CN115326968B - 一种茶叶中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的检测方法 - Google Patents

一种茶叶中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的检测方法 Download PDF

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Abstract

一种茶叶中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的检测方法，属于茶叶检测分析技术领域。该方法包括：配制芳樟醇樱草糖苷混合消旋体标准品溶液；对芳樟醇樱草糖苷标准品溶液进行手性超高效液相色谱‑质谱联用分析，确定芳樟醇樱草糖苷对映异构体的定性参数，绘制芳樟醇樱草糖苷对映异构体标准工作曲线；采用同样的条件对茶汤中的芳樟醇樱草糖苷对映异构体进行手性UPLC‑QQQ‑MS分析；参照标准品中的定性参数及标准工作曲线，计算出茶叶芳樟醇樱草糖苷对映异构体的含量。采用本发明提供的方法可实现对茶叶芳樟醇樱草糖苷对映异构体的精确定性定量检测。

Description

一种茶叶中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的检测方法
技术领域
本发明属于茶叶检测分析技术领域，具体涉及一种茶叶中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的检测方法。
背景技术
芳樟醇是一种重要的萜类化合物，广泛存在于自然界中，在茶叶、水果、植物、咖啡、香料等食品或生命体中均存在，对食品或植物的风味品质形成起着举足轻重的作用。茶叶中的芳樟醇主要以游离态和糖苷键合态两种形式存在，游离态的芳樟醇具有清新馥郁的迷人花香，气味阈值低(4-10ng/mL)，挥发性强，可被人体嗅觉系统直接感知，对茶叶香气品质的形成起着直接的促进作用。糖苷键合态的芳樟醇不具有挥发性，无色无味，在茶鲜叶和成品茶中均有所分布，可在酶、热、光照、辐射、化学法等方式下分解，从而释放出芳樟醇配基，同样对茶叶香气品质的形成起着举足轻重的作用。不仅如此，糖苷键合态芳樟醇也被认为是重要的潜香物质，由于其具有较强的耐高温能力，在特定条件下能够释放香气成分，可以达到缓释香气的效果，因此在香精香料领域也有着广阔的应用前景。目前在茶叶中能检测到的键合态芳樟醇以芳樟醇樱草糖苷及芳樟醇葡萄糖苷最为多见，其中芳樟醇樱草糖苷的含量远高于芳樟醇葡萄糖苷。
无论是糖苷键合态或游离态芳樟醇，由于分子结构中含有不对称碳原子，它们均为手性物质，具有旋光性，形成了空间结构上两两镜面对称的对映异构体。对映异构体间具有相同的平面结构、物理性质(如熔点，沸点，溶解度，折射率，酸性，密度等)、热力学性质(如自由能，焓、熵等)和化学性质，因此很长一段时间被人们所忽视。直到有研究表明，芳樟醇对映异构体在风味特征、生理活性等方面可能存在极大的差异，且不同来源(产地、品种、加工工艺)的食品或植物间的芳樟醇对映异构体分布特征存在显著差异，才引起了研究者们的一些关注。然而，正是由于手性化合物的对映异构体在理化性质上具有高度相似性，通常仅在手性环境(手性固定相、流动相等)中方可实现对映异构体分离及检测，且不同手性环境与对映异构体的作用力也不尽相同，需要针对化合物的结构特性进行广谱性筛选。然而市面上流通的手性色谱柱型号众多，所含固定相繁多复杂，高达上百种，且售价也较为昂贵(平均1万元/根)，往往给手性化合物的色谱分离带来较大的经济负担和技术挑战。
目前，游离态的芳樟醇对映异构体已被成功分离，并在食品领域被广泛研究。相反地，糖苷键合态芳樟醇的对映异构体在茶叶乃至生命科学领域的研究均罕有相关研究报道，究其原因，一方面糖苷的提取难度较大，往往需要复杂的提取分离过程(溶剂提取、柱分离、液液萃取等)；另一方面，由于化学结构中缺少共轭基团，芳樟醇樱草糖苷的紫外吸收弱，在常规液相色谱中无法出峰，因此在常规检测分析上已存在较大难度，而更深层次的对映异构体分离则是需要更多的技术含量，因此更具有挑战性。
早期的研究往往利用糖苷的酸解或酶解反应特性，通过制造酸性环境、外源添加茶鲜叶粗酶(丙酮粉)等方式使其释放出苷元，继而通过GC-MS手段测定苷元结构，利用葡萄糖氧化酶试剂盒测定糖基结构，从而获得糖苷化合物的整体结构信息及含量情况。该方法也与手性色谱技术结合，用于部分植物或茶叶中糖苷前体对映异构体的“曲线”分析，利用其苷元在手性GC-MS中的表征信息推导出该结构糖苷的绝对构型。然而，由于在酸性或部分酶解条件下，芳樟醇樱草糖苷易发生重排反应，从而导致结构信息的误判，且糖苷的前处理复杂，检测时间长也是造成实验误差的重要因素，因此该方法具有一定的局限性。
糖苷键合态芳樟醇樱草糖苷的衍生化也是以往研究中常用的“曲线”分析方法，采用硅烷化试剂衍生化处理后形成挥发性糖苷衍生物，再进行GC-MS分析，从而推导出芳樟醇樱草糖苷的含量范围。在理论上若结合手性气相色谱柱，也可获得直观的对映异构体分布信息，但目前相关文献较为罕见。该方法可以较为直观地获得整体糖苷化合物的结构信息，相比酶解及酸解法而言更为准确。然而，前处理的操作复杂性以及糖苷衍生化效率未知是该方法的较大缺陷。
近年来，研究者们发现利用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)可以实现对芳樟醇樱草糖苷的直接定性定量分析，无需复杂的前处理操作，只需要少量样品(0.1g左右)即可完成对茶叶中挥发性糖苷前体的提取及分析，具有灵敏性高、选择性强等特点。在医药合成及分析领域，采用LC-MS结合手性色谱技术实现对糖苷类化合物的对映异构体分离已有少部分研究报道，如利用纤维素键合手性固定相可以实现对黄酮糖苷类物质的手性分离。由此可见，糖苷键合态萜类化合物通过手性LC-MS手段实现对映异构体分离是理论可行的。然而，黄酮糖苷类物质为苯环衍生物，在结构上具有共轭基团，液相上紫外吸收强，在分离难度上远低于芳樟醇樱草糖苷。目前，直接利用手性LC-MS分离芳樟醇樱草糖苷对映异构体的方法在各个领域均未被报道。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种茶叶中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的检测方法的技术方案。该方法前处理简单，容易操作，定量精确，重复性好，能够实现对不同茶类中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的检测。
本发明采用的技术方案如下：
所述的一种茶叶中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的检测方法，其包括以下步骤：
1)配制芳樟醇樱草糖苷混合消旋体标准品溶液；
2)对芳樟醇樱草糖苷标准品溶液进行手性超高效液相色谱-质谱联用UPLC-QQQ-MS分析，确定芳樟醇樱草糖苷对映异构体的定性参数，绘制芳樟醇樱草糖苷对映异构体标准工作曲线；
3)提取茶汤中芳樟醇樱草糖苷对映异构体，采用步骤2)的条件对茶汤中的芳樟醇樱草糖苷对映异构体进行手性UPLC-QQQ-MS分析；
4)参照标准品中的定性参数及标准工作曲线，计算出茶叶芳樟醇樱草糖苷对映异构体的含量。
进一步，所述步骤1)中芳樟醇樱草糖苷混合消旋体标准品溶液浓度为1.20～26.00mg/L。
进一步，所述步骤2)中以芳樟醇樱草糖苷对映异构体标准品浓度为横坐标、芳樟醇樱草糖苷对映异构体定量离子峰峰面积为纵坐标，绘制芳樟醇樱草糖苷对映异构体的标准工作曲线。
进一步，所述步骤2)中手性UPLC-QQQ-MS中色谱条件具体为：
色谱柱：Asec CYCLOBONDR I 2000HP-RSP；
流动相：流动相A为0.1％v/v甲酸水溶液，流动相B为乙腈；
梯度洗脱条件：0.00-3.00min，10-25％B；3.00-9.00min，25-40％B；9.00-11.00min，40-90％B；11.00-12.00min，90％B；12.00-12.10min，90-10％B；12.10-16.00min，10％B。
进一步，所述步骤2)中手性UPLC-QQQ-MS中质谱条件具体为：
离子化模式为正离子模式ESI+，扫描模式为多反应监测，毛细管电压为3.0kV，脱溶剂气N2温度为400℃，碰撞气体是氩气，锥孔电压45V，锥孔气流速50L/hr，去溶剂气流速550L/hr，驻留时间为0.100s，碰撞能为30V。
进一步，所述步骤3)中提取茶汤中芳樟醇樱草糖苷对映异构体具体为：
称取茶粉样500.0mg±0.5mg于离心管中，加入5mL沸纯净水，摇匀后在70℃水浴浸提30分钟后，用离心机低温离心10分钟；取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤于样品瓶中备用。
进一步，所述色谱柱为Supelco Asec CYCLOBONDR I 2000HP-RSP，规格为15cm×4.6mm×5μm；所述色谱条件中，进样量为2μL，流速为0.6mL/min，柱温35℃。
采用本发明提供的方法能够检测出茶叶样品中的芳樟醇樱草糖苷对映异构体，定性参数如表1所示。
表1芳樟醇樱草糖苷对映异构体定性参数表
采用本发明提供的方法在较广的浓度范围内(1.22-77.94mg/L)呈现较好的线性关系，相关系数高达0.9951，检测限低至0.04mg/L，RSD值介于4.65-8.24％，可实现对茶叶芳樟醇樱草糖苷对映异构体的精确定性定量检测。
本发明采用高效液相色谱-质谱联用法结合手性色谱技术首次将茶叶中芳樟醇樱草糖苷对映异构体成功分离，该方法可实现芳樟醇樱草糖苷对映异构体的同时精确定量检测，线性浓度范围广，相关系数高，检测限、定量限及相对标准偏差均较为理想。本方法溶剂使用量少，前处理简单，容易操作，且可以极大避免其他检测方法中难以避免的“峰重叠”现象，在茶叶品质化学理论研究及茶叶滋味品质的调控方面均具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为芳樟醇樱草糖苷结构式图；
图2为芳樟醇樱草糖苷对映异构体标准品色谱图；
图3为云南白茶中可检测到的芳樟醇樱草糖苷对映异构体色谱图
图4为不同茶类中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的含量分布情况；
图5为烘青绿茶加工过程中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的含量变化规律。
具体实施方式
以下结合实例及附图来对本发明做进一步的解释说明。本实例仅用于具体说明该方法，而并非对本发明的范围进行限制，任何依照本发明的教导所做出的改动或改进，均属于本发明的保护范围。
实施例1：茶叶中芳樟醇樱草糖苷对映异构体定量分析方法的建立
具体操作步骤：
1)芳樟醇樱草糖苷对映异构体标准品溶液的配制
取消旋化芳樟醇樱草糖苷标准品，加纯水溶解，配制浓度为1558.8mg/L的芳樟醇樱草糖苷混合消旋体标准品，稀释10倍，获得溶液浓度为155.88mg/L的芳樟醇樱草糖苷混合消旋体标准品作为母液，-20℃低温保存待用。
2)外标法建立芳樟醇樱草糖苷对映异构体标准曲线
用适合量程的移液枪分别吸取0.8mL、1.0mL混标母液置于15mL离心管中，加入1.0mL纯水，配制系列浓度的芳樟醇樱草糖苷混合消旋体标准品溶液，转移至含200μL内插管的2.0mL液相进样瓶中，静置待用。对每个浓度的标准品进行UPLC-QQQ-MS分析后，以芳樟醇樱草糖苷对映异构体的浓度为横坐标，以相应定量离子峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性范围和相关系数。
手性UPLC-QQQ-MS分析条件：色谱柱采用Asec CYCLOBONDR I 2000HP-RSP(15cm×4.6mm，5μm，Supelco，德国)。色谱条件：流动相A为0.1％(v/v)甲酸水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱条件：0.00-3.00min，10-25％B；3.00-9.00min，25-40％B；9.00-11.00min，40-90％B；11.00-12.00min，90％B；12.00-12.10min，90-10％B；12.10-16.00min，10％B；其中进样量为2μL，流速为0.6mL/min，柱温35℃。质谱条件：离子化模式为正离子模式ESI+，扫描模式为多反应监测，毛细管电压为3.0kV，脱溶剂气(N2)温度为400℃，碰撞气体是氩气，锥孔电压45V，锥孔气流速50L/hr，去溶剂气流速550L/hr，驻留时间为0.100s，碰撞能为30V。
3)芳樟醇樱草糖苷定量方法的重复性、检测限及定量限测定
芳樟醇樱草糖苷对映异构体的检测限(limit of detection,LOD)为相应定量离子峰信噪比约等于3.0时对应的浓度，定量限(limit of quantitation,LOQ)为相应定量离子峰信噪比约等于10.0时对应的浓度，并测定茶样与标品的日内(Intra-day)和日间(Inter-day)相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)。
芳樟醇樱草糖苷映异构体的线性浓度范围、定性限、定量限及RSD值如表2所示。
表2芳樟醇樱草糖苷对映异构体的定量参数
实施例2：芳樟醇樱草糖苷对映异构体分离方法色谱、质谱条件筛选
具体操作步骤：
1)芳樟醇樱草糖苷对映异构体标准品溶液的配制
取消旋化芳樟醇樱草糖苷标准品，加纯水溶解，配制浓度合适的芳樟醇樱草糖苷混合消旋体标准品，-20℃低温保存待用。
2)手性UPLC-QQQ-MS分析色谱、质谱条件优化：
为了得到芳樟醇樱草糖苷的最佳分离效果，试验首先采用常规方法对手性色谱柱进行筛选，色谱柱信息如表3。
表3手性色谱柱信息
根据初步结果最终确定Asec CYCLOBONDR I 2000HP-RSP(15cm×4.6mm，5μm，Supelco，德国)手性柱存在较好的分离趋势。
进一步对流动相类的试剂类型(甲醇/乙腈)、甲酸浓度、洗脱梯度、柱温、流速、流速等分离参数进行优化。质谱条件首先对离子化模式进行筛选，最终确定选用正离子模式ESI+，扫描模式为多反应监测。质谱进一步优化参数包括MRM子离子，碰撞能、碎裂电压、驻留时间等，详见表4。
表4芳樟醇樱草糖苷MRM模式参数筛选范围
经过上述优化，最终实现了对消旋化芳樟醇樱草糖苷混合标准品的手性分离，如图2所示。
实施例3：不同茶类茶样中芳樟醇樱草糖苷对映异构体分离
茶样制备：收集代表性的绿茶茶样(安吉白茶、碧螺春、黄山毛峰、西湖龙井、六安瓜片、太平猴魁)、白茶茶样(福鼎白茶、云南白茶、印尼白茶)、乌龙茶(肉桂、水仙、凤凰单丛、闽北水仙、大红袍、铁观音、高山乌龙、佛手)、红茶茶样(金骏眉、英红、滇红、祁红)等茶样，用研磨机磨粉过40目筛备用。
茶汤中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的具体提取步骤为：称取茶粉样500.0mg(±0.5mg)于离心管中，加入5mL沸纯净水，摇匀后在70℃水浴浸提30分钟后，用离心机低温离心10分钟；取上清液经0.22μm膜过滤于样品瓶中备用，随后进行手性UPLC-QQQ-MS分析。代表性云南白茶中芳樟醇樱草糖苷对映异构体色谱图如图3所示。
手性UPLC-QQQ-MS分析条件：色谱柱采用Asec CYCLOBONDR I 2000HP-RSP(15cm×4.6mm，5μm，Supelco，德国)。色谱条件：流动相A为0.1％(v/v)甲酸水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱条件：0.00-3.00min，10-25％B；3.00-9.00min，25-40％B；9.00-11.00min，40-90％B；11.00-12.00min，90％B；12.00-12.10min，90-10％B；12.10-16.00min，10％B；其中进样量为2μL，流速为0.6mL/min，柱温35℃。质谱条件：离子化模式为正离子模式ESI+，扫描模式为多反应监测，毛细管电压为3.0kV，脱溶剂气(N2)温度为400℃，碰撞气体是氩气，锥孔电压45V，锥孔气流速50L/hr，去溶剂气流速550L/hr，驻留时间为0.100s，碰撞能为30V。
不同茶类中可检测到的芳樟醇樱草糖苷对映异构体平均含量与含量范围如表3所示。实验结果表明，基于平均含量，R-芳樟醇樱草糖苷在白茶中最高，乌龙茶次之，绿茶、红茶依次降低；结合含量范围结果发现，R-芳樟醇樱草糖苷在白茶中含量范围跨度最大。对于S-构型芳樟醇樱草糖苷而言，绿茶中的平均含量最高，随后是乌龙茶、白茶与红茶，经过发酵后的红茶中两种构型糖苷含量均较低。S-芳樟醇樱草糖苷在绿茶与白茶中含量跨度范围均较大。
表5绿茶、红茶、乌龙茶和白茶中芳樟醇樱草糖苷的平均含量与含量范围(mg/kg)
实施例4：烘青绿茶加工过程样中芳樟醇樱草糖苷映异构体的定性定量分析
烘青绿茶过程样6个包括：鲜叶样、摊放样、杀青样、揉捻样、初烘样、成品茶样。
茶汤中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的具体提取步骤为：称取茶粉样500.0mg(±0.5mg)于离心管中，加入5mL沸纯净水，摇匀后在70℃水浴浸提30分钟后，用离心机低温离心10分钟；取上清液经0.22μm膜过滤于样品瓶中备用。随后进行手性UPLC-QQQ-MS分析。
手性UPLC-QQQ-MS分析条件：色谱柱采用Asec CYCLOBONDR I 2000HP-RSP(15cm×4.6mm，5μm，Supelco，德国)。色谱条件：流动相A为0.1％(v/v)甲酸水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱条件：0.00-3.00min，10-25％B；3.00-9.00min，25-40％B；9.00-11.00min，40-90％B；11.00-12.00min，90％B；12.00-12.10min，90-10％B；12.10-16.00min，10％B；其中进样量为2μL，流速为0.6mL/min，柱温35℃。质谱条件：离子化模式为正离子模式ESI+，扫描模式为多反应监测，毛细管电压为3.0kV，脱溶剂气(N2)温度为400°，碰撞气体是氩气，锥孔电压45V，锥孔气流速50L/hr，去溶剂气流速550L/hr，驻留时间为0.100s，碰撞能为30V。
烘青绿茶过程样中芳樟醇樱草糖苷对映异构体含量如图5所示。实验结果表明，从芳樟醇樱草糖苷总量上看，绿茶加工过程中目标化合物总含量呈现先上升后降低的现象，杀青后茶样中芳樟醇樱草糖苷对映异构体总含量最高，成品茶中含量最低。从构型上看，加工过程中芳樟醇樱草糖苷均以S构型为主，构型比例变化不大，说明芳樟醇樱草糖苷对映异构体较为稳定，在绿茶加工过程中不会出现较大的构型变化情况，推断优势构型主要受茶叶品种或其他因素影响。
综上所述，采用本发明所述方法，溶剂使用量少，前处理简单，容易操作，即可实现对茶叶及茶叶加工过程样中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的精确定性定量。本发明实例中仅对部分茶类及烘青过程样中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的含量进行测定，若需测定更多其他类别茶叶、其他食品或植物中的芳樟醇樱草糖苷对映异构体，可以依照本发明的指导进行检测或采用适当的方法优化后进行检测，以上延伸内容均属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种茶叶中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
1）配制芳樟醇樱草糖苷混合消旋体标准品溶液；
2）对芳樟醇樱草糖苷标准品溶液进行手性超高效液相色谱−质谱联用UPLC-QQQ-MS分析，确定芳樟醇樱草糖苷对映异构体的定性参数，以芳樟醇樱草糖苷对映异构体标准品浓度为横坐标、芳樟醇樱草糖苷对映异构体定量离子峰峰面积为纵坐标，绘制芳樟醇樱草糖苷对映异构体的标准工作曲线；
手性UPLC-QQQ-MS中色谱条件具体为：
色谱柱：Supelco Asec CYCLOBONDR I 2000 HP-RSP，规格为15 cm × 4.6 mm × 5 μm；所述色谱条件中，进样量为2 μL，流速为0.6 mL/min，柱温35 ºC；
流动相：流动相A为0.1%v/v甲酸水溶液，流动相B为乙腈；
梯度洗脱条件：0.00−3.00min，10−25%B；3.00−9.00min，25−40%B；9.00−11.00min，40−90%B；11.00−12.00min，90%B；12.00−12.10min，90−10%B；12.10−16.00min，10%B；
手性UPLC-QQQ-MS中质谱条件具体为：
离子化模式为正离子模式ESI+，扫描模式为多反应监测，毛细管电压为3.0 kV，脱溶剂气N2温度为400 ºC，碰撞气体是氩气，锥孔电压45 V，锥孔气流速50 L/hr，去溶剂气流速550 L/hr，驻留时间为0.100 s，碰撞能为30 V，芳樟醇樱草糖苷对映异构体定性参数见下表：
化合物名称 MRM 模式m/z母离子→子离子 锥孔电压V 碰撞能V (R)-芳樟醇樱草糖苷 471.2000 → 333.0000 130 16 (S)-芳樟醇樱草糖苷 471.2000 → 333.0000 130 16
3）提取茶汤中芳樟醇樱草糖苷对映异构体，采用步骤2）的条件对茶汤中的芳樟醇樱草糖苷对映异构体进行手性UPLC-QQQ-MS分析；
提取茶汤中芳樟醇樱草糖苷对映异构体具体为：
称取茶粉样500.0 mg±0.5 mg于离心管中，加入5 mL沸纯净水，摇匀后在70 ºC水浴浸提30分钟后，用离心机低温离心10分钟；取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤于样品瓶中备用；
4）参照标准品中的定性参数及标准工作曲线，计算出茶叶芳樟醇樱草糖苷对映异构体的含量。
2.如权利要求1所述的一种茶叶中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的检测方法，其特征在于所述步骤1）中芳樟醇樱草糖苷混合消旋体标准品溶液浓度范围为1.20～26.00 mg/L。
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基于UHPLC-Q-TOF/MS的不同产地普洱生茶化学成分差异研究;杨晨 等;茶叶科学;第37卷(第6期);605-615 *
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