CN115298327A

CN115298327A - 用于识别高风险的dlbcl受试者的铁评分和体外方法以及治疗用途和方法

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Publication number: CN115298327A
Application number: CN202080091944.8A
Authority: CN
Inventors: J·莫罗; R·罗德里格斯; J·德文; C·布雷特; T·卡内克科博
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Montpellier I; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Institut Curie; Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier CHUM
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Montpellier I; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Institut Curie; Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier CHUM
Priority date: 2019-11-06
Filing date: 2020-11-06
Publication date: 2022-11-04
Also published as: CA3159909A1; WO2021089821A1; JP2023500948A; EP4055194A1; US20220396840A1; CN115244190A; US20230220480A1; WO2021089819A1; JP2023500950A; CA3159908A1; EP4055193A1

Abstract

本发明涉及铁评分作为预后标记物在患有DLBCL的受试者中的用途，特别是用于识别具有不良结果(例如，复发和/或死亡)的受试者中的用途，所述铁评分基于选自参与铁代谢的ALAS1、HIF1A、LRP2、HMOX1、HMOX2、HFE、ISCA1、SLC25A37、PPOX、STEAP1和TMPRSS6的至少2个基因，特别是至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因的表达水平。

Description

用于识别高风险的DLBCL受试者的铁评分和体外方法以及治疗用途和方法

技术领域

本发明涉及用于预后受B细胞淋巴瘤(特别是DLBCL)影响的受试者的结果的体外方法领域，以及相关的治疗用途和方法。

背景技术

淋巴瘤可影响身体的任何器官，出现多种症状。淋巴瘤通常分为霍奇金淋巴瘤(约占所有淋巴瘤的10％)和非霍奇金淋巴瘤。非霍奇金淋巴瘤代表广泛的疾病，从进展最缓慢的到最具侵袭性的恶性肿瘤。淋巴瘤产生于处于不同进展阶段的淋巴细胞，特定的淋巴瘤亚型的特征反映了其起源的细胞的特征。人成熟的B细胞恶性肿瘤代表着医学上的挑战，目前的治疗方法只能满足其部分要求，因此有理由对其分子回路(circuitry)和发病机制进行协同调查。根据免疫球蛋白(Ig)可变(V)区突变的存在与否和基因表达谱判断，每种淋巴瘤亚型都与处于特定分化阶段的B细胞具有表型上的相似性。

最常见的B细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤，尤其是：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)或粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞淋巴瘤(又称为慢性淋巴细胞白血病，CLL)和套细胞淋巴瘤(MCL)。

本发明将着重以DLBCL为示例。

弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是成人中最常见的淋巴恶性肿瘤，占非霍奇金淋巴瘤的多至35％。DLBCL特点在于是其临床和生物学异质性。

异质性反映在转录定义的亚型中，根据细胞起源(Cell-Of-Origin)分类划分为两个主要的分子组，并与不同的临床结果相关。生发中心细胞-DLBCL亚型(GCB)源自淋巴结暗区的中心母细胞，与更好的结果相关；而源自浆母细胞的激活的B细胞-DLBCL亚型(ABC)则与不良结果相关(Rosenwald等人，2002)。尽管超过60％的患者可以使用基于利妥昔单抗(Rituximab(R)的化疗方案(例如，CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松))治愈DLBCL，然而其余患者会发展为通常致命的复发性或进展性疾病。因此，仍然需要新的治疗方法以实现对高风险/难治性DLBCL的有效治疗。

发明人特别为DLBCL受试者开发了铁评分(Iron score)，这是基于11个预后基因的基于基因表达谱(GEP)的风险评分。铁在许多细胞必需的功能中发挥着核心作用，包括氧传感、能量代谢、呼吸和叶酸代谢，而且也是细胞增殖所必需的，是参与DNA合成和DNA修复的几种酶的辅因子。本发明的铁评分允许识别具有不良结果但可以受益于靶向疗法的DLBCL患者。此外，本发明人证明，与常规治疗相比，铁霉素(铁螯合剂)显著减少患者的活的原代DLBCL细胞的中位数，并且对来自微环境的非肿瘤细胞没有重大毒性，以及对造血祖细胞的毒性低。有趣的是，发明人还发现当铁霉素与多柔比星以及与维奈托克(Venetoclax)、艾达拉西布(Idelalisib)、依鲁替尼(Ibrutinib)和恩妥替尼(entospletinib)联合使用时，具有显著的协同效应。

总而言之，这些数据表明，高风险的DLBCL患者亚组可以通过铁评分来识别，并且可以受益于包含铁代谢抑制剂的治疗。

发明内容

本发明的第一个目标是铁评分作为预后标记物在患有B细胞淋巴瘤(特别是患有DLBCL)的受试者中的用途，特别是用于识别具有不良结果(例如，复发和/或死亡)的受试者中的用途，所述铁评分基于至少一个参与铁代谢的基因和/或蛋白质的表达水平，特别是由表3中列出的62个基因中的至少一个基因或由其编码的蛋白质的表达水平，优选选自参与铁代谢的HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1中的至少一个基因，特别是至少5个，优选至少10个以及甚至优选11个基因。

在一个具体实施方案中，本发明涉及铁评分作为预后标记物在DLBCL受试者中的用途，特别是用于识别具有不良结果(例如，复发和/或死亡)的DLBCL受试者中的用途，所述铁评分是基于选自参与铁代谢的HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1中的至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因和/或由所述至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因编码的蛋白质的表达水平。

本发明还涉及用于识别具有不良结果的B细胞淋巴瘤受试者，特别是具有不良结果的DLBCL受试者的体外方法，其可以受益于靶向铁代谢的治疗性治疗，包括步骤：

a)在获自所述受试者的生物样本中测量选自参与铁代谢的HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1中的至少1个，特别是至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因和/或由所述至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因编码的蛋白质的表达水平；

b)从在步骤a)中获得的所述表达水平计算评分值，

c)根据评分值与预定参考值的比较，对所述具有不良结果的受试者进行分类和识别。

在一个具体实施方案中，本发明涉及用于识别具有不良结果但可以受益于靶向铁代谢的治疗性治疗的DLBCL受试者的体外方法，包括步骤：

a)在获自所述受试者的生物样本中测量选自参与铁代谢的HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1中至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因和/或由所述至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因编码的蛋白质的表达水平；

b)从在步骤a)获得的所述表达水平计算评分值

本发明的另一个主题是用于监测在受试者中进行靶向铁代谢的治疗性治疗的疗效的体外方法，所述受试者患有B细胞淋巴瘤，特别是高风险的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)并正在接受所述治疗，所述方法包括步骤：

a)在受试者已经接受所述靶向铁代谢的治疗性治疗施用之前或期间或之后的时间T1，在获自所述受试者的生物样本中，测量选自参与铁代谢的HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1中的至少1个，特别是至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因和/或由所述至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因编码的蛋白质的表达水平；

b)从在步骤a)中获得的所述表达水平，计算在时间T1时的评分值，

c)在受试者已经接受所述靶向铁代谢的治疗性治疗施用之前或期间或之后的时间T2(其中所述时间T2在所述时间T1之后)，在获自所述受试者的生物样本中测量选自参与铁代谢的HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1中至少1个，特别是至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因和/或由所述至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因编码的蛋白质的表达水平；

d)从在步骤c)中获得的所述表达水平，计算在时间T2时的评分值，

e)基于在步骤d)中获得的在T2时的评分值与在步骤b)中获得的在T1时的评分值相比较，评估治疗性治疗的疗效。

在一个具体实施方案中，本发明涉及一种体外方法，用于监测在受试者中进行靶向铁代谢的治疗性治疗的疗效，所述受试者患有高风险的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)并正在接受所述治疗，包括步骤：

a)在受试者已经接受所述靶向铁代谢的治疗性治疗施用之前或期间或之后的时间T1，在获自所述受试者的生物样本中测量选自参与铁代谢的HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1中的至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因和/或由所述至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因编码的蛋白质的表达水平；

c)在受试者已经接受所述靶向铁代谢的治疗性治疗施用之前或期间或之后的时间T2(其中所述时间T2在所述时间T1之后)，在获自所述受试者的生物样本中测量选自参与铁代谢的HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1中至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因和/或由所述至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因编码的蛋白质的表达水平；

本发明的体外方法任选地包含一个或多个管家基因，用于归一化数据。

“管家基因”是指在许多或所有的已知条件下以相对恒定的水平组成型表达的基因，因为其编码细胞恒定需要的蛋白质，所以管家基因对细胞至关重要并且在任何条件下始终存在。推测管家基因的表达不受实验条件的影响。其编码的蛋白质通常参与细胞生存(sustenance)或维持(maintenance)所需的基本功能。可用于本发明方法的管家基因的非限制性示例包括：

-HPRT1(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1)，

-UBC(泛素C)，

-YWHAZ(酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白，ζ多肽)，

-B2M(β-2-微球蛋白)，

-GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)，

-FPGS(叶酰聚谷氨酸合酶)，

-DECR1(2,4-二烯酰CoA还原酶1，线粒体)，

-PPIB(肽基脯氨酰异构酶B(亲环蛋白B))，

-ACTB(肌动蛋白β)，

-PSMB2(蛋白酶体(prosome，macropain)亚基，β型，2)，

-GPS1(G蛋白通路抑制因子1)，

-CANX(钙联蛋白)，

-NACA(新生多肽相关复合物α亚基)，

-TAX1BP1(Tax1(人T细胞白血病病毒I型)结合蛋白1)，和

-PSMD2(蛋白酶体(prosome，macropain)26S亚基，非ATP酶，2)。

当这些管家基因添加到表达谱中时(并不总是必要的)，其用于归一目的。在这种情况下，在根据本发明的方法中用于归一化的管家基因的数量优选地包含在一至五之间，优选为三。

本发明的体外方法包括测量用于结果预后的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个基因(又称为根据本发明的“预后基因”或目的基因)的表达水平的步骤。

本发明还涉及专用于本发明的体外方法(特别是用于DLBCL受试者)的试剂盒，包括或由以下组成：用于确定在所述受试者样本中的选自HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1中的至少1个，优选至少5个，更优选至少10个和甚至优选至少11个基因和/或蛋白质的表达水平的试剂。

本发明还涉及药物组合物，其在药学上可接受的载剂(vehicle)中包含靶向铁代谢的分子，特别是铁螯合剂和螯合溶酶体铁的小分子，特别是选自地拉罗司(Deferasirox)、去铁胺(Deferoxamine)、去铁酮(Deferiprone)、盐霉素(Salinomycin)、其类似物或衍生物，优选盐霉素和盐霉素的含氮类似物，用于治疗患有B细胞淋巴瘤，特别是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)或粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞淋巴瘤(又称为慢性淋巴细胞白血病，CLL)和套细胞淋巴瘤(MCL)的受试者的方法，优选患有DLBCL的受试者。

在一个具体实施方案中，该药物组合物用在治疗B细胞淋巴瘤受试者的方法中，所述受试者根据本发明的体外方法根据铁评分识别为具有不良结果，并因此可能显示出B细胞淋巴瘤的复发和/或死亡，特别是DLBCL的复发和/或死亡。

本发明的另一个主题是药物产品，所述药物产品包含：

(i)靶向铁代谢的分子，特别是铁螯合剂或螯合溶酶体铁的小分子，和

(ii)另一种抗癌剂，其选自化疗、靶向治疗、免疫疗法及其组合中使用的试剂；

作为组合产品在治疗B细胞淋巴瘤，优选DLBCL，特别是通过使用根据本发明的体外方法具有不良结果的DLBCL受试者中作为药物同时、分开或交错使用。

本发明还涉及基于上述定义的基因和/或蛋白质的表达水平，执行本发明的体外方法的系统(和用于运行计算机系统的计算机可读介质)。

特别地，该系统包含机器可读存储器，例如计算机或/和计算器，以及配置成计算根据本发明的R Maxstat函数和Cox多变量函数的处理器。该系统专用于执行根据本发明的体外方法，特别是用于识别具有不良结果的B细胞淋巴瘤受试者。

具体地，用于分析受B细胞淋巴瘤(特别是DLBCL)影响的受试者的生物样本的系统1包括：

(a)确定模块2，其配置为接收生物样本并确定关于如本发明中公开的预后基因和任选地一个或多个管家基因的表达水平信息；

(b)存储装置3，其配置为存储来自确定模块的表达水平信息；

(c)比较模块4，适于将存储在存储设备上的表达水平信息与参考数据进行比较，并提供比较结果，其中比较结果指示受试者的结果；和

(d)显示模块5，用于为用户显示部分基于比较结果的内容，其中该内容是指示受试者结果的信号。

定义

术语“受试者”或“患者”或“个体”是指人受试者，不分其年龄或性别。受试者患有B细胞淋巴瘤。受试者可能已经接受过任意化疗剂的治疗，或者可能尚未接受治疗。

术语“DLBCL受试者”是指源自DLBCL受试者群体(从DLBCL的早期到晚期)的患有DLBCL的受试者，所述受试者正在或未经治疗性治疗，特别是经历复发性DLBCL的DLBCL受试者。

根据本发明的“铁评分”是基于GEP(基因表达谱)的铁评分；其是通过以下得以定义：Cox模型对每个预后基因的β系数加权±1(根据患者信号是高于还是低于探针组的Maxstat值)的总和。

“预后标记物”是指与评估受试者的结果相关的标记物。特别地，在本发明中确定的1至11个基因和/或蛋白质的表达谱或表达水平在B细胞淋巴瘤的受试者中差异表达，代表了可以区分“良好预后”的受试者与“不良预后”的受试者的预后标记物。

被鉴定为对评估受试者的结果具有参考价值的11个DLBCL基因，在本公开中也被称为“目的基因”或“预后(prognosis)基因”或“预后的(prognostic)基因”。

根据本发明的“良好预后”或“良好结果”是指受试者存活下来。

根据本发明的“不良预后”或“不良结果”是指受试者“疾病复发”或“死亡”。

通过根据本发明的“靶向铁代谢的治疗性治疗”，其包括铁螯合剂和螯合(sequester)溶酶体铁的小分子。此类分子的示例之后在本公开中进行说明。

术语“治疗(treating)”或“处理(treatment)”是指稳定、减轻、治愈或减少B细胞淋巴瘤(特别是DLBCL)的进展。

根据本发明的“生物样本”是指从受试者获得的、分离的或收集的生物样本，特别是细胞培养物、细胞系、组织活检或液体，例如血液或骨髓。特别地，生物样本是包含淋巴结或脾的组织活检、或包含B淋巴细胞的液体，如血液或骨髓。

“参考样本”是指临床结果已知(即，无病生存期(DFS)、无事生存期(EFS)或总生存期(OS)或两者的持续时间)的患者的生物样本。优选地，参考样本池包含至少一个(优选若干个，更优选至少5个，更优选至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个)“良好结果”的患者)和至少一个(优选若干个，更优选至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个)“不良结果”患者。参考样本的数量越多，根据本发明的预测受测受试者的结果的方法的可靠性就越好。

已评估预后基因的表达谱的所述参考样本(B细胞淋巴瘤受试者的收集样本)，允许测量预定参考值(如进一步公开的PREV和PREL)，用于比较目的。

附图说明

图1：在DLBCL患者中铁评分的预后值。

Lenz R-CHOP队列(n＝233)的患者根据递增铁评分进行排序，并且在铁评分为-0.16872获得OS(总生存期)最大差异(又称为“割点(cut point)”)，这将患者分为高风险和低风险组(A)，铁评分在三个其他独立的患者队列(Melnick R-CHOP队列、Lenz CHOP队列和FFPE R-CHOP队列)中也具有预后值(B、C和D)。

与GCB(生发中心细胞-DLBCL亚型)DLBCL患者相比，ABC(激活的B细胞-DLBCL亚型)DLBCL患者的铁评分显著更高(E)。

图2：铁稳态相关的基因在患有DLBCL的患者中具有预后值。

图2A表示11个预后基因的研究和选择的示意模型。三个基因的高表达与良好预后相关，包括ALAS1、HIF1A和LRP2(图2B)。与之相反，八个基因的高表达与不良预后相关：HMOX1、HMOX2、HFE、ISCA1、SLC25A37、PPOX、STEAP1和TMPRSS6(图2C)。

图3：铁螯合剂和铁霉素抑制DLBCL细胞生长

DLBCL细胞与不同浓度的铁螯合剂或载剂温育96小时。用去铁胺(A)、地拉罗司(B)和铁霉素(C)处理后，用浓度-反应曲线计算50％的抑制浓度(IC₅₀)。使用ATP测定的定量检查细胞活力。数据表示为一式六份进行的至少三个独立实验的平均百分比+/-SEM。IC₅₀总结在表6中。

图4：铁霉素诱导G1/S细胞周期停滞和DNA损伤。

细胞与载剂、7μM的去铁胺、80μM的地拉罗司或IC₅₀的铁霉素一起温育72小时。使用流式细胞术分析细胞周期，在BrdU掺入后用抗BrdU抗体将S相的细胞染色，对于OCI-LY3(A)和DB细胞(B)用4',6-二脒基-2-苯吲哚(DAPI)染色(strained)计算DNA含量。直方图表示三个独立实验的每个细胞周期时相的平均百分比和SEM。^*和^**表示使用配对的学生t检验分别为P<0.05和P<0.01的显著差异。

细胞与载剂或与7μM的去铁胺、80μM的地拉罗司或50nM的铁霉素一起温育24小时。通过Phospho-H2A.X(Ser139)染色监测DSB诱导，细胞核用DAPI染色。通过荧光显微镜观察病灶。原始放大×63。比例尺：10μm。在直方图中显示超过每个细胞中的phospho-H2A.X(Ser139)病灶(±SEM)的细胞百分比。^**和^****分别表示使用Fisher精确检验时的P<0.01和P<0.0001的显著差异，NS：不显著(C)。

细胞用铁螯合剂(80μM的地拉罗司)和铁霉素(20nM和100nM)处理24小时。通过蛋白质印迹分析Phospho-H2A.X(S139)的蛋白质水平(D)。

将源自DB和OCI-LY3 DLBCL的细胞系用50nM铁霉素处理24小时。在DLBCL细胞中对phospho-RPA2 T21的病灶、S相(EdU整合)和DAPI进行免疫荧光染色。(放大×63)。比例尺：10μm。在直方图中显示在每个细胞中有超过10个phospho-RPA2 T21病灶的细胞的百分比(E)。

对于每组至少计数300个细胞。使用Fisher精确检验测试统计差异。^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，^****P<0.0001。NS：不显著。

图5：铁霉素诱导有缺陷的DNA复制叉进展。

DB和OCI-LY3细胞用IdU标记，用载剂、吉西他滨(10μM)或铁霉素(100μM)处理再用CIdU标记(每个30分钟)，然后收获用于DNA纤维测定(A和B)。

DB细胞用或不用脱氧核苷酸预处理30分钟，用IdU标记，之后用载剂、吉西他滨(10μM)或铁霉素(100μM)处理再用CIdU标记(每个30分钟)，然后收获用于DNA纤维测定(C和D)。

箱线图(Boxplot)代表中位数±四分位数范围，点代表轨迹长度的异常值(以μm表示)。结果表示至少200次的轨迹测量。*P<0.05，****P<0.0001，NS：不显著，Mann-Whitney检验。

图6：铁霉素对DLBCL原代细胞具有显著的毒性，并增强多柔比星细胞毒性。

源自DB DLBCL的细胞系用增加浓度的铁霉素与多柔比星联合处理96小时，并通过ATP定量测试细胞活力以获得活力矩阵(viability matrix)。如材料和方法中所述计算协同矩阵(A)。

用铁霉素和/或多柔比星处理原代DLBCL细胞，并与CD40L一起温育96小时。通过流式细胞术分析肿瘤细胞(B)(在材料和方法中描述)并以与对照的百分比表示。

用来自5个供体的单采血(apheresis)的CD34+细胞进行造血祖细胞集落形成单位测定。细胞培养在具有或没有常规化疗或铁霉素的羟甲基纤维素介质中。对于CFU-C、CFU-E和CFU-GM，在培养14天后进行计数(C)。

结果表示五个患者的每个群体细胞的中位数±IQR。对于统计显著性，使用成对的t检验进行测试：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，^****P<0.0001和NS：非显著性。

图7：铁霉素诱导患者的原代DLBCL细胞的死亡率。

在存在、或不存在50nM和100nM的铁霉素的情况下，DLBCL患者的原代样本(primary sample)与其微环境中的重组CD40L培养在一起。通过流式细胞术分析每个个体患者的恶性DLBCL细胞的百分比，并以与对照相比的百分比表示(A)。表列出患者的表征(B)。通过流式细胞术评估单独使用铁霉素、或将铁霉素与多柔比星联合使用对正常CD3+细胞的影响(C)。

图8：铁霉素与维奈托克(Bcl2抑制剂)的协同效应。

三个源自DLBCL的细胞系用增加浓度的铁霉素与维奈托克联合处理96小时，并通过ATP定量测试细胞活力以获得活力矩阵(viability matrix)。如材料和方法中所述计算协同矩阵。图8A：U2932细胞系；图8B：DB细胞系；图8C：OCI-LY3细胞系。

图9：铁霉素与依鲁替尼(BTK抑制剂)的协同效应

两个源自DLBCL的细胞系用增加浓度的铁霉素与依鲁替尼联合处理96小时，并通过ATP定量测试细胞活力以获得活力矩阵。如材料和方法中所述计算协同矩阵。图9A：U2932细胞系；图8B：DB细胞系。

图10：铁霉素与恩妥替尼(Syk抑制剂)的协同效应

两个源自DLBCL的细胞系用增加浓度的铁霉素与维奈托克联合处理96小时，并通过ATP定量测试细胞活力以获得活力矩阵。如材料和方法中所述计算协同矩阵。图10A：U2932细胞系；图10B：DB细胞系。

图11：铁霉素与艾达拉西布(PI3K抑制剂)的协同效应

三个源自DLBCL的细胞系用增加浓度的铁霉素与维奈托克联合处理96小时，并通过ATP定量测试细胞活力以获得活力矩阵。如材料和方法中所述计算协同矩阵。图11A：U2932细胞系；图11B：DB细胞系；图11C：OCI-LY3细胞系。

具体实施方式

发明人已经鉴定了一组参与铁代谢的11个基因和/或蛋白质，其在患有DLBCL的个体(DLBCL细胞)中与在健康受试者(正常B细胞)中相比差异性地表达。这种基于基因表达谱(GEP)的风险评分可以有利地用于识别具有不良结果但可以从包含铁抑制剂的靶向治疗(又称为个性化药物)中受益的受试者。基于Cox统计模型，考虑到每个基因或蛋白质的β系数，计算出评分值。

如实施例所示，发明人从参与铁生物学调节的62个基因的列表中，通过使用Maxstat R函数和Benjamini Hochberg多重检验校正，识别出在两个独立的DLBCL患者队列(分别为n＝233和n＝181)中显示出预后值的11个基因。

具体地，发明人证明：

-三个基因的高表达与良好预后(“良好结果”)相关，其包括ALAS1(氨乙酰丙酸，δ-合酶1)、HIF1A(缺氧诱导因子1，α亚基)和LRP2(低密度脂蛋白相关蛋白2)；和

-八个基因的高表达与不良预后相关(“不良结果”)：HMOX1(血红素加氧酶(解环(decycling))1)、HMOX2(血红素加氧酶(解环)2)、HFE(血色病)、ISCA1(铁硫簇组装1同源物)、SLC25A37(溶质载体家族25(线粒体铁转运蛋白)，成员37)又称为MSCP(线粒体溶质载体蛋白)、PPOX(原卟啉原氧化酶)、STEAP1(前列腺六跨膜上皮抗原1)和TMPRSS6(跨膜蛋白酶，丝氨酸6)。

因此，本发明涉及铁评分作为预后标记物在患有B细胞淋巴瘤，特别是DLBCL的受试者中特别是用于识别具有不良结果(例如，复发和/或死亡)的受试者中的用途，所述铁评分基于选自参与铁代谢的HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1中的至少2个基因，特别是至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因和/或由所述至少5个基因，优选至少10个基因和甚至优选11个基因编码的蛋白质的表达水平。

这种根据本发明的通过其铁评分值识别为具有不良结果(例如，复发和/或死亡)的B细胞淋巴瘤受试者，特别是DLBCL受试者，可以有利地通过包含铁代谢抑制剂的靶向治疗性治疗进行治疗。

在一个具体实施方案中，所述靶向的治疗性治疗包含靶向铁代谢的分子，特别是铁螯合剂或螯合溶酶体铁的小分子，特别选自地拉罗司、去铁胺、去铁酮、盐霉素、其类似物或衍生物，优选盐霉素和盐霉素的含氮衍生物。

根据本发明的“靶向铁代谢的分子”，其特别指铁螯合剂和螯合溶酶体铁的小分子。铁螯合剂是容易与铁发生可逆地相互作用的小分子。螯合溶酶体铁的小分子是松散的铁结合剂，其积累在核内体/溶酶体区室中能够阻断该细胞器中的金属。此类化合物的示例在说明书下文中公开。

根据本发明的“其衍生物”，是指化学衍生自盐霉素的合成的小分子，其显示出更强的活性和对健康细胞可能更低的毒性。

“至少1个，特别是至少5个”基因和/或蛋白质，其是指1、2、3、4，特别是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个基因，或5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个蛋白质。

在一个实施方案中，评估选自HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1的2个基因和/或所述基因编码的蛋白质的组合。

在一个实施方案中，评估选自HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1的3个基因和/或所述基因编码的蛋白质的组合。

在一个实施方案中，评估选自HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1的4个基因和/或所述基因编码的蛋白质的组合。

在一个实施方案中，评估选自HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1的5个基因和/或所述基因编码的蛋白质的组合。

在另一个实施方案中，评估选自HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1的6个基因和/或所述基因编码的蛋白质的组合。

在另一个实施方案中，评估选自HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1的7个基因和/或所述基因编码的蛋白质的组合。

在另一个实施方案中，评估选自HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1的8个基因和/或所述基因编码的蛋白质的组合。

在另一个实施方案中，评估选自HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1的9个基因和/或所述基因编码的蛋白质的组合。

在另一个实施方案中，评估选自HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1的10个基因和/或所述基因编码的蛋白质的组合。

在另一个和优选的实施方案中，评估选自HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1的11个基因和/或所述基因编码的蛋白质的组合。

每个基因的NCBI参考见下表1：

表1.

一组所述目的基因或蛋白质(“预后基因”)的表达水平

这些测量是在体外进行的，从受试者的样本开始以及必要涉及样本的转化。实际上，如果不对样本进行某种类型的转化，就无法对特定基因的表达水平进行测量。大多数技术依赖于使用特异性结合目的RNA的试剂，从而产生还包含检测试剂的修饰样本。此外，大多数技术还涉及一些，在受试者样本与特定试剂结合之前，从受试者样本中初步提取RNA。因此，要求保护的方法还可以包括从受试者样本中提取RNA的初步步骤。

根据本发明，可以通过任何常用的技术测量该组的基因和/或蛋白质的表达水平，特别是选自HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1的基因或蛋白质的表达水平。

通过本领域技术人员已知的常用方法确定所述基因的存在或水平。特别地，可以在基因组和/或核酸和/或蛋白质水平测量每个基因的表达水平。在一个优选的实施方案中，表达谱通过测量每个基因的核酸转录物的量确定，例如PCR、定量PCR(qPCR)、NGS(下一代测序(NGS))和RNA测序。在另一个实施方案中，通过测量每个基因产生的蛋白质的量来确定表达谱。

可以通过本领域技术人员已知的任何技术测量核酸转录物的量。特别地，可以直接对提取的信使RNA(mRNA)样本进行测量，或通过本领域公知的技术从提取的mRNA制备的逆转录互补DNA(cDNA)进行测量。可以使用本领域技术人员已知的任何技术从mRNA或cDNA样本中测量核酸转录物的量，包括核酸微阵列、定量PCR、下一代测序和与标记探针的杂交。

使用从NCBI获得的基因组序列来设计包含以上公开的目的基因的DNA扩增子的PCR引物。

特别地，该组中每个基因的mRNA表达水平可以通过本领域技术人员公知的技术(例如杂交技术和/或扩增技术(PCR))，使用特异于每个基因mRNA的合适的引物或探针进行。

举例来说，mRNA可以例如使用裂解酶或化学溶液提取，或按照制造商的说明通过可商购的核酸结合树脂进行提取。随后，可以通过杂交(例如，Northern印迹)和/或扩增(例如，定量或半定量RT-PCR)检测提取的mRNA。其他扩增方法包括连接酶链式反应(LCR)、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。在一些实施方案中，可以使用以所述mRNA作为模板通过一种逆转录酶合成的cDNA的定量的方式测量每个目的基因的mRNA表达水平。

可以通过本领域技术人员已知的任何技术测量mRNA的量，包括mRNA微阵列、定量PCR、下一代测序和与标记探针的杂交。特别地，实时定量RT-PCR(qRT-PCR)可能是有用的。在一些实施方案中，qRT-PCR可用于RNA靶标的检测和定量。例如，可以采用基于商购的qRT-PCR的方法(例如，

阵列)，引物和/或探针容易基于上文公开的“预后基因”序列进行设计。

mRNA测定或阵列也可用于评估样本中mRNA的水平。

在一些实施方案中，mRNA寡核苷酸阵列可以制备或购买到。阵列通常包含固体支持物和至少一种与支持物接触的寡核苷酸，其中寡核苷酸对应于mRNA的至少部分。

任何合适的测定平台都可以用来确定样本中mRNA的存在。例如，测定可以是膜、芯片、圆盘、测试条、过滤器、微球、多孔板等的形式。测定系统可以具有固体支持物，其上附着与mRNA对应的寡核苷酸。固体支持物可以包含，例如塑料、硅、金属、树脂或玻璃。可以制备测定组分，将其包装在一起作为检测mRNA的试剂盒。为了确定靶核酸样本的表达谱，所述样本被标记，然后在杂交条件下与微阵列接触，导致在靶核酸和与其互补的附着在微阵列表面的探针序列之间形成复合物。然后，检测标记的杂交复合物的存在。本领域技术人员可获得许多微阵列杂交技术的变体。

也可以使用通过微阵列或通过RNA测序确定mRNA量的方法。在某些实施方案中，可以获得由扩增产生的双链核酸和荧光

分子之间的复合物，然后可以测量与所述扩增的核酸复合的

分子产生的荧光信号。识别特异于每个基因mRNA的合适引物，对于本领域的技术人员来说是常规工作。

在一个具体的实施方案中，如DLBCL受试者的示例所示，通过微阵列确定mRNA量的方法使用上文公开的特定11个预后基因的探针组。可以提及与所述特定的11个预后基因相关的Affymetrix HG-U133 plus 2.0微阵列和探针组ID。在一个具体的实施方案中，如在其他示例中说明的，通过微阵列确定mRNA量的方法对于特定的11个预后基因使用12个探针组(包括对于1个基因使用2个探针组)。

在一些实施方案中，杂交检测可以用可检测标记进行，例如荧光探针、酶促反应或其他配体(例如，亲和素/生物素)。

所述蛋白质的存在或水平可以通过公知的技术测量，包括通过特异性结合至所述蛋白质的任何类型的配体分子(包括核酸(例如，选择用于通过公知的SELEX方法结合的核酸)、抗体和抗体片段)的方式，检测和定量目的蛋白质。针对所述给定目的蛋白质的抗体可以通过常规技术(包括生成产生抗体的杂交瘤)轻松获得。

因此，在优选的实施方案中，使用例如以下评估标记物的表达：

-放射性标记的抗体，特别地对于本发明适用的是放射活性部分，例如可以选自3H、121I、123I、14C或32P；

-发色团标记的或荧光团标记的抗体，其中适用于本发明是发光标记物，特别是荧光标记物，其可以是本领域常用的任何标记物，例如荧光素、荧光探针、香豆素及其衍生物、藻红蛋白及其衍生物，或荧光蛋白，如GFP或DsRed；

-聚合物骨架抗体；

-酶标记的抗体，适用于本发明的所述标记酶可以是碱性磷酸酶、酪氨酸酶、过氧化物酶或葡萄糖苷酶；例如，合适的亲和素标记的酶可以是亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)，合适的底物可以是AEC、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(BCIP)、硝基蓝四唑氯化物(NBT)；

-抗体衍生物，例如，与底物偶联的抗体、或与蛋白质-配体对中的蛋白质或配体偶联的抗体，特别是生物素、链霉亲和素或结合多组氨酸标签的抗体；

-抗体片段，例如，单链抗体、分离的抗体高变结构域等，其特异性结合标记物蛋白质或其片段(包括已经经历了全部或部分正常翻译后修饰的标记物蛋白质)。

在一个具体优选的实施方案中，使用GFP荧光蛋白评估标记物的表达。

用于检测生物标记物蛋白质的体外技术，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。

在一个具体优选的实施方案中，用于检测和定量根据本发明的所述目的基因的表达水平的优选的体外方法，包括微阵列、NGS、RNA测序和PCR技术。

从所述目的基因或蛋白质的表达水平计算评分值(“铁评分”)

根据如上定义的“预后基因”的表达水平，根据本发明的评分值或“预后评分”或“铁评分”将有助于将B细胞淋巴瘤受试者分类为具有“良好结果”或具有“不好结果”。

与“不好结果”相关的基因表达越低，受试者的生存就越好。因此，铁评分水平越高，受试者就越有可能对靶向铁代谢的治疗产生反应。因此，在一个优选的实施方案中，基于患者样本中所述预后基因的表达水平与一个或多个阈值(预定参考值，PREV)的比较，可以预测受试者具有“不良结果”但因而可能对靶向铁代谢的治疗作出反应。

在一个具体实施方案中，当铁评分高于阈值时，患者视为具有不良结果。可以基于如上定义的参考样本池来确定这种阈值。在该实施方案中，基于所述预后基因的表达水平(取决于该表达水平是低于还是高于所述阈值)，将患者分为两组。铁评分高于阈值的患者视为结果不良，并可能对靶向铁代谢的治疗有反应。

在另一实施方案中，方法进一步包括基于所述预后基因的表达水平确定预后评分，其中该预后评分指示患者是否具有不良结果。特别地，如果预后评分高于或低于预定阈值(PREV或PREL)，则所述预后评分可以指示患者可能具有不良(poor)结果或不好(bad)结果(一分为二的结果)。

结果，如上文定义的，基于对本发明的所述预后基因的表达水平与参考样本池的无进展生存期(PFS)或总生存期(OS)之间的相关性的分析，可以确定预后评分。PFS和/或OS评分是使PFS或OS与本发明的所述预后基因的表达水平相关的函数，因此可以用作预测受试者结果的预后评分。

根据本发明的如上文公开的11个目的基因和/或蛋白质的每种组合的表达水平可以与评分值(在本发明中又称为“铁评分”)相关。

在从B细胞淋巴瘤，特别是DLBCL受试者获得的生物样本中测量选自HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1中的至少2个，特别是至少5个或更多个基因和/或由所述5个或更多个基因编码的蛋白质的表达水平(方法的步骤a)之后，可以通过包括以下步骤的方法计算评分值：

i)将在步骤a)中确定的表达水平与预定参考表达水平(PREL)进行比较；

ii)使用以下式计算评分值(“铁评分”)：

其中，

-n表示被测量表达水平的基因和/或蛋白质的数量，即n包括从1至11，特别是从5至11，

表示给定基因或蛋白质的回归β系数参考值，以及

-如果所述基因或蛋白质的表达水平高于预定参考水平(PREL)，则Ci表示“1”，或如果基因或蛋白质的表达水平低于或等于预定参考水平(PREL)，则Ci表示“-1”。

预定参考水平(PREL)通常称为“maxstat值”或“maxstat割点”。

在一些实施方案中，良好的预后状态或“良好结果”是指个体具有低于或等于预定参考值(PRV)的评分值。

在一些实施方案中，不好的预后状态或“不好结果”是指个体具有高于预定参考值(PRV)的评分值。

“回归β系数参考值”可以由本领域技术人员针对每个基因或蛋白质使用公知的统计Cox模型容易地确定出，该Cox模型是基于分析生存期数据的建模方法。该模型的目的是同时探索几个变量对生存期的影响。当用于分析临床试验中患者的生存期时，该模型可以将治疗效果从其他变量的影响中分离开来。Cox模型也可称为比例风险回归分析。特别是，该模型是关于定义的变量的生存时间的回归分析(或更特别地，所谓的“风险函数”)。“风险函数”是指个体在一个小的时间间隔内经历事件(例如，死亡)的概率，考虑到个体已经存活至间隔的开始。因此，风险函数可以解释为在时间t死亡的风险。量h0(t)是基线或基本(underlying)风险函数，对应于所有限定变量为零时死亡(或发生事件)的概率。基线风险函数类似于普通回归中的截距(因为exp0＝1)。“回归系数β”给出了与定义的变量的变化相关的，在风险中可以预期的比例变化。系数β通过称为最大似然的统计方法估计。在生存分析中，风险比(HR)(风险比＝exp(β))是对两组定义变量所描述的条件相对应的风险比的比率。

用于比较目的的预定参考值(例如，PREL或PRV)可以包含“截止”值。

例如，每个基因或蛋白质的每个参考(“截止”)值PREL可以通过执行包括以下步骤的方法来确定：

a)提供来自患有B细胞淋巴瘤，特别是DLBCL的受试者(患者)的样本集合(“参考样本”)；

b)确定步骤a)提供的集合中包含的每个样本的相关基因或蛋白质的表达水平；

c)根据所述表达水平对样本排序；

d)将所述样本分类为成对的子集，这些子集的成员数量根据其表达水平分别增加或减少而排序(classifying said samples in pairs of subsets of increasing,respectively decreasing,number of members ranked according to theirexpression level)；

e)对于在步骤a)中提供的每个样本，提供与相应B细胞淋巴瘤患者，特别是DLBCL患者的实际临床结果相关的信息(即无病生存期(DFS)，或无事件生存期(EFS)或总生存期(OS)或两者的持续时间)；

f)对于每对肿瘤组织样本的子集，获得生存曲线的Kaplan Meier百分比；

g)对于每对肿瘤组织样本的子集，计算两个子集之间的统计显著性(p值)；

h)选择p值最小的表达水平值作为表达水平的参考值PREL。

例如，可以对100个受试者(患者)的100个样本(“参考样本”)评估目的基因或蛋白质的表达水平。根据所述给定基因或蛋白质的表达水平对这100个样本进行排序。样本1可能具有最高表达水平，而样本100可能具有最低表达水平。第一个分组提供了两个子集：一侧是样本Nr 1，另一侧是其他99个样本。下一个分组在一侧提供样本1和2，在另一侧提供其余98个样本等，直到最后一个分组：一侧是样本1到99，另一侧是样本Nr 100。根据与相应DLBCL患者的实际临床结果相关的信息，可以为两个子集中的99组的每一个制备KaplanMeier曲线。同样对于99组中的每一组，计算两个子集之间的p值。然后选择参考值PREL，使基于最小p值的标准的区分度最强。换句话说，p值最小的两个子集之间的边界所对应的表达水平视为是参考值。需要说明的是，根据发明人的实验，参考值PREL不一定是表达水平的中值。

本领域技术人员还理解，相同的PRV评估技术可用于获得参考值，然后用于评估对本发明的包含铁代谢抑制剂的靶向治疗的反应。然而，在一个实施方案中，参考值PRV是PRV的中值。

如本发明的示例中进一步说明的，之后这11个目的基因(“预后基因”)的预后信息被组合在基于GEP(基因表达谱)的铁评分中。如之前所述，“铁评分”由对每个预后基因的Cox模型的β系数加权±1(根据患者信号是高于还是低于探针组Maxstat值进行)的总和所定义(Herviou等人，2018)。Maxstat算法将Lenz R-CHOP队列分为两组，39.5％的患者的铁评分>-0.168和60.5％的患者的铁评分≤-0.168，总生存期(OS)差异最大。在Lenz R-CHOP队列中，具有高风险的铁评分的患者的中位OS为50.6个月，而具有低的铁评分的患者未达到(P＝3，7E-15))此值。如示例所示，铁评分的预后值在另外三个独立的OS队列中得到验证。

如在本发明的示例中进一步公开的，对患有弥漫性大B细胞淋巴瘤的患者(R-CHOPLenz队列，n＝233)的总生存期(OS)进行Cox单变量和多变量分析，使用与预后不良的结果相关的因素，如生发中心B细胞样亚型(GCB亚型)或激活的B细胞样亚型(ABC亚型)、年龄和IPI(国际预后指数)。对所述预后因素使用Cox回归模型单独(A)、两两(B)或以多变量分析(所有变量)进行测试。如示例进一步说明所示，基于每种情况的P值和风险比(HR)，与多变量COX分析中的其他不良结果相关因素(如GCB或ABC亚型、年龄和IPI)进行比较，铁评分仍然是一个独立的预后因素。总之，这些数据强调了铁代谢基因的失调与DLBCL的不良结果相关。

在具体实施方案中，测量了11种目的基因或蛋白质中的每一种的回归β系数参考值、风险比和参考值PREP。这些值是在DLBCL受试者的参考样本(>200个样本)上测量的，但可能会根据参考样本的数量有5％至15％之间浮动。参考样本的数量越高，根据本发明的预测受测受试者的结果的方法的可靠性就越好。

下表2说明11个目的基因中的每一个的Maxstat_割点、β系数和风险比(HR)的相关参数范围。

表2：

名称	Maxstat_割点	β系数	风险比(HR)
				ALAS1	2117/2587	-0,49/-0,4	0,36
HMOX1	2679/3275	0,21/0,25	1,7
				HIF1A	20566/25136	-0,46/-0,38	0,38
HMOX2	830/1015	0,42/0,51	2,9
				TMPRSS6	421/514	0,34/0,42	2,4
STEAP1	167/204	0,29/0,35	2,1
				LRP2	65/79	-0,31/-0,26	0,52
SLC25A37	896/1095	0,31/0,38	2,2
				PPOX	669/818	0,37/0,46	2,6
SLC25A37	339/415	0,23/0,28	2,2
				ISCA1	1051/1284	0,25/0,31	1,9
HFE	129/158	0,31/0,38	2,2

此表2和相关的图2B和图2C显示基因HMOX2、PPOX、TMPRSS6、SLC25A37、HFE、STEAP1具有较高的风险比(HR>2)，这意味着铁评分(其基于这些基因中的至少2、3、4或5个的表达水平)将是DLBCL患者优良的预后标记物。

评分可以由计算机程序生成并且可以用于根据本发明的体外方法，特别是用于识别具有不良结果但可能受益于包含铁代谢抑制剂的靶向治疗的DLBCL受试者，和/或用于进一步监测靶向治疗性治疗的疗效。

用于识别具有不良结果的B细胞淋巴瘤受试者，特别是具有不良结果的DLBCL受试者的方法

本发明还涉及用于识别具有不良结果的B细胞淋巴瘤受试者，特别是不良结果的但可以受益于包含铁代谢抑制剂的靶向治疗性治疗的DLBCL受试者的体外方法，包括步骤：

a)在获自所述受试者的生物样本中测量选自参与铁代谢的HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1中至少2个，特别是至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因和/或由所述至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因编码的蛋白质的表达水平；

b)从在步骤a)中获得的所述表达水平计算评分值

在一个具体实施方案中，本发明涉及用于识别具有不良结果但可以受益于包含铁代谢抑制剂的靶向治疗性治疗的DLBCL受试者的体外方法，包括步骤：

a)在获自所述受试者的生物样本中测量选自参与铁代谢的HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1的基因中至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因和/或由所述至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因编码的蛋白质的表达水平；

b)从在步骤a)中获得的所述表达水平计算评分值

根据本领域公知的检测和/或定量方法测量步骤a)中的所述目的基因或蛋白质的表达水平。此类方法的示例已在上文公开。

如上文所述计算步骤b)中的评分值(“铁评分”)，特别是通过：

ii)使用以下式计算评分值：

其中

-n表示被测量表达水平的基因和/或蛋白质的数量，即n包括从5至11，

表示给定基因或蛋白质的回归β系数参考值，以及

基于受试者铁评分值与预定参考值(PRV)的比较，将受试者分类为“良好结果”亚组和“不好结果”亚组。

在本发明中，具有“不良结果”的受试者是指具有高于预定参考值(PRV)的评分值的个体。

在一个具体实施方案中，对于DLBCL受试者，当铁评分基于由HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1组成的11种基因或蛋白质的表达水平时，预定参考值(PRV)或“割点”是-0,16872，这意味着在上述体外方法的步骤c)中，根据铁评分具有不良结果的受试者是具有高于-0,16872的铁评分值的受试者。

监测靶向治疗性治疗的疗效的方法

本发明的另一个目标是用于监测在受试者中进行靶向铁代谢的治疗性治疗的疗效的体外方法，所述受试者患有高风险的B细胞淋巴瘤，特别是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)并正在接受所述治疗，所述方法包括步骤：

a)在受试者已经接受施用所述靶向铁代谢的治疗性治疗之前或期间或之后的时间T1，在获自所述受试者的生物样本中测量选自参与铁代谢的HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1中至少2个，特别是至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因和/或由所述至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因编码的蛋白质的表达水平。

b)从在步骤a)中获得的所述表达水平，计算在时间T1时的第一评分值，

c)在受试者已经接受施用所述靶向铁代谢的治疗性治疗之前或期间或之后的时间T2(其中所述时间T2在所述时间T1之后)，在获自所述受试者的生物样本中测量选自参与铁代谢的HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1中的至少2个，特别是至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因和/或由所述至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因编码的蛋白质的表达水平。

d)从在步骤c)中获得的所述表达水平，计算在时间T2时的第二评分值，

e)基于在步骤d)中获得的在T2时的第二评分值与在步骤b)中获得的在T1时的第一评分值相比较，评估治疗性治疗的疗效。

根据本发明，在步骤a)和d)中的目的基因或蛋白质的表达水平按照如上所公开的进行。

如上文公开所示，分别计算在时间T1和时间T2处的第一和第二评分值(铁评分值)。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于监测在受试者中进行靶向铁代谢的治疗性治疗的疗效的体外方法，所述受试者患有高风险的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)并正在接受所述治疗，包括步骤：

a)在受试者已经接受施用所述治疗性治疗(包含针对DCBCL的活性试剂和/或铁代谢的抑制剂)之前的时间T1，在获自所述受试者的生物样本中测量11个基因或蛋白质(其由参与铁代谢的HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1组成)的表达水平；

c)在受试者已经接受施用所述治疗性治疗(包含针对DCBCL的活性试剂和/或铁代谢的抑制剂)之后的时间T2(其中所述时间T2在所述时间T1之后)，在获自所述受试者的生物样本中测量11个基因或蛋白质(由参与铁代谢的HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1组成)的表达水平；

专用于本发明的体外方法的试剂盒

本发明的试剂盒是专用于本发明的体外方法。

“专用”是指在本发明试剂盒中的用于确定如上述定义的基因和/或蛋白质的表达水平的试剂，其基本上由以下组成：用于确定上述(i)表达谱(任选地具有一个或多个管家基因)的表达水平的试剂，以及因此包含用于确定其他基因(除上述(i)表达谱提及的那些和管家基因之外的)表达的最少试剂。例如，本发明的专用试剂盒优选包含不超过20个、优选不超过12个、优选不超过10个、优选不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1个用于确定(不属于上述(i)表达谱之一并且不是管家基因的)基因的表达水平的试剂。

这样的试剂盒还可以包含用于确定受试者的不良或良好结果的说明书。

所以，本发明涉及专用于本发明的体外方法的试剂盒，特别是用于确定B细胞淋巴瘤受试者，特别是DLBCL受试者是否具有高风险的死亡和/或复发的试剂盒，包括或由以下试剂组成：用于确定在所述受试者样本中的选自HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1中的至少2个，优选至少5个，更优选至少10个和甚至优选至少11个基因和/或蛋白质的表达水平的试剂；和用于确定不属于上述之一的基因的表达水平的不超过20个、优选不超过12个、优选不超过10个、优选不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1个试剂。

用于确定在所述受试者样本中的所述预后基因的表达水平的试剂，可以特别包括或由以下组成：特异于所述预后基因的引物对(正向和反向引物)和/或探针(特别是标记的探针，包括特异于目标序列的核酸和与其连接的标记，特别是荧光标记)，或包含特异于所述预后基因的序列的微阵列。本领域技术人员可以根据上面公开的所述基因的序列容易地设计引物和/或探针。

在一个具体实施方案中，所述试剂盒包含用于特异性定量扩增上述定义的“预后基因”转录物的特异性扩增引物和/或探针，和/或用于检测上述定义的所述“预后基因”的核酸微阵列。

本发明还涉及一种专用于本发明体外方法的试剂盒，其包含一组引物和/或探针，所述引物和/或探针用于测量选自HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1(作为用于执行上述公开的体外方法的一组预后标记物)中的至少5个，优选至少10个以及甚至优选11个基因和/或由所述至少5个，优选至少10个以及甚至优选11个基因编码的蛋白质的表达水平。特别地，所述试剂盒包含不超过20种、优选不超过12种、优选不超过10种、优选不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1种用于确定不属于上述之一的基因的表达水平的试剂。

在第一个实施方案中，本发明的试剂盒用于执行体外方法以识别具有不良结果的B细胞淋巴瘤受试者，特别是具有不良结果但可以受益于如上公开的靶向治疗性治疗的DLBCL受试者。

在另一个实施方案中，本发明的试剂盒是用于监测在受试者中进行靶向铁代谢的治疗性治疗的疗效的体外方法，所述受试者患有高风险B细胞淋巴瘤，特别是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)并正在接受所述治疗。

用于检测具有不良结果的B细胞淋巴瘤患者，特别是DLBCL患者的试剂盒，或分别用于监测靶向治疗性治疗的疗效的试剂盒，还可以包含用于检测和/或定量根据本发明的所述目的基因或蛋白质表达所需的所有试剂。

在一个具体实施方案中，专用于DLBCL受试者的试剂盒包含一组用于测量选自HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1的11个基因和/或所述11个基因编码的蛋白质的表达水平的探针组。特别地，所述试剂盒包含不超过20种、优选不超过12种、优选不超过10种、优选不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1种用于确定不属于上述之一的基因的表达水平的试剂。试剂盒还可包含用于测定任何基因表达水平的通用试剂，例如Taq聚合酶或扩增缓冲液。

药物组合物

本发明的另一个目标是药物组合物，其包含在药学上可接受的载剂中的靶向铁代谢的分子，特别是铁螯合剂或螯合溶酶体铁的小分子，特别是选自地拉罗司、去铁胺、去铁酮、盐霉素、其类似物或衍生物，优选盐霉素和盐霉素的含氮类似物，用于治疗以下受试者的方法：B细胞淋巴瘤受试者，特别是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)或粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞淋巴瘤(又称为慢性淋巴细胞白血病，CLL)和套细胞淋巴瘤(MCL)，优选患有DLBCL的受试者。

特别地，所述药物组合物使用在用于治疗受试者的方法中，所述受试者是根据本发明的体外方法识别为根据铁评分具有不良结果并因此可能表现出B细胞淋巴瘤复发和/或死亡，优选DLBCL复发和/或死亡的受试者。

盐霉素的含氮类似物的示例在WO2016/038223中公开。

在一个具体实施方案中，铁螯合剂是式(I)的盐霉素的含氮类似物

其中：

-W选自＝O；-NR₁R₂；-NR₃-(CH₂)_n-NR₄R₅；-O-(CH₂)_n-NR₄R₅；-NR₃-(CH₂)_n-N⁺R₆R₇R₈和-O-(CH₂)_n-N⁺R₆R₇R₈；

-X选自＝O、-OH；-NR₁R₂；-NR₃-(CH₂)_n-NR₄R₅；-O-(CH₂)_n-NR₄R₅；-NR₃-(CH₂)_n-N⁺R₆R₇R₈和-O-(CH₂)_n-N⁺R₆R₇R₈，

-Y选自-OH；＝N-OH；-NR₁R₂；-NR₃-(CH₂)_n-NR₄R₅；-O-(CH₂)_n-NR₄R₅；-NR₃-(CH₂)_n-N⁺R₆R₇R₈和-O-(CH₂)_n-N⁺R₆R₇R₈，

相同或不同的R₁和R₂选自H；(C₁-C₁₆)-烷基；(C₃-C₁₆)-烯基；(C₃-C₁₆)-炔基；(C₃-C₁₆)-环烷基；芳基；杂芳基；(C₁-C₆)-烷基-芳基；(C₁-C₆)-烷基-杂芳基；或R₁表示H和R₂表示OR₉，其中R₉是H、(C₁-C₆)-烷基、芳基和(C₁-C₆)-烷基-芳基；

R₃选自H；(C₁-C₆)-烷基；(C₁-C₆)-烷基-芳基；

相同或不同的R₄和R₅选自H；(C₁-C₆)-烷基；芳基和(C₁-C₆)-烷基-芳基；

相同或不同的R₆、R₇和R₈选自(C₁-C₆)-烷基；芳基和(C₁-C₆)-烷基-芳基；

-Z是基团，例如OH；NHNR₉R₁₀；NHOC(O)R₁₁；N(OH)-C(O)R₁₁；OOH、SR₁₂；2-氨基吡啶；3-氨基吡啶；-NR₃-(CH₂)_n-NR₄R₅；和-NR₃-(CH₂)_n-OH；其中：

相同或不同的R₉和R₁₀选自H、(C₁-C₆)-烷基、芳基和(C₁-C₆)-烷基-芳基；

R₁₁选自H；(C₁-C₁₆)-烷基；(C₃-C₁₆)-烯基；(C₃-C₁₆)-炔基；芳基；杂芳基；(C₁-C₆)-烷基-芳基；(C₁-C₆)-烷基-杂芳基；

R₁₂选自H；(C₁-C₁₆)-烷基；(C₃-C₁₆)-烯基；(C₃-C₁₆)-炔基；芳基；杂芳基；(C₁-C₆)-烷基-芳基；(C₁-C₆)-烷基-杂芳基；

n＝0、2、3、4、5或6，

条件是W、X和Y中的至少一个选自-NR₁R₂；-NR₃-(CH₂)_n-NR₄R₅；-O-(CH₂)_n-NR₄R₅；-NR₃-(CH₂)_n-N⁺R₆R₇R₈和-O-(CH₂)_n-N⁺R₆R₇R₈。

有利地，相同或不同的R₁和R₂选自H；(C₁-C₁₆)-烷基，有利地(C₃-C₁₄)-烷基，更有利地(C₈-C₁₄)-烷基；(C₃-C₁₆)-烯基，有利地(C₃-C₅)-烯基；(C₃-C₁₆)-炔基，有利地(C₃-C₅)-炔基；(C₃-C₁₆)-环烷基，有利地(C₃-C₆)-环烷基；(C₁-C₆)-烷基-芳基，有利地苯甲基和(C₁-C₆)-烷基-杂芳基，有利地CH₂-吡啶炔基(pyridynl)。

有利地，R₁和R₂不都是H。

更有利地，R₁是H和R₂选自(C₁-C₁₆)-烷基，有利地(C₃-C₁₄)-烷基，更有利地(C₈-C₁₄)-烷基；(C₃-C₁₆)-烯基，有利地(C₃-C₅)-烯基；(C₃-C₁₆)-炔基，有利地(C₃-C₅)-炔基；(C₃-C₁₆)-环烷基，有利地(C₃-C₆)-环烷基；(C₁-C₆)-烷基-芳基，有利地苯甲基和(C₁-C₆)-烷基-杂芳基，有利地CH₂-吡啶炔基。

有利地，R₃选自H和(C₁-C₆)-烷基。优选地，R₃是H。

有利地，Z是OH、OOH、NHNH₂、NHOH或NH₂OH，优选OH。

在一个优选的实施方案中，铁螯合剂是如上定义的式(I)化合物，其中X是OH、Z是OH并且Y是NR₁R₂，其中R₁是H以及R₂选自(C₁-C₁₆)-烷基，有利地(C₈-C₁₄)-烷基；(C₃-C₁₆)-烯基，有利地(C₃-C₅)-烯基；(C₃-C₁₆)-炔基，有利地(C₃-C₅)-炔基；和(C₃-C₁₆)-环烷基，有利地(C₃-C₆)-环烷基；C₁-C₆)-烷基-芳基，有利地苯甲基和(C₁-C₆)-烷基-杂芳基，有利地CH₂-吡啶炔基。

在一个更优选的实施方案中，铁螯合剂是如上定义的式(I)化合物，其中，W＝O、X是OH、Z是OH并且Y是NR₁R₂，其中R₁是H以及R₂选自(C₃-C₅)-炔基和(C₃-C₆)-环烷基，优选(C₃-C₅)-炔基。

式(I)的化合物，其中W＝O、X是OH、Z是OH并且Y是NR₁R₂，其中R₁是H以及R₂是(C₃-C₅)-炔基，优选是丙炔，又称为铁霉素或专利申请WO2016/038223中公开的化合物AM5。

式(I)的化合物，其中W是＝O、X是OH、Z是OH并且Y是NR₁R₂，其中R₁是H以及R₂是(C₃-C₆)-环烷基，优选是环丙基，如专利申请WO2016/038223中公开又称为AM23。

在另一个具体实施方案中，W是＝O、X是OH、Z是OH并且Y是NR₁R₂，其中R₁是H以及R₂是(C₃-C₆)-环烷基，特别是取代的环丙基，如以下公开：

在另一个具体实施方案中，W是＝O、X是OH、Z是OH并且Y是NR₁R₂，其中R₁是H以及R₂是(C₁-C₆)-烷基-芳基，特别是被羟基取代的苯甲基，如以下公开：

在另一个具体的实施方案中，W是＝O、X是OH、Z是OH并且Y是NR₁R₂，其中R₁是H以及R₂是(C₁-C₆)-烷基-吡啶基，特别是CH₂-吡啶基，如以下公开：

化合物AM5、AM23、AV10、AV13和AV16，优选AM5是用在如以下公开的药物组合物、药物产品和治疗用途的具体优选的化合物。

用于根据本发明的用途的药物组合物包含至少一种如上定义的式(I)化合物、其药用盐、溶剂化物或水合物，以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

出于本发明的目的，术语“药学上可接受的”旨在表示对药物组合物的制备有用的物质，以及对于药物用途而言通常安全且无毒的物质。

在本发明中，术语“药学上可接受的盐、溶剂化物的水合物”旨在表示如上定义的药学上可接受的并且具有相应化合物的药理学活性的化合物的盐。

此类盐包括：

-水合物和溶剂化物，

-与无机酸(如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等)形成的酸加成盐；或与有机酸形成的酸加成盐，所述有机酸如乙酸、苯磺酸、富马酸、葡庚糖酸(glucoheptonic)、葡萄糖酸(gluconic)、谷氨酸、乙醇酸、羟基萘酸、2-羟基乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘康酸、2-萘磺酸、丙酸、琥珀酸、联苯甲酰-L-酒石酸、酒石酸、对甲苯磺酸、三甲基乙酸和三氟乙酸等，和

-当化合物中存在的酸质子被金属离子(如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)取代时形成的盐；或与有机或无机碱配位(coordinate)时形成盐。可接受的有机碱包括二乙醇胺、乙醇胺、N-甲基葡糖胺、三乙醇胺、氨丁三醇等。可接受的无机碱包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠和氢氧化钠。

根据本发明使用的药物组合物可用于口服、舌下、皮下、肌内、静脉内、经皮、局部或直肠施用。活性成分可以与常规药物载体混合以施用的单位形式施用至动物或人。当以片剂形式制备固体组合物时，将主要活性成分与药物载剂和本领域技术人员已知的其他常规赋形剂混合。

本发明的化合物可以以每天0.01mg至1000mg的剂量用于药物组合物中，以每天仅以一次的剂量施用或以一天数次的剂量(例如每天两次)施用。每日施用剂量有利地包含在5mg至500mg之间，更有利地在10mg和200mg之间。然而，也有必要使用这些范围以外的剂量，本领域的技术人员可以注意到这一点。

本发明还涉及治疗B细胞淋巴瘤受试者，特别是DLBCL受试者的方法，所述受试者优选具有通过本发明的体外方法识别为不良结果，更优选为具有通过本发明的体外方法识别为不良结果的DLBCL受试者，该方法包括(i)通过根据本发明的体外方法并基于铁评分，确定受试者是否可能复发和/或死亡，以及(ii)如果已确定受试者具有“不良结果”，则向所述受试者施用靶向铁代谢的分子。

如果已确定受试者不太可能具有“不良结果”，则该方法还可以包括向受试者施用可选择的抗癌治疗的步骤(iii)。这种可选择的抗癌治疗取决于特定的B细胞淋巴瘤和以前测试过的治疗，但可以特别选自放疗、其他化疗分子或其他生物制剂，如针对其他抗原的单克隆抗体。

在某些实施方案中，抗B细胞淋巴瘤的治疗可以包括使用抗癌化合物、放射、手术或干细胞移植的治疗。

药物产品(又称为“组合产品”)

本发明还涉及药物产品，所述药物产品包含：

作为组合产品在治疗B细胞淋巴瘤，特别是DLBCL，特别是在根据本发明的体外方法具有不良结果的DLBCL受试者中作为药物同时、分开或交错使用中的用途。

根据本发明，“用于化疗的试剂”是指又称为“化疗药物(chemo drugs)”的药物，其能够通过杀伤细胞或阻止细胞分裂来阻止癌细胞生长。

根据本发明的“用于靶向治疗的试剂”是指能够识别和攻击特定类型癌细胞且对正常细胞伤害较小的药物或其他物质。一些靶向疗法会阻断某些酶、蛋白质或其他参与癌细胞生长和扩散的分子的作用。其他类型的靶向疗法帮助免疫系统杀伤癌细胞，或将毒性物质直接递送至癌细胞从而将其杀伤。与其他类型的癌症治疗相比，靶向疗法的副作用可能更少。大多数靶向疗法是小分子药物或单克隆抗体。

根据本发明的“用于免疫疗法的试剂”是指又称为“免疫调节剂”的物质，其能够刺激或抑制免疫系统以帮助身体对抗癌症。某些类型的免疫疗法仅靶向免疫系统的某些细胞。其他以一般方式影响免疫系统。免疫疗法的类型包括，例如，细胞因子和一些单克隆抗体。

在一些实施方案中，抗癌化合物可以包括化疗药物，特别是选自长春新碱、环磷酰胺、依托泊苷、多柔比星、脂质体多柔比星、阿糖胞苷、美法仑、苯达莫司汀、顺铂、柔红霉素、氟达拉滨、甲氨蝶呤。

在一些实施方案中，抗癌化合物可以包括：

-Bcl2抑制剂，或

-PI3K抑制剂，或

-BTK抑制剂，或

-Syk抑制剂

和其混合物。

“Bcl-2(B细胞淋巴瘤2)抑制剂”是一类抑制调节蛋白质的Bcl-2家族的化合物，所述Bcl-2家族通过抑制(抗凋亡)或诱导(促凋亡)凋亡来调节细胞死亡(凋亡)。Bcl-2抑制剂用于选择性地诱导恶性细胞的凋亡。可以提及ABT-737和奈维托克(ABT-263)，优选高选择性的抑制剂维奈托克(ABT-199，CAS号1257044-40-8)，其抑制Bcl-2，但不抑制Bcl-xL或Bcl-w。

“磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂”是一类抑制一种或多种磷酸肌醇3-激酶的化合物。这些酶构成PI3K/AKT/mTOR通路的部分，该通路涉及细胞生长和生存以及在许多癌症中经常被激活的其他几个过程。通过抑制这些酶，PI3K抑制剂会导致细胞死亡，抑制恶性细胞的增殖，并干扰多种信号传导通路。可以提及艾达拉西布(CAL-101，GS-1101，CAS号870281-82-6)。

“布鲁顿酪氨酸激酶”(缩写为Btk或BTK)抑制剂，又称为酪氨酸蛋白激酶BTK抑制剂，是一类抑制在B细胞发育中起至关重要作用的酪氨酸激酶的化合物。可以提及依鲁替尼(PCI-32765，CAS号936563-96-1)。

“脾酪氨酸激酶(Syk)抑制剂”是一类抑制Syk的化合物，Syk是一种主要在造血细胞中表达的细胞质中的非受体的蛋白酪氨酸激酶(PTK)，视为是在B细胞受体信号传导通路中的关键元件。几种口服的Syk抑制剂包括福他替尼(R788)、恩妥替尼(GS-9973)、赛拉提尼(cerdulatinib)(PRT062070)和TAK-659正在临床试验中进行评估。可以特别提及恩妥替尼(GS-9973，CAS号1229208-44-9)。

在一些实施方案中，抗癌化合物可以包括蛋白酶体抑制剂，特别是选自硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)和依沙佐米(ixazomib)。

在一些实施方案中，免疫调节剂选自沙利度胺、来那度胺、泊马度胺及其衍生物。

在一些实施方案中，抗癌化合物可以包含皮质类固醇，特别选自地塞米松和强的松。

在一些实施方案中，抗癌化合物可以包含表观药物，包括组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、DNMT抑制剂、EZH2抑制剂、BET抑制剂、PRMT5抑制剂、IDH抑制剂。

在一些实施方案中，抗癌化合物可以包含单克隆抗体，特别选自利妥昔单抗和奥比妥单抗(obinutuzumab)。

在一些实施方案中，抗癌化合物可以包含使用CAR-T细胞的免疫疗法，特别是选自Tisagenlecleucel和axicabtagene ciloleucel和lisocabtagene maraleucel。

在一个具体实施方案中，对于DLBCL受试者的治疗，靶向铁代谢的分子，特别是铁螯合剂或螯合溶酶体铁的小分子(i)选自地拉罗司、去铁胺、去铁酮、盐霉素、其类似物或衍生物，优选盐霉素和如上定义的盐霉素的含氮类似物；以及其他抗癌剂(ii)选自化疗中使用的试剂(iia)，特别是环磷酰胺、多柔比星、依托泊苷、维奈托克、艾达拉西布、依鲁替尼、恩妥替尼及其组合。

在用于DLBCL治疗的一个具体优选的实施方案中，铁螯合剂(i)是如以上定义的式(I)化合物，其中，W是＝O、X是OH、Z是OH并且Y是NR₁R₂，其中R₁是H以及R₂选自(C₃-C₅)-炔基和(C₃-C₆)-环烷基，优选(C₃-C₅)-炔基，以及其他化疗化合物(ii)是多柔比星、维奈托克、艾达拉西布、依鲁替尼或恩妥替尼。

本发明的用于DLBCL治疗的另一个优选的主题是药物产品或药物组合物，其包含：

(i)如以上定义的式(I)的化合物，其中，W是＝O、X是OH、Z是OH并且Y是NR₁R₂，其中R₁是H以及R₂选自(C₃-C₅)-炔基和(C₃-C₆)-环烷基，优选(C₃-C₅)-炔基，以及

(ii)化疗化合物，其选自环磷酰胺、多柔比星、依托泊苷、维奈托克、艾达拉西布、依鲁替尼、恩妥替尼，优选多柔比星、维奈托克、艾达拉西布、依鲁替尼或恩妥替尼。

现在将通过非限制性实施例阐明本发明。

实施例

材料和方法

基因表达数据分析和铁评分的构建

参与铁生物学调节的62个基因列表是使用之前公布的数据建立的(Miller等人，2011)。

使用Compagno组公布的数据，在正常B细胞(n＝5个中心母细胞，n＝5个中心细胞)和DLBCL样本(n＝73)中查询这些基因的表达(Compagno等人，2009)。Affymetrix基因表达数据可通过在线的Gene Expression Omnibus(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)以登录号GSE12195公开获得。

参与铁代谢的相关62个基因列于下表3：

表3.

对不同样本中的所选择的62个探针组应用微阵列分析的显著性分析(其中排列(permutation)为1000、倍数变化为2和错误发现率为0％(t检验))。

使用来自两组独立队列的患者的基因表达微阵列数据，其中患者诊断为DLBCL并接受R-CHOP(利妥昔单抗与环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松)治疗。第一个队列包含233名患者(Lenz等人，2008)，第二个队列包括69名患者(Shaknovich et al.，2010)。患者的治疗前临床特征之前由G.Lenz和R.Shaknovich的小组发表。Affymetrix基因表达数据可通过在线的Gene Expression Omnibus(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)以登录号GSE10846和GSE23501公开获得。其是使用Affymetrix HG-U133 plus 2.0微阵列对两组患者队列进行。用Microarray Suite 5.0版(MAS 5.0)分析数据，使用Affymetrix默认分析设置和整体量表(global scaling)作为归一化方法。每个阵列的修剪后的平均目标强度被强制设定为500。

在每个队列中，通过对数秩检验计算铁列表中每个探针组的表达总生存期(OS)的统计显著性。使用Cox比例风险模型进行多变量分析。使用平台Genomicscape中的Kaplan-Meier方法绘制生存曲线(Kassambara等人，2015)。选择在两个队列中具有共同预后值的探针组。为了在一个参数内收集其预后信息，DLBCL的铁评分被构建为β系数加权±1(根据患者信号高于还是低于探针组的Maxstat值)的总和(Kassambara等人，2012)。

人DLBCL细胞系

16种DLBCL细胞系(U2932、OCI-LY-3、NU-DHL-1、OCI-LY-19、DB、SUDHL4、OCILY1、SUDHL5、DOHH2、SUDHL10、HT、RI-1、SU-DHL-6、NUDUL-1、WSU-DLCL-2和OCI-LY-7)购自DSMZ(Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，德国)。U2932、SUDHL-4、HT、DOHH2、SUDHL-10、RI-1、WSU-DLCL-2细胞系、维持在补充10％胎牛血清(PAA laboratory GmbH)的RPMI-1640(Gibco，Invitrogen)中，对于OCI-LY3、DB、SUDHL-5、NUDHL-1、SU-DHL-6、NUDUL-1细胞系则是20％的FBS。OCI-LY1和OCI-LY7培养在补充有20％胎牛血清的IMDM(Gibco，Invitrogen)，OCI-LY19培养在补充有20％胎牛血清的MEMα改良介质(Gibco，Invitrogen)。将培养物维持在37℃的含5％CO₂的湿润气氛中。

试剂

分别将去铁胺(来自Novartis Pharma SAS)溶解在无菌蒸馏水中至浓度为300mM，将地拉罗司(来自Selleckchem S1712)溶解在二甲亚砜(DMSO)中至浓度为50mM。将铁霉素(在专利申请WO2016/038223中也称为“AM5”)溶解在二甲亚砜(DMSO)中，浓度为10mM。埃拉斯丁(erastin)(来自Selleckchem S7242，以10mM在DMSO中)和铁锈素-1(Ferrostatin-1)(来自Selleckchem S7243，50mM的DMSO溶液)、Q-VD Oph(来自SelleckChem S7311，10mM的DMSO溶液，30秒预处理)、铁(III)六水合氯化物(31232Sigma Aldrich，0.1M的水溶液，处理后4小时)、还原型谷胱甘肽GSH(Sigma Aldrich G4251，0.1M的PBS溶液)、H₂O₂(SigmaAldrich 216763)。马磷酰胺(Mafosfamide)(环磷酰胺的替代物，Santa Cruz ChemCruzSC-211761，10mM的盐水溶液)、吉西他滨(来自Sellekchem S1149，50mM的盐水溶液)、多柔比星(来自Sellekchem S1208，20mM的DMSO溶液)、维奈托克(来自Selleckchem S8048，10mM的DMSO溶液)、艾达拉西布(来自Selleckchem S2226，50mM的DMSO溶液)、依鲁替尼(来自Selleckchem S2680，50mM的DMSO溶液)、恩妥替尼(来自Selleckchem S7523，50mM的DMSO溶液)、CIdU(abcam ab213715，20mM的水溶液)、IdU(abcam ab142581，2mM的水溶液)。

细胞活力测定

源自DLBCL的细胞系在RPMI 1640介质、10％或20％的FCS(对照介质)中在各种化合物的存在下在96孔平底微量滴定板中培养4天。使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定(Promega，Madison，WI，USA)通过Centro LB 960光度计(Berthold Technologies，BadWildbad，德国)确定培养物中活细胞的数量。

这个测试是基于对细胞内ATP存在的定量，这指示(signal)着代谢活跃的细胞的存在。数据表示为六次重复的平均百分比，针对未处理的对照进行归一化。

原代DLBCL细胞

根据《赫尔辛基宣言》和蒙彼利埃大学医院机构研究委员会的批准，在患者的书面知情同意后收集淋巴结样本。细胞取自5个DLBCL患者的淋巴结或血液。来自血液的细胞通过密度梯度分离获得，来淋巴结的细胞通过组织分离器获得并通过流式细胞术定量。

细胞以0.5×10^{^6}细胞/mL的密度培养在

Iscove的MDM(Glutamax)介质(#31980-022)中，其含有20％的FBS和抗生素-抗真菌剂(Gibco青霉素-链霉素-两性霉素B100×，#15240-096)、50ng/mL的组氨酸标签的CD40L(R&D System，2706-CL)和5μg/mL的抗组氨酸抗体(R&D System，MAB050)、

丙酮酸盐(100×，#1136-039)。细胞在解冻后24小时接种，并在72小时内用各种化合物处理。

用台盼蓝对总细胞计数，使用以下组(panel)进行染色：对CD45用V500(BD，#560777)、对κ用FITC(Dako，F0434)、对CD19用PE-Cy7(BD，#341113)、对λ用PE(Dako，R0437)、对CD3用APC-H7(BD，#641415)、对CD10用APC(BD，#332777)以及对CD20用V450(BD，#655872)，然后通过流式细胞术(Canto II流式细胞仪，BD Pharmigen)进行分析。肿瘤群体细胞门控(gate)在CD19+、CD45+、CD20+，κ或λ和非肿瘤细胞群门控在CD45+、CD19-，以及T细胞门控在在CD45+、CD3+、CD19-。

造血祖细胞集落形成单位(CFU)测定

使用单采机收集供体的流动(Mobilized)的外周血。通过免疫磁性细胞分离和荧光激活细胞分选(FACS)富集CD34+的细胞。

CD34+细胞以约250个活的细胞/mL培养在Methocult GF H84434介质(StemCell，#84434)中。使用连接到16号平头针头上的3mL注射器，将1mL混合物分配到2个35mm培养皿中。

将培养皿在37℃、5％的CO2和≥95％的湿度下温育14天。

相互作用效果的定量

在体外测试的药物之间的相互作用通过浓度矩阵测试进行了研究，评估其中每种单一药物的浓度增加以及与其他药物的所有可能组合。对于每种组合，据Bliss方程计算在效果独立的情况下，预期的生长细胞的百分比(Combes等人，2019)：

fuC＝fuA.fuB

其中fuC是在效果独立的情况下不受药物组合影响的预期细胞分数(fraction)，以及fuA和fuB分别是不受处理A和B影响的细胞分数。细胞毒性测试中活细胞分数与fuC值之间的差异视为对相互作用效果的估计，正值表示协同效应，负值表示拮抗效应。

结果：

考虑到铁代谢在癌细胞生物学中的重要作用，发明人首先旨在鉴定与DLBCL预后值相关的铁代谢基因。参与铁生物学调节的62个基因的列表提取自文献(Miller等人，2011)，如上述材料和方法中所公开(表3)。

使用Maxstat R函数和Benjamini Hochberg多重检验校正(Lausen和Schumacher，1992)，11个基因在两个独立的DLBCL患者队列(分别为n＝233和n＝181)中显示出预后值(图2A)，如上文所公开并在下表4中报告：

表4.铁评分的预后基因的探针组和名称

三个基因的高表达与良好预后相关，其包括ALAS1(氨乙酰丙酸，δ-合酶1)、HIF1A(缺氧诱导因子1，α亚基)和LRP2(低密度脂蛋白相关蛋白2)(图2B)。与之相反，八个基因的高表达与不良预后相关：HMOX1(血红素加氧酶(解环)1)、HMOX2(血红素加氧酶(解环)2)、HFE(血色病)、ISCA1(铁硫簇组装1同源物)、SLC25A37(溶质载体家族25(线粒体铁转运蛋白)，成员37)又称为MSCP(线粒体溶质载体蛋白)、PPOX(原卟啉原氧化酶)、STEAP1(前列腺六跨膜上皮抗原1)和TMPRSS6(跨膜蛋白酶，丝氨酸6)(图2C)。

接下来，我们将这些基因的预后信息组合在基于GEP的铁评分中。如之前所述，铁评分由对每个预后基因的Cox模型的β系数加权-1(根据患者MMC信号是高于还是低于探针组的Maxstat值)的总和所定义(Herviou等人，2018)。Maxstat算法将Lenz R-CHOP队列分为两组，总生存期差异最大时，39.5％的患者的铁评分>-0.168和60.5％的患者的铁评分≤-0.168(OS；图1A)。在Lenz R-CHOP队列中，具有高风险的铁评分的患者的中位OS为50.6个月，而具有低的铁评分的患者未达到(P＝3，7E-15))此值(图1A)。铁评分的预后值在另外三个独立的OS队列中得到验证(图1B、图1C和图1D)。

对患有弥漫性大B细胞淋巴瘤(R-CHOP Lenz队列，n＝233)的患者的总生存期(OS)进行Cox单变量和多变量分析。对所述预后因素使用Cox回归模型单独(A)、两两(B)或以多变量分析(所有变量)(C)进行测试。P值和风险比(HR)显示在表5中。

表5.

NS：在5％阈值时不显著。IPI组定义如下：低风险组＝IPI评分为0或1，低中风险组＝IPI评分为2，高中风险组＝IPI评分为3，高风险组＝IPI评分为4或5。IPI，国际预后指数。GCB，生发中心B细胞样亚组。ABC，激活的B细胞样亚型。

ABC DLBCL患者的铁评分相较于GCB显著更高(图1E)。在多变量COX分析中，将DNA修复评分和其他不良结果相关因素(如GCB或ABC亚型、年龄和IPI)进行比较，铁评分仍然是独立的预后因素。GSEA分析显示，铁评分定义的高风险患者与MYC靶基因和嘌呤代谢的显著富集相关。铁评分定义的低风险DLBCL患者在参与免疫反应的基因中表现出显著富集。总之，这些数据强调了铁代谢基因的失调与DLBCL的不良结果相关。靶向铁代谢可能代表对于高风险DLBCL患者的新的潜在治疗途径。

靶向铁代谢诱导DLBCL细胞毒性

根据这些结果，我们使用两种ABC细胞系(OCI-LY3和U-2932)以及两种GCB细胞系(DB和SUDHL-5)研究了铁螯合剂去铁胺和地拉罗司的治疗效果。用去铁胺或地拉罗司处理后，发现在细胞活力上的浓度依赖性降低。对OCI-LY3、DB、U2932和SUDHL5细胞使用去铁胺获得的50％抑制浓度(IC₅₀)值分别为3.75μM、3.24μM、2.42μM和1.55μM(图3A)。针对OCI-LY3、DB、U2932和SUDHL5细胞使用地拉罗司获得的50％抑制浓度(IC₅₀)值分别为9.50μM、13.9μM、4.79μM和1.48μM(图3B)。

表6.铁螯合剂和铁霉素的50％抑制浓度(IC₅₀)比较，以μM计

铁霉素是盐霉素的合成衍生物，通过在溶酶体中积累和螯合铁，对癌症产生治疗作用(Mai等人，2017)。与去铁胺和地拉罗司相比，铁霉素处理诱导细胞活力发生浓度依赖性地降低，具有纳摩尔级的IC₅₀值(在OCI-LY3、DB、U2932和SUDHL5细胞中分别为16.8nM、17.2nM、30.4nM和28.9nM)(图3C)。

我们将分析扩展到16个DLBCL细胞系的大组。将16个DLBCL细胞系的组与浓度增加的铁霉素或载剂一起温育96小时。下表7显示铁霉素对16个DLBCL细胞系的50％抑制浓度(IC₅₀)。有趣的是，所有DLBCL细胞系表现出纳摩尔浓度的IC₅₀(范围：7.2–91.5nM)。

表7.

发明人进一步研究了铁补充对由这些处理所诱导的细胞死亡的影响。根据患者可达到的最大血浆浓度选择铁螯合剂浓度(Nisbet-Brown等人，2003)。发明人在通过膜联蛋白V和PARP切割(cleavage)监测，证明铁螯合剂和铁霉素在OCI-LY3和DB细胞系中诱导细胞凋亡。铁补充剂显著抑制铁螯合剂对DLBCL细胞凋亡的影响(去铁胺和地拉罗司处理分别为P<0.05和P<0.01)。然而，铁补充剂不影响铁霉素诱导的对DLBCL细胞的细胞毒性。

发明人还探索了参与铁霉素诱导的DLBCL细胞死亡相关的机制，并表明：

-铁霉素处理诱导DLBCL细胞系凋亡，其被喹啉-Val-Asp-二氟苯氧基甲基酮(Oph-Q-VD)泛半胱天冬酶(pan-caspase)抑制剂部分抑制(P<0.001)；铁霉素诱导的细胞凋亡与半胱天冬酶-3和-7的激活有关，可以通过添加Oph-Q-VD来拯救；

-铁霉素在DLBCL细胞中诱导铁凋亡(ferroptosis)，Bodipy-C11染色强调表明存在脂质过氧化。此外，铁凋亡抑制剂铁锈素-1可以部分预防铁霉素诱导的细胞死亡(Dixon等人，2012)。铁锈素在DLBCL细胞中没有表现出显著的毒性，但消除了埃拉斯丁(用作阳性对照的铁凋亡诱导剂)的作用。Oph-Q-VD和Fer-1的组合不能完全消除铁霉素介导的毒性，这表明其他机制可能参与铁霉素诱导的细胞死亡；

-发明人还研究铁霉素处理是否诱导DLBCL细胞中的自噬。他们监测了用铁霉素(100nM)处理DLBCL细胞24小时后，自噬相关蛋白LC3I-II(Orhon和Reggiori，2017)的表达，而BIX-01294用作阳性对照(Ding等人，2013)，并发现在铁霉素处理后，在DLBCL细胞中LC3BII点(puncta)明显增加(P<0.0001)；

-最后，用铁螯合剂或铁霉素处理OCI-LY3和DB DLBCL细胞，诱导ROS产生，使用荧光素探针5-(和-6)-氯甲基-2′,7′-二氯二氢荧光素二醋酸-乙酸酯(CM-H2DCFDA)染色进行监测。铁霉素介导的ROS产生部分被铁锈素(ferrostin)抑制，但不被谷胱甘肽(GSH)抑制。毛壳素(chaetocin)被用作GSH抑制ROS产生的阳性对照(Isham等人，2007)。

总之，这些结果表明铁霉素通过铁凋亡、自噬诱导对DLBCL的细胞毒性。

铁霉素影响DLBCL细胞分裂并诱导DNA损伤反应。

为了研究铁剥夺对DLBCL细胞增殖的影响，用铁螯合剂和铁霉素处理OCI-LY3和DB细胞系，并在72小时评估细胞周期分布。铁螯合剂地拉罗司通过阻断BrdU结合以及增加G0/G1期，而显著影响了存活细胞的细胞周期分布(P<0.01)。用铁霉素也有同样的结果(图4A和图4B)。

考虑到铁在DNA复制中的作用，研究了铁耗竭对自发DNA损伤的影响。有趣的是，铁螯合剂和铁霉素诱导DNA双链断裂，这被γH2AX病灶(foci)的形成和蛋白质印迹监测到的H2AX磷酸化增加得以证明(图4C、图4D)。

真核细胞含有大量需要铁的蛋白质，如铁硫(Fe-S)簇蛋白、血红蛋白和核糖核苷酸还原酶，其在DNA复制中起关键作用并需要铁作为辅因子(Zhang，2014)。发明人接下来使用DNA纤维分析监测铁霉素对DLBCL细胞中叉(fork)进展的影响。为此，DLBCL细胞系用10μM的IdU和100μM的CldU进行脉冲标记，并测量CldU轨迹(track)的长度以估计脉冲期间单个叉覆盖的距离。有趣的是，与对照细胞相比，铁霉素处理后CldU轨迹的长度显著缩短(P<0.0001；图5A和图5B)。这些数据表明，有缺陷的叉进展解释了铁霉素处理介导的DLBCL细胞中自发DNA损伤的增加。吉西他滨用作阳性对照。铁霉素的铁螯合也与DNA单链和复制压力的积累有关，这可以通过复制蛋白A亚基2(RPA2)在苏氨酸21位的磷酸化增加得以证明(图4E)。由于已知铁在dN合成中起关键作用(Torti和Torti，2013)，本发明人研究了dN补充对铁霉素处理的细胞中复制叉进程的影响。补充脱氧核苷酸部分逆转了铁霉素诱导的复制叉延迟(图5C-图5D)。

铁剥夺诱导原代DLBCL细胞的细胞死亡，并使用DLBCL处理的化合物(多柔比星、维奈托克、依鲁替尼、恩妥替尼、艾达拉西布)增强。

为了证实铁剥夺对DLBCL具有治疗意义，DLBCL患者的原代样本与其微环境中的重组CD40L培养在一起(在存在或不存在50nM和100nM铁霉素的情况下)。铁霉素处理分别在50nM和100nM时，活的原代DLBCL细胞的中位数显著降低了63.1％(P＝0.02，N＝5)和67.1％(P＝0.006，N＝5)(图6B和图7A&图7B)。有趣的是，与来自微环境的正常细胞相比，铁霉素在DLBCL细胞中表现出更高的毒性(图7C)。

然后，发明人研究了将铁霉素与DLBCL中通常使用的常规药物(例如，多柔比星、依托泊苷、环磷酰胺、维奈托克、依鲁替尼、恩妥替尼、艾达拉西布)组合的潜力。

用增加浓度的铁霉素和增加浓度的常规化疗剂处理细胞。应用来自活力(viability)矩阵的Bliss方程构建协同矩阵(Combes等人，2019)。铁霉素显著地增强多柔比星在DLBCL细胞中的毒性(图6A)。这些数据在患者的原代样本中进行验证(图6B)。与单药疗法相比，铁霉素与多柔比星的组合表现出显著更高的毒性(P<0.05，N＝5)，活DLBCL细胞减少了92.3％(图6B)。为了研究铁霉素相关的造血毒性，用来自5个正常供体的单采血的CD34⁺细胞进行造血祖细胞集落形成单位测定。细胞培养在具有或没有常规化疗(5μM的4-OH-环磷酰胺或200nM的多柔比星)或铁霉素(10、50或100nM)的羟甲基纤维素介质中。与对照相比，环磷酰胺和多柔比星诱导了平均生长的祖细胞的81.8％和99％的主要毒性。以10nM使用铁霉素处理时，对CFU-C、CFU-E和CFU-GM形成(N＝5)没有表现出显著毒性。与常规化疗相比，用50和100nM的铁霉素处理表现出显著降低的造血毒性(图6C)。

发明人在不同的源自DLBCL细胞系(U2932、DB和OCI-LY3)上，测试了将铁霉素与DLBCL中使用的常规化学疗法联合的治疗意义。有趣的是，当铁霉素与维奈托克Bcl2抑制剂联合使用时，发现了协同效应(图8)。还发现，当铁霉素与BTK抑制剂依鲁替尼(图9)、Syk抑制剂恩妥替尼(图10)和PI3K抑制剂艾达拉西布(图11)联合使用时，会产生协同效应。这些强调了铁霉素与DLBCL治疗所用的常规药物联合使用的治疗意义。

总而言之，这些数据表明，通过铁评分识别具有高风险的DLBCL患者亚组可以受益于单独使用的靶向铁稳态的铁霉素，或铁霉素与多柔比星的联合使用。

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Claims

1.铁评分作为预后标记物在患有DLBCL的受试者中的用途，特别是用于识别具有不良结果(例如，复发和/或死亡)的受试者中的用途，所述铁评分基于选自参与铁代谢的HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1的至少2个基因，特别是至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因的表达水平。

2.一种用于识别具有不良结果但可以受益于靶向铁代谢的治疗性治疗的DLBCL受试者的体外方法，其包括步骤：

a)在获自所述受试者的生物样本中，测量选自参与铁代谢的HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1中的至少2个，特别是至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因和/或由所述至少1个，特别至少5个，优选至少10个和甚至优选11个基因编码的蛋白质的表达水平；

b)从在步骤a)中获得的所述表达水平计算评分值

c)根据所述评分值与预定参考值(PRV)的比较，对所述具有不良结果的受试者进行分类和识别。

3.根据权利要求2所述的体外方法，其中所述靶向铁代谢的治疗性治疗选自铁螯合剂和螯合溶酶体铁的小分子，特别选自地拉罗司、去铁胺、去铁酮、盐霉素、其类似物或衍生物，优选盐霉素和盐霉素的含氮衍生物。

4.一种专用于权利要求1至3中任一项所述的体外方法的试剂盒，包括或由以下组成：用于确定在所述受试者样本中的选自HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1中的至少2个，优选至少5个，更优选至少10个和甚至优选至少11个基因和/或蛋白质的表达水平的试剂。

5.根据权利要求4所述的专用于DLBCL受试者的试剂盒，其包含一组引物和/或探针，其用于测量选自HMOX2、PPOX、TMPRSS6、HFE、SLC25A37、STEAP1、ISCA1、HMOX1、LRP2、HIF1A和ALAS1中的至少5个，优选至少10个以及甚至优选11个基因和/或由所述至少5个，优选至少10个以及甚至优选11个基因编码的蛋白质的表达水平。

6.一种药物组合物在用于治疗患有弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的受试者的方法中的用途，所述药物组合物包含在药学上可接受的载剂中的靶向铁代谢的分子，特别是铁螯合剂或螯合溶酶体铁的小分子，特别是选自地拉罗司、去铁胺、去铁酮、盐霉素、其类似物或衍生物，优选盐霉素和盐霉素的含氮类似物。

7.权利要求6所述的药物组合物在治疗受试者的方法中的用途，所述受试者使用权利要求2所述的体外方法根据铁评分被识别为具有不良结果并因此可能表现出DLBCL复发和/或死亡。

8.根据权利要求6或权利要求7所述的药物组合物的用途，其中所述铁螯合剂是式(I)的盐霉素的含氮类似物，

其中：

R₃选自H；(C₁-C₆)-烷基；(C₁-C₆)-烷基-芳基；

n＝0、2、3、4、5或6，

9.根据权利要求8所述的药物组合物用于权利要求7或8所述的用途，其中所述铁螯合剂是如权利要求8所定义的式(I)的化合物，其中X是OH，Z是OH并且Y是NR₁R₂，其中R₁是H以及R₂选自(C₁-C₁₆)-烷基，有利地(C₈-C₁₄)-烷基；(C₃-C₁₆)-烯基，有利地(C₃-C₅)-烯基；(C₃-C₁₆)-炔基，有利地(C₃-C₅)-炔基和(C₃-C₁₆)-环烷基，有利地(C₃-C₆)-环烷基。

10.根据权利要求9所述的药物组合物用于权利要求6或7所述的用途，其中所述铁螯合剂是如权利要求8所定义的式(I)化合物，其中W是＝O，X是OH，Z是OH并且Y是NR₁R₂，其中R₁是H以及R₂选自(C₃-C₅)-炔基和(C₃-C₆)-环烷基，优选(C₃-C₅)-炔基。

11.一种药物产品，其包含：

作为组合产品用于作为药物同时、分开或交错使用以治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，特别是根据权利要求2所述的体外方法中具有不良结果的DLBCL受试者。

12.根据权利要求11所述的药物产品在治疗DLBCL中的用途，其中所述靶向铁代谢的分子，特别是铁螯合剂或螯合溶酶体铁的小分子(i)选自地拉罗司、去铁胺、去铁酮、盐霉素、其类似物或衍生物，优选如权利要求9至11所定义的盐霉素和盐霉素的含氮类似物；以及所述其他抗癌剂(ii)选自化疗中使用的试剂(iia)，特别是环磷酰胺、多柔比星、依托泊苷、维奈托克、艾达拉西布、依鲁替尼、或恩妥替尼及其组合。

13.根据权利要求12所述的药物产品的用途，其中铁螯合剂(i)是权利要求10所定义的式(I)的化合物，其中，W是＝O、X是OH、Z是OH并且Y是NR₁R₂，其中R₁是H以及R₂选自(C₃-C₅)-炔基和(C₃-C₆)-环烷基，优选(C₃-C₅)-炔基，以及其他化疗化合物(ii)是多柔比星、维奈托克、艾达拉西布、依鲁替尼或恩妥替尼。

14.一种药物产品或组合物，其包含：

(i)如权利要求8所定义的式(I)的化合物，其中，W是＝O、X是OH、Z是OH并且Y是NR₁R₂，其中R₁是H以及R₂选自(C₃-C₅)-炔基和(C₃-C₆)-环烷基，优选(C₃-C₅)-炔基，以及

(ii)化疗化合物，其选自环磷酰胺、多柔比星、依托泊苷、艾达拉西布、依鲁替尼或恩妥替尼，优选多柔比星、艾达拉西布、依鲁替尼或恩妥替尼。