CN115326736A - 一种定量检测Pluronic F-68的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定量检测PluronicF‑68的方法，该方法应用显色法，快速、准确、特异地定量检测PluronicF‑68的含量；适用于生产工艺过程中的rAAV中间品，rAAV终产品，以及其他生物制品；所述方法操作简单，重复性好，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测Pluronic F-68的方法，特别涉及一种应用显色法定量检测Pluronic F-68的方法。
背景技术
根据市场调研机构Fortune Business Insights发布的报告，2019年基因治疗市场规模为36.1亿美元，预计到2027年将达到356.7亿美元，预测期内的年均复合增长率(CAGR)为33.6％。目前，基因药物的病毒类载体主要是腺相关病毒(Adeno-AssociatedVirus，缩略为AAV)和腺病毒(Adenovirus)两大类。
2012年11月2日，以1型AAV为载体表达脂蛋白脂酶的药物Glybera被欧盟正式批准上市，递送表达编码脂蛋白脂肪酶(lipoprteinlipase，缩略为LPL)的转基因，用于治疗LPL缺失患者，但后来于2017年退市。2017年12月20日，美国Spark Therapeutics公司开发的Luxturna获FDA批准，用于治疗Leber先天性黑蒙2型(Leber’s Congenital Amaurosis 2,缩略为LCA2)，由于RPE65(Retinal Pigment Epithelium-specific 65kDa Protein，缩略为RPE65)基因突变而导致失明的患者。它使用AAV2平台来递送正常RPE65基因，采用在视网膜下腔直接注射的方法将病毒导入眼球中。这是美国第一个利用AAV病毒作为载体，体内直接用药，用于治疗“基因缺失遗传病”的基因治疗药物。2019年5月24日，美国FDA批准Novartis公司AveXis Inc.开发的基因治疗产品Zolgensma，应用AAV9介导表达运动神经元存活蛋白SMN1(Survival Motor Neuron Gene 1，缩略为SMN1)，用于治疗SMN-1缺失的脊髓性肌萎缩症的婴儿患者。
这些基因治疗的成功，激发了rAAV基因药物的研发热潮。AAV是一种隶属细小病毒科(Parvoviridae)，无包膜的单链线状DNA病毒，外形为裸露的20面体颗粒，大小为20～26nm。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒(如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒)存在时，才能进行复制。AAV病毒的基因组约4700bp，包括上下游两个开放读码框架(Open ReadingFrame，缩略为ORF)，位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(InvertedTerminal Repeats,缩略为ITR)之间。在两个ITR之间编码两个蛋白：Cap和Rep。其中Rep基因参与病毒的复制和整合，Cap基因编码病毒衣壳蛋白。
rAAV病毒基因治疗制品的适应症主要集中在单基因遗传病领域,包括血友病、杜氏肌营养不良症、先天性黑蒙症、脂蛋白脂酶缺乏症和阿尔茨海默症等。与传统的替代疗法相比,rAAV制品在基因层面进行修复,单次给药即有可能达到长期疗效。
根据衣壳蛋白的不同,AAV病毒可分为12种血清型和100多种变体。不同血清型对人体不同组织的靶向性和感染效率存在差异,如AAV8对肝脏组织细胞感染效率较高,AAV1和AAV9则分别对心脏细胞和骨骼肌细胞更为敏感。rAAV病毒载体对于骨骼肌、视网膜、肝细胞、心脏平滑肌细胞、神经元细胞、胰岛B细胞、关节滑膜细胞等具有良好的感染效果。
rAAV病毒是安全级别最高的基因治疗载体。rAAV病毒源于非致病的野生型腺相关病毒，rAAV病毒具有结构简单、无致病性,可感染分裂期/非分裂期细胞,不整合至基因组等优势。由于其安全性好、宿主细胞范围广(可感染分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，rAAV病毒被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。
目前，大多数药企和CDMO平台,采用传统的HEK293细胞质粒转染方式生产rAAV病毒。rAAV病毒生产工艺和最终制剂中，通常加入一定浓度的Pluronic F-68。
Pluronic F-68是聚氧乙烯一聚氧丙烯共聚物，其中聚氧乙烯占80％。PluronicF-68以丙二醇为起始剂，依次经环氧丙烷和环氧乙烷的阴离子开环聚合反应，得到两端为聚氧乙烯(PEO)、中间为聚氧丙烯(PPO)的三嵌段共聚物(PEO-PPO—PEO)。Pluronic F-68是一种高分子药用辅料，具有较佳的乳化性能和安全性，性质稳定，毒性较低。
Pluronic F-68是一种非离子表面活性剂。在rAAV的生产工艺中，细胞培养时加入Pluronic F-68，能减少搅拌时泡沫的形成，降低溶液中的剪切力，减缓细胞膜被剪切。Pluronic F-68还能防止rAAV病毒颗粒的聚集，所以rAAV终制剂中会加入一定量的Pluronic F-68。
但Pluronic F-68也有一定的毒性。狗和家兔的毒性试验表明，Pluronic F-68大鼠口服的LD50为9.4g/kg，大鼠静脉注射LD50为7.5g/kg；小鼠口服的LD50为15g/kg，小鼠静脉注射LD50为lg/kg。Pluronic F-68在体内不被代谢，以原形由肾脏排出。
所以，需要对rAAV生产工艺中间品和终产品里含有的Pluronic F-68进行准确定量。
目前，定量检测Pluronic F-68的方法，有Rossi等报道的基于HPLC技术，采用分子排阻层析(Size Exclusion Chromatography，缩略为-SEC)来分离检测Pluronic F-68的方法。Rossi等采用Tosoh公司的TSKgel G3000 PW分子排阻层析色谱柱，其孔径为
填料粒径为10-17μm，利用示差折光检测器(Refractive Index Detector)，将Pluronic F-68从蛋白溶液中分离出来，并作定量检测。线性范围为50-160μg/mL，灵敏度为50μg/mL。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种定量检测Pluronic F-68的方法，通过应用显色法，快速、准确、特异地定量检测(聚氧乙烯-聚丙乙烯嵌段共聚物)含量，适用于生产工艺过程中的重组腺相关病毒(recombinantAdeno-Associated Virus，缩略为rAAV)中间品，rAAV终产品，以及其他生物制品。所述方法操作简单，重复性高，灵敏度高。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种定量检测Pluronic F-68的方法，包括以下步骤：
1.将Pluronic F-68配制为10mg/mL溶液，分别稀释至31.25、62.5、125，250、500和1000μg/mL。
2.分别取上述稀释后的Pluronic F-68溶液至离心管中，水为阴性对照。每支离心管中，分别加入100mM硫氰酸钴溶液、乙酸乙酯和无水乙醇，漩涡震荡均匀。
3.将每支离心管在冰上放置10分钟时间。其后，在2-8℃温度下离心，将离心管中的上面两层液相介质移走。
4.用乙酸乙酯清洗蓝色固相沉淀，直至乙酸乙酯没有颜色。
5.移走乙酸乙酯，并在离心管中加入乙腈，使蓝色固相沉淀溶解在乙腈中。
6.将分光光度计用乙腈调零。319nm为光吸收波长，625nm为参考波长，在319nm和625nm处均调零。
7.以625nm为参考波长，测量各离心管中的样品在319nm处的光吸收值，每个样品至少测量三次。绘制Pluronic F-68浓度-光吸收值λ319nm-625nm标准曲线，计算线性相关系数R2。
较佳的，步骤2中，Pluronic F-68溶液的加入量︰100mM硫氰酸钴溶液的加入量为1～3︰0.5～1.5(体积比)；Pluronic F-68溶液的加入量︰乙酸乙酯的加入量为1～3︰1～3(体积比)；Pluronic F-68溶液的加入量︰无水乙醇的加入量为1～3︰0.4～1.2(体积比)。
较佳的，步骤3中，离心的转速大于或等于15,000g，时间为5-10分钟。
较佳的，步骤5中，乙腈的加入量︰Pluronic F-68溶液的加入量为2～10︰1～3(体积比)。
本发明有以下优点：
1.本发明线性范围31.25-1000μg/mL。现有方法线性范围50-160μg/mL。
2.本发明简单方便，1-2小时内可完成实验。现有方法从准备试剂到完成实验，需要6-8小时。
3.本发明利用比色法的原理，以625nm为参考波长，测量319nm处光吸收值，使用设备为普通紫外分光光度计，成本在10万元以内。现有方法需要配备昂贵的HPLC仪器和色谱柱，成本至少为200万。
4.本发明重复性好。在第1天、第11天和第18天,分析员1分别配制溶液，做Pluronic F-68标准曲线。三条标准曲线几乎重合，线性关系好，线性相关系数均在0.99以上。三条标准曲线的斜率和残差均没有显著差异，Pvalue分别为0.136和0.634，说明方法重复性好。在第11天，分析员2配制溶液，重复Pluronic F-68标准曲线。四条标准曲线几乎重合，线性相关系数均在0.99以上。四条标准曲线的斜率和残差均没有显著差异，Pvalue分别为0.155和0.415，说明不同实验人员没有显著差异。
附图说明：
图1是Pluronic F-68标准曲线的建立。
图2是在第1天、第11天和第18天，分别配制Pluronic F-68标准溶液，重复标准曲线。三条标准曲线几乎重合，线性相关性好，线性相关系数均在0.99以上。三条标准曲线的斜率和残差没有显著差异，P value分别为0.136和0.634，说明不同天没有显著差异。
图3是在第1天、第11天和第18天，分析员1(Analyst 1)分别配制Pluronic F-68标准溶液，重复标准曲线。在Day 11,分析员2(Analyst 2)配制Pluronic F-68标准溶液，重复标准曲线。四条标准曲线几乎重合，线性相关性好，线性相关系数均在0.99以上。四条标准曲线的斜率和残差均没有显著差异，P value分别为0.155和0.415，说明不同人员没有显著差异。
具体实施方式
实施例1:
Pluronic F-68标准曲线的建立。
将Pluronic F-68配制为10mg/mL溶液，分别稀释至31.25、62.5、125、250、500和1000μg/mL。
分别取100-300μLPluronic F-68溶液至1.5mL离心管中，水为阴性对照。每支离心管中，分别加入50-150μL 100mM硫氰酸钴溶液，100-300μL乙酸乙酯，40-120μL无水乙醇，漩涡震荡混合均匀。
将每支离心管在冰上放置10分钟时间。其后，在2-8℃温度下，以大于或等于15,000g的转速离心5-10分钟。离心后，将离心管中的上面两层液相介质移走。
用乙酸乙酯清洗蓝色固相沉淀，直至乙酸乙酯没有颜色。
移走乙酸乙酯，并在离心管中加入200-1000μL乙腈，使蓝色固相沉淀溶解在乙腈中。
将分光光度计用乙腈调零。319nm为光吸收波长，625nm为参考波长，在319nm和625nm处均调零。
以625nm为参考波长，测量各离心管中的样品在319nm处的光吸收值，每个样品至少测量三次。
绘制Pluronic F-68浓度-光吸收值λ319nm-625nm标准曲线，计算线性相关系数R2。
实验结果如图1所示。Pluronic F-68在浓度分别为31.25、62.5、125、250、500和1000μg/mL时，光吸收值λ319nm-625nm与Pluronic F-68浓度的线性关系好，线性回归方程为：y＝0.019-0.0546；线性相关系数为0.9994。在浓度分别为31.25、62.5、125、250、500和1000μg/mL时，各浓度点的CV分别为3.33％、2.30％、2.40％、2.66％、1.19％和0.47％。
实施例2:
在实施例1的基础上，考察Pluronic F-68标准曲线的可重复性。
分别在第1天、第11天和第18天，配制Pluronic F-68标准溶液，浓度分别为31.25、62.5、125、250、500和1000μg/mL。分析Pluronic F-68标准曲线的重复性。
实验结果如图2所示。从图2可以看出，分别在第1天、第11天和第18天，获得的三条标准曲线，线性关系都很好，线性方程分别为：y＝0.0018x–0.0789，y＝0.0019x–0.0546，y＝0.0018x–0.0673。线性相关系数分别为：0.9993，0.9994，0.9988。三条标准曲线几乎重合，斜率和残差均没有显著差异，P value分别为0.136和0.634，说明方法的重复性好。在浓度分别为31.25、62.5、125、250、500和1000μg/mL时，各浓度点的CV分别为10.10％、4.05％、3.81％、3.72％、1.52％和2.95％。
实施例3:
考察不同实验人员的可重复性。
在第1天、第11天和第18天，分析员1分别配制Pluronic F-68标准溶液，重复标准曲线。在第11天，分析员2配制Pluronic F-68标准溶液，重复标准曲线。Pluronic F-68浓度分别为31.25、62.5、125、250、500和1000μg/mL。实验结果如图3所示。四条标准曲线几乎完全重合，线性关系都很好，线性方程分别为：y＝0.0018x–0.0789，y＝0.0019x–0.0546，y＝0.0018x–0.0673，y＝0.0018x–0.0324。线性相关系数分别为：0.9993，0.9994，0.9988，0.9989。四条标准曲线的斜率和残差均没有显著差异，P value分别为0.155和0.415，说明不同实验人员没有显著差异。
Claims (6)
1.一种定量检测Pluronic F-68的方法，包括以下步骤：
1).将Pluronic F-68配制为10mg/mL溶液，分别稀释至31.25、62.5、125、250、500和1000μg/mL；
2).分别取稀释后的Pluronic F-68溶液至离心管中，水为阴性对照，每支离心管中，分别加入100mM硫氰酸钴溶液、乙酸乙酯和无水乙醇，漩涡震荡均匀；
3).将每支离心管在冰上放置10分钟时间，其后，在2-8℃温度下离心，将离心管中的上面两层液相介质移走；
4).用乙酸乙酯清洗蓝色固相沉淀，直至乙酸乙酯没有颜色；
5).移走乙酸乙酯，并在离心管中加入乙腈，使蓝色固相沉淀溶解在乙腈中；
6).将分光光度计用乙腈调零，319nm为光吸收波长，625nm为参考波长，在319nm和625nm处均调零；
7).以625nm为参考波长，测量各离心管中的样品在319nm处的光吸收值，每个样品至少测量三次，绘制Pluronic F-68浓度-光吸收值λ319nm-625nm标准曲线，计算线性相关系数R2。
2.根据权利要求1所述的一种定量检测Pluronic F-68的方法，其特征在于，步骤2)中，所述Pluronic F-68溶液的加入量︰所述100mM硫氰酸钴溶液的加入量为1～3︰0.5～1.5。
3.根据权利要求1或2所述的一种定量检测Pluronic F-68的方法，其特征在于，步骤2)中，所述Pluronic F-68溶液的加入量︰所述乙酸乙酯的加入量为1～3︰1～3。
4.根据权利要求1或2所述的一种定量检测Pluronic F-68的方法，其特征在于，步骤2)中，所述Pluronic F-68溶液的加入量︰所述无水乙醇的加入量为1～3︰0.4～1.2。
5.根据权利要求1或2所述的一种定量检测Pluronic F-68的方法，其特征在于，步骤3)中，离心的转速大于或等于15,000g，时间为5-10分钟。
6.根据权利要求1或2所述的一种定量检测Pluronic F-68的方法，其特征在于，步骤5)中，所述乙腈的加入量︰所述Pluronic F-68溶液的加入量为2～10︰1～3。
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