CN115300453B - 一种含氯霉素纳米粒的眼用温敏凝胶及其制备方法 - Google Patents

一种含氯霉素纳米粒的眼用温敏凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种含有包载氯霉素的壳聚糖纳米粒的眼用温敏凝胶剂及其制备方法。采用壳聚糖为载体材料、三聚磷酸钠为交联剂，用壳聚糖与三聚磷酸钠通过阴阳离子静电作用自发形成纳米粒，将氯霉素包封于壳聚糖纳米粒网络结构中，从而实现了对水溶性低分子量药物氯霉素的缓释，可延长药物作用时间，减少给药次数，增强药效，降低药物毒副作用，并提高其抗菌稳定性。

Description

一种含氯霉素纳米粒的眼用温敏凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及药剂学技术领域，尤其涉及一种眼用温敏凝胶及其制备方法。
背景技术
氯霉素(chloramphenicol)又名氯胺苯醇、左霉素，可与细菌细胞合成蛋白质的主要细胞成分——70S核糖体进行可逆结合，被认为是抑菌性抗生素，其对革兰氏阳性、阴性细菌均有抑制作用，且对后者的作用较强。以氯霉素为主要成分的滴眼液，主要用于治疗由大肠杆菌、流感嗜血杆菌、克雷伯菌属、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌和其他敏感菌所致的眼部感染，如沙眼、结膜炎、角膜炎、眼睑缘炎等。
纳米给药系统具有减少急性毒性、克服耐药性、提高药物生物利用度等优势。一个理想的纳米载药载体应该具有良好的生物相容性和生物可降解性，壳聚糖是由甲壳素脱乙酰基后的产物，是自然界中唯一的碱性多糖，因其本身成分具有安全、无毒、低危险、高度稳定、亲水性以及有害物易被人体降解等优良的特性，通常作为一种载体材料来制备药物纳米粒。它表面的正电荷与眼部粘膜上的负电荷发生静电作用可以有效地延长药物在眼内的滞留时间以及促进药物透过角膜。利用壳聚糖制备的纳米粒粒径在95～200nm之间，具有良好的缓释效果，适用于眼部给药。因此壳聚糖作为载体制备的纳米粒在眼部给药系统应用中有广阔的前景。
目前，临床上使用的眼用制剂通常为药物溶液或膏剂，滴眼剂通常存在停留时间短、生物利用度低等问题，需要频繁给药，对患者造成较大的不便。原位凝胶药物递送系统是以溶液状态给药后，立即在用药部位发生相转变，形成非化学交联的半固体制剂，可以长时间与作用部位发生紧密接触，提高药物利用率。目前研究较多的眼用原位凝胶为温度触发型和pH触发型，温度触发型凝胶一般对眼的刺激性更小，其在室温状态下为低粘度的溶胶，在眼部达到临界温度后会迅速变为凝胶状态，对眼表具有较高的亲和力，从而延长药物作用时间，提高药物利用率。现有氯霉素滴眼剂存在眼部滞留时间短等问题，研发一种含氯霉素的原位凝胶制剂用于眼部感染具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的缺陷与不足，提供一种可以延长眼部作用时间，增加患者眼部用药的依从性的氯霉素壳聚糖纳米粒的温敏凝胶剂及其制备方法。本发明的凝胶剂以构建的氯霉素壳聚糖纳米粒为药物储库，控制氯霉素的释放；再将氯霉素壳聚糖纳米粒组装到温敏凝胶之中，不仅提高了药物在眼部的滞留时间，而且还使得氯霉素的抗菌作用快速发挥，同时控制药物释放，增加药物的吸收和利用。
一方面，本发明提供了一种含有氯霉素壳聚糖纳米粒的眼用温敏凝胶，所述眼用温敏凝胶包括氯霉素壳聚糖纳米粒和温敏凝胶基质制备而成，所述的氯霉素壳聚糖纳米粒包括壳聚糖、交联剂和氯霉素，所述温敏凝胶基质由泊洛沙姆制备而成。
在一个实施方式中，所述交联剂为三聚磷酸钠。
在一个实施方式中，所述壳聚糖浓度为0.4-1.2mg/mL，所述三聚磷酸钠的浓度为0.3-1.0mg/mL，所述氯霉素的浓度为0.3-1.5mg/mL。
另一方面，本发明提供一种包载氯霉素的壳聚糖纳米粒的温敏凝胶的制备方法，包括：(1)制备氯霉素壳聚糖纳米粒；(2)制备温敏凝胶基质；(3)将氯霉素壳聚糖纳米粒与温敏凝胶基质混合后制备所述眼用温敏凝胶。
在一个实施方式中，上述步骤(1)可以通过以下方式实现：
(i)壳聚糖溶解于乙酸溶液中，滴加氢氧化钠调节pH，用0.45μm孔径的滤膜过滤制成壳聚糖溶液；(ii)将氯霉素溶解于10％乙醇溶液中制成氯霉素溶液；(iii)将三聚磷酸钠溶解于去离子水中制成三聚磷酸钠溶液；(iv)在磁力搅拌机搅拌下，将氯霉素溶液缓慢滴加入壳聚糖溶液中，搅拌一段时间后，再缓慢滴加三聚磷酸钠溶液，进行搅拌，超声即制得分散的氯霉素壳聚糖纳米粒。
在一个实施方式中，所用的壳聚糖的分子量为10Kda，壳聚糖的脱乙酰度为90％。
在一个实施方式中，所述壳聚糖的浓度为0.4-1.2mg/mL；优选地，为0.4-0.8mg/mL；优选地，为0.5mg/mL；即每100ml乙酸溶液中加入壳聚糖的质量为40mg-120mg；优选地，为40mg-80mg；优选地，为50mg；所述乙酸溶液浓度为1％-3％；优选地，为1％；所述pH为4.0-6.0；优选地，为4.5-5.0；优选地，为4.8。
在一个实施方式中，所述氯霉素的浓度为0.4-1.4mg/mL，优选地，所述为0.4-1.2mg/mL，优选地，为1.2mg/mL，即每100mL 10％乙醇溶液中加入氯霉素的质量为40mg-140mg，优选地，为40mg-120mg，优选地，为120mg。
在一个实施方式中，所述三聚磷酸钠的浓度为0.4-1.0mg/mL，优选地，为0.5mg/mL。
在一个实施方式中，所述磁力搅拌的转速为300-1000r/min；优选地，为450-600r/min；优选地，为550r/min；所述将氯霉素溶液缓慢滴加入壳聚糖溶液后搅拌时间为30-120min；优选地，为60min-90min；优选地，为60min；所述加入三聚磷酸钠后搅拌时间为60-120min，优选地，为120min；所述搅拌后超声时间为3min-5min；优选地，为3min。
在一个实施方式中，所述氯霉素壳聚糖纳米粒中的氯霉素质量分数为0.1％-0.5％。
在一个实施方式中，所述温敏凝胶基质包括泊洛沙姆、生理盐水、苯扎溴铵和去离子水，所述泊洛沙姆包括泊洛沙姆407和伯洛沙姆188，所述生理盐水作为渗透压调节剂，所述苯扎溴铵作为抑菌剂，浓度为0.03％。
在一个实施方式中，所述泊洛沙姆407的质量分数为16％-24％；优选地，为20.5％-21.0％。
在一个实施方式中，所述伯洛沙姆188的质量分数为1％-10％；优选地，为5％-6％。
在一个实施方式中，所述温敏凝胶基质的制备按照下述方法制备而成：
(1)将所述泊洛沙姆407加入去离子水中，搅拌放入冰箱冷藏直至完全溶胀；
(2)将所述泊洛沙姆188加入去离子水中，搅拌室温放置直至完全溶胀；
(3)在上述步骤(1)处理后的泊洛沙姆407中加入步骤(2)所述泊洛沙姆188，同时与生理盐水、苯扎溴铵和去离子水，搅拌混匀，即得空白温敏凝胶载体，即温敏凝胶基质。
在一个实施方式中，所述冰箱冷藏温度为2-5℃。
在一个实施方式中，上述步骤(3)中所述泊洛沙姆407和泊洛沙姆188混合在冰水浴中进行，防止伯洛沙姆407凝固。
进一步，所述包载氯霉素的壳聚糖纳米粒的温敏凝胶的制备方法还包括氯霉素壳聚糖纳米粒超滤浓缩后与温敏凝胶基质混合的步骤。
在一个实施方式中，所述眼用温敏凝胶测定凝胶相变温度的方法为倒置法，所述倒置法包括以下步骤：
(1)微量移液器量取1mL温敏凝胶至玻璃试管中置于低温水浴中，保持样品上层距离水浴液面下2cm，使水浴缓慢恒速持续升温；
(2)在水浴温度达到设定温度时，将样品放在液面中恒温3min后取出，倾斜试管，当测试样品刚好由流动态转变为非流动态的温度即为凝胶相变温度T1。
(3)制备人工模拟泪液，量取1mL凝胶基质，按人工模拟泪液：眼用温敏凝胶＝7:40的量向所述眼用温敏凝胶中滴入所述人工模拟泪液，同等条件下重复上述测量操作得凝胶相变温度T2。
进一步，上述步骤(1)所述低温水浴的初始温度T0约18℃，升温梯度为0.5℃/次。
进一步，上述步骤(3)所述人工模拟泪液的组成成分包括每升去离子水中含2.18g碳酸氢钠，6.78g氯化钠，0.084g二水氯化钙和1.38g氯化钾。
另一方面，本发明还提供了一种眼用温敏凝胶在制备眼用制剂中的用途，所述眼用温敏凝胶的制备方法包括(1)制备氯霉素壳聚糖纳米粒；(2)制备温敏凝胶基质；(3)将氯霉素壳聚糖纳米粒与温敏凝胶基质混合制备所述眼用温敏凝胶。
在一个实施方式中，所述眼用制剂的剂型为液体制剂或膏体或胶体或凝胶剂。
进一步，所述眼用制剂的剂型为凝胶剂，所述凝胶剂为乳胶剂、胶浆剂或混悬型凝胶剂。
本发明的有益效果是：采用壳聚糖为载体材料、三聚磷酸钠为交联剂，两者通过阴阳离子静电作用自发形成纳米粒，将氯霉素包封于经交联的壳聚糖纳米粒网络结构中，从而实现了对水溶性低分子量药物氯霉素的缓。本发明所述温敏凝胶剂在33℃以下呈流动的液体状态，在眼表温度下发生相突变，形成原位凝胶，均匀分布黏附于眼部，成为药物的缓释储库，本发明的氯霉素壳聚糖纳米粒温敏型原位凝胶与常规的氯霉素温敏型原位凝胶、氯霉素壳聚糖纳米粒、和氯霉素水溶液相比，释药速率更加缓慢，前4h累计释药率仅为50％，有效释放时间高达18h，相较于氯霉素滴眼液延长了14h，提高生物利用度，可延长药物作用时间，增强药效，降低药物的毒副作用，并提高其抗菌稳定性。
附图说明
图1.氯霉素壳聚糖纳米粒的粒度分布图。
图2.氯霉素壳聚糖纳米粒的ζ电位图。
图3.氯霉素壳聚糖纳米粒扫描电镜照片。
图4.氯霉素壳聚糖纳米粒温敏凝胶在25℃和37℃的形态。
图5.氯霉素壳聚糖纳米粒抑菌圈结果图，图5A试验菌为金黄色葡萄球菌、图5B试验菌为大肠杆菌、图5C试验菌为铜绿假单胞菌、图5D为抑菌圈直径图。
图6.胶凝温度为36℃的氯霉素壳聚糖纳米粒温敏凝胶体外释放结果情况图。
图7.给药后家兔眼部滞留的荧光图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1：制备包载氯霉素的壳聚糖纳米颗粒(CHL-CS-NPs)
1、制备包载氯霉素的壳聚糖纳米颗粒的方法
(1)将分子量为10kDa、脱乙酰度为90％的壳聚糖50mg溶于100ml质量百分浓度为1％的醋酸水溶液中，室温磁力搅拌60min，搅拌速度为800r/mi n，滴加1mM的氢氧化钠水溶液调节pH为4.8，并用0.45μm孔径的滤膜过滤，制得0.5mg/mL壳聚糖溶液；
(2)将120mg的氯霉素溶于100ml 10％乙醇溶液中配制成浓度为1.2mg/mL的氯霉素溶液；
(3)将50mg三聚磷酸钠的溶于100mL超纯水中配制成浓度为0.5mg/mL的三聚磷酸钠溶液；
(4)精确量取5mL氯霉素溶液加入至20mL上述壳聚糖溶液，室温磁力搅拌60min，再缓慢滴加2mL上述三聚磷酸钠水溶液，使三聚磷酸钠与壳聚糖通过阴阳离子静电作用自发形成载药纳米粒，继续室温磁力搅拌120min，搅拌速度为550r/min，超声3min(超声3s，暂停3s，共30个循环)，即得分散的包载氯霉素的壳聚糖纳米颗粒(CHL-CS-NPs)。
2、对获得的包载氯霉素的壳聚糖纳米颗粒的表征进行测定：
(1)粒径大小和电位测定
取氯霉素壳聚糖纳米粒制剂的胶体溶液倒入测试容器中，利用粒度分析仪和电位测定仪分别测定其平均粒径及电位大小，粒径分布如图1所示，氯霉素壳聚糖纳米粒的平均粒径为110nm左右，粒径分布峰值为80nm左右，多分散指数为0.260；电位分布图如图2所示，Zeta电位为23.3mV。
(2)外观形态观察
取氯霉素壳聚糖纳米粒制剂的胶体溶液，滴于镀膜的电镜铜网上，晾干后，置于扫描电镜下观察纳米粒的外观形态，拍照，结果如图3所示。从图3可以看出，本发明包载氯霉素的壳聚糖纳米粒粒子的大小均匀，形态相似，分布均匀。
(3)包封率、载药量的测定
采用优化工艺制备出包载氯霉素的壳聚糖纳米粒(CHL-CS-NPs)之后，高速离心20min(4℃，12000rpm)多次，收集每次离心后的上清液，通过紫外分光光度计测定在特定波长吸光度，带入氯霉素浓度标准曲线得出上清液中未包埋的氯霉素含量，根据以下公式得出包封率和载药量。
包封率＝(氯霉素投入量-上清液中氯霉素含量)/氯霉素投入量×100％
载药量＝(氯霉素投入量-上清液中氯霉素含量)/壳聚糖投入量×100％
3、氯霉素标准曲线的制备
精密量取氯霉素对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL，用去离子水稀释，得到一系列对照品溶液。以纯化水为空白，在278nm波长处测定吸光度，以氯霉素对照品溶液浓度C(μg·mL－1)为横坐标，以吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，得出标准曲线回归方程：
A＝0.0289x+0.0194，R2＝0.997
上述结果显示，采用离子交联法制备的包载氯霉素的壳聚糖纳米粒外观呈圆球形或近圆球形，氯霉素壳聚糖纳米粒的平均粒径为110nm左右，zeta电位为23.3mV，多分散指数为0.260，说明粒径分布较窄，粒径大小均匀；纳米粒的包封率为82.76％，载药量为38.30％。
实施例2：制备氯霉素壳聚糖纳米粒-温敏凝胶
1、氯霉素壳聚糖纳米粒-温敏凝胶的制备
(1)称取15g泊洛沙姆407和25mL去离子水，将伯洛沙姆407边搅拌边加入去离子水中，放入冰箱冷藏12-24h直至完全溶胀，制得质量分数为37.5％的伯洛沙姆407备用；
(2)称取4g泊洛沙姆188和6mL去离子水，将伯洛沙姆188边搅拌边加入去离子水中，室温放置直至完全溶胀，制得质量分数为40％的伯洛沙姆407备用；
(3)称取步骤(1)中泊洛沙姆407 5.476g中加入步骤(2)所述泊洛沙姆188 1.25g、90mg氯化钠和3mg苯扎溴铵，加去离子水至总质量10g，冰水浴下搅拌混匀，即得空白温敏凝胶载体，称为温敏凝胶基质，其中伯洛沙姆407的质量分数为20.5％，伯洛沙姆188的质量分数为5.0％；
(4)将实例1中制备的包载氯霉素的壳聚糖纳米颗粒用10KD超滤管进行浓缩至氯霉素质量分数为0.25％，与步骤(3)所述空白温敏凝胶载体混合，即得氯霉素壳聚糖纳米粒-温敏凝胶。
2、凝胶相变温度的测定
测定凝胶相变温度采用倒置法，倒置法包括以下步骤：
(1)微量移液器量取1mL温敏凝胶至EP管中置于恒温水浴中，保持样品上层距离水浴液面下2cm，使水浴缓慢恒速持续升温。具体的，恒温水浴中初始温度T0为18℃，升温梯度为0.5℃/次。
(2)在水浴温度达到设定温度时，将样品放在液面中恒温3min后取出，倾斜试管，当测试样品刚好由流动态转变为非流动态的温度即为凝胶相变温度T1。
(3)制备人工模拟泪液，量取1mL凝胶基质，按人工模拟泪液：眼用温敏凝胶＝7:40的量，向眼用温敏凝胶中滴入人工模拟泪液，同等条件下重复步骤(2)操作得凝胶相变温度T2。人工模拟泪液的组成成分包括每升去离子水中含2.18g碳酸氢钠，6.78g氯化钠，0.084g二水氯化钙和1.38g氯化钾。
结果如图4所示，制得的氯霉素壳聚糖纳米粒温敏凝胶在25℃时呈现流动状态如图4A所示，37℃呈现非流动态如图4B所示。
实施例3：凝胶相变温度测定
本实施例中提供的氯霉素壳聚糖纳米粒-温敏凝胶，其中泊洛沙姆407质量分数为21.0％，泊洛沙姆188质量分数为6.0％，制备方法参见实施例2，实施例2和本实施例的凝胶相变温度如表1：
表1凝胶相变温度统计表
处方组成(P407：P188) T1(℃) T2(℃)
实施例2 20.5％:5.0％ 27.17±0.21 33.83±0.21
实施例3 21.0％:6.0％ 26.43±0.12 33.03±0.06
由表1数据可知，在实施例2制备的氯霉素壳聚糖纳米粒-温敏凝胶中，泊洛沙姆407质量分数为20.5％，泊洛沙姆188质量分数为5.0％，样品刚好由流动态转变为非流动态的温度为27.17±0.21℃，即凝胶相变温度T1为27.17±0.21℃，当样品和人工模拟泪液7:40混合后，样品刚好由流动态转变为非流动态的温度为33.83±0.21℃，即凝胶相变温度T2为33.83±0.21℃；在实施例3制备的氯霉素壳聚糖纳米粒-温敏凝胶中，泊洛沙姆407质量分数为21.0％，泊洛沙姆188质量分数为6.0％，样品刚好由流动态转变为非流动态的温度为26.43±0.12℃，即凝胶相变温度T1为26.43±0.12℃，当样品和人工模拟泪液7:40混合后，样品刚好由流动态转变为非流动态的温度为33.03±0.06℃。
如上表所示，加入制备的人工模拟泪液后，含氯霉素壳聚糖纳米粒的眼用凝胶相变温度为接近人体体温的温度，即眼用温敏凝胶进入人体眼部时，眼用温敏凝胶的状态可逆性地转变为凝胶状态，均匀分布黏附于眼部，成为药物的缓释储库，延长药物在眼部的滞留时间，增加药物的吸收和利用。
实施例4：抑菌圈实验评价氯霉素壳聚糖纳米粒-温敏凝胶抑菌效果
按实施例2的方法制备氯霉素壳聚糖纳米粒-温敏凝胶样本，测定氯霉素壳聚糖纳米粒-温敏凝胶的抑菌效果。
测试方法：在超净工作台中，用移液枪挑取待测细菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌)至装有5mL TSB的试管中混悬，37℃孵育20-24h；将母液用TSB稀释浊度为0.5MCF，吸取1mL 0.5MCF菌悬液到9mL TSB中作两次10倍梯度稀释，该稀释菌液备用；用灭菌棉签蘸取稀释菌液后均匀地涂抹在TSA平板上，在培养基表面直接垂直放上牛津杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，在杯中分别加入待测样品市售氯霉素滴眼液、氯霉素-温敏凝胶和氯霉素壳聚糖纳米粒-温敏凝胶，培养基正面向上置37℃培养24-36小时，观察结果，测量抑菌圈大小，根据抑菌圈的大小确定抑菌作用，抑菌圈越大抑菌效果越明显。
测试结果如图5所示，图5A为含有金黄色葡萄球的培养基，上方样本为水作为空白对照，下方样本为氯霉素凝胶，左侧样本为氯霉素滴眼液，右侧样本为氯霉素壳聚糖纳米粒凝胶；图5B含有大肠杆菌的培养基，上方样本为氯霉素壳聚糖纳米粒凝胶，下方样本为氯霉素滴眼液，左侧样本为空白对照水，右侧样本为氯霉素凝胶；图5C为含有铜绿假单胞菌的培养基，上方样本为氯霉素壳聚糖纳米粒凝胶，下方样本为氯霉素滴眼液，左侧样本为空白对照水，右侧样本为氯霉素凝胶；图5D为不同样本对三种致病菌的抑菌圈直径图。
根据图5结果可知，在含有金黄色葡萄球菌的培养基上，本发明中的氯霉素壳聚糖纳米粒凝胶的抑菌圈和氯霉素滴眼液、氯霉素凝胶抑菌圈的大小基本一致，即对于金黄色葡萄球菌抑菌作用本发明中的氯霉素壳聚糖纳米粒凝胶与市面上的氯霉素滴眼液、氯霉素凝胶效果相同；在含有大肠杆菌的培养基上，氯霉素壳聚糖纳米粒凝胶的抑菌圈>氯霉素凝胶＝氯霉素滴眼液，即对于大肠杆菌的抑菌作用，氯霉素滴眼液和氯霉素凝胶的抑菌效果基本相同，但是本发明中的氯霉素壳聚糖纳米粒凝胶的抑菌效果明显强于二者；在含有铜绿假单胞菌的培养基上，氯霉素壳聚糖纳米粒凝胶的抑菌圈>氯霉素凝胶>氯霉素滴眼液，即对于铜绿假单胞菌的抑菌作用，本发明中的氯霉素壳聚糖纳米粒凝胶的抑菌效果显著强于氯霉素凝胶和氯霉素滴眼液。
由上述实验结果可知，本发明中的氯霉素壳聚糖纳米粒凝胶对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌具有显著的抑菌作用，比其他种类的氯霉素眼用制剂的抑菌效果更强。
实施例5：氯霉素壳聚糖纳米粒-温敏凝胶的体外释放
按实施例2的方法制备氯霉素壳聚糖纳米粒-温敏凝胶样本，测定氯霉素壳聚糖纳米粒-温敏凝胶体外释放。
测试方法：精密量取氯霉素温敏型原位凝胶、氯霉素壳聚糖纳米粒、氯霉素壳聚糖纳米粒温敏型原位凝胶和氯霉素水溶液各5mL，分别置于透析袋中，再将透析袋置于300mL人工模拟泪液中，水浴温度为(34±0.5)℃，搅拌桨转速为100r/min。分别在5、15和30min，1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24h时取透析袋外溶出介质2mL，并补充等量同温度介质，取出的样品测定吸光度，计算累积释放度。
图6为氯霉素壳聚糖纳米粒温敏型原位凝胶的累计释放曲线，四条曲线分别代表氯霉素滴眼液、氯霉素壳聚糖纳米粒温敏型原位凝胶、氯霉素壳聚糖纳米粒和氯霉素温敏型原位凝胶。
由图6可知：氯霉素滴眼液前4h累计释药率已接近100％，壳聚糖包载的氯霉素纳米粒前4h累计释药率达到80％，累计释药时间相较于氯霉素滴眼液延长了8h，相对于氯霉素滴眼液起到了一定的缓释效果，氯霉素与伯洛沙姆组装成的温敏凝胶前4h累计释药率为60％左右，累计释药时间相较于氯霉素滴眼液延长了10h，缓释效果有了较大提升，而氯霉素壳聚糖纳米粒在和伯洛沙姆构建成氯霉素壳聚糖纳米粒-温敏凝胶之后，释药速率更加缓慢，前4h累计释药率仅为50％，其有效释放时间达到了18h，相较于氯霉素滴眼液延长了14h。在构建成氯霉素壳聚糖纳米粒温敏凝胶之后，相对于氯霉素壳聚糖纳米粒和氯霉素-温敏凝胶，缓释效果更加明显，可以长时间与眼部紧密接触，从而延长药物作用时间，提高药物利用率。
实施例6：家兔眼部滞留时间考察
按实施例2的方法制备氯霉素壳聚糖纳米粒-温敏凝胶样本，测定氯霉素壳聚糖纳米粒-温敏凝胶在家兔眼部的滞留时间。
测试方法：精密称取0.2g荧光素钠，分别加至10mL氯霉素壳聚糖纳米粒温敏凝胶和氯霉素滴眼液中，并超声混合均匀，即得荧光素钠标记的制剂。将已标记制剂1滴(约45μL)滴入家兔结膜囊内，并使其眼睛被动闭合9s，每隔1min用紫外分析仪在365nm波长下观察角膜制剂荧光的强弱，角膜荧光消失的时间即为制剂在兔眼的滞留时间。
测试结果如图7所示，图7A为氯霉素滴眼液给药后的照片，由左向右分别为给药后0、2、5和10min的照片；图7B为氯霉素壳聚糖纳米粒温敏凝胶给药后的照片，由左向右分别为给药后0、5、15和40min的照片。
根据图7结果可知，氯霉素滴眼液滴入后可观察到制剂很快从眼角流出，10min时基本无荧光显示。氯霉素壳聚糖纳米粒温敏凝胶给药后，随即便形成凝胶，并且由于眨眼的作用，制剂即形成了一层覆盖于兔眼表面的凝胶膜，40min时仍由少量荧光可见。因此，与氯霉素滴眼液相比，氯霉素壳聚糖纳米粒温敏凝胶明显延长了药物在眼部的滞留时间。
根据上述实验结果，本发明氯霉素壳聚糖纳米粒温敏凝胶的缓释效果更明显，而且同时具有黏附作用，更有利于缓释。
实施例7：家兔眼部刺激性考察
测试方法：将家兔按照简单随机化法随机分为2组，记为A、B组，A组作为单次给药组，B组作为多次给药组。A组左眼滴入氯霉素壳聚糖纳米粒原位凝胶，右眼滴市售氯霉素滴眼液作为自身对照。观察给药后0、1、2、3、5和7d家兔眼部刺激情况。B组家兔眼滴入氯霉素壳聚糖纳米粒原位凝胶，右眼滴市售氯霉素滴眼液作为自身对照，每天用药两次，连续用药七天，观察用药后眼部刺激情况。按照Draize眼部刺激性实验评价标准表对其结膜、虹膜及角膜分别计分，计算每次观察结果的总得分及平均值，即为最终分值。并按照眼用制剂眼部刺激性的评价标准，判定眼部刺激性结果。
A组和B组单次给药后0、1、2、3、5和7d分别观察刺激性情况，发现实验家兔结膜、虹膜、角膜、分泌物均无异常现象，各总分及平均分均为0，根据评价标准，可知氯霉素壳聚糖纳米粒温敏凝胶和氯霉素滴眼液对兔眼单次给药均无刺激性。多次给药后，氯霉素壳聚糖纳米粒温敏凝胶和氯霉素滴眼液的刺激性评分均小于3，表明两者对眼睛均无刺激性。

Claims (3)

1.一种制备眼用温敏凝胶的方法，其特征在于，
所述眼用温敏凝胶由氯霉素壳聚糖纳米粒和温敏凝胶基质制备而成，所述氯霉素壳聚糖纳米粒包括壳聚糖、交联剂和氯霉素，所述温敏凝胶基质由泊洛沙姆制备而成所述交联剂为三聚磷酸钠，所述壳聚糖浓度为0.5mg/mL，所述三聚磷酸钠的浓度为0.5mg/mL，所述氯霉素的浓度为1.2mg/mL，所述温敏凝胶基质由泊洛沙姆407和泊洛沙姆188制备而成，所述泊洛沙姆407的质量分数为20.5%-21%，所述泊洛沙姆188的质量分数为5%-6%，所述壳聚糖的分子量为5Kda-20Kda，所述壳聚糖的脱乙酰度为90%，所述氯霉素壳聚糖纳米粒中的氯霉素质量分数为0.1%-0.5%，
所述方法包括以下步骤：
（1）制备氯霉素壳聚糖纳米粒；
（2）制备温敏凝胶基质；
（3）将氯霉素壳聚糖纳米粒与温敏凝胶基质混合制备所述眼用温敏凝胶；
所述步骤（1）包括如下步骤：
（i）壳聚糖溶解于乙酸溶液中，滴加氢氧化钠调节pH，用0 .45μm孔径的滤膜过滤制成壳聚糖溶液；所述壳聚糖的浓度为0.5mg/mL，所述壳聚糖溶液为每100ml乙酸溶液中加入50mg的壳聚糖；所述乙酸溶液浓度为1%，所述pH为4.8；(ii)将氯霉素溶解于10%乙醇溶液中制成氯霉素溶液；(iii)将三聚磷酸钠溶解于去离子水中制成三聚磷酸钠溶液；(iv)在磁力搅拌机搅拌下，将氯霉素溶液缓慢滴加入壳聚糖溶液中，搅拌一段时间后，再缓慢滴加三聚磷酸钠溶液，进行搅拌，超声即制得分散的氯霉素壳聚糖纳米粒。
2.权利要求1所述的方法制备得到的眼用温敏凝胶在制备眼用制剂中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述眼用制剂的剂型为液体制剂。
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