CN115318351B - 一种单细胞配对的双层微井阵列芯片及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请属于微流控芯片技术领域，尤其涉及一种单细胞配对的双层微井阵列芯片及其制备方法和应用。其中，本申请提供的双层微井阵列芯片包括阵列结构的微井单元以及阵列结构的微井，所述芯片以一种高通量的方式实现较高的单细胞配对效率，同时能够保证配对细胞非常高的细胞存活率，并进一步提供给细胞较大的培养空间，有利于共培养细胞的长期培养。从而为体外单细胞共培养研究提供了一种切实可行的策略。
Description
技术领域
本申请属于微流控芯片领域，尤其涉及一种单细胞配对的双层微井阵列芯片及其制备方法和应用。
背景技术
细胞互作是机体协调发育、分化、免疫等生物学过程的基础，并与多种疾病的发生发展紧密相关。体外细胞共培养是研究细胞互作的有效方法。然而，常规基于细胞群的共培养方式仅能实现整体平均水平的观测，难以阐明单细胞层次的细胞互作异质性。近来，单细胞共培养因能有效揭示细胞互作异质性而受到广泛关注。迄今为止，单细胞共培养技术已取得较大进展，其主要实现平台是微流控芯片，即利用芯片上集成的微流道、微孔或微电极等微米级功能元件将将不同类型单细胞配对，再对其进行芯片上共培养和观测。目前，基于微流控芯片的单细胞的配对方法主要包括：微井阵列法、微液滴法、水力捕获法以及基于外力场的方法等。其中，微液滴法通常是将两种细胞混合悬液与油相液体相互作用，形成包裹目标细胞对的均匀液滴。但是传统的微液滴技术难以精确控制每个液滴内包裹细胞的种类及数量，以及存在液滴体积有限导致营养物质供应受限的固有弊端。水力捕获法依靠细胞溶液流动通道内设置一些特殊结构捕获经过通道的细胞，以实现细胞配对的目的。例如一种双向凹陷的微结构阵列，当一种细胞流过芯片时，会在双向凹陷微结构的一面被捕获，此时将溶液反向流过后，捕获的细胞会被冲到另一面的凹陷中，然后再次进样捕获另一种细胞以形成单细胞配对阵列。但是为了实现单细胞配对，芯片内部通常需设置辅助流道以调节流阻，限制了芯片通量；基于外力场进行单细胞配对的方法是指依靠电、磁、光和声等外部力量将异型单细胞配对，该类方法易于自动化，但电、磁、光和声等外部力量容易对捕获的细胞产生电、磁、光或声刺激，不可避免地对细胞产生外在因素的干扰。进一步的，微井阵列法因其操作方便，芯片设计简单，无需引入大量流道设计，具有较高通量等优点而备受关注。现有技术中，例如通过重力沉降法或两步离心法等可以实现单个微井中细胞配对的目的，该类方法有效提高了细胞配对通量，但通常微井体积较小，限制了细胞的长时间培养及观测。在此，本发明设计了一种结构新颖的用于单细胞配对的微井阵列芯片，在保证细胞良好生物活性的同时兼顾单细胞捕获/配对的效率和通量，并可以满足长期培养需求。
发明内容
有鉴于此，本申请提供了一种用于单细胞配对的双层微井阵列芯片及其制备方法和应用，在保证细胞良好生物活性的同时兼顾单细胞捕获/配对的效率和通量，并可以满足长期培养需求。
本申请第一方面提供了单细胞配对的双层微井阵列芯片，包括微井单元；
所述微井单元包括微井；
所述微井单元为阵列结构；
所述微井为阵列结构；
所述微井包括两个单细胞配对微井和单细胞培养微井；
两个所述单细胞配对微井为分布在单细胞培养微井底面的空心圆柱体；
所述空心圆柱体的直径为20～30μm，高度为20～25μm。
优选的，所述单细胞培养微井为空心正四方体结构；
所述空心正四方体的边长为100～120μm，高度为10～15μm。
需要说明的是，单细胞培养微井的边长远大于单细胞配对微井，这为后续进行细胞共培养，观察细胞相互作用提供了空间上的基础。
优选的，所述单细胞配对微井为对角分布在单细胞培养微井底面的空心圆柱体。
优选的，所述微井单元为10×10阵列结构；
所述微井为5×5阵列结构。
需要说明的是，经过实验证明，上述结构的单细胞配对的双层微井阵列芯片进行单细胞被动捕获/配对时，单细胞捕获率高达61.0±2.4％，单细胞配对率高达42.4％，且捕获的单细胞存活率均高于90.0％，说明上述的单细胞配对的双层微井阵列芯片结构设置的优越性。
优选的，所述微井单元设置有编码。
需要说明的是，微井单元上设置的编码定位不同的微井单元和细胞位置，实现了对细胞准确追踪观测。
优选的，所述编码设置在所述微井单元的第三行第三列。
需要说明的是，与设置在角落相比，将编码位置设置在微井单元的正中央，更符合追踪观测的视觉角度。
优选的，相邻所述微井单元的间隔为190～250μm，相邻所述微井间隔为50～80μm。
优选的，所述单细胞配对的双层微井阵列芯片为正方形，所述正方形的边长为1cm。
本申请第二方面提供了一种单细胞配对的双层微井阵列芯片的制备方法，用于制备上述单细胞配对的双层微井阵列芯片，包括以下步骤：
步骤1、将聚二甲基硅氧烷预聚体浇筑在单细胞配对的双层微井阵列芯片模具上，得到双层微井阵列芯片预聚体；
步骤2、将双层微井阵列芯片预聚体进行抽真空、干燥、脱模，得到双层微井阵列芯片。
需要说明的是，双层微井阵列芯片模具的制备方法可以先通过AutoCAD画出双层微井阵列芯片对应的平面图形，然后将平面图形制作成为掩膜版，再通过光刻技术得到对应的芯片模具。
优选的，步骤1中，所述聚二甲基硅氧烷预聚体包括聚二甲基硅氧烷和固化剂；
以质量份计算，所述聚二甲基硅氧烷和固化剂的比为5:1～15:1。
优选的，步骤2中，所述抽真空具体为连接真空泵抽真空20-60分钟。
需要说明的是，抽真空去除气泡，可以提高单细胞配对的双层微井阵列芯片的结构完整性、均匀性，避免进行单细胞捕获/配对时效率、通量和捕获的细胞存活率降低。
优选的，步骤2中，所述干燥具体为在40～60℃的烘箱中固化2～4h。
本申请第三方面提供了上述单细胞配对双层微井阵列芯片在生命科学、医学或细胞生物学领域中的应用。
综上所述，本申请提供了一种单细胞配对的双层微井阵列芯片及其制备方法和应用，其中，单细胞配对的微井阵列芯片包括阵列结构的微井单元，微井单元包括阵列结构的微井，微井包括单细胞培养微井及其分布在单细胞培养微井底面的单细胞配对微井；其中，单细胞配对微井为空心圆柱体，直径为20～30μm，高度为20～25μm，单细胞配对微井尺寸略大于单个细胞，在离心过程中可以利用尺寸排斥原理实现单细胞的捕获并配对，并且单细胞配对微井凹槽外的单细胞培养微井为配对细胞提供了较大培养空间，无需转移单细胞，就能进行后续的细胞共培养；本申请提供的单细胞配对的双层微井阵列芯片结构新颖，在保证细胞良好生物活性的同时兼顾单细胞捕获/配对的效率和通量，并可以满足长期培养需求。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例1提供的单细胞配对的双层微井阵列芯片的整体示意图以及芯片表面的局部扫描电镜放大图；
图2为本申请实施例1提供的单细胞配对的双层微井阵列芯片中单个微井单元的俯视扫描电镜图片和旋转一定角度的扫描电镜图；
图3为本申请实施例1提供的单细胞配对的双层微井阵列芯片的俯视扫描电镜图片和横切扫描电镜图；
图4为本申请实施例1提供的单细胞配对的双层微井阵列芯片中单个微井单元细胞配对的Hoechst 33342染色的荧光显微图；
图5为本申请实施例1提供的单细胞配对的双层微井阵列芯片中单个微井细胞配对的明场显微图；
图6为本申请实施例1提供的单细胞配对的双层微井阵列芯片中活死单细胞染色荧光显微图；
图7为本申请实施例1提供的单细胞配对的双层微井阵列芯片在不同细胞密度和不同离心机转速下被捕获细胞的存活率定量分析图。
具体实施方式
本申请提供了单细胞配对的双层微井阵列芯片及其制备方法和应用，在保证细胞良好生物活性的同时兼顾单细胞配对的效率和通量，并可以满足长期培养需求。
下面将结合附图对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1
本申请实施例1提供了一种单细胞配对的双层微井阵列芯片，单细胞配对的双层微井阵列芯片整体结构如图1所示，包括阵列结构的微井单元，微井单元上设置了编码，其中，单细胞配对的双层微井阵列芯片为正方形，边长为1cm，微井单元为10×10阵列结构，相邻微井单元的间隔为190～250μm；
进一步的，本申请实施例1提供的单细胞配对的双层微井阵列芯片中微井单元的整体结构如图2所示，微井单元包括微井；其中，微井为5×5阵列结构，相邻所述微井间隔为50～80μm；
再进一步的，本申请实施例1提供的单细胞配对的双层微井阵列芯片中微井结构如图3所示，微井包括单细胞培养微井及其对称分布的两个单细胞配对微井；其中，还对单细胞培养微井的边长做了标注，其中1,2为边长，边长为100～120μm，3为空心圆柱体的单细胞配对微井的直径，直径为20～30μm，4为单细胞培养微井的高度，高度为10～15μm，5为单细胞配对微井的高度，高度为20～25μm。
实施例2
本申请实施例2提供了单细胞配对的双层微井阵列芯片的制备方法，用于制备实施例1所述双层微井阵列芯片，制备方法包括以下步骤：
步骤1、利用AutoCAD画出包括呈阵列分布的微井单元的芯片的平面图形，所述微井单元包括呈阵列分布的微井；
步骤2、将步骤1所述平面图形制作成为掩膜版，通过光刻技术得到对应的单细胞配对的双层微井阵列芯片模具；
步骤3、将聚二甲基硅氧烷预聚体混合物浇注到步骤2所述单细胞配对的双层微井阵列芯片模具上；
步骤4、将步骤3所述浇筑了聚二甲基硅氧烷预聚体混合物的单细胞配对的双层微井阵列芯片模具置于在烘箱中，在40～60℃固化2～4小时，然后将聚二甲基硅氧烷预聚体混合物从模具上剥离，得到单细胞配对的双层微井阵列芯片。
需要说明的是，为提高单细胞配对的双层微井阵列芯片的制备效率，可设置包括多个微井阵列芯片的平面图形，然后按照设计边线切割为一个个独立的微井阵列芯片。
需要说明的是，光刻技术制备本申请所述结构的单细胞配对的双层微井阵列芯片参照现有光刻技术即可。
测试例1
本申请测试例1提供了实施例1单细胞配对的双层微井阵列芯片的测试例，用于测试单细胞配对的双层微井阵列芯片进行单细胞捕获/配对时的效率、通量以及配对细胞存活率。
测试在400g的离心力、10万/ml的单细胞混合悬液条件下，实施例1所提供的单细胞配对的双层微井阵列芯片进行单细胞配对的性能，测试包括以下步骤：
步骤1、在离心管中浇注聚二甲基硅氧烷预聚体混合物，然后依次除气泡、干燥固化，得到离心管基底，其中，离心管为50ml离心管，所述浇注聚二甲基硅氧烷预聚体混合物的体积为10ml；
步骤2、将实施例1提供的单细胞配对的双层微井阵列芯片用除尘纸清理干净，然后正面朝上紧贴于所述步骤1提供的离心管基底中并高温灭菌；其中，正面朝上是指微井单元正面朝上，高温灭菌为置于高温蒸汽锅中进行高温灭菌；
步骤3、将单细胞混合悬液加入步骤2所述高温灭菌后的离心管中，使得单细胞混合悬液浸没单细胞配对的双层微井阵列芯片；其中，单细胞混合悬液中细胞浓度为10万/ml，单细胞混合悬液的加入量为5ml，单细胞混合悬液中细胞比例为1:1。
步骤4、将步骤3中加入单细胞混合悬液的离心管置于离心机中离心；其中，离心的离心力为400g；
步骤5、将步骤4离心后的单细胞配对的双层微井阵列芯片在无菌环境下取出，并用磷酸盐平衡生理盐水轻轻清洗1-2次，以洗去没有位于单细胞配对微井中的细胞；
对步骤5中清洗后的单细胞配对的双层微井阵列芯片进行显微观测；其结果如图4-6所示。从图4-5可以看出，本申请提供的单细胞配对的双层微井阵列芯片能够进行被动单细胞捕获/配对，同时，对本申请提供的单细胞配对的双层微井阵列芯片进行单细胞捕获和配对效率计算，计算公式为单细胞捕获效率＝被捕获的细胞总数/芯片单细胞配对微井总数，单细胞配对效率＝细胞配对的微井总数/芯片微井总数，经过计算得到本申请提供的单细胞配对的微井阵列芯片的单细胞捕获率可以高达61.0±2.4％，单细胞配对率可以高达42.4％。
进一步的，对本申请提供的单细胞配对的微井阵列芯片的细胞存活率进行计算，其结果如图6-7所示，计算公式为细胞存活率＝被捕获的活的细胞数量/被捕获的总的细胞数量，从图7可以看出，在不同浓度单细胞混合悬液和离心力下离心，本申请提供的单细胞配对的微井阵列芯片捕获的单细胞存活率均高于90.0％。
经过本实施例可以确定，本申请提供的单细胞配对的双层微井阵列芯片可以解决现有技术中单细胞捕获/配对效率、通量和细胞存活率有待提高的技术问题。
测试例2
本申请测试例2提供了实施例1单细胞配对的双层微井阵列芯片的测试例，用于测试单细胞配对的微井阵列芯片，在不同单细胞混合悬液浓度条件下进行单细胞捕获/配对的单细胞存活率，用于测试实施例1单细胞配对的双层微井阵列芯片的应用范围。
测试步骤参照测试例1，测试条件为400g的离心力、1、5、20、40万/ml的单细胞混合悬液测试条件下，实施例1所提供的单细胞配对的双层微井阵列芯片进行单细胞捕获/配对的后细胞的存活率，其结果参照附图7。
测试例3
本申请测试例3提供了实施例1单细胞配对的双层微井阵列芯片的测试例，用于测试单细胞配对的微井阵列芯片，在不同离心力条件下进行单细胞捕获/配对的单细胞存活率，用于测试实施例1单细胞配对的双层微井阵列芯片的应用范围。
测试步骤参照测试例1，测试条件为10万/ml的单细胞混合悬液浓度、100g、200g、600g和800g的离心力测试条件下，实施例1所提供的单细胞配对的双层微井阵列芯片进行单细胞捕获/配对的后细胞的存活率，其结果参照附图7。
从图7可以确定，本申请实施例1提供的单细胞配对的双层微井阵列芯片在上述不同的试验条件下进行单细胞配对，均能够保证非常高的细胞存活率，有利于后续单细胞共培养体系的建立。
以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
Claims (8)
1.一种单细胞配对的双层微井阵列芯片，其特征在于，包括微井单元；
所述微井单元包括微井；
所述微井单元为阵列结构；
所述微井为阵列结构；
所述微井包括两个单细胞配对微井和单细胞培养微井；
两个所述单细胞配对微井为分布在单细胞培养微井底面的空心圆柱体；
所述空心圆柱体的直径为20~30 μm，高度为20~25 μm；
所述单细胞配对微井为对角分布在单细胞培养微井底面的空心圆柱体；
所述单细胞培养微井为空心正四方体结构；
所述空心正四方体的边长为100~120 μm，高度为10~15 μm。
2.根据权利要求1所述的一种单细胞配对的双层微井阵列芯片，其特征在于，所述微井单元为10×10阵列结构；
所述微井为5×5阵列结构。
3.根据权利要求1所述的一种单细胞配对的双层微井阵列芯片，其特征在于，所述微井单元设置有编码。
4.根据权利要求3所述的一种单细胞配对的双层微井阵列芯片，其特征在于，所述编码设置在所述微井单元的第三行第三列。
5.根据权利要求1所述的一种单细胞配对的双层微井阵列芯片，其特征在于，相邻所述微井单元的间隔为190~250 μm，相邻所述微井间隔为50~80 μm。
6.根据权利要求1所述的一种单细胞配对的双层微井阵列芯片，其特征在于，所述微井阵列芯片为正方形，所述正方形的边长为1 cm。
7.权利要求1所述的一种单细胞配对的双层微井阵列芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将聚二甲基硅氧烷预聚体浇筑在单细胞配对的双层微井阵列芯片模具上，得到单细胞配对的双层微井阵列芯片预聚体；
步骤2、将单细胞配对的双层微井阵列芯片预聚体进行抽真空、干燥、脱模，得到单细胞配对的双层微井阵列芯片。
8.权利要求1-6任一项所述的一种单细胞配对的双层微井阵列芯片或权利要求7所述的制备方法制备得到的单细胞配对的双层微井阵列芯片在体外单细胞共培养中的应用。
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