CN115317437A - 一种基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针及其制备方法;所述基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针包括:水溶性高分子化合物作为可溶解微针基质,以及分散在可溶解微针基质中的装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料作为递送药物。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针及其制备方法,属于生物材料制造领域。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖(空腹血糖≥7.0mM,和/或餐后两小时血糖≥11.1mM)为特征的代谢紊乱。长期存在高血糖会导致诸多并发症,包括心脑血管、神经、足部、肾脏、眼部等病变,严重危害生命,孕妇或儿童患病还会影响青少年期成长发育,导致死亡率、发病率和卫生系统成本居高不下。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素,通过刺激肝脏和肌肉细胞吸收血液中的葡萄糖来调节血糖水平。胰岛素替代疗法仍是目前最主要的糖尿病治疗手段之一。然而,这种方法需要结合实时动态监测和皮下注射或输注胰岛素,任务十分繁重。每日多次注射短效胰岛素十分痛苦,而长效胰岛素效果缓慢,患者依从性差。且自我注射胰岛素容易控制不当剂量,有低血糖的风险。
采用非注射型递药方式递送胰岛素为提高生物利用度、无痛微创治疗提供了新的途径。其中经皮递药(Transdermal drug delivery,TDD)是指将药物穿过皮肤屏障经由皮肤吸收进入人体血液循环并达到有效血药浓度、实现疾病治疗或预防。在多种经皮递药的方法中,微针经皮技术最大的优势在于其能够在不伤及真皮和神经的前提下刺透阻碍药物吸收的最大障碍——表皮及其角质层。由于不接触神经,微针对表皮的刺穿不引起痛感。甚至对于表皮的微创来说,由于皮肤的可逆变形大于创伤,微针移去后数小时内可回复原状。而水溶性药物则可通过微针刺出的微米级通道有效地渗入到真皮内,进入全身血液循环。特别是对于大分子药物如多肽、蛋白和疫苗等,在采用常规经皮方法效果甚微的情况下,采用微针经皮给药技术,促进效果非常明显。微针是指由数十至数百根针长约50~900μm,针头约10~20μm的空心或实心针组成的贴片。可用于提取皮肤间质液进行血糖、核酸检测,如Sulaiman等人(ACS Nano,2019,13,8,9620–9628)利用水凝胶涂层微针微创取样并从皮肤组织间液中检测特定循环核酸。也可以用于递送细胞、纳米药物等,如Tang等人(ScienceAdvances,2018,4,11,9365)用微针集成心肌细胞治疗心肌梗死。
微针前期常用来直接负载胰岛素,如将胰岛素装载在针头,或使用溶胀微针吸收间质液再释放胰岛素,这样导致的问题是胰岛素剂量不准确,可能造成疗效不足或低血糖的危害。为了能够控制释放胰岛素,国内外研究人员们将响应型纳米材料与微针相结合。一种方法是通过葡萄糖与氧气产生的葡萄糖酸使pH值降低,如Xu等人(ACSBiomater.Sci.Eng.,2018,4,7,2473–2483)通过酸性环境下溶解的氧化锌量子点作为响应开关制备酸响应胰岛素释放装置。也可以通过苯硼酸和刀豆蛋白A与葡萄糖的结合使聚合物降解来制备纳米颗粒。然而,pH响应和苯硼酸结合法存在生理环境下即pH为7.4的时候,反应具有滞后性的问题,有低血糖的风险,刀豆蛋白A则具有毒性较大,生物相容性较差的缺点。
发明内容
针对这些问题,本发明的目的在于提供一种无痛微创、生物相容性好、生物利用度高、具有H2O2响应性能、制备过程简便快速、技术参数精确可控的胰岛素递送微针及其制备方法,具有重要的研究意义和推广价值。而且,与pH响应相比,H2O2响应不具有滞后性,反应迅速,效率高,更具有优势。
一方面,本发明提供了一种基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针,包括:水溶性高分子化合物作为可溶解微针基质,以及分散在可溶解微针基质中的装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料作为递送药物。
较佳的,所述胆红素基纳米材料为由亲水链段与脂溶性胆红素偶联并形成自组装体。
其中,胆红素是人胆汁中的主要色素。在生理pH下,胆红素是难溶于水的脂溶性物质。大量研究表明,胆红素作为一种有效的内源性抗氧化剂,在清除各种活性氧(ReactiveOxygen Species,ROS)方面发挥着关键作用,活性氧暴露可使脂溶性胆红素氧化为亲水性胆绿素,从而能够保护细胞和整个机体免受氧化应激介导的损伤。活性氧包括过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(·OH)等,高血糖患者体液内高浓度的葡萄糖可在葡萄糖氧化酶的催化下生成葡萄糖酸和H2O2,H2O2在pH逐渐下降的过程中易转化为羟基自由基。因此脂溶性胆红素一方面可以通过响应H2O2构建胰岛素递送系统,一方面可以清除H2O2产生的羟基自由基,减少机械损伤导致的炎症反应的发生,并且在抑制由糖尿病引发的炎症反应方面具有一定的潜力。
在本公开中,采用至少一种亲水链段与脂溶性胆红素偶联并形成自组装体,在其上负载胰岛素和葡萄糖氧化酶作为H2O2响应型纳米材料用于递送胰岛素,混入一种水溶性高分子化合物作为可溶解微针基质。其中,可溶解微针插入皮肤后溶解,装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料释放至真皮层,血液内高浓度的葡萄糖与O2在葡萄糖氧化酶的催化作用下产生H2O2。胆红素是一种有效的内源性抗氧化剂,可与H2O2快速发生反应使自组装体发生裂解,实现H2O2响应释放胰岛素。而且,微针可以直接打开在皮肤上打开微米级通道,控制释放胰岛素,有效提高了生物利用度。
较佳的,所述亲水链段选自为聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、壳聚糖中的至少一种;优选地,所述亲水链段分子量≥1000;更优选的,所述亲水链段中含有氨基。
较佳的,所述水溶性高分子化合物选自透明质酸、明胶、壳聚糖、海藻酸钠、葡聚糖(葡聚糖是指以葡萄糖为单糖组成的同型多糖)、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的至少一种。
较佳的,所述水溶性高分子化合物的分子量≥40000g·mol-1。
较佳的,所述胆红素基纳米材料用于负载递送药物胰岛素和葡萄糖氧化酶。
较佳的,所述装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料中胰岛素的负载量为5~25wt%;所述装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料中葡萄糖氧化酶的负载量为0.5~10wt%。
较佳的,所述装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料的粒径大小为10~300nm,优选为20~50nm。
较佳的,所述基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针中递送药物的总含量为1~10wt%。
较佳的,所述基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针中每个针头的针长为50~900μm,针尖宽为5~30μm;优选的,所述基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针中每个针头的针长为400~700μm,针尖宽为10~20μm。
较佳的,所述基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针(或称可溶解微针贴片)的面积为0.01~25cm2,针尖数量为4~200个·cm-2;优选的,所述基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针的面积为0.4~16cm2,针尖数量为100~200个·cm-2。
较佳的,所述基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针的机械强度为16~40N,优选为16~28N。
另一方面,本发明还提供了一种制备基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针的制备方法,包括:
(1)将亲水链段与脂溶性胆红素偶联并形成自组装体,并在其上负载胰岛素和葡萄糖氧化酶,得到装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料;
(2)将基于胆红素的纳米材料分散在水溶性高分子化合物溶液中,得到混合溶液;
(3)将所得混合溶液置于微针模具中并置于真空环境中,利用真空环境下的负压力将混合溶液压至微针针头,然后放于干燥阴凉处静置成型,最后脱模,得到所述基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针。
在本发明中,以装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料作为H2O2响应释放胰岛素材料,混入具有良好可塑性的水溶性高分子化合物溶液作为微针基质,真空加压将基质导入微针模具以此通过模板法进行批量、稳定的制备。具体来说,将一种亲水链段与脂溶性胆红素偶联形成两亲性分子链,从而在溶剂中产生自组装得到具有空腔的结构体,使得胰岛素和葡萄糖氧化酶装载于空腔中。然后,再将装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料和水溶性高分子化合物的混合溶液作为微针基质,置于具有不同微针尺寸、微针大小、针尖数量、针尖形状等微针模具中,放置于真空环境中,负压使溶液填满针尖,一定时间后取出平稳放置于干燥阴凉处静置使溶液凝固成型。该微针制备技术可实现制备过程简便快速的优点,更为便捷,不需要真空太久也不需要冷冻条件。
较佳的,步骤(1)中,所述脂溶性胆红素与亲水链段的质量比为10~80mg:80mg;所述脂溶性胆红素与胰岛素的质量比为2~50mg:1mg;所述胰岛素与葡萄糖氧化酶的质量比为1~20mg:1mg。
较佳的,步骤(2)中,所述装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料和水溶性高分子化合物的质量比为1mg:10~100mg;所述混合溶液的混合方式为搅拌,搅拌时间为5~60分钟;优选的,搅拌在弱光下进行,以提前除去水溶性高分子化合物溶液中的O2,更大程度地保留胆红素的效用。
较佳的,步骤(2)中,所述水溶性高分子化合物溶液的浓度为100~1000mg·mL-1,优选为400~900mg·mL-1。本发明通过调控水溶性高分子化合物溶液的浓度来实现微针部分性能的调控。若是浓度过低,微针可塑性下降,变薄易碎,机械强度降低;若是浓度过高,不利于基于胆红素的纳米材料在水溶性高分子化合物溶液中均匀分散,微针效用降低。
较佳的,所述微针模具置于真空度为-0.05MPa的环境下10~60分钟,取出后置于干燥箱干燥;干燥成型的时间为6~48小时;优选的,在真空度为-0.05MPa的环境下放置10~60分钟后后再继续抽真空,保持1~5分钟后取出于干燥箱干燥,可以更大程度地去除微针基质中的空气,得到气泡更少、针尖形状更饱满、外观更平整的可溶解微针贴片。
较佳的,所述微针模具为聚二甲基硅氧烷模具。
有益效果
本发明中,所得基于胆红素纳米材料通过对高血糖患者体液内高葡萄糖的智能响应,利用胆红素与葡萄糖氧化酶催化葡萄糖产生的H2O2之间的快速氧化还原反应,实现了类似人工胰腺的闭环胰岛素输送系统,实现了自我调节的胰岛素输送。在血糖浓度升高时释放胰岛素,并在正常范围内调节血糖水平,从而降低了低血糖的风险。同时材料的生物安全性和相容性好,对正常细胞无明显毒副作用。
本发明中,所得可降解微针机械强度为16~28N,针长为400~700μm,可以有效刺穿角质层到达真皮层,促进胰岛素释放并且被真皮层内丰富的毛细血管吸收,通过人体血液循环系统抵达全身。因此,使用微针作为递药方式,可以提高胰岛素生物利用度,通过维持恒定的血药浓度增加疗效,达到长期缓释给药和控制给药量的效果,而且可根据需要随时给药或中止给药。微针经皮递药避免了患者长期多次注射皮下注射的痛苦,可以大幅提高患者的生活质量。
本发明中,所得基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针可以长期保存,有效提高了胆红素基纳米材料的稳定性和保质期。同时,可溶解微针制备技术产量高,制备工艺简单、可重复性强,因此适用于工业化大规模生产。
附图说明
图1为实施例1的装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料透射电镜图,从图中可知纳米材料直径约50nm;
图2为实施例1的装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料放置于高浓度葡萄糖溶液24h后的透射电镜图,从图中可知24h后纳米材料发生裂解;
图3为实施例1的胆红素基纳米材料的核磁共振氢谱图,从图中可分析得到胆红素的特征氢谱峰和酰胺的特征氢谱峰均有出现,说明胆红素基纳米材料的成功合成;
图4为实施例1的可溶解微针的数码照片图,从图中可知微针呈四面锥状,针尖完整无损,排列有序;
图5为实施例1的可溶解微针的扫描电镜图,从图中可知微针针长约为450μm,针尖约为3μm;
图6为实施例4的装载有异硫氰酸荧光素标记的胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料的可溶解微针的激光扫描共聚焦显微镜三维结构图,从图中可知胰岛素均匀分布在微针针尖;
图7为实施例1中的胆红素基纳米材料和装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料的体外细胞毒性图,从图中可知在给定的纳米颗粒浓度条件下细胞生存率均大于95%,证明该材料生物安全性良好;
图8为实施例1中的基于胆红素纳米材料的异硫氰酸荧光素标记的胰岛素递送微针分别浸泡于不同浓度的葡萄糖溶液中,利用荧光法测试体外胰岛素释放。从图中可知微针在400mg·dL-1葡萄糖溶液内胰岛素累积释放率可达80%,在100mg·dL-1葡萄糖溶液内胰岛素累积释放率为30%,在0mg·dL-1葡萄糖溶液内胰岛素累积释放率为15%,证明基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针可在高血糖环境内有效释放胰岛素;
图9为对实施例1中的胆红素基纳米材料清除自由基能力的评估分析图,在不同的组分溶液内加入等量的2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(自由基引发剂),通过2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐荧光探针检测自由基的产生。胆红素和聚乙二醇化胆红素均可以完全清除产生的自由基。证明胆红素基纳米材料能够清除葡萄糖氧化酶过度催化产生多余的H2O2后形成的羟基自由基,减少机械损伤导致的炎症反应,并且在抑制由糖尿病引发的炎症反应方面具有一定的潜力。
具体实施方式
以下通过下述实施方式进一步说明本发明,应理解,下述实施方式仅用于说明本发明,而非限制本发明。
针对现有技术中胰岛素每日输注痛苦、pH响应释放滞后、毒性较大等技术问题,本发明首次选用具有H2O2响应功能的脂溶性胆红素接枝至少一种亲水链段用于负载胰岛素和葡萄糖氧化酶(作为递送药物),选用水溶性高分子化合物作为无痛经皮递送方式的基质,最终得到一种基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针。其中,微针是指由数十至数百根的空心针或实心针组成的皮肤贴片。本发明中,基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针也可称为可溶性微针贴片。本发明,选用“选用亲水链段和脂溶性胆红素偶联形成的自组装体”作为载体,对于胰岛素和葡萄糖氧化酶的释放。本专利使用的材料为H2O2响应,较于pH响应不具有滞后性,反应更为迅速,灵敏性得到提高,可规避低血糖的风险。本专利使用了脂溶性小分子药物胆红素,其响应产物胆绿素是内源性生物活性材料,即指人类和哺乳动物体内天然存在的具有生理功能和生物学活性的物质,因此其具有更高的生物相容性。
在可选的实施方式中,亲水链段包括但不限于聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、壳聚糖等。
在可选的实施方式中,所述水溶性高分子化合物选自透明质酸、明胶、壳聚糖、海藻酸钠、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物等中的至少一种。
在可选的实施方式中,所述装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料的粒径大小为10~300nm;优选为20~50nm。
在可选的实施方式中,所述可溶解微针针长可为50~900μm,针尖宽可为5~30μm;优选的,所述可溶解微针针长可为400~700μm,针尖宽可为10~20μm。所述可溶解微针贴片面积可为0.01~25cm2,针尖数量可为4~200个/cm2。优选,所述可溶解微针贴片面积为0.4~16cm2,针尖数量为100~200个·cm-2。
在可选的实施方式中,用万能试验机测得所述可溶解微针机械强度可为16~40N;优选的,所述可溶解微针机械强度可为16~28N。
在可选的实施方式中,所述装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料中胰岛素的负载量可为5~25wt%;葡萄糖氧化酶的负载量可为0.5~10wt%。
在本发明的一实施方式中,通过模板法实现了可智能响应递送胰岛素的可溶解微针的制备。该制备方法条件简单,快捷易行产量高,适用于大规模生产。以胆红素基纳米材料作为胰岛素载体,示例性地说明可智能响应递送胰岛素的可溶解微针的制备方法。
将胰岛素与葡萄糖氧化酶与胆红素基纳米材料混合,得到装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料。其中,混合的方式可为磁力搅拌、薄膜水合、微量泵注射等。混合的温度可为25~37℃。胆红素与胰岛素的质量比为2~50:1mg,胰岛素与葡萄糖氧化酶的质量比为1~20:1mg。作为一个详细的示例,将含有胰岛素和葡萄糖氧化酶的磷酸盐缓冲溶液加入到含有胆红素基纳米材料的薄膜中,在室温下超声,再经透析、冷冻和干燥,得到载药胆红素基纳米材料。本专利所选用的脂溶性小分子材料胆红素具有快速响应活性氧的功能,活性氧不止包括H2O2,还包括容易引起炎症反应的羟基自由基,本专利使用的亲水链段和脂溶性胆红素偶联形成的自组装体具有与胆红素相似的活性氧清除能力。如图9所示,在不同的组分溶液内加入等量的AAPH(自由基引发剂),通过DCFH-DA荧光探针检测自由基的产生。胆红素和聚乙二醇化胆红素均可以完全清除产生的自由基。
利用水溶性高分子化合物作为微针基质,通过模板法得到可降解微针。在本发明中,微针模具可购买商品化成品,也可自行制备。只要保证选用的模具平整无损、方便使用即可。
将装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料和水溶性高分子化合物按一定质量比搅拌均匀,得到混合溶液,用于作为基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针基质。在微针制备过程中,使用抽真空装置,在真空加压的辅助下实现了可溶解微针快速、批量制备,该载药胆红素基纳米颗粒均匀地分布在微针针尖。在微针制备过程中,温度一般为室温,例如25~30℃,优选25℃。该制备条件温和、制备工艺简单易操作。
在可选的实施方式中,所述微针模具置于真空度为-0.05MPa的环境下10~60分钟,取出后置于干燥箱干燥;干燥成型的时间为6~48小时;优选的,在真空度为-0.05MPa的环境下放置10~60分钟后后再继续抽真空,保持1~5分钟后取出于干燥箱干燥。
在可选的实施方式中,混合溶液中的水溶性高分子化合物溶液的浓度可为100~1000mg·mL-1,优选为400~900mg·mL-1。
在本发明中,基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针稳定性高,可长期保存。刺入皮肤后快速溶解释放装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料,该材料具有智能响应释放胰岛素的功能,可用于经皮递送胰岛素,无痛微创,提高患者依从性,降低低血糖的风险,具有广阔的应用前景。
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解,以下实施例只用于对本发明进行进一步说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例,即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择,而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
将58.5mg胆红素、23mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于2mL二甲基亚砜中,避光搅拌30min,得到羧基活化后的胆红素。向羧基活化后的胆红素溶液中添加甲氧基聚乙二醇胺的二甲基亚砜溶液(1mL,80mg·mL-1)和30μL三乙胺溶液,在避光氮气环境中搅拌4h。向反应后溶液添加10mL氯仿,分别用0.01M的盐酸、碳酸氢钠溶液萃取后进行旋蒸,得到粗产物(未除去过量胆红素的聚乙二醇化胆红素)。将所得粗产物溶于20mL甲醇中,离心收集上清液,取4mL进行旋蒸,得到产物聚乙二醇化胆红素PEG-BR。所得PEG-BR溶于添加了5mg胰岛素和2mg葡萄糖氧化酶的磷酸盐溶液中,水浴超声15min,超声破碎机超声15min。选用截留分子量为12000g·mol-1的透析膜,在超纯水中透析提纯,最后冷冻干燥得到棕黄色粉末,即为装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料IG@PEG-BR。所述装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料中胰岛素的负载量为14.4wt%,葡萄糖氧化酶的负载量为9.6wt%。
取80mg载药纳米材料粉末加入4g聚乙烯吡咯烷酮溶液(800mg·mL-1,Mw44000~54000g·mol-1)中,搅拌均匀,得到含有IG@PEG-BR的聚乙烯吡咯烷酮悬浮液。在微针模具内逐滴加入悬浮液,液面呈圆拱形。将模具水平放入真空装置内,抽真空至真空度保持为-0.05MPa,停留30min。之后再次抽真空,持续5min后停止。取出微针模具置于干燥通风处静置24h,即可脱模,取出微针后避光保存。所得基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针机械强度为23N。所述基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针中递送药物的总含量为2wt%。
实施例2
将58.5mg胆红素、23mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于2mL二甲基亚砜中,避光搅拌30min,得到羧基活化后的胆红素。向羧基活化后的胆红素溶液中添加甲氧基聚乙二醇胺的二甲基亚砜溶液(1mL,80mg·mL-1)和30μL三乙胺溶液,在避光氮气环境中搅拌4h。向反应后溶液添加10mL氯仿,分别用0.01M的盐酸、碳酸氢钠溶液萃取后进行旋蒸,得到粗产物(未除去过量胆红素的聚乙二醇化胆红素)。将所得粗产物溶于20mL甲醇中,离心收集上清液,取4mL进行旋蒸,得到产物聚乙二醇化胆红素PEG-BR。将所得PEG-BR溶于添加了5mg胰岛素和2mg葡萄糖氧化酶的磷酸盐溶液中,水浴超声15min,超声破碎机超声15min。选用截留分子量为12000g·mol-1的透析膜,在超纯水中透析提纯,最后冷冻干燥得到棕黄色粉末,即为装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料IG@PEG-BR。所述装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料中胰岛素的负载量为12.6wt%,葡萄糖氧化酶的负载量为9.2wt%。
取80mg载药纳米材料粉末加入4g聚乙烯吡咯烷酮溶液(600mg·mL-1,Mw44000~54000g·mol-1)中,搅拌均匀,得到含有IG@PEG-BR的聚乙烯吡咯烷酮悬浮液。在微针模具内逐滴加入悬浮液,液面呈圆拱形。将模具水平放入真空装置内,抽真空至真空度保持为-0.05MPa,停留30min。之后再次抽真空,持续5min后停止。取出微针模具置于干燥通风处静置24h,即可脱模,取出微针后避光保存。所得微针机械强度为18N。所述基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针中递送药物的总含量为2wt%。
实施例3
将58.5mg胆红素、23mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于2mL二甲基亚砜中,避光搅拌30min,得到羧基活化后的胆红素。向羧基活化后的胆红素溶液中添加甲氧基聚乙二醇胺的二甲基亚砜溶液(1mL,80mg·mL-1)和30μL三乙胺溶液,在避光氮气环境中搅拌4h。向反应后溶液添加10mL氯仿,分别用0.01M的盐酸、碳酸氢钠溶液萃取后进行旋蒸,得到粗产物(未除去过量胆红素的聚乙二醇化胆红素)。将所得粗产物溶于20mL甲醇中,离心收集上清液,取4mL进行旋蒸,得到产物聚乙二醇化胆红素PEG-BR。将所得PEG-BR溶于添加了5mg胰岛素和2mg葡萄糖氧化酶的磷酸盐溶液中,水浴超声15min,超声破碎机超声15min。选用截留分子量为12000g·mol-1的透析膜,在超纯水中透析提纯,最后冷冻干燥得到棕黄色粉末,即为装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料IG@PEG-BR。所述装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料中胰岛素的负载量为13.4wt%,葡萄糖氧化酶的负载量为9.5wt%。
取80mg载药纳米材料粉末加入4g聚乙烯吡咯烷酮溶液(400mg·mL-1,Mw44000~54000g·mol-1)中,搅拌均匀,得到含有IG@PEG-BR的聚乙烯吡咯烷酮悬浮液。在微针模具内逐滴加入悬浮液,液面呈圆拱形。将模具水平放入真空装置内,抽真空至真空度保持为-0.05MPa,停留30min。之后再次抽真空,持续5min后停止。取出微针模具置于干燥通风处静置24h,即可脱模,取出微针后避光保存。所得微针机械强度为9N。所述基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针中递送药物的总含量为2wt%。
实施例4
将58.5mg胆红素、23mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于2mL二甲基亚砜中,避光搅拌30min,得到羧基活化后的胆红素。向羧基活化后的胆红素溶液中添加甲氧基聚乙二醇胺的二甲基亚砜溶液(1mL,80mg·mL-1)和30μL三乙胺溶液,在避光氮气环境中搅拌4h。向反应后溶液添加10mL氯仿,分别用0.01M的盐酸、碳酸氢钠溶液萃取后进行旋蒸,得到粗产物(未除去过量胆红素的聚乙二醇化胆红素)。将所得粗产物溶于20mL甲醇中,离心收集上清液,取4mL进行旋蒸,得到产物聚乙二醇化胆红素PEG-BR。将所得PEG-BR溶于添加了5mg用异硫氰酸荧光素标记的胰岛素和2mg葡萄糖氧化酶的磷酸盐溶液中,水浴超声15min,超声破碎机超声15min。选用截留分子量为12000g·mol-1的透析膜,在超纯水中透析提纯,最后冷冻干燥得到棕黄色粉末,即为装载有异硫氰酸荧光素标记的胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料FITC-IG@PEG-BR。所述装载有异硫氰酸荧光素标记的胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料中胰岛素的负载量为15.3wt%,葡萄糖氧化酶的负载量为8.9wt%。
取80mg载药纳米材料粉末加入4g聚乙烯吡咯烷酮溶液(800mg·mL-1,Mw44000~54000g·mol-1)中,搅拌均匀,得到含有FITC-IG@PEG-BR的聚乙烯吡咯烷酮悬浮液。在微针模具内逐滴加入悬浮液,直至铺满针尖与基底,液面呈圆拱形。将模具水平放入真空装置内,抽真空至真空度保持为-0.05MPa,停留30min。之后再次抽真空,持续5min后停止。取出微针模具置于干燥通风处静置24h,即可脱模,取出微针后避光保存。所得基于胆红素纳米材料的异硫氰酸荧光素标记的胰岛素递送微针机械强度为23N。所述基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针中递送药物的总含量为2wt%。
实施例5
将58.5mg胆红素、23mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于2mL二甲基亚砜中,避光搅拌30min,得到羧基活化后的胆红素。向羧基活化后的胆红素溶液中添加甲氧基聚乙二醇胺的二甲基亚砜溶液(1mL,80mg·mL-1)和30μL三乙胺溶液,在避光氮气环境中搅拌4h。向反应后溶液添加10mL氯仿,分别用0.01M的盐酸、碳酸氢钠溶液萃取后进行旋蒸,得到粗产物(未除去过量胆红素的聚乙二醇化胆红素)。将所得粗产物溶于20mL甲醇中,离心收集上清液,取4mL进行旋蒸,得到产物聚乙二醇化胆红素PEG-BR。将所得PEG-BR溶于添加了5mg胰岛素和2mg葡萄糖氧化酶的磷酸盐溶液中,水浴超声15min,超声破碎机超声15min。选用截留分子量为12000g·mol-1的透析膜,在超纯水中透析提纯,最后冷冻干燥得到棕黄色粉末,即为装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料IG@PEG-BR。所述装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料中胰岛素的负载量为10.5wt%,葡萄糖氧化酶的负载量为8.5wt%。
取80mg载药纳米材料粉末加入4g聚乙烯吡咯烷酮溶液(800mg·mL-1,Mw44000~54000g·mol-1)中,搅拌均匀,得到含有IG@PEG-BR的聚乙烯吡咯烷酮悬浮液。在微针模具内逐滴加入悬浮液,直至铺满针尖与基底,液面呈圆拱形。将模具水平放入真空装置内,抽真空至真空度保持为-0.05MPa,停留30min。取出微针模具置于干燥通风处静置24h,即可脱模,取出微针后避光保存。由于抽真空强度不够,导致悬浮液内残留气泡较多,上浮过程中挤压悬浮液,占用针尖和基底空间,使得所得微针表面气泡较多,针尖不完整。
效果实施例1
将实施例1的装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料IG@PEG-BR和小鼠表皮成纤维细胞共孵育24小时,然后利用CCK-8法测定细胞存活率。测试过程为:在96孔板中配制100μL的细胞悬液,将培养板放在培养箱预培养24小时(37℃,5%CO2)。然后向培养板加入10μL不同浓度的待测物质,并在培养箱孵育一段24小时。随后向每孔加入10μLCCK-8溶液,继续在培养箱内孵育2小时。最后用酶标仪测定在450nm处的吸光度,分析得到图7结果。证明载药胆红素基纳米材料安全性良好。
效果实施例2
将实施例1的基于胆红素纳米材料的异硫氰酸荧光素标记的胰岛素递送微针分别浸泡于不同浓度的葡萄糖溶液中,利用荧光法测试体外胰岛素释放。测试过程为:将微针放入截留分子量为12000g·mol-1的透析膜内,分别浸泡于浓度为0、100、400mg·dL-1的葡萄糖溶液中,溶剂为pH=7.4的磷酸盐缓冲液,37℃摇床振荡。分别于0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、9.0、12.0、24.0小时取出2mL液体用荧光光谱测定其在520nm处的荧光强度(激发光为480nm),并补加2mL对应缓冲液。分析得到图8结果,可知微针在400mg·dL-1葡萄糖溶液内胰岛素累积释放率可达80%,证明基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针可在高血糖环境内有效释放胰岛素。
效果实施例3
将实施例1的胆红素基纳米材料PEG-BR加入含有2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(自由基引发剂)的PBS溶液中,利用2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐荧光探针检测1小时内自由基的产生。测试过程为:分别将胆红素(50mM)、甲氧基聚乙二醇胺(1mg·mL-1)、PEG-BR(1mg·mL-1)分别加入5mL含有2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(1mM)的PBS溶液(pH=7.4)中,设置一组空白对照,搅拌均匀后加入2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(50μM),37℃摇床振荡。分别于0、5、10、15、20、30、40、50、60分钟取出2mL液体用荧光光谱测定其在520nm处的荧光强度(激发光为490nm)。分析得到图9结果,可知PEG-BR在60分钟内完全清除了产生的自由基,证明胆红素基纳米材料抗氧化能力强,可以减少细胞产生氧化应激的风险和机械损伤导致的炎症反应的发生,并且可以用在抑制由糖尿病引发的炎症反应方面。
Claims (15)
1.一种基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针,其特征在于,包括:水溶性高分子化合物作为可溶解微针基质,以及分散在可溶解微针基质中的装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料作为递送药物。
2.根据权利要求1所述的基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针,其特征在于,所述胆红素基纳米材料为由亲水链段与脂溶性胆红素偶联并形成自组装体;所述亲水链段选自为聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、壳聚糖中的至少一种;优选地,所述亲水链段分子量≥1000;更优选的,所述亲水链段中含有氨基;
所述水溶性高分子化合物选自透明质酸、明胶、壳聚糖、海藻酸钠、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的至少一种;优选地,所述水溶性高分子化合物的分子量≥40000 g·mol-1。
3.根据权利要求1或2所述的基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针,其特征在于,所述
胆红素基纳米材料用于负载递送药物胰岛素和葡萄糖氧化酶。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针,其特征在于,所述装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料中胰岛素的负载量为5~25wt%;所述装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料中葡萄糖氧化酶的负载量为0.5~10 wt%。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针,其特征在于,所述装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料的粒径大小为10~300 nm,优选为20~50 nm。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针,其特征在于,所述基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针中递送药物的总含量为1~10 wt%。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针,其特征在于,所述基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针中每个针头的针长为50~900μm,针尖宽为5~30μm;优选的,所述基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针中每个针头的针长为400~700μm,针尖宽为10~20μm。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针,其特征在于,所述基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针的面积为0.01~25 cm2,针尖数量为4~200个·cm-2;优选的,所述基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针的面积为0.4~16 cm2,针尖数量为100~200个·cm-2。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针,其特征在于,所述基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针的机械强度为16~40 N,优选为16~28N。
10.一种制备权利要求1-9中任一项所述的基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针的制备方法,其特征在于,包括:
(1)将亲水链段与脂溶性性胆红素偶联并形成自组装体,并在其上负载胰岛素和葡萄糖氧化酶,得到装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料;
(2)将基于胆红素的纳米材料分散在水溶性高分子化合物溶液中,得到混合溶液;
(3)将所得混合溶液置于微针模具中并置于真空环境中,利用真空环境下的负压力将混合溶液压至微针针头,然后放于干燥阴凉处静置成型,最后脱模,得到所述基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针。
11.根据权利要求10所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述脂溶性胆红素与亲水链段的质量比为10~80 mg : 80 mg;所述脂溶性胆红素与胰岛素的质量比为2~50 mg:1 mg;所述胰岛素与葡萄糖氧化酶的质量比为1~20 mg : 1 mg。
12.根据权利要求10或11所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述装载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的胆红素基纳米材料和水溶性高分子化合物的质量比为1 mg:10~100mg;所述混合溶液的混合方式为搅拌,搅拌时间为5~60分钟;优选的,搅拌在弱光下进行,以提前除去水溶性高分子化合物溶液中的O2,更大程度地保留胆红素的效用。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述水溶性高分子化合物溶液的浓度为100~1000 mg·mL-1,优选为400~900 mg·mL-1。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的制备方法,其特征在于,所述微针模具置于真空度为-0.05 MPa的环境下10~60分钟,取出后置于干燥箱干燥;干燥成型的时间为6~48小时;优选的,在真空度为-0.05 MPa的环境下放置10~60分钟后后再继续抽真空,保持1~5分钟后取出于干燥箱干燥。
15.根据权利要求10-14中任一项所述的制备方法,其特征在于,所述微针模具为聚二甲基硅氧烷模具。
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