CN115317476A - 木犀草素在制备特应性皮炎皮损治疗药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了木犀草素在制备特应性皮炎皮损治疗药物中的应用，木犀草素及其可药用衍生物可作为药物的唯一有效成分，通过抑制IL‑4、IL‑13、IL‑6、TNF‑α、IL‑17、p‑JAK2和p‑STAT3水平的升高来预防、缓解或治疗特应性皮炎皮损，对脾虚或胸腺不良病人比较友好，避免了糖皮质激素类药物对脾脏以及胸腺的损伤。

Description

木犀草素在制备特应性皮炎皮损治疗药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及木犀草素在制备特应性皮炎皮损治疗药物中的应用。

背景技术

木犀草素(luteolin)是一种天然食品类黄酮化合物，广泛存在于络石藤、野菊花、金银花等多种药用植物中，具有多种药理活性，如抗炎、抗氧化和抗过敏等，其毒副作用低，具有良好的临床应用前景。目前，木犀草素类药物常用于缓解各类皮炎的瘙痒症状。

特应性皮炎(Atopicdermatitis，AD)是一种慢性、复发性、炎症性皮肤疾病，由免疫系统、炎症介质、AD相关易感基因和多种环境因素相互作用所介导的免疫性疾病。AD影响全球15-20％的儿童和高达10％的成年人，以剧烈的持续性瘙痒和大面积皮肤损伤为主要临床表现，并导致睡眠障碍、抑郁等精神负担，严重影响患者的生活质量。目前，临床上治疗AD的药物主要为糖皮质激素和免疫抑制剂，疗效不佳且副作用大，例如，长期外用糖皮质激素类药物可出现局部皮肤萎缩变薄、毛细血管扩张、加重皮肤损伤、继发感染等不良反应。

因此，寻找毒副作用较小的皮损治疗药物是当下亟需解决的临床问题。

发明内容

申请人发现，木犀草素对特应性皮炎皮损症状具有显著的治疗效果，且对脏器的影响远小于临床上常用的地塞米松，具有良好的应用前景。

基于以上发现，本发明提供如下技术方案：

第一方面，本发明提供木犀草素及其可药用衍生物在制备用于预防、缓解或治疗特应性皮炎皮损症状的药物中的应用。

在上述技术方案的基础上，木犀草素及其可药用衍生物作为药物的主要有效成分，可结合其他有效成分进行特应性皮炎皮损症状治疗。更优选地，木犀草素或其可药用衍生物作为药物的唯一有效成分。

在上述技术方案的基础上，木犀草素或其可药用衍生物通过抑制IL-4、IL-13、IL-6、TNF-α、IL-17、p-JAK2和p-STAT3水平的升高来预防、缓解或治疗特应性皮炎皮损。

优选地，上述药物用于预防、缓解或治疗脾虚或胸腺不良病人的特应性皮炎皮损症状。

在上述技术方案的基础上，特应性皮炎由半抗原2,4-二硝基氟苯(DNFB)诱导而成。

在上述技术方案的基础上，药物为栓剂、软硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂、片剂、糖衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、丹剂、粉剂或注射剂。

在上述技术方案的基础上，药物包括重量分数为0.01％～0.8％的木犀草素或其可药用衍生物，余量为辅料和溶剂。优选地，药物包括重量分数为0.1％～0.5％的木犀草素或其可药用衍生物，余量为辅料和溶剂。

在上述技术方案的基础上，辅料为淀粉、山梨醇、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、硅衍生物、纤维素及其衍生物、明胶、甘油、滑石粉、碳酸钙、碳酸氢钙、蒸馏水、环糊精中的一种或几种的混合物。

第二方面，本发明提供木犀草素及其可药用衍生物在制备IL-4抑制剂中的应用。

第三方面，本发明提供木犀草素及其可药用衍生物在制备IL-6抑制剂中的应用。

第四方面，本发明提供木犀草素及其可药用衍生物在制备TNF-α抑制剂中的应用。

第五方面，本发明提供木犀草素及其可药用衍生物在制备IL-17抑制剂中的应用。

第六方面，本发明提供木犀草素及其可药用衍生物在制备p-JAK2抑制剂中的应用。

第七方面，本发明提供木犀草素及其可药用衍生物在制备p-STAT3抑制剂中的应用。

第八方面，本发明提供木犀草素及其可药用衍生物在制备IL-13抑制剂中的应用。

附图说明

附图用来提供对本申请技术方案的理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。

图1为木犀草素与AD的交集靶点韦恩(Venn)图；

图2为核心靶点的互作网络图；其中：

图2(A)为31个交集靶点的互作网络图；

图2(B)展示了根据“Degree”参数筛选得到的20个核心靶点；

图3为木犀草素治疗AD的KEGG富集分析气泡图；

图4展示了体内实验证实木犀草素能改善AD小鼠背部皮损情况；其中

图4(A)展示了造模第0、8、13d各组小鼠背部皮损代表性图片；

图4(B)展示了造模第0、8、13d各组小鼠皮损部位评分；

图5展示了木犀草素对AD小鼠皮损组织病理学的影响；其中：

图5(A)展示了苏木精和伊红(H&E)结果(200×；标尺＝100μm)，直线表示表皮厚度(μm)；

图5(B)展示了甲苯胺蓝(TB)染色结果(100×；标尺＝200μm)；

图5(C)展示了表皮厚度测量统计结果，每张皮肤切片随机选取3个区域测量；

图5(D)展示了总肥大细胞数量，每张皮肤切片随机选取3个区域测量；

图5(E)展示了脱颗粒肥大细胞数量，每张皮肤切片随机选取3个区域测量；

图6展示了木犀草素对AD小鼠脾脏指数的影响(100*g/g体重)；

图7展示了木犀草素改善AD小鼠皮肤屏障功能的影响；

图7(A)展示了造模第0、7和12d皮肤表面的TEWL(g/m²/h)结果；

图7(B)展示了皮损组织中FLG的免疫荧光染色结果；

图8展示了木犀草素对AD小鼠血清以及皮损皮肤中Th1/Th2相关细胞因子的影响；其中：

图8(A)展示了木犀草素对AD小鼠血清中IL-4的影响；

图8(B)展示了木犀草素对AD小鼠皮损皮肤中IL-4的影响；

图8(C)展示了木犀草素对AD小鼠血清中IL-13的影响；

图8(D)展示了木犀草素对AD小鼠皮损皮肤中IL-13的影响；

图8(E)展示了木犀草素对AD小鼠血清中IFN-γ的影响；

图8(F)展示了木犀草素对AD小鼠皮损皮肤中IFN-γ的影响；

图9展示了木犀草素对AD小鼠血清以及皮损皮肤中Th17相关细胞因子的影响；其中：

图9(A)展示了木犀草素对AD小鼠血清中IL-6的影响；

图9(B)展示了木犀草素对AD小鼠皮损皮肤中IL-6的影响；

图9(C)展示了木犀草素对AD小鼠血清中TNF-α的影响；

图9(D)展示了木犀草素对AD小鼠皮损皮肤中TNF-α的影响；

图9(E)展示了木犀草素对AD小鼠血清中IL-17的影响；

图9(F)展示了木犀草素对AD小鼠皮损皮肤中IL-17的影响；

图10展示了木犀草素对AD小鼠皮损皮肤中JAK2/STAT3信号通路的影响；其中：

图10(A)展示了AD小鼠皮损皮肤中p-JAK2的免疫组织化学染色结果；

图10(B)展示了AD小鼠皮损皮肤中p-STAT3的免疫组织化学染色结果；

图10(C)展示了p-JAK2和p-STAT3的平均光密度分析结果。

具体实施方式

本发明利用数据挖掘和网络药理学方法，将木犀草素靶标蛋白、AD相关靶标蛋白等信息构建成“化合物-靶点-疾病网络”、“PPI蛋白互作网络”以及“化合物-靶点-通路网络”，发现木犀草素靶标蛋白和AD相关靶标蛋白有重合，通过DNFB(2,4-二硝基氟苯)诱导的特应性皮炎动物模型验证了木犀草素具有治疗AD相关疾病的用途，发现木犀草素对特应性皮炎皮损症状具有显著的治疗效果，且对脏器的影响远小于临床上常用的地塞米松，具有良好的应用前景。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。

实施例1：网络药理学筛选潜在靶点和信号通路

1.木犀草素的潜在作用靶点搜集与筛选

搜索数据库，分别从中药系统药理学数据库与分析平台(简称TCMSP)、化学-蛋白质相互作用网络数据库(简称STITCH 4.0)和Swiss靶点预测数据库(简称SwissTargetPrediction)获得56个、10个和104个木犀草素的作用靶点，将这些潜在的作用靶点上传到全球蛋白质资源数据库(简称Uniprot)，选择物种为“Homo sapiens(人类)”，利用Uniprot数据库校正为官方标准化名称，即为“Gene symbol(基因符号)”，保留人源靶标蛋白，并删除重复项，最终得到151个潜在的木犀草素作用靶点。

2 AD疾病靶点的预测

以“Atopic Dermatitis(特应性皮炎)”为关键词，挖掘药物靶点数据库(简称TTD)、GeneCards以及DisGeNET数据库中与AD有关的潜在靶点。收集TTD中全部与AD有关的潜在靶点，获得52个潜在靶点基因；GeneCards数据库中以“Relevance score≥5”为筛选条件收集数据，获得潜在靶点443个；DisGeNET数据库中以“Gene-Disease Score≥0.05”为筛选条件收集数据，获得潜在靶点160个。最后将三个数据库中符合条件的检索结果进行合并，去除重复靶点，共获得553个与AD有关的潜在靶点。

3药物-疾病交集靶点确定

利用Venny 2.1.0工具绘制木犀草素作用靶点与AD有关的潜在靶点的Venn图，获取两者的交集靶点，如图1所示，交集靶点有31个，占潜在的木犀草素作用靶点的20.5％，占与AD有关的潜在靶点的5.61％。

4.蛋白之间互作网络(PPI)的构建及核心靶点的确定

将步骤(3)获取的31个交集靶点上传至STRING 11.0数据库，设定种属为“Homosapiens”，可靠指数节点选取≥0.7(High confidence)，其余参数为默认，获取交集靶点的高置信度交互作用关系。STRING11.0是一个预测蛋白质相互作用的功能蛋白关联数据库。根据不同的置信范围可生成不同的PPI网络，其中置信下限(low confidence)设置为：scores≥0.15；medium：≥0.4；high：≥0.7；highest：≥0.9。利用Cytoscape 3.9.0软件将“string_interactions.tsv”文件输出的PPI数据构建交集靶点的PPI网络图。

PPI网络共包含31个节点和259条边。“节点”代表木犀草素对抗AD的潜在靶点，“边”代表靶点之间的相互作用。CytoHubba和MCODE插件挖掘木犀草素抗AD的PPI网络核心靶点。其中，CytoHubba插件计算网络中的各节点的“Degree”值，选择“Degree”值最大的前20个靶点建立Hub基因网络。MCODE参数设置如下：度cutoff＝2，节点score cutoff＝0.2，K-score＝2，Max deapth＝100。对Cytohubba和MCODE的分析结果进行汇总，获得重叠基因，即为木犀草素抗AD的关键枢纽基因。由CytoHubba插件计算得到的度值是一个重要的拓扑属性，可以解释网络中最重要的节点。节点的大小和颜色趋势随“Degree”值的变化而变化。提取“Degree”值最高的前20个节点建立枢纽基因网络，包括MMP9、IL-6、TNF、IL-10、VEGFA、IL-4、ICAM1、MPO、MAPK1、IL-2、MAPK8、JUN、EGFR、PPARG、IFNG、MMP1、MMP2、CD40LG、NFKBIA、AHR(图2)。

5.潜在作用靶点的生物功能富集分析及其可视化

将步骤(3)获取的31个交集靶点上传至g:profiler在线数据库，并将交集靶点的Gene symbol转化为相应的Ensembl ID，导入OmicShare云平台进行KEGG通路分析。KEGG通路分析结果显示木犀草素抗AD的31个靶点主要富集于71条信号通路(Adjust P<0.01)。

为了进一步揭示木犀草素治疗AD的机制，利用OmicShare工具将AD相关的KEGG分析结果的前20名可视化。通过建立“化合物-靶点-通路”相互关系的网络文件以及属性文件，并且利用Cytoscape 3.9.0软件使其关系可视化。构建木犀草素、预测靶标以及根据KEGG通路富集分析结果所筛选出来的通路相互关系，并将其导入Cytoscape 3.9.0软件，绘制“化合物-靶点-通路”网络图，直观体现三者之间的关系。KEGG通路富集分析中，筛选出Adjust P(Q值)<0.05且与AD相关的前20条条目(按Q值大小排序)。图3中气泡大小代表该条通路上富集靶点基因的数目，气泡颜色深浅代表靶基因富集在该条通路上富集程度的高低。木犀草素抗AD的主要机制可能包括IL-17信号通路、T细胞受体信号通路、Th17细胞分化、TNF信号通路、Th1和Th2细胞分化、JAK/STAT信号通路等(根据Adjust P排序)。

实施例2：动物实验验证作用靶点和信号通路

1.动物造模

适应性饲养1周后，KM雌性小鼠，按体重随机分为5组，每组6只。分别为正常组(Normal)、AD模型组(Model)、0.2％木犀草素组、0.5％木犀草素组以及0.05％DEX(地塞米松)组，0.05％地塞米松为临床上常用药皮炎平软膏(30g:22.5mg醋酸地塞米松)中地塞米松的等效剂量。

AD小鼠造模方法：于实验前1天(Day 0)，采用电动剃须刀和6％硫化钠溶液剔除小鼠背部毛发，区域设定为3cm×3cm，5min后温水洗净残留硫化钠。实验第1天(Day 1)，在小鼠背部脱毛区域均匀外涂100μL 1.0％DNFB(2,4-二硝基氟苯，溶剂为丙酮：橄榄油＝3:1)溶液致敏，于第3天(Day3)加强致敏。随后采用0.5％DNFB溶液对小鼠背部脱毛区域进行局部激发，每周2次，持续2周。最后一次激发24h后，摘眼球取血以及颈椎处死小鼠，收集皮损组织及外周血标本。

表1

分组	DNFB干预	Day0-Day13经皮给药
			正常组	无干预	空白溶剂
AD模型组	连续干预14天	空白溶剂
			0.2％木犀草素组	连续干预14天	0.2％(g/mL)木犀草素
0.5％木犀草素组	连续干预14天	0.5％(g/mL)木犀草素
			0.05％DEX组	连续干预14天	0.05％(g/mL)地塞米松

各组给药方式均为经皮给药，给药剂量为100μL/只，1天给药1次，连续干预14天(Day 0-Day 13)。正常组和AD模型组经皮给药空白溶剂(由体积比为3:1的丙二醇和乙醇组成)，木犀草素组和DEX组分别经皮给药0.2％(g/mL)木犀草素、0.5％(g/mL)木犀草素、0.05％(g/mL)DEX，木犀草素和DEX的溶剂均由体积比为3:1的丙二醇和乙醇组成。造模前期、中期、后期分别对小鼠背部皮损进行拍照，并记录病情进展，并每隔一天监测各组小鼠死亡率、体重、食量、水量等情况。

2.评价木犀草素对AD小鼠皮损的影响

小鼠背部皮肤完成脱毛工作后，每周动态观察小鼠背部皮损状况，于造模第0、8、13d，对小鼠背部皮损部位进行半定量评分，参照临床表现标准来评价，具体如下：0分：无损伤；1分：轻度损伤；2分：中度损伤；3分及以上：严重损伤；损伤评价根据以下四种临床症状(1)红斑/出血；(2)渗出/结痂：(3)表皮剥落/糜烂；(4)干燥/脱屑。

结果发现：如图4(A)所示，实验第0天，各组小鼠背部皮肤无异常，皮肤表面细致滑嫩、质地柔软、皮肤纹理清晰可见。DNFB半抗原致敏1周后，AD模型组出现明显的皮损症状：第8天表现为红斑、点状出血、干燥及部分结痂现象；第13天，红斑现象减弱，结痂面积大幅度增加，且皮肤厚度明显增厚。结合红斑/出血、渗出/结痂、表皮剥落/糜烂、干燥/脱屑四种临床表现对各组小鼠背部皮损程度进行评分，与宏观图像观察结果保持一致，AD模型组小鼠于实验第8天起，皮损SCORAD评分显著性增加，0.5％木犀草素组以及0.05％DEX组皮损评分明显降低(p<0.05)。药物干预2周后，木犀草素剂量依赖地降低AD小鼠皮肤的SCORAD评分，0.5％木犀草素组小鼠皮损处的点状出血、红斑、干燥及结痂等症状几乎完全消退(图4A)，且效果优于0.05％DEX组。值得我们注意的是，随着试验周期的延长，与0.5％木犀草素组相比，0.05％DEX组的治疗局限性开始凸显，皮损程度反而加重，图4(B)展示的手持显微镜局部放大拍摄结果可进一步支持该结论。通过相机拍摄以及手持显微镜放大观察，我们发现局部应用0.5％木犀草并未改变正常小鼠背部脱毛部位皮肤外观状态，证明了0.5％木犀草治疗特应性皮炎的安全性。

3.评价AD小鼠皮肤屏障功能

临床上，AD患者受累皮肤和非受累皮肤均存在表皮屏障功能障碍，具体表现为皮肤水分流失、水分滞留减少。我们以经皮水分流失(Trans Epidermal Water Loss,TEWL)值直观评判AD小鼠皮肤屏障的变化。水分流失是指在体内非侵入性测量的角质层水分流失的值，我们于造模的第0、7、12天，使用经皮水分丢失仪测量每组每只小鼠背侧皮肤水分流失值。如图7(A)所示，造模第1周，DNFB致敏的皮肤即出现显著性的TEWL升高，一直持续到造模结束，与背部皮损变化一致(p<0.01，AD模型组[59.09±6.36]g/m2/hvs.正常组[8.74±1.45]g/m²/h)。造模结束后，与AD模型组相比，0.2％木犀草素降低DNFB导致的TEWL升高，但无明显差异。0.5％木犀草素组显著性地使皮损处TEWL值从(46.23±5.62)g/m²/h降低至(28.00±2.17)g/m²/h，明显恢复AD小鼠受损的皮肤屏障功能。阳性药0.05％DEX组TEWL值为(32.65±7.52)g/m²/h，显著性高于0.5％木犀草素组，皮肤屏障受损的修复程度明显弱于木犀草素，与背部皮损评分结果一致。

正常皮肤中丝聚蛋白(FLG)的降解产物是吸湿性天然保湿因子的组成部分，对皮肤的补水、pH值的维持和微生物的防御至关重要。采用免疫荧光测定AD小鼠皮损部位丝聚蛋白(filaggrin,FLG)的表达变化。根据皮肤标本的免疫荧光分析(图7(B))，正常小鼠皮肤中FLG的阳性反应明显，AD模型组小鼠皮损部位中FLG的表达被高度抑制，阳性表达的面积显著性减少(p<0.05)，而木犀草素显著性恢复皮损处FLG的表达。

4.AD小鼠组织病理学实验

肥大细胞是介导过敏性炎症反应发生的主要起始细胞之一。采用甲苯胺蓝对各组皮损处的肥大细胞进行染色，比较各组小鼠皮损中肥大细胞浸润以及脱颗粒的情况。具体操作如下：

随机剪取部分皮损处皮肤-80℃保存备用，皮肤圆片用4％甲醛溶液浸泡24h固定，常规石蜡包埋，4.5μm厚度连续切片，苏木精和伊红染色(H&E)观察表皮厚度和嗜酸性细胞浸染情况，甲苯胺蓝观察颗粒状和脱颗粒状肥大细胞总数。每张切片选取3-5个视野，ImageJ软件分别统计表皮厚度以及肥大细胞数量。

HE切片病理染色发现：与正常组相比，AD模型组小鼠皮肤中棘层细胞层数显著增加，导致表皮明显增厚(p<0.01，正常组[13.77±2.21]vs.AD模型组[90.47±11.56]μm)，且真皮层炎细胞浸润、毛细血管增生、扩张充血等现象明显(图5(A))。木犀草素组显著改善上述病理变化。

肥大细胞染色结果如图5(B)所示，与正常组相比，DNFB致敏后，总肥大细胞以及脱颗粒形态的肥大细胞显著增加(p<0.01，正常组[38.50±16.34]vs.AD模型组[130.33±28.84]，正常组[7.75±1.70]vs.AD模型组[58.67±2.12])。0.2％或者0.5％木犀草素干预后可以有效减少总肥大细胞以及脱颗粒肥大细胞的数量(p<0.01或p<0.05)。

5.AD模型小鼠Th1、Th2、Th17细胞因子含量测定

AD发病的核心免疫机制是Th2型免疫应答反应过度激活，Th1型免疫反应被抑制。有文献报道，Th2免疫细胞通过释放IL-4、IL-13、IL-5等细胞因子诱导IgE的合成以及皮肤中炎症细胞的浸润。为了探讨木犀草素的免疫调节作用，我们测定各组小鼠血清以及皮肤中与Th1/Th2免疫反应密切相关的细胞因子的表达水平，如IL-4、IFN-γ等，同时也是网络药理学预测的木犀草素抗AD的核心靶点。具体操作如下：

解剖当天，眼眶采全血，静置1h后于4℃离心机，3500rpm离心10min，收集上清即为血清，-20℃保存备用。精密称取小鼠背侧皮肤组织50-100mg，按其重量加入9倍体积的预冷生理盐水均质匀浆，12000rpm离心15min后收集上清液进行生化检测。ELISA试剂盒测检测血清和皮肤匀浆中IL-4、IL-13、IL-6、IL-17和TNF-α等细胞因子的水平。

结果显示：AD模型组小鼠血清中IL-4含量相对于正常组显著升高(p<0.05)，0.5％木犀草素组小鼠血清中IL-4含量相对AD模型组显著性降低(图8A)。木犀草素对于皮肤匀浆中IL-4水平的影响更为显著(图8B)。此外，木犀草素剂量依赖地降低皮肤中IL-13的水平(p<0.01)，虽然各组小鼠血清中IL-13水平未见差异(图8C、图8D)。Th1型免疫因子IFN-γ的表达增强可抑制IgE合成，Th2型细胞的分化及其细胞因子的分泌，进而有助于恢复AD患者血清以及皮肤中与Th1/Th2免疫反应的平衡。图8D、图8E结果表明，与AD模型组相比，0.5％木犀草素组小鼠皮肤中IFN-γ的水平显著提高(p<0.05，AD模型组[80.52±9.31]vs.0.5％木犀草素组[96.80±5.99])，虽轻微提高血清中IFN-γ的水平，但差别无统计学意义。

AD是主要Th2细胞介导的皮肤过敏炎症反应是公认的发病机制之一，但近几年Th17细胞的发现拓宽了对AD形成机制的认识。研究学者发现在AD患者慢性湿疹病变皮肤中也观察到了Th17细胞数量增加，IL-17是其分泌的主要效应因子。IL-6、TNF-α作为多功能的细胞因子，在炎症性疾病中发挥重要的作用，免疫学研究发现，IL-6是促进Th17分化的起始必要因子之一，参与了免疫调节的过程。网络药理学KEGG富集通路结果也显示，木犀草素最有可能调控IL17信号通路以及Th17细胞分化改善AD皮损症状。采用ELISA进一步检测各组小鼠血清以及皮肤中与Th17/IL-17信号轴密切相关的细胞因子，如IL-6、TNF-α以及IL-17的表达水平。如图9所示，相较于正常组，AD模型组小鼠血清的中IL-6以及TNF-α的水平显著提高了1.21和0.26倍(p<0.01)，IL-17血清含量升高，但统计上没有显著性差异(p>0.05)。对比AD模型组，木犀草素组小鼠血清中IL-6以及TNF-α含量下降明显(p<0.05)。而在皮肤匀浆中，AD模型组小鼠皮肤中IL-6、TNF-α以及IL-17水平升高明显，差异均有统计学意义(p<0.05)。木犀草素不同程度逆转该现象，其中高剂量木犀草素的作用最为显著。局部应用0.5％木犀草素于AD小鼠皮肤，皮损处IL-6的含量从(52.85±8.37)ng/μg降至(30.60±2.85)ng/μg，TNF-α含量从(309.59±43.77)pg/mg降至(186.22±23.59)pg/mg，IL-17的含量从(17.06±2.00)ng/μg降至(13.53±1.43)ng/μg。

6.AD小鼠皮损皮肤中p-JAK2和p-STAT3蛋白的检测

网络药理学分析结果表明，JAK/STAT信号通路是木犀草素缓解AD皮肤损伤的关键机制。我们以JAK2/STAT3信号通路为切入点，通过免疫组织化学染色检测背部皮损皮肤中p-JAK2和p-STAT3的蛋白质表达情况。具体操作如下：

小鼠皮肤石蜡切片置于60℃烤箱内熔蜡，然后进行二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水。组织切片置于盛满抗原修复缓冲液(pH6.0)中微波炉抗原修复30min，然后分别用p-JAK2和p-STAT3一抗和相对应的二抗进行孵育。二氨基联苯胺二氨基联苯胺(DAB)显色、苏木精复染，最后封片观察。

结果显示：与正常组相比，AD模型组皮肤活检石蜡切片中p-JAK2和p-STAT3的蛋白表达明显增加约1.36倍和1.40倍(p<0.01)，而木犀草素显著降低p-p-JAK2和p-STAT3水平的升高(p<0.05或p<0.01)。这表明，木犀草素可通过抑制JAK2/STAT3信号通路的活化改善AD皮肤炎症(图10)。

7.木犀草素对脏器指数和血液学指标的影响

脏器指数的结果显示，除机体的重要免疫器官—脾脏与胸腺之外，正常组、AD模型组以及木犀草素组各组间各器官系数无显著差异(表2)，表明木犀草素治疗安全性较高，无明显的毒副作用。脾脏，作为人体最大的外周免疫器官，在机体免疫防御功能起着重要的作用，也是B淋巴细胞的主要定居地。胸腺，则是机体的中枢免疫器官，是T细胞分化、发育、成熟的主要场所。脾以及胸腺肿大广泛被认为是免疫系统功能激活的表现。如表2、图6所示，AD模型组脾脏指数以及胸腺指数明显增加，符合过敏性疾病的特点(p<0.05)，0.5％木犀草素组以及0.05％DEX组能有效降低脾脏以及胸腺肿大(p<0.05)。值得注意的是，0.05％DEX组小鼠，脾脏和胸腺缩小至正常值以下，表现出糖皮质激素类药物强大的免疫抑制副作用。

表2木犀草素对AD小鼠各脏器指数的影响

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.木犀草素及其可药用衍生物在制备用于预防、缓解或治疗特应性皮炎皮损症状的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：木犀草素或其可药用衍生物作为IL-4、IL-13、IL-6、TNF-α、IL-17、p-JAK2和p-STAT3抑制剂在制备用于预防、缓解或治疗特应性皮炎皮损症状的药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物用于预防、缓解或治疗脾虚或胸腺不良病人的特应性皮炎皮损症状。

4.木犀草素及其可药用衍生物在制备IL-4抑制剂中的应用。

5.木犀草素及其可药用衍生物在制备IL-13抑制剂中的应用。

6.木犀草素及其可药用衍生物在制备IL-6抑制剂中的应用。

7.木犀草素及其可药用衍生物在制备TNF-α抑制剂中的应用。

8.木犀草素及其可药用衍生物在制备IL-17抑制剂中的应用。

9.木犀草素及其可药用衍生物在制备p-JAK2抑制剂中的应用。

10.木犀草素及其可药用衍生物在制备p-STAT3抑制剂中的应用。

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