和使用。

通过用IL1β(10ng/ml,O/N)处理细胞获得炎症模型。

通过用H₂O₂(1.5mM，2小时)处理细胞获得氧化应激模型。

1.溶解度研究

以粉末形式接收的单个物质溶解如下：

-维生素C：通过制备100mM储液(相当于17.612mg/ml)将维生素C溶解在水中。

-胶原蛋白肽：胶原蛋白肽具有低分子量和亲水性，可制备等于100mg/ml的储液。

-虾青素(AstaReal EL25)：将虾青素溶解在DMSO中，制成浓度为100mg/ml的储液。储液浓度的建立使得处理的最终剂量包含的DMSO百分比小于1％，否则对细胞有毒性。

注意：配方中含有2.5％的虾青素。从这里开始，用于处理的浓度不是指原料AstaREAL EL25的浓度，而是指虾青素的实际浓度(2.5％)。

-白藜芦醇(CWD90 EVOLVA)：将白藜芦醇溶解在DMSO中，制成等于50mg/ml的储液。储液浓度的建立使得处理的最终剂量包含的DMSO百分比小于1％，否则对细胞有毒性。

2.细胞毒性研究——MTT测试

对用各种物质处理的健康肌腱细胞进行初步细胞毒性研究(即MTT测试(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)和随后的统计分析)，以确定用于后续实验的剂量，以及用于分析协同作用的混合剂量。

细胞以6000个细胞/孔的密度接种在48孔多孔板中。48小时后，将其用不同浓度的维生素C(0.88μg/mL至352μg/mL)、胶原蛋白肽(100μg/mL至3000μg/mL)、虾青素(1μg/mL至1000μg/mL)或白藜芦醇(0.1μg/mL至100μg/mL)处理24小时。对每种物质选择的浓度范围是基于文献报道的数据确定的。在治疗结束时进行MTT测试。简言之，去除生长培养基并用不含酚红的含有0.5mg/ml MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)的培养基代替，将细胞置于温育箱中1小时。线粒体酶将黄色MTT转化为紫色甲臜指示了线粒体活性，因此指示细胞活力。然后用异丙醇溶解细胞中的甲臜沉淀，获得均匀的溶液，由此可以在分光光度计上测量其吸光度(510nm处的吸光度)。

使用GraphPad Prism程序进行统计分析，使用单向ANOVA，然后进行多重比较的Dunnet检验。

获得的结果(未报告)显示，在所测试剂量下，胶原蛋白和虾青素没有毒性，而用维生素C(352μg/ml)或白藜芦醇(50μg/ml和100μg/ml)处理观察到对细胞活力的负面效果。

基于所述细胞毒性结果，后续实验采用以下剂量(通过3次系列稀释1:2、1:4和1:8获得)：

-维生素C：88、44、22、11μg/ml(即1和稀释1:2、1:4和1:8)

-胶原蛋白：1000、500、250、125μg/ml

-虾青素：500、250、125、62,5ng/ml

-白藜芦醇：10、5、2,5、1,25μg/ml。

3.细胞毒性测试——组合(根据本发明的)

因此进行了类似的细胞毒性测试以检查由于物质组合而可能产生的毒性。通过组合最大剂量的每种物质(即维生素C 88μg/ml、胶原蛋白1000μg/ml、虾青素500ng/ml、白藜芦醇10μg/ml)来制备4种化合物的混合物(MIX)，并使用三次系列1:2稀释获得后续浓度(分别为1:2、1:4、1:8)。

如第2节所述进行MTT测试和随后的统计分析，发现(结果未报告)四种物质的组合在各个所测试浓度下对肌腱细胞都没有毒性作用。

4.H₂O₂存在下的细胞毒性测试

评估了被分析物质对抗氧化应激的能力。

在存在或不存在各个物质或其混合物(MIX，根据本发明的混配物)的情况下，用H₂O₂处理肌腱细胞，H₂O₂是自由基氧物质(ROS)和随后的氧化应激的已知诱导剂。

为了确认H₂O₂(及其与物质的组合)的浓度是无毒性的且因此ROS的产生与细胞死亡无关，对根据以下实验方案处理的肌腱细胞进行MTT测试。

将肌腱细胞以6000个细胞/孔的密度接种在48孔多孔板中。48小时后，用不同浓度的单个物质或其混合物进行预处理。处理24小时后，将1.5mM H₂O₂添加到培养基中，持续2小时，随后如第2节所述进行MTT测试。使用GraphPad Prism程序进行统计分析，使用单向ANOVA，随后进行用于多重比较的Tukey检验。

获得的结果(未报告)显示，H₂O₂本身不影响肌腱细胞的活力。

类似地，其与四种物质或其混合物(MIX)的组合不会造成对肌腱细胞本身的毒性作用。

5.自由基氧物质(ROS)的产生的分析

在氧化应激模型中分析了单个物质及其组合(MIX，根据本发明的混配物)在对抗自由基氧物质(ROS)的产生方面的功效。

将肌腱细胞以3000个细胞/孔的密度接种在96孔黑色多孔板中。48小时后，用不同浓度的单个物质或其混合物(MIX)进行预处理(表5)。处理24小时后，将H₂DCFDA(2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯)探针添加到生长培养基中，该探针会被参与氧化应激的酶切割。该转换的产物DCF(二氯荧光素)能够吸收λ_ex 492nm至495nm处的光，并在λ_em 517nm至527nm处重新发射。温育1小时后，进一步向培养基中加入1.5mM H₂O₂保持2小时，并通过分光光度法测量ROS的产生。

5.1.实验设计方案

-独立变量：

·处理1.施用的化合物：包括6个级别：虾青素、胶原蛋白、白藜芦醇、维生素C、混合(MIX)和未经处理的对照

·处理2.添加过氧化氢(H₂O₂)：包括2个级别：有/无

·浓度.处理1的浓度.包括4个级别：C1、C2、C3、C4(表5)

-响应变量：荧光。

处理	C1	C2	C3	C4
					虾青素	500ng/ml	250ng/ml	125ng/ml	62.5ng/ml
胶原蛋白	1000ug/ml	500ug/ml	250ug/ml	125ug/ml
					白藜芦醇	10ug/ml	5ug/ml	2.5ug/ml	1.25ug/ml
维生素C	88ug/ml	44ug/ml	22ug/ml	11ug/ml
					混合(MIX)	1:1	1:2	1:4	1:8

表5

5.2.分析目标

对相关试验数据进行统计分析的目标在于：

1.在4种浓度(C1-C4)的每一种下，在存在和不存在过氧化氢的情况下，处理1和对照之间的响应(荧光)的比较。

2.在4种浓度(C1-C4)的每一种下，在存在和不存在过氧化氢的情况下，Mix和其他处理1之间的响应(荧光)的比较。

3.在仅用过氧化氢处理的样品组中，4种浓度(C1-C4)下的单个处理和Mix的比较。

5.3.统计分析

分析1(目标1和2)：最适合此类试验的统计分析是分类多因素方差分析模型(ANOVA)，其中荧光值(对各个空白进行校正后)代表因变量。处理1和2以及它们的交叉代表独立变量。对每个浓度水平进行独立分析。

分析2(目标3)：在这种情况下，使用单因素方差分析模型，其中荧光值(在对各个空白进行校正后)代表因变量，而处理(给定浓度下的单独处理和更低浓度下的混合处理)代表独立变量。

5.4.结果

为简单起见，下面仅详细报告测试浓度C4的数据。对于测试浓度C1-C3获得了类似的结果。

图1显示了在浓度C4下存在和不存在过氧化氢的情况下各处理之间的荧光比较。

图2显示了在浓度C4下的单个处理相对于混合物中的四种处理(1:1、1:2、1:4和1:8MIX)的响应差异。

从图1中可以看出，所获得的结果表明，用H₂O₂处理能够有效地诱导ROS产生，证实了实验模型：用过氧化氢处理后荧光显著增加，两种对照(有和没有过氧化氢)之间的差异高度显著。

图1显示四种物质的混合物(MIX，根据本发明的混配物)相对于氧化的对照(即在H₂O₂存在下的对照(缩写cel.si))能够抑制ROS的产生，表现出即便在最低浓度(1:8MIX)下的功效，并且相对于具有相似浓度的混合物中的单个成分、特别是相对于胶原蛋白而言具有更高的有效性。

根据所进行的统计分析结果(图2)，可以得出结论，由于1:1和1:2MIX的作用之间没有统计学上的显著差异，因此减半的剂量足以具有与更高浓度的MIX(即1:1MIX)所展示的相同的生物学功效。同样，使用降低八倍的浓度(1:8MIX)显示出与降低四倍的浓度(MIX1:4)相同的功效。此外，1:8MIX的效果大于单个成分的效果(对于虾青素和胶原蛋白而言具有统计学意义)。

根据以上报道，可以得出如下结论：

-1:8MIX的效果(其中活性成分的浓度降低为八分之一)与1:4MIX的效果是可比较的，并且相对于1:1MIX中的一种(例如参考浓度C1下的物质的混合物)相比没有低很多，从而允许在混合物中使用低剂量的单个成分(1:8MIX v.s.1:1MIX)以获得相似的效果(协同效应)；和

-在相似浓度(C4)下，1:8MIX的效果相对于混合物的单个成分(特别是胶原蛋白和虾青素)的效果更大。

6.IL-1β存在下的细胞毒性测试

为了评估这些物质对抗炎症过程的能力，在存在或不存在单个物质或其混合物的情况下，用已知的炎症诱导剂IL-1β处理肌腱细胞。为了确认IL-1β(及其与物质的组合)的浓度没有毒性，对根据以下实验方案处理的肌腱细胞进行MTT测试。

将肌腱细胞以6000个细胞/孔的密度接种于48孔多孔板中，32小时后用IL-1β10ng/ml O/N处理，目的是诱导炎症过程。次日，用不同剂量的单个物质或它们的组合处理细胞24小时。最后，如上所述进行MTT测试(第2节)。

使用GraphPad Prism程序进行统计分析，使用单因素ANOVA，然后使用Tukey检验进行多重比较。

结果(未报告)显示，在所使用的剂量下，IL-1β对肌腱细胞没有毒性作用。同时，可以观察到，IL-1β与四种物质以及它们的混合物的组合不会引起毒性作用。

7.炎症和组织重塑的标志物的剂量

一旦确定在IL-1β存在下不存在毒性，对单个物质及其组合在减少炎症介质分泌和改变组织重塑介质(IL-6和MMP-2)的产生方面的功效进行了分析。

为此，将肌腱细胞以6000个细胞/孔的密度接种在6孔多孔板中。32小时后，通过用IL-1β10ng/ml，O/N处理诱导炎症过程。次日，用不同浓度的单个物质或其组合(MIX)处理细胞。处理24小时后，收获、等分并储存肌腱细胞的条件培养基以供后续分析。炎症介质的分泌或组织重塑的分泌使用ELISA测试在条件培养基上进行评估，遵循各自数据表上指示的方案。分析的分子是：IL-6和MMP-2。

7.A.IL-6的调节分析

7.A1.实验设计方案

类似于第5.1节中报告的实验设计，其中将IL-1β而不是H₂O₂添加到“处理2”。

响应变量：吸光度。

7.A2.分析目标

对相关试验数据进行统计分析的目标为：

1.在存在和不存在IL-1β的情况下，处理1和对照之间的响应(测量为吸光度的IL-6表达)的比较。

2.在IL-1β存在下，4种浓度下的单个处理和混合物处理之间的比较。

7.A3.统计分析

最适合此类试验的统计分析是分类多因素方差分析模型(ANOVA)，其中吸光度值(在对各个空白进行校正后)代表因变量。处理1和2以及它们的交叉代表独立变量。对每个浓度水平进行独立分析。

7.A4.结果

图3显示了在存在和不存在IL-1β时的对照、在IL-1β存在下的浓度C4的单个成分及其混合物(1:8MIX)的吸光度(表达指标IL-6)。

从图3中可以看出，是通过用IL-1β处理有效诱导了炎症过程(比较未处理和处理的阳性对照)。

此外，与阳性对照(用IL-1β处理)相比，和与浓度C4的单个活性成分相比，浓度C4下的四种物质的混合物(1:8MIX，根据本发明的混配物)能够以统计学显著的方式降低IL-6表达(图3)。

因此，可以得出结论，根据本发明的混合物对在降低炎症水平方面的作用与单独摄取的活性成分的作用相比是协同性的。

7.B.MMP-2的调节分析

7.B1.实验设计方案

响应变量：吸光度。

7.B2.分析目标

对相关试验数据进行统计分析的目标是：

1.在存在和不存在IL-1β的情况下，处理1和对照之间的响应(测量为吸光度的MMP-2表达)的比较。

2.在IL-1β存在下，4种浓度下的单个处理和混合处理之间的比较。

7.B3.统计分析

7.B4.结果

图4显示了在存在和不存在IL-1β时的对照、在IL-1β存在下的浓度C4的单个成分及其混合物(1:8MIX)的吸光度(表达指标MMP-2)。

从图4可以看出，IL-1β诱导的促炎刺激诱导了MMP-2酶分泌的增加(比较未处理或用IL-1β处理的阳性对照)。

此外，图4中报告的数据显示，与阳性对照(用IL-1β处理)和以浓度C4单独施用的所有活性成分相比，浓度为C4的四种物质的混合物(1:8MIX，根据本发明的混配物)能够以统计学显著的方式减少MMP-2的产生。

因此，四种物质的混合物(根据本发明的混配物)相对于单独的活性物质在降低MMP-2酶的分泌方面的协同作用是明显的。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种组合物，该组合物包含：

(I)包括以下成分或由以下成分组成的混合物M：

(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽；

(b-i)白藜芦醇；

(c-i)虾青素；

(d)抗坏血酸；

并且，任选地，所述组合物包含：

(II)至少一种药学或食品级添加剂和/或赋形剂；

其中，所述组合物应用于预防性和/或治愈性治疗有需要的受试者中的肌腱病、附着点病、腱周围炎、肌腱变性、肌腱断裂、腱鞘炎、以及关节炎和/或关节痛的方法中。

2.如权利要求1所述应用的组合物，其中，所述(a)胶原蛋白肽是水解的胶原蛋白肽；优选为(a)酶促水解的胶原蛋白肽。

3.如权利要求1或2所述应用的组合物，其中，所述(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽的平均分子量为0.3kDa至10kDa，优选为1kDa至5kDa，更优选为1.5kDa至3kDa。

4.如权利要求1至3中任一项所述应用的组合物，其中，所述(b-i)白藜芦醇由(b-i.i)虎杖(Polygunum cuspidatum)提取物组成，其中相对于该虎杖提取物的总重量，所述虎杖提取物中的滴定的白藜芦醇以重量百分比计为80％至99.5％，优选为90％至99.5％，更优选为约98％；优选地，所述(b-i.i)是虎杖干燥根提取物。

5.如权利要求1至3中任一项所述应用的组合物，其中，所述(b-i)白藜芦醇由(b-i.ii)来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵物的白藜芦醇组成，其中相对于来自发酵物的白藜芦醇的总重量，所包含的白藜芦醇以百分比计为70％至99.5％，优选为85％至95％，更优选为约90％。

6.如权利要求1至5中任一项所述应用的组合物，其中，所述(c-i)虾青素由以下组成：(c-i.i)雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)提取物，其中相对于该雨生红球藻提取物的总重量，所述提取物中的滴定的虾青素以重量百分比计为0.1％至10％，优选0.5％至7.5％，更优选为1％至5％。

7.如权利要求1至6中任一项所述应用的组合物，其中，相对于由(a)、(b)、(c)和(d)组成的所述混合物M的总重量，所述混合物M以重量百分比计包含：

(b)白藜芦醇，以百分比计为0.5％至8％，优选为2％至4％；

(d)L-抗坏血酸，以百分比计为5％至30％，优选为12％至18％。

8.如权利要求1至7中任一项所述应用的组合物，其中，所述组合物的剂量单位以以下重量比包含：[(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽500至50]:[(b)白藜芦醇5至0.5]:[(c)虾青素0.25至0.025]:[(d)L-抗坏血酸50至5]；

9.如权利要求1至8中任一项所述应用的组合物，其中，所述组合物配制用于口服应用。

10.如权利要求9所述应用的组合物，其中，所述组合物是粉末状或颗粒的固体形式，或者是悬浮液或溶液的液体形式。

Claims

1.一种组合物，该组合物包含：

(I)包括以下成分或由以下成分组成的混合物M：

(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽；

(b-i)白藜芦醇；

(c-i)虾青素；

(d)抗坏血酸；

并且，任选地，所述组合物包含：

(II)至少一种药学或食品级添加剂和/或赋形剂。

2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述(a)胶原蛋白肽是水解的胶原蛋白肽；优选为(a)酶促水解的胶原蛋白肽。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其中，所述(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽的平均分子量为0.3kDa至10kDa，优选为1kDa至5kDa，更优选为1.5kDa至3kDa。

4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中，所述(b-i)白藜芦醇由(b-i.i)虎杖(Polygunum cuspidatum)提取物组成，其中相对于该虎杖提取物的总重量，所述虎杖提取物中的滴定的白藜芦醇以重量百分比计为80％至99.5％，优选为90％至99.5％，更优选为约98％；优选地，所述(b-i.i)是虎杖干燥根提取物。

5.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中，所述(b-i)白藜芦醇由(b-i.ii)来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵物的白藜芦醇组成，其中相对于来自发酵物的白藜芦醇的总重量，所包含的白藜芦醇以百分比计为70％至99.5％，优选为85％至95％，更优选为约90％。

6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中，所述(c-i)虾青素由以下组成：(c-i.i)雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)提取物，其中相对于该雨生红球藻提取物的总重量，所述提取物中的滴定的虾青素以重量百分比计为0.1％至10％，优选0.5％至7.5％，更优选为1％至5％。

7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中，相对于由(a)、(b)、(c)和(d)组成的所述混合物M的总重量，所述混合物M以重量百分比计包含：

(b)白藜芦醇，以百分比计为0.5％至8％，优选为2％至4％；

(d)L-抗坏血酸，以百分比计为5％至30％，优选为12％至18％。

8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中，所述组合物的剂量单位以以下重量比包含：[(a)胶原蛋白或胶原蛋白肽500至50]:[(b)白藜芦醇5至0.5]:[(c)虾青素0.25至0.025]:[(d)L-抗坏血酸50至5]；

9.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中，所述组合物配制用于口服应用。

10.如权利要求9所述的组合物，其中，所述组合物是粉末状或颗粒的固体形式，或者是悬浮液或溶液的液体形式。

11.如权利要求1至10中任一项所述的组合物，所述组合物用作药物。

12.如权利要求1至10中任一项所述的组合物，所述组合物应用于预防性和/或治愈性治疗有需要的受试者中的肌腱病、附着点病、腱周围炎、肌腱变性、肌腱断裂、腱鞘炎和/或与它们相关的症状的方法中。

13.如权利要求12所述应用的组合物，其中，与所述肌腱病相关的所述症状选自关节炎和/或关节痛。