CN115300668B - 鲳鱼骨来源双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物陶瓷材料和生物医用材料领域，具体是一种鲳鱼骨来源双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料，是以鲳鱼脊椎骨为原料，经过去除有机质、高温煅烧、灭菌和功能性修饰步骤制备得到的保留天然三维孔隙结构，拥有较高孔隙率，主要成分由羟基磷灰石(HA)和β‑磷酸三钙(β‑TCP)组成的多孔骨支架材料。本发明原料来源丰富，成本低，制备过程保留了鲳鱼脊椎骨特有的天然多孔三维结构，拥有较高的孔隙率，孔径大小和孔隙率适宜细胞的黏附生长和增殖，并以表面功能性修饰的方法增加了材料的细胞黏附能力，可以作为良好的骨支架材料应用于临床骨缺损的修复。
Description
技术领域
本发明涉及生物陶瓷材料和生物医用材料领域，具体地说，是一种鲳鱼骨来源双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料及其制备方法与应用。
背景技术
异种天然骨作为临床常用的骨移植材料，常用猪、牛等哺乳动物的松质或密质骨通过化学工艺脱脂、脱细胞、脱蛋白处理，或者高温煅烧去除免疫原性物质，最终成品多数是成分单一的羟基磷灰石(HA)。HA作为植入材料的主要作用是提升材料生物相容性和骨传导性，可增强人成骨细胞的附着、生长和增殖。HA在化学上非常稳定，在植入机体后不能降解，而这可能致使骨变形，并导致HA骨替代物周围骨折风险的增加。与HA相反，另一种磷酸钙类材料，β-磷酸三钙(β-TCP)是可吸收的，很容易被新骨取代。它的溶解度接近骨矿物质的溶解度，因此，β-TCP在生理条件下不能溶解，但通常会被破骨细胞吸收。除了骨传导能力，一些研究表明β-TCP具有很高的骨诱导潜能。同时含有HA和β-TCP的BCP陶瓷材料通过更好地控制生物活性和生物降解性，在促进骨生长的同时保证了生物材料的稳定性，比其他类型的磷酸钙类生物陶瓷有着显著的优势。
发明人在前期研究中发明了一种简便可行，制备成本低，无需人工添加化合物便可制备出纯度较高的HA/β-TCP双相磷酸钙陶瓷的方法，且该方法可以通过控制制备过程中的煅烧温度来改变羟基磷灰石和β-磷酸三钙的含量，生成的陶瓷骨支架材料还含有少量的碳酸化羟基磷灰石以及与人体骨含量相接近的镁、钾、锶等多种微量元素，并且整理后将论文发表于Ceramics International，第43卷，第12213-12220页，论文题目为“Thepreparation and characterization of HA/β-TCP biphasic ceramics from fishbones”，但在材料的应用探究过程中，由于鱼种的影响或是材料表面光滑，微形貌复杂，材料的细胞黏附性能差，缺乏成骨性能的评估。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鲳鱼骨来源双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料及其制备方法与应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明工艺流程为：鲳鱼骨→去除有机质→高温煅烧→灭菌→功能性修饰。
本发明是以鲳鱼脊椎骨为原料，其无机成分主要为以低结晶度羟基磷灰石(HA)为主的骨盐，图3为鲳鱼骨的X光粉末衍射图。首先将鲳鱼骨经过去离子水反复煮沸，去除肉眼可见有机质，烘干后放入马弗炉中高温煅烧，煅烧过后的鱼骨通过检测即为含有羟基磷灰石(HA)和磷酸三钙(β-TCP)的化合物。进一步经过灭菌消毒，功能性修饰，即可利用鱼骨天然孔隙结构制备成双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料。
本发明的第一方面，提供一种鲳鱼骨来源双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料的制备方法，包括以下步骤：
A、去除有机质：鲳鱼脊椎骨在去离子水中煮沸2小时，剔除肉眼可见有机质，重复3次，去离子水再次冲洗后在干燥箱中65℃烘干；
B、高温煅烧：将清洗干燥后的鲑鱼脊椎骨置于马弗炉中，在800-1100℃空气气氛中煅烧1小时，得到含双相磷酸钙成分煅烧骨；
C、灭菌：将步骤B中所得骨支架材料分装后用压力蒸汽灭菌器126℃，30min灭菌后干燥保存；
D、功能性修饰：将步骤C中所得骨支架材料用0.2mg/ml Sulfo-SANPAH蛋白交联剂浸泡，紫外照射10min，吸出交联剂后紫外再照射1min，之后用1：100稀释的Hepes溶液清洗3次，最后用1：50稀释的Matrigel基质胶37℃孵育3h。
进一步的，所述的步骤B中马弗炉的升温速率控制在5℃/分钟，煅烧时间控制在2小时，自然降至室温。升温速率过快或者煅烧时间过长会改变双相磷酸钙骨支架材料的HA和β-TCP含量比例。
进一步的，所述的步骤B中高温煅烧温度控制在800-1000℃，改变煅烧的温度会影响双相磷酸钙骨支架材料的羟基磷灰石(HA)和β-磷酸三钙(β-TCP)含量比例，低于800℃的煅烧温度将不能有效去除鱼骨内有机物质且生成的无机相仅有羟基磷灰石，无β-TCP产生。随着煅烧温度的升高，β-磷酸三钙在双相磷酸钙骨支架材料中的含量也升高，但高于1000℃的煅烧温度将导致碳酸化羟基磷灰石成分完全分解，同时过高的煅烧温度还会陶瓷材料结晶度的升高和晶粒尺寸的变化而影响降解速率，纳米级的微孔结构也会发生改变从而造成孔隙率的下降，从而改变煅烧出陶瓷的孔隙率和比表面积等关键物理参数，不利于支架材料和细胞的结合。优选900℃。在所有煅烧体系中，900℃左右为最佳温度，因为在此煅烧温度下产生的BCP有机物基本去除、保留部分碳酸化羟基磷灰石、β-TCP含量高、具有天然均匀的孔隙结构、晶粒大部分处于纳米级。
进一步的，所述的步骤C中将煅烧后的骨支架材料在去离子水中冲洗3遍，去除多余粉尘，而后用压力蒸汽灭菌器126℃，30min灭菌，最后在65℃恒温干燥箱中烘干。
进一步的，所述的步骤D中骨支架材料功能性修饰后可直接用于细胞培养或体内移植。
本发明的第二方面，提供一种采用如上所述的制备方法制备得到的鲳鱼骨来源双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料。所述的骨支架材料是以鲳鱼脊椎骨为原料，经过去除有机质、高温煅烧、灭菌和功能性修饰步骤制备得到的保留天然三维孔隙结构，拥有较高孔隙率，主要成分由羟基磷灰石(HA)和β-磷酸三钙(β-TCP)组成的多孔骨支架材料。
进一步的，所述的骨支架材料的主要物相为羟基磷灰石(HA，Ca10(PO4)6(OH)10)的质量含量百分比为68-72％，β-磷酸三钙(β-TCP，Ca3(PO4)2)的质量含量百分比为28-32％；微量元素钾、镁、锶的质量百分比为0.01-1.19％，同时还含有少量的碳酸化羟基磷灰石。
进一步的，所述的骨支架材料具有天然多孔连通结构，同时具备大孔、微孔和连接孔结构，孔隙大小分布集中于45-340um和0.09-0.22um。
本发明的第三方面，提供一种如上所述的骨支架材料在制备骨缺损修复材料中的应用。
本发明优点在于：
1、原料来源丰富，制备过程无需添加任何化学原料，只需要将煅烧温度控制在800-1000℃即可制备出含有相对含量为68-72％的HA和28-32％的β-TCP的双相磷酸钙陶瓷材料，并可以通过控制制备过程中的煅烧温度来改变HA和β-TCP的含量。所述骨支架材料同时含有少量的碳酸化羟基磷灰石和与人体骨含量相接近的镁、钾、锶等多种微量元素。
2、制备过程保留了鲳鱼脊椎骨特有的天然多孔三维结构，拥有较高的孔隙率，孔径大小和孔隙率适宜细胞的黏附生长和增殖，并以表面功能性修饰的方法增加了材料的细胞黏附能力，可以作为良好的骨支架材料应用于临床骨缺损的修复。
3、本发明的制备方法简便可行，成本低，适用于大规模生产。通过该方法制备出的双相磷酸钙陶瓷骨支架材料HA和β-TCP含量高，成分较纯，其余杂质少，无需经过二次处理去除其余杂质。
附图说明
图1.本发明的鲳鱼骨来源骨支架材料外观图。
图2.本发明的鲳鱼骨来源骨支架材料电子显微镜结果图，可见材料具有大小不等的孔隙结构以及随温度增加的晶粒大小。
图3.本发明的鲳鱼骨来源骨支架材料X光粉末衍射结果，图中可见HA和β-TCP的特征衍射峰，证实材料具有HA/β-TCP双相磷酸钙成分，煅烧温度800℃以下材料只有HA而无β-TCP，图中“β”指代β-TCP特征衍射峰。
图4.本发明的鲳鱼骨来源骨支架材料的傅里叶红外光谱图，图中可见HA主要官能团PO4 3-和OH-的特征吸收峰，图中“β”指代β-TCP特征吸收峰。
图5.900℃煅烧后本发明的鲳鱼骨来源骨支架材料的孔径分布，孔隙大小分布集中于45-340um和0.09-0.22um。
图6.人骨髓间充质干细胞负载于煅烧后鲳鱼骨来源骨支架材料和商品Bio-Oss的扫描电镜图。
图7.动物实验四周后的苏木精伊红染色图像。
图8.使用Image J软件对新生骨痂的定量分析。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：本发明的鲳鱼骨来源骨支架材料的制备
原材料：鲳鱼鱼骨100g，鲳鱼，英文学名：Butterfish，产地：中国，浙江。
去除有机质：将鱼骨放入去离子水中煮沸2小时，剔除肉眼可见有机质，去离子水冲洗，重复此步骤3次。将清洗干净的鱼骨放入65℃恒温干燥箱中干燥24h，去除多余水分。
高温煅烧：将干燥后鱼骨放入马弗炉，升温速率控制在5℃/分钟，高温煅烧温度控制在800-1000℃，煅烧时间控制在2小时，自然降至室温，最后得到46.9g煅烧鱼骨。
灭菌：骨支架材料分装后用压力蒸汽灭菌器126℃，30min灭菌，而后65℃烘箱干燥3天。
功能性修饰：将灭菌后的骨支架材料用0.2mg/ml Sulfo-SANPAH蛋白交联剂浸泡，紫外照射10min，吸出交联剂后紫外再照射1min，之后用1：100稀释的Hepes溶液清洗3次，最后用1：50稀释的Matrigel基质胶37℃孵育3h。
实施例2：本发明的鲳鱼骨来源骨支架材料的成分组成、孔隙结构分析和孔隙率测定
实施例1制得的骨支架材料为白色的多孔支架材料，如图1所示。使用扫描电子显微镜对其微观结构进行分析，发现材料具备45-340um大小不等且相互连通的孔隙结构，如图2所示，这样的结构有利于细胞的长入和营养运输。为了了解骨支架材料的成分组成，采用X射线衍射(XRD)和傅里叶变换红外光谱(FTIR)对材料进行分析。
采用X射线衍射对实施例1制备的骨支架材料进行成分分析的方法如下：将制备好的颗粒状骨支架材料经过玛瑙研钵中反复研磨成均匀细粉，压片，上机检测，设定参数为铜靶，电压40kV，电流120mA，扫描角度10°-90°，扫描速度4°/min，每步0.03°，结果如图3。根据绝热法，若系统中存在N个相，则其中X相的质量分数为：
根据样品中每相的K值(即RIR值)和衍射强度I，可计算样品中各物相的质量分数。作为特例，样品中有两相A，B，其RIR都可查。则：WB＝1-WA。由此计算得出800℃煅烧后HA/β-TCP为68.5/31.5，900℃煅烧后HA/β-TCP为66.1/33.9，1000℃煅烧后HA/β-TCP为72.0/28.03。实验重复三次。
采用傅里叶变换红外光谱对实施例1制得的骨支架材料进行成分分析的方法如下：将制备好的颗粒状骨支架材料经过玛瑙研钵中反复研磨成均匀细粉，KBr压片，放入红外光谱仪扫描，扫描波段为4000cm-1到400cm-1。结果如图4所示。
采用压汞仪对实施例1的骨支架材料进行孔隙率和孔隙分布测定，结果显示骨支架材料孔隙率为75.92％，孔隙大小分布集中于45-340um和0.09-0.22um。结果如图5所示。
实施例3：本发明的鲳鱼骨来源骨支架材料细胞黏附能力，体内成骨性能测定
将人骨髓间充质干细胞负载于实施例1制得的修饰后的骨支架材料和商品Bio-Oss骨粉上，培养14天后，固定，临界干燥法干燥，喷金后采用扫描电镜对其进行观察。结果如图6所示。
图6结果显示，所有材料均具有密集的hBMSCs粘附，hBMSCs生长良好，伪足突起，呈星形附着于材料，同时材料的孔隙中也可见hBMSCs及其伪足。
选择700℃和900℃煅烧后鲳鱼骨作为植入骨支架，采用大鼠股骨缺损模型，植入骨支架材料和Bio-Oss进行对照，4周后处死，取出股骨，固定，切片，苏木精伊红染色。结果如图7所示。
图7结果显示，手术后4周，对照组和各实验组单层皮质骨缺损均得到不同程度的修复，7+C、9+C和B+C组与对照组相比，材料周围明显有更多的新生骨痂形成，并且在骨髓腔内连接成块状，骨传导性较好。与Bio-Oss松质骨小颗粒相比，煅烧后的鲳鱼骨具有更多的孔隙结构和大量的新生骨痂形成。
根据组织学染色图像，使用Image J软件对新生骨痂进行定量分析，结果如图8所示。
图8结果显示，手术后4周，各实验组新生骨痂量相较对照组均有统计学意义的增加，7+C组新生骨痂量明显少于B+C组，7+C组新生骨痂量明显少于9+C组，9+C组与B+C组新生骨痂量比较，差异无统计学意义。总体而言，组织学定量分析表明，含BCP成分的煅烧后鲳鱼骨成骨性能明显优于仅含HA的煅烧后鲳鱼骨，并且与临床实践中最常用的商业骨粉无统计学差异。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (8)
1.一种鲳鱼骨来源双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、去除有机质：鲳鱼脊椎骨在去离子水中煮沸2小时，剔除肉眼可见有机质，重复3次，去离子水再次冲洗后在干燥箱中65℃烘干；
B、高温煅烧：将清洗干燥后的鲑鱼脊椎骨置于马弗炉中，在800-1100℃空气气氛中煅烧1小时，得到含双相磷酸钙成分煅烧骨；
C、灭菌：将步骤B中所得骨支架材料分装后用压力蒸汽灭菌器126℃，30min灭菌后干燥保存；
D、功能性修饰：将步骤C中所得骨支架材料用0.2mg/ml Sulfo-SANPAH蛋白交联剂浸泡，紫外照射10min，吸出交联剂后紫外再照射1min，之后用1：100稀释的Hepes溶液清洗3次，最后用1：50稀释的Matrigel基质胶37℃孵育3h。
2.根据权利要求1所述的骨支架材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤B中马弗炉的升温速率控制在5℃/分钟，煅烧时间控制在2小时，自然降至室温。
3.根据权利要求1所述的骨支架材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤B中高温煅烧温度控制在800-1000℃。
4.根据权利要求1所述的骨支架材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤C中将煅烧后的骨支架材料在去离子水中冲洗3遍，去除多余粉尘，而后用压力蒸汽灭菌器126℃，30min灭菌，最后在65℃恒温干燥箱中烘干。
5.根据权利要求1所述的骨支架材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤D中骨支架材料功能性修饰后直接用于细胞培养或体内移植。
6.一种采用如权利要求1-5任一所述的制备方法制备得到的鲳鱼骨来源双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料，其特征在于，所述的骨支架材料主要成分为羟基磷灰石和β-磷酸三钙；羟基磷灰石的质量含量百分比为68-72％，β-磷酸三钙的质量含量百分比为28-32％；微量元素钾、镁、锶的质量百分比为0.01-1.19％，同时还含有少量的碳酸化羟基磷灰石。
7.根据权利要求6所述的骨支架材料，其特征在于，所述的骨支架材料具有天然多孔连通结构，同时具备大孔、微孔和连接孔结构，孔隙大小分布集中于45-340um和0.09-0.22um。
8.一种如权利要求6或7所述的骨支架材料在制备骨缺损修复材料中的应用。
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