CN115297717A

CN115297717A - 具有高极限糊精酶活性的大麦植物

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Publication number: CN115297717A
Application number: CN202180018547.2A
Authority: CN
Inventors: 奥利·奥尔森; 芬恩·洛克; 索伦·克努森; L·马里; A·斯特里贝克; P·R·佩达斯; J·A·奎斯特-塞约; H·汤姆森; K·B·布劳内
Original assignee: Carlsberg AS
Current assignee: Carlsberg AS
Priority date: 2020-03-02
Filing date: 2021-03-01
Publication date: 2022-11-04
Anticipated expiration: 2041-03-01
Also published as: MX2022010777A; IL296009A; CN115297717B; KR20220148185A; AU2021231112A1; BR112022015008A2; CO2022012415A2; AR121488A1; EP4114170A1; US20230111237A1; JP2023516327A; CA3167028A1; WO2021175786A1

Abstract

本发明提供了一种具有高极限糊精酶活性的大麦植物或其部分。特别地，提供了携带HvLDI基因中的突变的大麦植物。此外，描述了从所述大麦植物或其部分制备的植物产品以及生产它们的方法。

Description

具有高极限糊精酶活性的大麦植物

技术领域

本发明涉及提供具有高游离极限糊精酶活性的大麦植物的领域。特别地，本发明涉及具有含高游离极限糊精酶活性的谷粒的大麦植物。此类植物的谷粒有利于生产具有增加的可发酵糖量的基于大麦的液体提取物，例如麦芽汁。本发明进一步涉及生产基于大麦的饮料如啤酒、威士忌、伏特加或maltina的方法，以及从本发明的大麦植物制备的产品。

发明背景

发芽是植物从种子生长的过程的初始部分。为了做到这一点，谷粒需要控制繁多的酶。一些酶参与将胚乳中的淀粉降解为麦芽糖和葡萄糖，而麦芽糖和葡萄糖又充当植物胚胎的能量来源。同样的过程产生可发酵糖，这些糖可以从发芽的谷粒或麦芽中被提取出来，并在酿造过程中被酵母用来生产醇。

淀粉是一种由两种形式的葡萄糖链组成的碳水化合物：主要是直链的直链淀粉(amylose)和支链的支链淀粉(amylopectin)。直链淀粉和支链淀粉的直链部分可以被不同种类的淀粉酶降解成可发酵糖。然而，淀粉酶通常不能降解其分支点周围的支链淀粉。因此，淀粉酶活性不足以实现从淀粉中有效释放可发酵糖。

极限糊精酶(limit dextrinase，LD)是一种糖苷水解酶，其催化淀粉分支点的水解，产生直链淀粉片段，从而增加淀粉酶底物的可用性。LD特异性催化例如支链淀粉或支链糊精中α-1,6键的水解。这种酶的水解作用导致形成直链的α-1,4-连接的葡萄糖链，通过α-淀粉酶和β-淀粉酶的联合作用，可将其深度解聚成葡萄糖和麦芽糖。

LD的活性被认为至少部分受其抑制剂极限糊精酶抑制剂(limit dextrinaseinhibitor，LDI)控制。LDI被认为结合和失活LD。

低水平的LD活性通常会导致淀粉的低降解，这在谷粒灌浆期间是有利的，并允许足够水平的淀粉在谷粒中积聚。在酿造过程中，发芽的大麦谷粒或麦芽的提取物用作酵母发酵的底物，并且通常需要含有高水平可发酵糖的提取物。没有LD的作用，支链糊精和支链淀粉不能被酵母有效发酵。

文献已表明，大麦植物中通过反义物下调LDI对大麦谷粒的健康具有深远的影响，表现为粒重降低、每粒大麦谷粒中淀粉颗粒数量减少和淀粉合成改变，包括增加的直链淀粉与支链淀粉比率，支链淀粉结构的变化，其表现为支链淀粉的支链长度改变(9至15个残基的链更多，而30至60个残基的长链更少)和小B型淀粉颗粒的水平降低(参见Y.Stahl等人，2004年)。

已经使用大麦LD-LDI复合物的晶体结构研究了LD和LDI之间的相互作用。已经进行了LDI和LD突变体的体外结合研究，对LDI中的4个不同位置进行突变，并显示K_D的些许到大量增加(参见M

等人，2015)，但是这些突变体都没有在体内进行检测，因此无法评估这些突变是否会影响谷粒健康，或者体外结果是否能够转化为对谷粒中可发酵糖水平的体内影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有高LD活性的谷粒的大麦植物，尤其是在发芽期间和进行制麦(malting)时，其中所述大麦植物同时是健康的，并例如具有与野生型大麦植物相当的产量和粒重。此类大麦植物在生产基于大麦/麦芽的饮料如啤酒中将非常有用。

具有高LD活性的谷粒的大麦植物可用于生产基于大麦/麦芽的饮料，例如啤酒、威士忌、伏特加或maltina。一个优点是，从具有高LD活性的大麦植物的谷粒和/或麦芽制备的水性提取物，例如麦芽汁，具有高含量的可发酵糖。因此，通过使用本发明的谷粒和/或麦芽，可以减少或甚至完全消除糖化(mashing)期间添加外源极限糊精酶或短梗霉聚糖酶(pullulanase)的需要。此外，发酵含有高含量可发酵糖的水性提取物在酿造过程中是一个优势，因为它增加了每个所使用谷粒量生产的啤酒量，并增加了每粒重每百公升的ABV％(相对于体积的醇)。此外，来自本发明的大麦植物的具有增加的游离大麦极限糊精酶(Hordeum vulgare limit dextrinase，HvLD)活性的谷粒和/或麦芽可用于制麦过程，其中如例如WO 2018/001882中所述，缩短了发芽时间。

令人惊讶的是，本发明提供了携带LDI基因中的突变的大麦植物，其中所述植物是健康的，并且具有与野生型大麦植物相当的谷粒产量、谷粒大小和谷粒支链淀粉支链长度，但同时具有高LD活性。此类大麦植物可用作用于制备具有高含量可发酵糖的提取物的原材料。

具体地，本发明显示大麦极限糊精酶抑制剂(Hordeum vulgare limitdextrinase inhibitor，HvLDI)基因中的某些突变编码突变的HvLDI多肽，其在体外与HvLD的结合降低。结合HvLD的能力降低导致游离LD增加，从而导致体内LD活性更高，这转而导致通过使用来自携带HvLDI多肽中的本发明的突变的大麦植物的谷粒制备的水性提取物中可发酵糖的含量更高。重要的是，与此同时，在携带HvLDI基因中的本发明的突变的大麦植物中未观察到谷粒大小、谷粒支链淀粉支链长度和谷粒产量的差异。

因此，本发明提供了一种大麦植物或其部分，其中所述大麦植物携带HvLDI基因中的突变，其中所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变是以下突变之一

a.导致HvLDI多肽的一个或多个环区中的脯氨酸变为不同的氨基酸的错义突变，其中所述环区选自对应于SEQ ID NO:1的位置25至44的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置56至62的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置77至78的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置91至111的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置124至147的氨基酸；或

b.导致wt HvLDI的一个或多个α螺旋区中带负电荷的氨基酸变为不带负电荷的氨基酸的错义突变，其中所述α螺旋区选自对应于SEQ ID NO:1的位置45至55的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置63至76的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置79至90的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置112至123的氨基酸。

本发明进一步提供植物产品，例如从本发明的大麦植物制备的谷粒、麦芽、麦芽汁或饮料。

此外，公开了制备麦芽的方法，其中所述方法可以包括以下步骤：

a.提供本发明的大麦植物的谷粒；

b.在预定条件下浸泡所述谷粒并使之发芽；

c.任选地，干燥所述发芽的谷粒。

此外，公开了生产水性提取物的方法，其中所述方法可以包括以下步骤：

a.提供本发明的大麦植物的谷粒和/或从这样的大麦植物制备的麦芽；

b.制备所述谷粒和/或所述麦芽的水性提取物，例如麦芽汁。

此外，公开了生产饮料的方法，其中所述方法可以包括以下步骤：

a.提供本发明的大麦植物的谷粒和/或从这样的大麦植物制备的麦芽和/或从这样的大麦植物和/或麦芽制备的水性提取物；

b.将所述水性提取物加工成饮料，例如通过发酵或与其他饮料组分混合。

此外，公开了制备本发明的大麦植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a.提供大麦谷粒；和

b.随机诱变所述大麦谷粒，

c.选择携带突变的HvLDI基因的大麦谷粒或其部分，所述突变的HvLDI基因编码携带以下突变之一的突变体HvLDI多肽：

i.导致HvLDI的一个或多个环区中的脯氨酸变为不同的氨基酸的错义突变，其中所述环区选自对应于SEQ ID NO:1的位置25至44的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置56至62的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置77至78的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置91至111的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置124至147的氨基酸；或

ii.导致wt HvLDI的一个或多个α螺旋区中带负电荷的氨基酸变为不带负电荷的氨基酸的错义突变，其中所述α螺旋区选自对应于SEQ ID NO:1的位置45至55的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置63至76的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置79至90的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置112至123的氨基酸。

附图说明

图1：显示了野生型(wt)HvLDI或突变体HvLDI在体外测定中抑制wt HvLD活性的能力。A)wt LDI(无突变)，B)HvLDI突变体(P60L)，C)HvLDI突变体(P60S)，D)HvLDI突变体(V66M)和E)HvLDI突变体(E68K)。Y轴显示HvLD的活性百分比。X轴显示体外测定中使用的wtHvLDI或突变的HvLDI的量(μM)。wt HvLDI和突变体HvLDI抑制重组表达的HvLD的效力通过测定期间释放的发色团的量来评估。将测定期间释放的发色团的量与完全活性HvLD的释放量进行比较，并用于计算保留活性。将活性相对于测定中使用的HvLDI浓度进行作图，并将数据用sigmoidal响应曲线进行拟合。

图2：显示了来自突变体大麦植物HENZ-16a(P60S)和HENZ-18(V66M)以及它们的对照Paustian，和突变体大麦植物HENZ-31(E68K)以及其对照Planet的谷粒经发芽72小时的水解酶活性。根据实施例3中描述的发芽方案使谷粒发芽。在实验中包括EBC19作为额外对照。A)显示α-淀粉酶的总量。B)显示β-淀粉酶的总量。C)显示极限糊精酶和游离极限糊精酶的总量，以及游离极限糊精酶与总极限糊精酶之间的比率，以％计。

图3：显示了来自突变体大麦植物HENZ-16a(P60S)及其对照Paustian，和突变体大麦植物HENZ-31(E68K)及其对照Planet的经flex麦芽制麦的谷粒中的水解酶活性。根据实施例5中描述的方法将谷粒制麦。A)显示α-淀粉酶的总量。B)显示β-淀粉酶的总量。C)显示极限糊精酶和游离极限糊精酶的总量，以及游离极限糊精酶与总极限糊精酶之间的比率，以％计。

图4：显示了来自突变体大麦植物HENZ-16a(P60S)及其对照Paustian的经VLB制麦的谷粒中的水解酶活性。根据实施例6对谷粒进行VLB制麦。在实验中包括比尔森(pilsner)麦芽作为额外对照。A)显示α-淀粉酶的总量。B)显示β-淀粉酶的总量。C)显示极限糊精酶和游离极限糊精酶的总量，以及游离极限糊精酶与总极限糊精酶之间的比率，以％计。

图5：显示了经flex制麦的谷粒中的动力学测量。实心圆圈和三角形分别表示HENZ-16a(P60S)中游离极限糊精酶的量和极限糊精酶的总量。空心圆圈和三角形分别表示Paustian中游离极限糊精酶的量和极限糊精酶的总量。

图6：显示了来自经flex制麦的HENZ-16a(P60S)、Paustian和EBC19的麦芽汁中的糖分分析。A)显示总可发酵糖(TFS)，即果糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖的量(PPM)。条形上方的数字代表TFS的总量。B)显示不同麦芽汁中存在的每种糖的量。条形上方的数字代表HENZ-16a(P60S)和Paustian之间的差异百分比。

图7：显示了来自经VLB制麦的HENZ-16a(P60S)、Paustian和EBC19以及比尔森麦芽的麦芽汁中的糖分分析。A)显示总糖(TFS)，即果糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖的量(PPM)。条形上方的数字代表TFS的总量。来自HENZ-16a(P60S)的经VLB制麦的谷粒的麦芽汁具有比来自Paustian的经VLB制麦的谷粒的麦芽汁多7.2％的TFS。B)显示来自经VLB制麦的HENZ-16a(P60S)和Paustian的麦芽汁中存在的每种糖的量。条形上方的数字代表HENZ-16a(P60S)和Paustian之间的差异百分比。

图8：A)和C)显示了来自HENZ-16a(P60S)和HENZ-31、Planet和Paustian大麦植物的谷粒中支链淀粉的链长分布分析。B)和D)显示了突变体大麦植物与其对照之间的峰面积差异(丹麦，2017年)。HvLDI突变体大麦植物和对照植物于2017产季在丹麦的邻近地块种植。可以得出结论，HvLDI突变体大麦植物(HENZ-16a和HENZ-31)与它们各自的对照之间的DP没有显著差异。DP：聚合程度。

图9：A)和C)显示了来自HENZ-16a和HENZ-31大麦植物的谷粒中支链淀粉的链长分布分析。B)和D)显示了突变体大麦植物与其对照之间的峰面积差异(新西兰2017-18)。HvLDI突变体大麦植物和对照植物于2017/2018产季在新西兰的邻近地块种植。可以得出结论，HvLDI突变体大麦植物(HENZ-16a和HENZ-31)与它们各自的对照之间的DP没有显著差异。DP：聚合程度。

发明详述

定义

如本文所用，"一"可表示一个或多个，这取决于其所使用的上下文。

如本文所用，术语“通气(aeration)”是指向给定物质供应包含氧气的气体，例如纯氧或空气。水性溶液(例如水)的通气优选通过使所述气体通过水来进行，例如通过在包含水性溶液的容器的底部和/或下部引入气体。通常，气体将在水性溶液中扩散并从水性溶液顶部离开水性溶液。空气静置(air-rest)期间大麦谷物的通气可以例如通过将气体引导通过大麦谷粒床和/或使所述气体流通过大麦谷粒床的表面来进行。

如本文所用的术语"氨基酸"是指蛋白原氨基酸。优选地，蛋白原氨基酸是由标准遗传密码编码的20种氨基酸之一。IUPAC单字母代码和三字母代码用于命名氨基酸。

当在本文中与数值相关使用时，术语"大约"优选地意指±10％，更优选地±5％，还更优选地±1％。

术语"直链淀粉"是指α-D-葡萄糖的均聚物。直链淀粉具有线性分子结构，因为其葡萄糖单元几乎仅通过α-1-4糖苷键连接。

术语"支链淀粉"是指α-D-葡萄糖的均聚物。支链淀粉分子含有频繁的α-1-6糖苷键。这些将分支点引入到α-1-4-连接的葡萄糖链中，导致沿着分子的轴以规则的间隔出现的平行链簇。

术语“空气静置(air rest)”是指发芽过程中在谷粒已浸泡在水(水性溶液)中的阶段之后的阶段。在空气静置阶段，水从谷粒中排出，并且谷粒被允许静置。优选地，谷粒的水分在该阶段期间保持在20％以上，更优选地在30％以上，甚至更优选地在40％以上。在一些实施方案中，在空气静置期间对谷粒进行通气。优选地，使湿空气或湿氧气在空气静置期间通过谷粒。温度可以是任何合适的温度，优选温度保持在20至28℃之间。

涉及制造基于大麦的饮料例如啤酒的过程的术语“大麦”，尤其是当用于描述制麦过程时，是指大麦谷粒。在所有其他情况下，除非另有说明，否则“大麦”是指大麦植物(Hordeum vulgare)，包括任何育种系或栽培品种或品种，而大麦植物的部分可以是大麦植物的任何部分，例如任何组织或细胞。

术语“不同的氨基酸”涵盖蛋白原氨基酸，例如由标准遗传密码编码的20种氨基酸中的一种或多种。

如本文所用，术语“DP”或“聚合程度”表示支链淀粉侧链中α-1,4-连接的葡萄糖单元的数量。

如本文所用，“可发酵糖”是指微生物可以利用或发酵的任何糖。具体地，可发酵糖是单糖、二糖和短寡糖，包括但不限于葡萄糖、果糖、麦芽糖、麦芽三糖和蔗糖，它们可以被微生物尤其是酵母或乳酸菌发酵以产生乙醇或乳酸。

如本文所用，“总可发酵糖”或“TFS”是指果糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖。因此，TFS的量是果糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖的总量。

如本文所用，术语“极限糊精酶”描述了属于酶类别EC 3.2.1.142的糖水解酶。该酶是一种淀粉脱支酶，其催化支链淀粉和糖原的α-极限糊精和β-极限糊精、支链淀粉和短梗霉聚糖中的1,6-α-D-糖苷键水解。在糖化过程中，游离极限糊精酶的可用性预计会影响可发酵糖从淀粉中的释放，尤其是如果淀粉高度支化(参见，例如，Calum等人2004J InstBrewing 110(4):284-296)。具体地，极限糊精酶可以是UniProt登录号Q9FYY0下可获得的序列的多肽或共有至少90％，例如至少95％的序列同一性的其功能同源物。

如本文所用，术语“极限糊精酶抑制剂”或“LDI”描述了结合并阻止淀粉脱支酶极限糊精酶的酶作用的多肽，参见例如Y Stahl等人2007Plant Science172(3):452-561。

当在本文中使用时，术语“游离极限糊精酶活性”或“游离LD活性”意指不被极限糊精酶抑制剂结合的极限糊精酶。当极限糊精酶和极限糊精酶抑制剂以复合物结合在一起时，极限糊精酶不能发挥其酶促作用。而未与极限糊精酶抑制剂结合的极限糊精酶是游离的并且可以发挥其酶促活性。如果没有另外说明，术语“极限糊精酶活性”是指“游离极限糊精酶活性”。

当在本文中使用时，术语“总极限糊精酶”代表不被极限糊精酶抑制剂结合的游离极限糊精酶和被极限糊精酶抑制剂结合的失活极限糊精酶。因此，总极限糊精酶是指结合和未结合形式的极限糊精酶。

如本文所用，术语“糊化温度”是指淀粉在热的影响下在水中失去其半结晶结构并形成凝胶的温度范围的峰值温度。优选地，糊化温度如下文实施例4中所述来确定。提及具有特定糊化温度的谷物是指包含具有所述糊化温度的淀粉的谷物。

如本文所用，术语"发芽的谷粒"是指已经发育有可见的嫩芽的谷粒。

如本文所用，术语"开始发芽"是指含水量小于15％的大麦谷粒与足够的水接触以开始发芽的时间点。

术语“谷粒”定义为包括谷物颖果，也称为内部种子。此外，谷核可以包括外稃和内稃。在大多数大麦品种中，外稃和内稃附着在颖果上，并且是脱粒后谷核的一部分。然而，也有裸大麦品种。在这些中，颖果没有外稃和内稃，像小麦一样自由脱粒。术语“谷粒”和“谷核”在本文中可互换使用。

如本文所用，术语"制麦"是指在受控环境条件下发生的谷物谷粒(尤其是大麦谷粒)的受控发芽。在一些实施方案中，"制麦"可以进一步包括干燥所述发芽的谷物谷粒的步骤，例如通过窑烧干燥。制麦过程诱导例如α-淀粉酶和极限糊精酶的水解酶活性。

如本文所用，术语“麦芽”是指经过制麦的谷物谷粒。

“糖化”是将磨碎的麦芽(例如，绿麦芽或窑烧干燥麦芽)和/或未发芽的谷物谷粒在水中温育。糖化优选在特定温度和特定体积的水中进行。该过程允许提取麦芽和/或谷粒的糖、寡糖和多糖、蛋白质和其他化合物，并允许将提取物中的寡糖和多糖(特别是淀粉)酶促水解成可发酵糖。

如本文所用，术语“错义突变”是指核苷酸序列中的一个/多个突变，其导致由所述核苷酸序列编码的多肽中的一个氨基酸变为另一个。

"突变"包括基因的编码区和非编码区中的缺失、插入、取代、颠换和点突变。缺失可以是整个基因的缺失，或者仅是基因的一部分的缺失。点突变可涉及一个碱基对的变化，并可产生提前的终止密码子、移码突变、剪接位点突变或氨基酸取代。包含突变的基因当与野生型基因相比时可以称为"突变体基因"。在本发明中，突变体基因通常编码具有不同于野生型的序列的多肽，所述多肽可被称为"突变体多肽"。突变体多肽可以包含氨基酸取代，这样的取代可以例如被描述为“位置n处的氨基酸XXX已被氨基酸YYY取代”，其中XXX描述了野生型多肽的特定位置(n)处的氨基酸，YYY描述了当将两个基因比对时，突变体多肽中存在于相同位置处的氨基酸。

如本文所用，术语“非极性氨基酸”是指具有疏水侧链的氨基酸。优选地，非极性氨基酸选自丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

如本文所用，术语“带电荷的氨基酸”是指具有带电荷的侧链的氨基酸。优选地，带电荷的氨基酸选自精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。带负电荷的氨基酸优选选自天冬氨酸和谷氨酸。带正电荷的氨基酸优选选自精氨酸、组氨酸和赖氨酸。

如本文所用，术语“不带负电荷的氨基酸”是指具有不带负电荷的侧链的氨基酸。优选地，不带负电荷的氨基酸选自丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸。

如本文所用，术语“极性氨基酸”是指具有极性、不带电荷的侧链的氨基酸。优选地，极性氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。

术语"植物产品"是指由植物或植物材料的加工产生的产品。因此，所述植物产品可以是例如绿麦芽、窑烧干燥麦芽、麦芽汁、发酵或非发酵饮料、食品或饲料产品。

如本文所用，术语“子代”是指以给定植物作为其祖先之一的任何植物。子代不仅包括给定植物的直接子代，还包括多代后的子代，例如多达100代后的子代。可以通过确定植物是否在HvLDI基因中携带与所述亲本植物相同的突变来确定所述植物是否是给定亲本植物的子代。除了HvLDI基因中的突变之外，位于HvLDI基因附近的基因中存在的其他多态性可用于确定植物是否是给定亲本植物的子代。相同多态性的存在表明该植物是所述亲本植物的子代。

如本文所用，术语“环区”是指对应于SEQ ID NO:1的位置25至44处的氨基酸、对应于SEQ ID NO:1的位置56至62处的氨基酸、对应于SEQ ID NO:1的位置77至78处的氨基酸、对应于SEQ ID NO:1的位置91至111处的氨基酸和/或对应于SEQ ID NO:1的位置124至147处的氨基酸的一个或多个连续氨基酸组。所述环区可形成环结构，其连接下文所述的α螺旋区。

如本文所用，术语“α螺旋区”是指对应于SEQ ID NO:1的位置45至55处的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置63至76处的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置79至90处的氨基酸和/或对应于SEQ ID NO:1的位置112至123处的氨基酸的一个或多个连续氨基酸组。这些α螺旋区可以形成螺旋结构。

如本文所用，术语“序列同一性”描述了两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间，即候选序列(例如，突变序列)和参考序列(例如野生型序列)之间，基于它们的成对比对的相关性。为了本发明的目的，两个氨基酸序列之间的序列同一性使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mo/.Biol.48:443-453)，如在EMBOSS包(EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277)的Needle程序(优选5.0.0或更新版本(可在https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/找到)中所实施地来确定。使用的参数是10的空位开放罚分、0.5的空位延伸罚分和EBLOSUM62(30BLOSUM62的EMBOSS版本)替换矩阵。标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作同一性百分比，计算如下：

(相同的残基x 100)/(比对长度–比对中空位总数)

Needleman-Wunsch算法还用于确定除参考序列(例如SEQ ID NO:1的天然变体或单倍型)之外的序列中的给定氨基酸是否对应于SEQ ID NO:1(参考序列)的给定位置。例如，如果天然变体在N末端具有两个额外的氨基酸，则天然变体中的位置70将对应于SEQ IDNO:1的位置68。

为了本发明的目的，两个氨基酸序列之间的序列同一性使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上)，如在EMBOSS包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite,Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277)的Needle程序(优选5.0.0或更新版本)中所实施地来确定。使用的参数是10的空位开放罚分、0.5的空位延伸罚分和DNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替换矩阵。标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作同一性百分比，计算如下：

(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度–比对中空位总数)

如本文所用，术语“淀粉”是指一个或两个离散大分子的组合物，即直链淀粉和支链淀粉。

如本文所用，术语"终止密码子"是指遗传密码中的核苷酸三联体，其在mRNA中导致翻译终止。如本文所用，术语"终止密码子"也指基因内的编码mRNA中终止密码子的核苷酸三联体。DNA中的终止密码子通常具有以下序列之一：TAG、TAA或TGA。

如本文所用，术语“野生型HvLDI”或“wt HvLDI”是指野生型大麦极限糊精酶抑制剂基因或由所述基因编码的多肽。自然界中存在数种HvLDI单倍型，其可以被认为是野生型LDI。这些也可以被描述为SEQ ID NO:1的HvLDI参考序列的天然变体。因此，术语“野生型HvLDI”涵盖了一组wt HvLDI，包括Huang等人，2014所描述的那些。

术语"麦芽汁"意指麦芽和/或谷物谷粒(例如磨碎的麦芽和/或磨碎的谷物谷粒和任选的额外附加助剂)的液体提取物。麦芽汁通常通过糖化，任选地随后是在用热水糖化后从废谷粒中提取残余的糖和其它化合物的过程中进行"洗槽(sparging)"，来获得。洗槽通常在过滤槽、醪液过滤器或其它设备中进行，以允许从废谷粒中分离出提取的水。糖化后得到的麦芽汁通常称为"初次麦芽汁(first wort)"，而洗槽后得到的麦芽汁通常称为"二次麦芽汁(second wort)"。如果没有指定，术语麦芽汁可以是初次麦芽汁、二次麦芽汁或两者的组合。在传统的啤酒生产过程中，麦芽汁与啤酒花一起煮沸。不含啤酒花的麦芽汁也可以称为"甜麦芽汁"，而与啤酒花一起煮沸的麦芽汁可以称为"煮沸的麦芽汁"或简单地称为麦芽汁。

如本文所用，术语“千粒重”是指千粒(1000)谷粒的总重量。

极限糊精酶抑制剂(LDI)

本发明提供一种大麦植物或其部分，其中所述大麦植物携带本发明的HvLDI基因中的突变，其中所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽。

野生型大麦极限糊精酶抑制剂(HvLDI)的编码核苷酸序列可在登录号DQ285564.1下获得。HvLDI的编码核苷酸序列也在本文中作为SEQ ID NO:2提供。技术人员将理解，其他野生型大麦植物包含具有不同于SEQ ID NO:2的序列的HvLDI基因。这些也可以描述为SEQID NO:2的HvLDI参考序列的天然变体。

HvLDI多肽可在UniProt登录号Q2V8X0下获得。本发明上下文中的wt HvLDI多肽是具有序列SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1共有至少90％，例如至少93％，例如至少95％，例如至少98的序列同一性％的序列的多肽，并且其中所述序列至少包含对应于SEQ ID NO:1的位置60和68的氨基酸，即分别为脯氨酸和谷氨酸。换句话说，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸60和68的氨基酸在wt HvLDI中是保守的。

关于本发明多肽的氨基酸位置的定义以SEQ ID NO:1作为参考序列进行，但应理解，本发明多肽的序列可能在一定程度上与多肽SEQ ID NO:1的序列(参见例如wt HvLDI的定义)不同。因此，应当理解，在所述多肽与SEQ ID NO:1的参考多肽之间的比对之后，如果氨基酸与SEQ ID NO:1的位置X比对，则该氨基酸对应于SEQ ID NO:1的位置X。

表1A/1B说明了在SEQ ID NO:1的给定位置处的天然野生型变体。例如，SEQ IDNO:1的位置108是Arg，而Wt单倍型2在对应于位置108的位置处具有Thr。

表1A：SEQ ID:1的多肽(SEQ ID NO:1的氨基酸1至137)

-：对应于在SEQ ID NO:1的位置中列出的相同氨基酸

表1B：SEQ ID:1的多肽(SEQ ID NO:1的氨基酸138至147)

-：对应于SEQ ID NO:1所列位置的氨基酸

％：缺乏该氨基酸

具有上文表1A和1B中提及的取代的SEQ ID NO:1的多肽在本发明的上下文中均被认为是wt HvLDI多肽。

在本发明的一个实施方案中，本发明的突变体HvLDI多肽与SEQ ID NO:1除了在位置60和/或68处的氨基酸以外至少90％同一，例如95％同一，例如98％，例如100％同一。

Stahl等人，2004和

等人，2015中描述了LDI的建议结构。LDI被认为由一个信号肽和四个α螺旋区组成，其中α螺旋区由环区连接。环区可选自对应于SEQ ID NO:1的位置25至44的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置56至62的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置77至78的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置91至111的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置124至147的氨基酸。α螺旋区可选自对应于SEQ ID NO:1的位置45至55的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置63至76的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置79至90的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置112至123的氨基酸。信号肽对应于来自SEQ ID NO:1的1至24的氨基酸。

此外，没有信号肽的成熟HvLDI多肽也被认为是wt HvLDI，包括表1A和1B中没有对应于SEQ ID NO:1的位置1至24的氨基酸的所有多肽。特别地，没有SEQ ID NO:1的位置1至24处的氨基酸的SEQ ID NO:1的成熟多肽被认为是wt HvLDI。换句话说，由来自SEQ ID NO:1的25至147的氨基酸组成的多肽被认为是wt HvLDI。

没有信号肽的成熟HvLDI多肽的氨基酸可以相对于SEQ ID NO:1的HvLDI的氨基酸进行描述。因此，成熟HvLDI多肽的氨基酸位置可以基于SEQ ID NO:1的氨基酸位置通过将SEQ ID NO:1的氨基酸位置减去24个氨基酸来计算。例如，

等人2015中使用的氨基酸位置就是这种情况。

就此而言，一个实例是SEQ ID NO:1的HvLDI多肽的位置60处的氨基酸对应于成熟HvLDI多肽的位置36处的氨基酸。就此而言，另一个实例是SEQ ID NO:1的HvLDI多肽的位置66处的氨基酸对应于成熟HvLDI多肽的位置42处的氨基酸。就此而言，另一个实例是SEQ IDNO:1的HvLDI多肽的位置68处的氨基酸对应于成熟HvLDI多肽的位置44处的氨基酸。

wt HvLDI基因是编码wt HvLDI多肽的基因。特别地，wt HvLDI基因可以是SEQ ID:2的核苷酸序列或与其共有至少90％，例如至少93％，例如至少95％，例如至少98％的序列同一性的功能同源物。

优选地，wt HvLDI基因是编码wt HvLDI多肽的基因，其与SEQ ID NO:2共有至少90％，例如至少93％，例如至少95％，例如至少98％的序列同一性，其中所述序列至少包含SEQ ID NO:2的位置966和990处的核酸，即分别为C和G。更具体地，由wt HvLDI基因编码的多肽优选包含在SEQ ID NO:1的氨基酸位置60处的脯氨酸和在SEQ ID NO:1的氨基酸位置68处的谷氨酸。

本发明提供一种大麦植物或其部分，其中所述大麦植物携带HvLDI基因中的突变，其中所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变是以下突变之一

a.导致HvLDI的一个或多个环区中的脯氨酸变为不同的氨基酸的错义突变，其中所述环区选自对应于SEQ ID NO:1的位置25至44的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置56至62的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置77至78的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置91至111的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置124至147的氨基酸；或

在一个实施方案中，所述突变体HvLDI多肽与成熟的wt HvLDI多肽或其天然变体除了在特定位置的突变以外其他均相同。

本发明还提供了一种大麦植物或其部分，其中所述大麦植物携带在HvLDI基因中的一个或多个突变，所述突变选自：

a.在对应于HvLDI基因的编码序列(SEQ ID NO:2)的核苷酸966的位置处的核苷酸C至T的突变；和

b.在对应于HvLDI基因的编码序列(SEQ ID NO:2)的核苷酸967的位置处的核苷酸C至T的突变；和

c.在对应于HvLDI基因的编码序列(SEQ ID NO:2)的核苷酸968的位置处的核苷酸C至T的突变；和

d.在对应于HvLDI基因的编码序列(SEQ ID NO:2)的核苷酸990的位置处的核苷酸G至A的突变。

导致从脯氨酸变为不同的氨基酸的错义突变

在本发明的一些实施方案中，突变体HvLDI多肽包含在HvLDI的一个或多个环区中的脯氨酸至不同氨基酸的取代。脯氨酸的取代可以是极性氨基酸或非极性氨基酸。特别地，它可以是脯氨酸被丝氨酸或亮氨酸取代。优选地，脯氨酸的取代是在对应于SEQ ID NO:1的位置60的氨基酸处。

在本发明的一些实施方案中，所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变体HvLDI多肽包含在HvLDI的一个或多个环区中的脯氨酸至不同氨基酸的取代，其中所述环区选自由对应于SEQ ID NO:1的位置25至44的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置56至62的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置77至78的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置91至111的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置124至147的氨基酸。

在一个实施方案中，所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述环区选自对应于SEQ ID NO:1的位置56至62的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置77至78的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置91至111的氨基酸。

在一个实施方案中，所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变体HvLDI多肽包含在wt HvLDI的一个或多个环区中的脯氨酸至极性氨基酸的取代。

在一个实施方案中，所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变体HvLDI多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的位置60的氨基酸处的脯氨酸至不同氨基酸的取代。

在另一个实施方案中，所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述HvLDI多肽包含在HvLDI的一个或多个环区中的脯氨酸至丝氨酸的取代。

在一个实施方案中，优选地，所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变体HvLDI多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的位置60的氨基酸处的脯氨酸至丝氨酸的取代。

在一个实施方案中，本发明的突变体HvLDI多肽包含来自SEQ ID NO:3的位置25至142或SEQ ID NO:3的位置25至147的氨基酸序列或由其组成。

在本发明的一些实施方案中，所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI，其中所述突变体HvLDI多肽包含在wt HvLDI的一个或多个环区中的脯氨酸至非极性氨基酸的取代。

在一个实施方案中，所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变体HvLDI多肽包含在HvLDI的一个或多个环区中的脯氨酸至亮氨酸的取代。

在另一个实施方案中，优选地，所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变体HvLDI多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的位置60的氨基酸处的脯氨酸至亮氨酸的取代。

在一个实施方案中，本发明的突变体HvLDI多肽包含来自SEQ ID NO:4的位置25至142或SEQ ID NO:4的位置25至147的氨基酸序列或由其组成。

在一个实施方案中，所述突变的HvLDI基因在对应于SEQ ID NO:2的HvLDI参考基因的核苷酸966的位置处含有核苷酸C至T的突变。

在另一个实施方案中，所述突变的HvLDI基因在对应于SEQ ID NO:2的HvLDI参考基因的核苷酸967的位置处含有核苷酸C至T的突变。

在一个实施方案中，所述突变的HvLDI基因在对应于SEQ ID NO:2的HvLDI参考基因的核苷酸966和967的位置处含有核苷酸C至T的突变。

在一个实施方案中，所述突变的HvLDI基因在对应于SEQ ID NO:2的HvLDI参考基因的核苷酸966和/或968的位置处含有核苷酸C至T的突变。

在一个实施方案中，本发明的大麦植物包含编码具有SEQ ID NO:1的Pro60Ser突变的突变体HvLDI蛋白的突变体HvLDI基因。例如，大麦植物可以包含携带SEQ ID NO:2的HvLDI编码序列的核苷酸966的C→T突变的突变体HvLDI基因。所述大麦植物可以例如是HENZ-16a或其子代。HENZ-16a在本文中也可称为“HENZ-16”。例如，大麦植物可以是如实施例1中所述鉴定的HENZ-16a大麦植物或其子代。

出于本专利申请的目的，命名为“HENZ-16”(本文也称为“HENZ-16a”)的大麦植物(Hordeum vulgare)的种子已根据布达佩斯条约的规定保藏在NCIMB Ltd.FergusonBuilding,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen,AB219YA苏格兰。HENZ-16大麦植物于2020年2月12日保藏，并已收到登录号NCIMB 43581。

在一个实施方案中，本发明的大麦植物是于2020年2月12日在NCIMB保藏的大麦植物，保藏号为NCIMB 43581，被称为“HENZ-16”或其子代。因此，本发明的大麦植物可以是于2020年2月12日保藏在NCIMB并具有登录号NCIMB 43581的大麦植物HENZ-16或其任何子代大麦植物，其中所述子代大麦植物携带SEQ ID NO:2的HvLDI编码序列的核苷酸966的C→T突变，和/或其中所述大麦植物的HvLDI基因编码包含SEQ ID NO:1的Pro60Ser突变的突变体HvLDI蛋白。

导致从带负电荷的氨基酸变为不带负电荷的氨基酸的错义突变

在本发明的一些实施方案中，突变体HvLDI多肽包含在HvLDI的一个或多个α螺旋区中的带负电荷的氨基酸至不带负电荷的氨基酸的取代。带负电荷的氨基酸的取代可以是带正电荷的氨基酸。特别地，它可以是带负电荷的氨基酸至赖氨酸的取代。优选地，带负电荷的氨基酸的取代是对应于SEQ ID NO:1的位置68的氨基酸。

在本发明的一些实施方案中，所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变体HvLDI多肽包含在HvLDI的一个或多个α螺旋区中的带负电荷的氨基酸至不带负电荷的氨基酸的取代。在一个实施方案中，所述带负电荷的氨基酸是谷氨酸。

在本发明的一些实施方案中，所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变体HvLDI多肽包含在HvLDI的一个或多个α螺旋区中的带负电荷的氨基酸至带正电荷的氨基酸的取代。在一个实施方案中，所述带负电荷的氨基酸是谷氨酸。

在一个实施方案中，所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变体HvLDI多肽包含在HvLDI的一个或多个α螺旋区中的带负电荷的氨基酸至赖氨酸的取代。在一个实施方案中，所述带负电荷的氨基酸是谷氨酸。

在一些实施方案中，α螺旋区选自对应于SEQ ID NO:1的位置45至55的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置63至76的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置79至90的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置112至123的氨基酸。

在另一个实施方案中，所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变体HvLDI多肽包含对应于SEQ ID NO:1的位置68处的氨基酸的谷氨酸至不带负电荷的氨基酸的取代。

在又一个实施方案中，所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变体HvLDI多肽包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置68的谷氨酸至赖氨酸的取代。

在一个实施方案中，本发明的突变体HvLDI多肽包含来自SEQ ID NO:6的位置25至142或SEQ ID NO:6的位置25至147的氨基酸序列或由其组成。

在一个实施方案中，所述突变的HvLDI基因在对应于SEQ ID NO:2的HvLDI参考基因的核苷酸990的位置处含有核苷酸G至A的突变。

在一个实施方案中，所述突变的HvLDI基因在对应于SEQ ID NO:2的HvLDI参考基因的核苷酸966的位置处含有核苷酸C至T的突变，且在对应于SEQ ID NO:2的HvLDI参考基因的核苷酸990的位置处含有核苷酸G至A的突变。

在一个实施方案中，所述突变的HvLDI基因在对应于SEQ ID NO:2的HvLDI参考基因的核苷酸967的位置处含有核苷酸C至T的突变，且在对应于SEQ ID NO:2的HvLDI参考基因的核苷酸990的位置处含有核苷酸G至A的突变。

在一个实施方案中，本发明的大麦植物包含编码具有SEQ ID NO:1的Glu68Lys突变的突变体HvLDI蛋白的突变体HvLDI基因。例如，所述大麦植物可以包含携带SEQ ID NO:2的HvLDI编码序列的核苷酸990的G→A突变的突变体HvLDI基因。所述大麦植物可以例如是HENZ-31或其子代。例如，所述大麦植物可以是如实施例1所述鉴定的HENZ-31大麦植物或其子代。

出于本专利申请的目的，命名为“HENZ-31”的大麦植物种子已根据布达佩斯条约的规定保藏在NCIMB Ltd.Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen,AB21 9YA苏格兰。HENZ-31大麦植物于2020年2月12日保藏，并已收到登录号NCIMB 43582。

在一个实施方案中，本发明的大麦植物是于2020年2月12日在NCIMB保藏的大麦植物，保藏号为NCIMB 43582，称为“HENZ-31”；或其子代。因此，本发明的大麦植物可以是于2020年2月12日保藏于NCIMB且具有保藏号NCIMB 43582的大麦植物HENZ-31或其任何子代大麦植物，其中所述子代大麦植物携带SEQ ID NO:2的HvLDI编码序列的核苷酸990的G→A突变，和/或其中所述大麦植物的HvLDI基因编码包含SEQ ID NO:1的Glu68Lys突变的突变体HvLDI蛋白。

HvLDI活性

如上文所述，HvLDI能够与HvLD结合，从而抑制HvLD的活性。具有活性的HvLD能够切割支链糊精分子中的α-1-6键。

HvLDI在体外抑制HvLD的能力可以通过本领域技术人员已知的任何有用方法来测量。对于此类方法，重组体HvLD和HvLDI可以根据已知方法制备或从标准供应商处购买。用于评估HvLD和HvLDI之间的结合亲和力的市售测定法是例如来自爱尔兰Megazyme的Pullulanase/Limit-Dextrinase Assay试剂盒。

用于确定HvLDI和HvLD之间的结合亲和力的优选体外方法描述于实施例2中。

当根据实施例2的测定进行评估时，携带根据本发明的突变的突变体HvLDI多肽具有降低的抑制HvLD的能力。

当体外测量时，与wt HvLDI抑制HvLD的能力相比，携带根据本发明的突变的突变体HvLDI多肽优选具有降低至少2倍的抑制HvLD的能力，例如降低至少3倍的抑制HvLD的能力。在本发明的一个实施方案中，突变的HvLDI在体外测量时不能完全抑制HvLD活性。

在本发明的一个实施方案中，与野生型HvLDI基因相比，根据本发明的HvLDI基因中的突变导致游离HvLD活性增加。

大麦植物

本发明涉及大麦植物或其部分，以及大麦产品和生产这些产品的方法。大麦植物可以是大麦(Hordeum vulgare)种的任何植物，包括任何育种系或栽培品种或品种。

"野生大麦"，野生二棱大麦(Hordeum vulgare ssp.Spontaneum)，被认为是当今栽培的大麦形式的先祖。大麦的驯化的但异质的混合被称为大麦地方品种(landraces)。今天，大部分地方品种已经在先进的农业中被纯种系栽培品种取代。与地方品种相比，现代大麦栽培品种具有许多改进的特性(Nevo，1992；Pelger等人，1992)。

在本发明中，术语"大麦植物"包括任何大麦植物，例如大麦地方品种或现代大麦栽培品种。因此，本发明涉及包含本发明的HvLDI基因中的突变的任何大麦植物。

然而，用于本发明的优选大麦植物是现代大麦栽培品种或纯种系。本发明可用的大麦栽培品种的非限制性实例包括Planet、Paustian、Sebastian、Quench、Celeste、Lux、Prestige、Saloon、Neruda、Harrington、Klages、Manley、Schooner、Stirling、Clipper、Franklin、Alexis、Blenheim、Ariel、Lenka、Maresi、Steffi、Gimpel、Cheri、Krona、Camargue、Chariot、Derkado、Prisma、Union、Beka、Kym、Asahi 5、KOU A、Swan Hals、KantoNakate Gold、Hakata 2号、Kirin–choku 1号、Kanto late Variety Gold、Fuji Nijo、NewGolden、Satukio Nijo、Seijo 17号、Akagi Nijo、Azuma Golden、Amagi Nijpo、NishinoGold、Misato golden、Haruna Nijo、Scarlett、Rosalina和Jersey，优选选自Haruna Nijo、Sebastian、Quench、Celeste、Lux、Prestige、Saloon、Neruda和Power，优选选自Paustian、Harrington、Klages、Manley、Schooner、Stirling、Clipper、Franklin、Alexis、Blenheim、Ariel、Lenka、Maresi、Steffi、Gimpel、Cheri、Krona、Camargue、Chariot、Derkado、Prisma、Union、Beka、Kym、Asahi 5号、KOU A、Swan Hals、Kanto Nakate Gold、Hakata 2号、Kirin–choku 1号、Kanto late Variety Gold、Fuji Nijo、New Golden、Satukio Nijo、Seijo 17号、Akagi Nijo、Azuma Golden、Amagi Nijpo、Nishino Gold、Misato golden、HarunaNijo、Scarlett和Jersey，优选选自Planet、Paustian、Haruna Nijo、Sebastian、Tangent、Lux、Prestige、Saloon、Neruda、Power、Quench、NFC Tipple、Barke、Class、Vintage、Applaus、Bowie、Broadway、Champ、Chanson、Charles、Chimbon、Cosmopolitan、Crossway、Dragoon、Ellinor、Embrace、Etoile、Evergreen、Flair、Highway、KWS Beckie、KWSCantton、KWS Coralie、KWS Fantex、KWS Irina、KWS Josie、KWS Kellie、LG Diablo、LGFigaro、LG Nabuco、LG Tomahawk、Laureate、Laurikka、Lauxana、Luther、Odyssey、Ovation、Prospect、RGT Elysium、RGT Observer、RGT Planet、Rotator、Sarbi、Scholar、Subway或Golden Promise。

大麦植物可以是任何合适的形式。例如，本发明的大麦植物可以是有活力的大麦植物、干燥的植物、均质化的植物或磨碎的大麦谷核。植物可以是成熟植物、胚、谷核、发芽的谷核、经制麦的谷核、磨碎的经制麦的谷核、磨碎的谷核等。

大麦植物的部分可以是植物的任何合适的部分，例如谷粒、胚、叶、茎、根、花或其部分。部分可以是例如谷核、胚、叶、茎、根或花的部分。大麦植物的部分也可以是匀浆的部分或磨碎的大麦植物或谷核的部分。

在本发明的一个实施方案中，大麦植物的部分可以是所述大麦植物的细胞，例如可以在组织培养物中体外繁殖的活细胞。然而，在其他实施方案中，大麦植物的部分可以是不能成熟为完整大麦植物的活细胞，即不是繁殖材料的细胞。

优选地，大麦植物不是单独通过基本上生物学的过程获得的，或者是其子代。例如，大麦植物可包含HvLDI基因中的突变，其中所述突变已由化学和/或物理试剂如叠氮化钠诱导。

因此，大麦植物可以通过涉及诱导诱变步骤的方法制备，或者所述大麦植物可以是通过涉及诱导诱变步骤的方法制备的植物的子代。所述诱导诱变可以例如是用诱变化学品如叠氮化钠处理。

大麦植物也可以是通过基因工程技术制备的大麦植物，例如通过使用质粒或基因重组或Crisper/CAS-9技术将突变的HvLDI基因插入宿主基因组。优选地，wt HvLDI基因已在此类植物中被敲除。

在本发明的一些实施方案中，大麦植物或其部分携带根据本发明的HvLDI基因中的突变。

除了HvLDI基因中的突变之外，大麦植物还可以包含其他突变。

携带HvLDI基因中的突变的大麦植物的特征

本发明提供了携带本发明的HvLDI基因中的突变的大麦植物或其部分，所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽。

此类大麦植物的一个主要优点是根据本发明的所述大麦植物的谷粒与具有wtHvLDI基因的大麦植物相比具有增加的游离HvLD活性。此外，从此类大麦谷粒制备的麦芽也具有更高水平的游离HvLD活性。令人惊讶的是，增加的游离HvLD活性与从所述大麦植物的谷粒制备的麦芽汁中可发酵糖的浓度很好地相关，而从具有低或正常水平的游离HvLD活性的大麦谷粒制备的麦芽汁通常具有低或正常浓度的可发酵糖。因此，增加的游离HvLD活性对于大麦麦芽汁和啤酒生产来说是有利特征。

大麦中游离HvLD活性的量可以通过本领域技术人员已知的任何有用方法来测量。通常，第一步是破碎一个或多个大麦谷粒，例如通过机械手段，以获得大麦面粉。这可以通过任何有用的手段来完成，例如通过液压机和/或通过使用碾磨机和/或研磨机，但机械破碎的具体方法不那么重要。

用于测量游离HvLD活性的有用方法的一个非限制性实例可以是将获得的面粉提取到酸性水性溶液中，如马来酸，在pH 4.7于40℃下1小时。可以通过来自Megazyme的PullG6方法分析游离HvLD活性。

实施例7中描述了确定大麦中游离HvLD活性的优选方法。

在本发明的一些实施方案中，当在相同条件下培养时，与除了携带编码wt HvLDI的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物或其部分相比，携带本发明的HvLDI基因中的突变的所述大麦植物或其部分具有更高的游离HvLD活性。

在本发明的一个实施方案中，当在相同条件下制备时，与除了携带编码wt HvLDI的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的麦芽中测量的游离HvLD活性相比，携带本发明的HvLDI基因中的突变的本发明的大麦植物或其部分或从所述大麦植物的谷粒制备的发芽的谷粒或麦芽具有高至少20％的游离HvLD活性。在一些实施方案中，当在相同条件下制备时，与除了携带编码wt HvLDI的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的麦芽中测量的游离HvLD活性相比，所述游离HvLD活性高至少50％，例如高至少100％，例如高至少140％。在一个实施方案中，所述谷粒在测量前已经发芽72小时。

总HvLD活性可以通过任何有用的方法来确定。通常，此类方法包括在破坏LDI和LD之间结合的条件下温育，然后测定LD活性。测量总HvLD的一个非限制性实例可以是将获得的面粉提取到氧化还原试剂中，如二硫苏糖醇，于40℃下在pH 4.7下1小时。然后可以如上所述分析HvLD活性的量。与氧化还原试剂温育后测定的HvLD活性将反映总HvLD活性。

实施例7中描述了确定总HvLD活性的优选方法。

在本发明的一些实施方案中，当在相同条件下培养时，与除了携带编码wt HvLDI的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物或其部分相比，携带本发明的HvLDI基因中的突变的所述大麦植物或其部分具有更高的游离HvLD活性与总HvLD活性的比率。游离HvLD与总HvLD的比率可以以游离/总(％)的形式提供。

在本发明的另一个实施方案中，当在相同条件下制备时，与除了携带编码SEQ IDNO:1的HvLDI的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的麦芽中测量的游离/总％HvLD活性相比，携带本发明的HvLDI基因中的突变的大麦植物或其部分或其发芽的谷粒或麦芽具有高至少20％的游离/总％HvLD活性。在一些实施方案中，当在相同条件下制备时，与除了携带编码wt HvLDI的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的麦芽中测量的游离/总％HvLD活性相比，所述游离/总％HvLD高至少30％，例如高至少40％，例如高至少50％。

在本发明的一个实施方案中，游离极限糊精酶和总极限糊精酶之间的比率在经flex麦芽制麦的麦芽中为至少35％，在常规制麦的谷粒(例如，窑烧干燥麦芽)中为至少60％。

本发明的大麦植物通常具有与不携带HvLDI基因中的突变的大麦植物相当的物理外观和谷粒产量。因此，当在相同条件下培养时，本发明的大麦植物的谷粒通常还具有与相同基因型的野生型大麦植物的谷粒相当的糊化温度、α-淀粉酶活性、β-淀粉酶活性、支链淀粉链长度分布、重量、大小、蛋白质含量、含水量和淀粉含量。

在一个实施方案中，根据本发明的大麦植物的谷粒与不携带本发明的HvLDI基因中的突变的大麦植物的谷粒相比具有基本上相同的发芽能力。例如，在一个实施方案中，当在相似或相同的条件下制备时，与来自相同基因型的wt大麦植物的谷粒相比，根据本发明的大麦植物的谷粒具有基本上相同的发芽指数，其使用等式10*(x+y+z)/(x+2*y+3*z)在3天的时间段内进行计算，其中x是在24小时计数的发芽的谷粒数，y是在48小时计数的发芽的谷粒数，z是在72小时计数的发芽的谷粒数。在另一个实施方案中，当在相似或相同的条件下制备时，与来自相同基因型的wt大麦植物的谷粒相比，根据本发明的大麦植物的谷粒在24小时、48小时和72小时具有基本上相同的发芽百分比，其使用在24小时计数的发芽的谷粒数相对于24小时的谷粒总数、在48小时计数的发芽的谷粒数相对于48小时的谷粒总数和在72小时计数的发芽的谷粒数相对于72小时的谷粒总数来计算。例如，在另一个实施方案中，当在相似或相同的条件下制备时，与来自相同基因型的wt大麦植物的谷粒的水敏性相比，根据本发明的大麦植物的谷粒具有基本上相同的水敏性，其通过计数与8ml液体温育72小时后的发芽的谷粒相对于与4ml液体温育72小时后的发芽的谷粒来测量。

在一个实施方案中，根据本发明的大麦植物的谷粒与不携带本发明的HvLDI基因中的突变的大麦植物的谷粒相比具有基本上相同的糊化温度(℃)。例如，在一个实施方案中，本发明提供了大麦植物的谷粒，其中所述谷粒的淀粉具有平均糊化温度，当在相似或相同的条件下生长时，其与除了不携带所述突变以外其他相同的大麦植物的谷粒的淀粉的平均糊化温度相似。

在一个实施方案中，根据本发明的大麦植物的谷粒与不携带本发明的HvLDI基因中的突变的大麦植物的谷粒相比具有基本上相同的α-淀粉酶活性。在一个实施方案中，本发明提供了大麦植物的谷粒，当在相似或相同的条件下生长时，其中所述谷粒的α-淀粉酶活性与除了不携带所述突变以外其他相同的大麦植物的谷粒中的α-淀粉酶活性相似。在另一个实施方案中，本发明提供了从大麦植物的谷粒制备的麦芽，当在相似或相同的条件下制备时，其中所述麦芽中的α-淀粉酶活性与从除了不携带所述突变以外其他相同的大麦植物的谷粒制备的麦芽中的α-淀粉酶活性相似。

在一个实施方案中，根据本发明的大麦植物的谷粒与不携带本发明的HvLDI基因中的突变的大麦植物的谷粒相比具有基本上相同的β-淀粉酶活性。在一个实施方案中，本发明提供了大麦植物的谷粒，当在相似或相同的条件下生长时，其中所述谷粒中的β-淀粉酶活性与除了不携带所述突变以外其他相同的大麦植物的谷粒中的β-淀粉酶活性相似。在另一个实施方案中，本发明提供了从大麦植物的谷粒制备的麦芽，当在相似或相同的条件下制备时，其中所述谷粒中的β-淀粉酶活性与从除了不携带所述突变以外其他相同的大麦植物的谷粒制备的麦芽中的β-淀粉酶活性相似。

在一个实施方案中，根据本发明的大麦植物的谷粒与不携带本发明的HvLDI基因中的突变的大麦植物的谷粒相比具有基本上相同的支链淀粉链长度分布。例如，在一个实施方案中，当在相似或相同的条件下生长时，本发明的大麦植物的谷粒可以含有与除了不携带所述突变以外其他相同的大麦植物的谷粒的支链淀粉相比具有相同的支链长度分布的支链淀粉。

在一个实施方案中，根据本发明的大麦植物的谷粒与不携带本发明的HvLDI基因中的突变的大麦植物的谷粒相比具有基本上相同的重量。特别地，当在相似或相同的条件下生长时，本发明的大麦植物的谷粒与除了不携带所述突变以外其他相同的大麦植物的谷粒的平均谷粒重量相比可以具有相同的平均谷粒重量。

在一个实施方案中，根据本发明的大麦植物的谷粒具有至少40克，例如至少45克，例如至少50克，例如至少55克的千粒重。

在一个实施方案中，当在相同条件下生长时，根据本发明的大麦植物的谷粒具有除了携带编码wt HvLDI多肽的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的谷粒千粒重的至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％。

在一个实施方案中，根据本发明的大麦植物的谷粒具有至少40克，例如至少45克，例如至少50克，例如至少55克的重量。

在一个实施方案中，当在相同条件下生长时，根据本发明的大麦植物的谷粒与来自除了携带编码wt HvLDI多肽的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的谷粒相比具有至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％的谷粒重量。

在一个实施方案中，根据本发明的大麦植物的谷粒与不携带本发明的HvLDI基因中的突变的大麦植物的谷粒相比具有基本上相同的大小。优选地，当在相似或相同的条件下生长时，本发明的大麦植物的谷粒可以具有与除了不携带所述突变以外其他相同的大麦植物的谷粒的谷粒直径相比相同的谷粒直径。

在一个实施方案中，根据本发明的大麦植物的谷粒与不携带本发明的HvLDI基因中的突变的大麦植物的谷粒相比具有基本上相同的蛋白质含量。优选地，当在相似或相同的条件下生长时，本发明的大麦植物的谷粒可以具有与除了不携带所述突变以外其他相同的大麦植物的谷粒的蛋白质含量相同的蛋白质含量。

在一个实施方案中，根据本发明的大麦植物的谷粒与不携带本发明的HvLDI基因中的突变的大麦植物的谷粒相比具有基本上相同的水含量。在一个实施方案中，当在相似或相同的条件下生长时，本发明的大麦植物的谷粒可以具有与除了不携带所述突变以外其他相同的大麦植物的谷粒中的含水量相同的含水量。

在一个实施方案中，根据本发明的大麦植物的谷粒与不携带本发明的HvLDI基因中的突变的大麦植物的谷粒相比具有基本上相同的淀粉含量。例如，在一个实施方案中，当在相似或相同的条件下生长时，本发明的大麦植物的谷粒可以含有与除了不携带所述突变以外其他相同的大麦植物的谷粒中的淀粉相当的淀粉。

在一个实施方案中，根据本发明的大麦植物的谷粒具有至少50％，例如至少55％，例如至少60％的淀粉含量(干重％)。

在一个实施方案中，当在相同条件下生长时，根据本发明的大麦植物的谷粒与除了携带编码wt HvLDI多肽的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的谷粒相比具有至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％的淀粉含量。

在一个实施方案中，根据本发明的大麦植物具有与不携带本发明的HvLDI基因中的突变的大麦植物的谷粒产量相当的谷粒产量。例如，在一个实施方案中，当在相似或相同的条件下生长时，本发明的大麦植物可以具有与除了不携带所述突变以外其他相同的大麦植物的谷粒产量相似的谷粒产量。

在一个实施方案中，当在相同条件下生长时，根据本发明的大麦植物与除了携带编码wt HvLDI多肽的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的谷粒产量相比具有至少80％，例如90％，例如95％的谷粒产量。

包含多于一个突变的大麦植物

本发明涉及大麦植物或其部分，以及所述大麦植物的产品和生产以上这些的方法，其中所述大麦植物携带HvLDI基因中的突变，例如本文所述的HvLDI基因中的任何突变。

除了HvLDI基因中的所述突变之外，本发明的大麦植物可以进一步包含在一个或多个另外的基因中的一个或多个另外的突变。

除了本文所述的HvLDI基因中的突变以外，本发明的大麦植物还可以包含编码脂氧合酶-1(lipoxygenase-1，LOX-1)的基因(WO 2005/087934中的SEQ ID NO:1或GenBank登录号LC099006.1)中的突变，其导致功能性LOX-1的完全丧失。所述突变可以例如是国际专利申请WO 2005/087934中描述的任何突变。例如，大麦植物可以包含编码LOX-1的基因，所述基因包含过早终止密码子，所述密码子对应于WO 2005/087934的SEQ ID NO:2的碱基编号3572-3574或剪接位点突变，所述突变对应于WO 2005/087934的SEQ ID NO:2的SEQ IDNO:6的碱基编号2311。LOX-1的功能丧失导致使用这样的大麦植物生产的饮料中游离反式-2-壬烯醛(trans-2-nonenal，T2N)的量减少。优选地，在4至6ppm范围内的亚硫酸盐存在下，在37℃下温育4周后，T2N为至多0.05ppb。

除了本文所述的HvLDI基因中的突变外，本发明的大麦植物还可以包含编码脂氧合酶-2(lipoxygenase-2，LOX-2)的基因中的突变，其导致功能性LOX-2的完全丧失。所述突变可以例如是国际专利申请WO 2010/075860中描述的任何突变。例如，大麦植物可以包含编码LOX-2的基因，所述基因包含在WO 2010/075860的SEQ ID NO:1的核苷酸位置2689处的突变，其导致过早终止密码子的形成。LOX-2的功能丧失导致使用这样的大麦植物生产的饮料中游离反式2-壬烯醛(T2N)的量减少，尤其是潜在T2N的量减少。

除了本文所述的HvLDI基因中的突变以外，本发明的大麦植物还可以包含编码甲硫氨酸S-甲基转移酶(MMT)的基因(WO 2010/063288中的SEQ ID NO:1或GenBank登录号AB028870)中的突变，其导致功能性MMT的完全丧失。所述突变可以例如是国际专利申请WO2010/063288中描述的任何突变。例如，大麦植物可以包含编码MMT的基因，所述基因包含WO2010/063288的SEQ ID NO:3的碱基编号3076的G→A突变，或包含WO 2010/063288的SEQ IDNO:16的碱基编号1462的G→A突变。MMT的功能丧失导致绿麦芽和窑烧麦芽二者以及由这样的麦芽制备的饮料中二甲基硫醚(DMS)的量减少。优选地，由具有MMT功能丧失的大麦植物制备的饮料含有少于30ppm的DMS。MMT的功能丧失还导致绿麦芽和窑烧麦芽二者以及由这样的麦芽制备的饮料中S.甲基-L-甲硫氨酸(SMM)的量减少。优选地，由具有MMT功能丧失的大麦植物制备的饮料含有少于30ppm的SMM。

除了本文所述的HvLDI基因中的突变以外，本发明的大麦植物还可以包含编码纤维素合酶样F6(CslF6)的基因(WO2019/129736中的SEQ ID NO:1或genbank登录号EU267181.1)中的突变，其中所述突变体基因编码具有降低的CslF6活性的突变体CslF6蛋白。所述突变可以例如是国际专利申请WO 2019/129736中描述的任何突变。例如，大麦植物可以包含编码CslF6的基因，所述基因编码包含WO 2019/129736的SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3的G847E突变或G748D突变或T709I突变的突变体CslF6。具有降低的CslF6活性的大麦谷核具有降低的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量。麦芽中的高(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量可以形成高粘度的水性溶液，这会减缓啤酒厂的过滤过程并导致最终饮料中出现不希望的混浊。

除了本文所述的HvLDI基因中的突变以外，本发明的大麦植物还可以包含国际专利申请WO 2019/129739中描述的导致增加的α-淀粉酶活性的任何突变。特别地，本发明的大麦植物可以包含大麦转录抑制子(HvHRT)基因(WO 2019/129739中的SEQ ID NO:1或NCBI登录号nr.AK362734.1)中的突变，其导致HRT的功能丧失。所述HvHRT基因中的突变可以例如是国际专利申请WO 2019/129739中描述的HvHRT基因中的任何突变。例如，大麦植物可以包含编码HRT的基因，所述基因包含过早终止密码子。所述HvHRT基因的突变可以例如是WO2019/129739的SEQ ID NO:1的HvHRT编码序列的核苷酸1293的G→A突变，和/或它可以是其中所述大麦植物的突变体HvHRT基因编码包含WO 2019/129739的SEQ ID NO:2的W431stop突变的突变体HvHRT蛋白的突变。所述HvHRT基因的突变还可以例如是WO 2019/129739的SEQ ID NO:1的HvHRT编码序列的核苷酸510的G→A突变，和/或其中突变体HvHRT基因编码具有WO 2019/129739的SEQ ID NO:2的W170stop突变的突变体HvHRT蛋白的突变。所述HvHRT基因的突变还可以例如是WO 2019/129739的SEQ ID NO:1的HvHRT编码序列的核苷酸1113的G→A突变，和/或它可以是其中所述大麦植物的突变体HvHRT基因编码包含WO 2019/129739的SEQ ID NO:2的W371stop突变的突变体HvHRT蛋白的突变。HvHRT的突变可能会增加大麦谷核中的α-淀粉酶。制麦中增加的α淀粉酶活性增加了淀粉降解和谷核中可发酵糖的可用性。

除了本文所述的HvLDI基因中的突变以外，本发明的大麦植物还可以包含国际专利申请WO 2019/129739中描述的导致增加的α-淀粉酶活性的任何突变。特别地，本发明的大麦植物可以包含导致HvHBL12功能丧失的HvHBL12基因(WO 2019/129739中的SEQ ID NO:5和NCBI登录号AK376953.1和AK361212.1)中的突变。所述HvHBL12基因中的突变可以例如是国际专利申请WO 2019/129739中描述的HvHBL12基因中的任何突变。例如，大麦植物可以包含编码突变体HvHBL 12基因的基因，所述基因编码突变体HvHBL 12蛋白，所述蛋白至少缺少i)WO 2019/129739中的SEQ ID NO:6的氨基酸26至79；或ii)SEQ ID NO:6的氨基酸81至122，或iii)WO 2019/129739中的SEQ ID NO:6的氨基酸228至250。同样的突变可以发生在WO 2019/129739的SEQ ID NO:6的多态性之一，即多态性N141D、M142V或E184D。或者，大麦植物可以包含HvHDL12基因中的过早终止密码子。特别地，所述大麦植物可以包含WO2019/129739中的SEQ ID NO:5的HvHBL12编码序列的核苷酸684的G→A突变或其任何上述多态性，其编码包含WO 2019/129739中SEQ ID NO:6的W228stop突变的突变体HvHBL 12蛋白。已显示缺乏HvHBL功能的大麦谷核具有较高的α-淀粉酶活性。

除了本文所述的HvLDI基因中的突变以外，本发明的大麦植物还可以包含国际专利申请WO 2019/129739中描述的导致α-淀粉酶活性增加的任何突变。特别地，本发明的大麦植物可以包含WKRY38基因(WO 2019/129739中的SEQ ID NO:10或NCBI登录号AJ536667.1或AK360269.1或AY541586.1)中的突变，其导致WKRY38的功能丧失。所述WKRY38基因中的突变可以例如是国际专利申请WO 2019/129739中描述的WKRY38基因中的任何突变。特别地，所述大麦植物可以包含WO 2019/129739中的SEQ ID NO:10的HvWRKY38编码序列的核苷酸600的G→A突变。已显示缺乏WKRY38功能的大麦谷核具有较高的α-淀粉酶活性。

除了本文所述的HvLDI基因中的突变以外，本发明的大麦植物还可以包含无花青素和无原花青素的突变体(ant突变)，例如由Himi等人,2012或Jende-Strid,1993描述的任何ant突变。特别地，ant突变可以是Hvmyb10基因(GenBank登录号AB645844)的突变，例如Hvmyb10的非同义突变，优选在ant28突变体中发现的Hvmyb10基因中的任何突变。因此，ant突变可以是野生型Hvmyb10的编码区的核苷酸51的G→A突变或野生型Hvmyb10的编码区的核苷酸558的G→A突变，如Himi等人,2012中所述。特别地，ant28突变体具有降低的谷粒休眠水平。

本发明的大麦植物还可以包含上述另外的突变的组合。下表示出了基因突变的可能组合，显示了不同大麦植物的8个实例，其中“Mut”表示植物包含在指定基因中的本文所述的任何突变。

LDI

LOX-1

MMT

CslF6

HRT

HBL12

WRKY38

Myb10

实例1

Mut

实例2

Mut

实例3

Mut

实例4

Mut

实例5

Mut

实例6

Mut

实例7

Mut

实例8

Mut

具体描述的是具有本发明的LDI突变以及LOX-1和MMT和Myb10中的功能丧失突变的大麦植物(如上表第一行中的实例1所示)，以及具有本发明的LDI突变以及LOX-1和MMT和CslF6和Myb10中的功能丧失突变的大麦植物(如上表第二行中的实例2所示)。

可以通过任何有用的方法产生包含多于一个突变的大麦植物。例如，可将所述一个或多个另外的突变引入携带HvLDI基因中的突变的大麦植物中，或者，可将如本文所述的HvLDI基因中的突变引入已经携带所述另外的突变的大麦植物中。可以基本上如国际专利申请WO 2018/001884中所述，使用设计用于鉴定所述特定突变的引物和探针，来制备和鉴定携带特定所需突变的大麦植物。

或者，所述大麦植物可以通过将携带HvLDI基因中的突变的大麦植物与携带一个或多个所述另外的突变的大麦植物杂交来制备，例如，在国际专利申请WO 2005/087934、WO2010/075860、WO 2010/063288、WO 2019/129736或WO 2019/129739中描述或保藏或在Himi等人,2012中描述的任何大麦植物。

植物产品

本发明还提供了从携带本发明的HvLDI基因中的突变的大麦植物制备的植物产品，例如本文所述的任何大麦植物或其部分。

植物产品可以是从大麦植物制备的任何产品，例如食物、饲料或饮料。因此，植物产品可以是在下文"饮料及其生产方法"部分中描述的任何饮料。植物产品还可以是大麦植物和/或所述大麦植物的麦芽的水性提取物，例如植物产品可以是麦芽汁。所述水性提取物可以例如如下文"水性提取物及其生产方法"部分中所述制备。

在一个实施方案中，植物产品可以是麦芽，例如在下文"麦芽及其生产方法"部分中描述的任何麦芽，或基于麦芽的产品，例如基于麦芽的饮料。尽管麦芽的主要用途是用于饮料生产，但它也可用于其它工业过程，例如在焙烤工业中作为酶源，或在食品工业中作为调味剂和着色剂，例如以麦芽或麦芽粉的形式或间接作为麦芽糖浆等。因此，本发明的植物产品可以是任何上述产品。

在另一个方面，本发明的植物产品包含糖浆，或甚至由糖浆组成，例如大麦糖浆或大麦麦芽糖浆。植物产品也可以是大麦或麦芽的提取物。因此，植物产品可以是麦芽汁。

麦芽及其生产方法

本发明还提供了从携带本发明的HvLDI基因中的突变的大麦植物制备的麦芽，例如本文所述的任何大麦植物。

麦芽可以通过制麦来制备，即通过在受控环境条件下进行的过程中使浸泡过的大麦谷粒发芽。发芽之后可以任选地进行干燥步骤。所述干燥步骤可以优选地是在高温下对发芽的谷粒进行窑烧干燥。

因此，根据本发明的制麦方法优选包括以下步骤：

a)提供本发明的大麦植物或其部分的谷粒；

b)在预定条件下浸泡所述大麦谷粒并使其发芽；

c)任选地，干燥所述发芽的大麦谷粒。

本发明的大麦尤其适用于绿麦芽工艺，即，麦芽在糖化之前不进行窑烧干燥的制麦工艺。归因于高水平的极限糊精酶，本发明的大麦也尤其适用于短制麦工艺，例如下文描述的工艺。

a)在一个实施方案中，根据以下方法制备麦芽：将任选地已经清洁的大麦谷粒在水性溶液中浸泡(温育)，优选在水中浸泡4至24小时范围内的时间段，优选在5至15小时的范围内，更优选在5至10小时的范围内。在此期间，将包含谷粒的水性溶液通气。通气可以增加水性溶液中的氧气水平和/或使大麦谷粒变松和/或有助于避免大麦谷粒间的干块(drypocket)。浸泡可以在任何有用的温度下进行，优选在20至28℃范围内的温度下，更优选在约25℃下；

b)排出水性溶液，并将谷粒空气静置5至30小时，优选8至24小时，更优选8至16小时。优选地，在空气静置期间将谷粒通气。优选地，在正在发芽的谷粒中保持20-28℃范围内的恒定温度，例如通过控制用于通气的气体温度；

c)将大麦谷粒在水性溶液中温育2至24小时，优选2至15小时，更优选2至10小时，同时通气，例如以混合谷粒。优选地，将水保持在20至28℃范围内的温度，例如25℃左右；和

d)排出水性溶液，并将谷粒进行空气静置阶段5至30小时，优选8至20小时。优选地，将温度保持在20至28℃的范围内，例如通过控制用于通气的气体温度。

e)发芽过程优选在48至72小时内完成，优选在48至60小时内完成，甚至更优选在48至56小时内完成。优选地，在步骤a之后的整个过程中，发芽的谷粒的含水量为至少20％。发芽的谷粒可以作为绿麦芽直接用于进一步的加工。

在一个实施方案中，所述麦芽可以通过包括在通气下在水中温育谷粒并且不进行窑烧干燥的方法制备。这样的麦芽在本文中也可称为“flex麦芽”。特别地，flex麦芽可以如WO 2018/001882和WO 2019/129724中所述制备。尤其如WO 2018/001882的第14页至第22页的“发芽”部分、第22页至第24页的“热处理”部分和第56页至第57页的“实施例1”部分，以及WO 2019/129724中的第14页至第22页的“发芽”部分、第22页至第24页的“热处理”部分和第56页至第57页的“实施例1”部分所述，以上通过引用并入本文。

在下文实施例5中描述了制备“flex麦芽”的方法。

发芽通常从谷粒与水接触的时间点开始，例如从含水量小于15％的大麦谷粒与足够的水接触以开始发芽的时间点开始。

在一个实施方案中，当从下方用不同水平的大气空气将谷粒通气不同时间段时，开始发芽，在此期间谷粒水分含量增加。

当发芽过程缩短时，已显示本发明的大麦植物的谷粒尤其有用。因此，本发明的大麦植物的谷粒确实可用于缩短发芽时间的制麦方法。在一个实施方案中，本发明的谷粒的浸泡和发芽步骤进行至多4天，例如至多3天。

在另一个实施方案中，麦芽可以通过传统制麦来制备，其中浸泡过程和发芽过程在两个单独的步骤中进行。因此，可以通过本领域技术人员已知的任何常规方法进行浸泡。一个非限制性实例包括在10至25℃的温度范围内以交替的干湿条件浸泡。例如，在浸泡期间，可以将谷物谷核湿温育30分钟至3小时，然后干温育30分钟至3小时，并且任选地重复所述温育方案2至5次。浸泡后的最终水含量可以例如在40％至50％的范围内。谷粒的发芽可以通过本领域技术人员已知的任何常规方法进行。一个非限制性实例包括在10至25℃范围内的温度下发芽，任选地在1至6天的范围内改变温度。

任选地，可以在常规温度下进行窑烧干燥，例如至少75℃，例如在80至90℃的范围内，例如在80至85℃的范围内。

因此，麦芽可以例如通过Hough等人(1982)描述的任何方法来生产。然而，任何其他合适的生产麦芽的方法也可以用于本发明，例如生产特制麦芽的方法，包括但不限于烘烤麦芽的方法。

麦芽可以进一步加工，例如通过研磨。因此，根据本发明的植物产品可以是任何种类的麦芽，例如未经加工的麦芽或经研磨的麦芽，例如面粉。经研磨的麦芽及其面粉包含麦芽的化学成分和缺乏再发芽能力的死细胞。

研磨可以在干态下进行，即将麦芽在干态下进行研磨，或者研磨可以在湿态下进行，即将麦芽在湿态下进行研磨。

从携带本发明的HvLDI基因中的突变的大麦植物或其部分制备的麦芽的优势是，所述麦芽与来自除了没有HvLDI突变以外具有相同基因型的wt大麦植物的麦芽相比具有高水平的游离HvLD活性。高水平的游离HvLD活性使麦芽具有优势，这出于多个原因。增加的游离HvLD活性在制麦过程中是有用的，其中发芽时间被缩短。具体地，图3显示，当用于flex麦芽工艺时，来自本发明大麦(HENZ-16a和31)的麦芽在传统制麦工艺中优于wt大麦如Paustian(图4)，这体现在flex麦芽工艺中的HENZ变体的极限糊精酶的游离/总比率仍然提高了61.6％和56.3％，高于Paustian在传统工艺中提高的50％。此外，增加的游离HvLD活性导致淀粉降解成可发酵糖的增加，因此从来自所述大麦植物的谷粒和/或麦芽制备的麦芽汁的特征可以是较高含量的可发酵糖。因此，通过使用本发明的麦芽，可以减少或甚至完全消除糖化期间添加外源性极限糊精酶或短梗霉聚糖酶的需要。此外，发酵含有高含量可发酵糖的水性提取物在酿造过程中具有优势，因为它增加了每个所使用谷粒量所生产的啤酒量，并增加了每粒重每百公升的ABV％(相对于体积的醇)。

水性提取物及其生产方法

本发明提供了基于大麦的饮料及其制备方法，其中大麦植物携带本发明的HvLDI基因中的突变。

通常，制备基于大麦的饮料的方法包括制备本发明的大麦植物的谷粒和/或从本发明的大麦植物制备的麦芽和任选的一种或多种附加助剂(adjunct)的水性提取物的步骤。

在一个实施方案中，水性提取物从本发明的大麦植物的谷粒和/或由本发明的大麦植物制备的麦芽制备。在另一个实施方案中，水性提取物从本发明的大麦植物的谷粒和/或由本发明的大麦植物制备的麦芽和wt大麦植物的谷粒和/或由wt大麦的谷粒制备的麦芽的混合物和任选的一种或多种附加助剂制备。在一些实施方案中，至少10％、例如至少20％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如100％的用于制备水性提取物的大麦谷粒和/或麦芽可以是根据本发明的大麦植物的大麦谷粒或从本发明的大麦植物制备的麦芽和任选的一种或多种附加助剂。

在一个实施方案中，用于水性提取物的麦芽是如“麦芽及其生产方法”部分中所述的绿麦芽或flex麦芽，具体地，绿麦芽可以在湿态下研磨。特别地，绿麦芽/flex麦芽在研磨和糖化之前的含水量从未低于20％，并且未曾经过窑烧。

水性提取物通常可以通过在水中或水性溶液中温育大麦面粉和/或麦芽面粉来制备。特别地，水性提取物可以通过糖化来制备。

通常，所述水性溶液可以是水，例如可添加一种或多种另外的试剂的自来水。另外的试剂可以从一开始就存在于水性溶液中，或者它们可以在制备水性提取物的过程中添加。所述另外的试剂可以是酶。因此，水性溶液可以包含一种或多种酶。所述酶可以从一开始或随后在所述过程中添加到水性溶液中。

所述酶可以是例如一种或多种水解酶。合适的酶包括脂肪酶、淀粉降解酶(例如淀粉酶)、葡聚糖酶[优选(1-4)-和/或(1,3；1,4)-β-葡聚糖酶]和/或木聚糖酶(如阿拉伯糖基木聚糖酶)和/或蛋白酶，或包含一种或多种上述酶的酶混合物，例如Cereflo、Ultralo或Ondea Pro(Novozymes)。例如，水性溶液可以包含一种或多种水解酶，其选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、极限糊精酶、短梗霉聚糖酶、β-葡聚糖酶(例如内切-(1,3；1,4)-β-葡聚糖酶或内切-1,4-β-葡聚糖酶)、木聚糖酶(例如内切-或外切-1,4-木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿魏酸酯酶)、葡糖淀粉酶和蛋白酶。

本发明的大麦植物的一个优势是在所述大麦植物的谷粒中或在从所述大麦植物制备的麦芽中的高游离HvLD活性的量。有时，当将大麦谷粒和/或麦芽进行糖化时，可以添加极限糊精酶或其他能够催化α-1,6键水解的酶，例如短梗霉聚糖酶，以便通过从支链淀粉衍生的支链糊精中释放直链糊精来促进淀粉水解。因此，本发明的一个优点是减少或甚至消除添加外源性极限糊精酶或短梗霉聚糖酶的需要，并且仍然可以获得提取物中足够水平的可发酵糖。在本发明的一些实施方案中，甚至可以在不添加外源性极限糊精酶或短梗霉聚糖酶的情况下制备水性提取物。

所述另外的试剂，优选具有食品级质量，还可以是盐，例如CaCl₂，或酸，例如H₃PO₄。

通常通过在一个或多个预定温度下在水性溶液中温育大麦面粉和/或麦芽面粉来制备水性提取物。所述预定温度在本文中也可以被称为"糖化温度"。所述糖化温度可以是例如用于糖化的常规温度。糖化温度通常保持恒定(等温糖化)或逐渐升高，例如依序、逐步方式升高。在任一情况下，大麦谷粒和/或麦芽中的可溶性物质被释放到所述水性溶液中，从而形成水性提取物。

糖化温度通常为30至90℃范围内、例如40至85℃范围内、例如50至85℃范围内的温度。特别地，可以使用相对低的糖化温度(mashing-in temperature)，例如50至60℃范围内的温度。

在水溶液中在例如糖化容器中温育之后，可以将水性溶液转移到另一个容器例如过滤槽中，并在升高的温度下温育额外的时间。

有用的糖化方案的非限制性实例可在酿造文献中找到，例如Hough等人(见上文)。

糖化(即大麦面粉和/或麦芽面粉在水性溶液中的温育)可在附加助剂的存在下进行，所述附加助剂被理解为包含除麦芽以外的任何碳水化合物来源，例如但不限于以完整谷核或加工产品如粗面粉、糖浆或淀粉的形式存在的大麦、大麦糖浆或玉米或大米。所有上述附加助剂主要用作提取物的附加来源(糖浆通常在麦芽汁加热期间定量加入)。在酿酒厂中对附加助剂的处理要求取决于所用附加助剂的状态和类型，且尤其取决于淀粉糊化或液化温度。。

在水性溶液中温育后，通常可以将水性提取物分离，例如通过过滤分离为水性提取物和残留的不溶解固体颗粒，后者也称为"废谷粒(spent grain)"。例如，可以在过滤槽中进行过滤。或者，过滤可以是通过醪液过滤器(mash filter)过滤。由此获得的水性提取物也可以称为"初次麦芽汁"。在也称为洗槽的过程中，可以将额外的液体，例如水，添加到废谷粒中。在洗槽和过滤后，可以获得"二次麦芽汁"。通过重复该过程可以制备进一步的麦芽汁。因此，水性提取物可以是麦芽汁，例如初次麦芽汁、二次麦芽汁、进一步的麦芽汁或其组合。

从携带本发明的HvLDI基因中的突变的大麦植物制备的水性提取物的一个优势可以是它们含有高水平的可发酵糖。

在一个实施方案中，当在相同的条件下制备时，与除了携带编码wt HvLDI的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的水性提取物相比，从根据本发明的大麦植物的谷粒和/或麦芽制备的所述水性提取物具有增加的总可发酵糖浓度。

在另一个实施方案中，当在相同的条件下制备时，与除了携带编码wt HvLDI的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的水性提取物相比，从由根据本发明的大麦植物制备的麦芽所制备的所述水性提取物具有多至少5％的总可发酵糖，例如多至少6％的总可发酵糖，例如多至少7％的总可发酵糖。

在另一个实施方案中，当在相同的条件下制备时，与除了携带编码wt HvLDI的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的水性提取物相比，从由根据本发明的大麦植物制备的麦芽所制备的所述水性提取物具有多至少10％的葡萄糖、果糖和/或麦芽三糖。

饮料及其生产方法

本发明还提供了基于大麦的饮料和生产此类饮料的方法，其中大麦植物携带本发明的HvLDI基因中的突变。

所述饮料可以是基于大麦的酒精饮料或基于大麦的非酒精饮料。基于大麦的酒精饮料可以是例如啤酒或蒸馏酒精。

所述啤酒可以是任何种类的啤酒，例如贮藏啤酒(lager)或淡啤酒(ale)。因此，啤酒例如可以选自德国老式啤酒(Altbier)、琥珀艾尔(Amber ale)、大麦酒、柏林酸小麦(Berliner Weisse)、北法窖藏(Bière de Garde)、苦啤(Bitter)、金色艾尔(Blonde Ale)、博克(Bock)、棕色艾尔(Brown ale)、加州蒸汽啤酒(California Common)、奶油艾尔(CreamAle)、多特蒙德出口啤酒(Dortmunder Export)、双倍博克(Doppelbock)、深色啤酒(Dunkel)、深色小麦啤酒(Dunkelweizen)、冰博克(Eisbock)、水果兰比克(Fruit lambic)、金色艾尔(Golden Ale)、古斯(Gose)、贵兹(Gueuze)、酵母小麦啤酒(Hefeweizen)、清亮(Helles)、印度淡色艾尔(India pale ale)、科隆啤酒

兰比克(Lambic)、低度啤酒(Light ale)、五月博克(Maibock)、麦芽酒、英国黄啤酒(Mild)、三月啤酒

老艾尔(Old ale)、老棕酸(Oud bruin)、淡色艾尔(Pale ale)、皮尔森啤酒(Pilsener)、波特(Porter)、红色艾尔(Red ale)、黑麦啤酒(Roggenbier)、赛松(Saison)、苏格兰艾尔(Scotch ale)、蒸汽啤酒、世涛(Stout)、德式黑啤(Schwarzbier)、拉格(lager)、比利时小麦(Witbier)、德式小麦白啤(Weissbier)和小麦博克(Weizenbock)。啤酒也可以是低酒精或非酒精啤酒(也称为“无酒精啤酒”或afb)。

所述蒸馏酒精可以是任何种类的蒸馏酒精。特别地，蒸馏酒精可以基于谷物，例如经制麦的谷物，例如大麦麦芽。这样的蒸馏酒精的非限制性实例包括威士忌和伏特加。

饮料可以是非酒精饮料，例如基于大麦的非酒精饮料，例如非酒精啤酒或非酒精麦芽饮料，例如maltina或noussy。

饮料可以例如通过包括以下步骤的方法制备：

a.提供根据本发明的大麦植物的谷粒和/或从根据本发明的大麦植物的谷粒制备的麦芽和/或从根据本发明的大麦植物的谷粒和/或麦芽制备的水性提取物；

b.将所述水性提取物加工成饮料。

可以在有或没有啤酒花的情况下将水性提取物煮沸，此后可以将其称为煮沸的麦芽汁。可以将初次麦芽汁、二次麦芽汁和进一步的麦芽汁合并，然后进行煮沸。可以将水性提取物煮沸任何合适的时间量，例如60分钟至120分钟。

步骤(a)可以特别包括所述水性提取物的发酵，例如通过麦芽汁的发酵。因此，可以通过用酵母发酵水性提取物来生产饮料。

一旦制备了水性提取物，就可以通过包括常规酿造方法的任何方法将其加工成啤酒。合适酿造方法的实例的非限制性描述可参见例如Hough等人(1982)的出版物。许多用于分析大麦和啤酒产品的定期更新方法是可获得的，例如但不限于美国谷物化学家协会(American Association of Cereal Chemists)(1995)、美国酿造化学家协会(AmericanSociety of Brewing Chemists)(1992)、欧洲啤酒酿造协会(European BreweryConvention)(1998)和酿造研究所(Institute of Brewing)(1997)。已经认识到，给定的啤酒厂采用了许多特定的程序，其中最显著的变化与当地消费者的偏好有关。任何这样的生产啤酒的方法均可以用于本发明。

从水性提取物生产啤酒的第一步优选包括如上所述煮沸所述水性提取物，随后是冷却和任选的漩涡静置的后续阶段。可以将一种或多种另外的化合物添加到水性提取物中，例如，在下文"另外的化合物"部分中描述的一种或多种另外的化合物。冷却后，可以将水性提取物转移到含有酵母的发酵罐中，所述酵母例如是酿造酵母，如巴斯德毕赤酵母(S.pastorianus)或酿酒酵母(S.cerevisiae)。可以将水性提取物发酵任何合适的时间段，通常在1至20天的范围内，例如1至10天。发酵在任何有用的温度下进行，例如在10至20℃范围内的温度下。所述方法还可以包括添加一种或多种酶，例如可以在发酵之前或发酵期间将一种或多种酶添加到麦芽汁中。特别地，所述酶可以是脯氨酸特异性内切蛋白酶。脯氨酸特异性内切蛋白酶的非限制性实例是可从DSM获得的"Brewer's Clarex"。在其它实施方案中，在所述方法期间不添加外源酶。

在数天长的发酵过程中，糖转化为醇和CO₂，同时产生一些风味物质。发酵可以在任何期望的时间终止，例如一旦没有观察到％P的进一步下降。

随后，啤酒可以被进一步处理，例如被冷藏。它还可以被过滤和/或贮藏-一个产生令人愉快的香气和较少酵母样风味的过程。也可以加入添加剂。此外，可添加CO₂。最后，在包装(例如转移到容器或桶中，装瓶或装罐)之前，可以对啤酒进行巴氏灭菌和/或过滤。啤酒也可以通过标准方法进行巴氏灭菌。

另外的化合物

本发明的方法可以包括添加一种或多种另外的化合物的步骤。所述另外的化合物可以是例如风味化合物、防腐剂、功能性成分、着色剂、甜味剂、pH调节剂或盐。pH调节剂可以例如是缓冲剂或酸，如磷酸。

功能性成分可以是为获得给定功能而添加的任何成分。优选地，功能性成分使饮料更健康。功能性成分的非限制性实例包括维生素或矿物质。

防腐剂可以是任何食品级防腐剂，例如其可以是苯甲酸、山梨酸、山梨酸盐(例如山梨酸钾)、亚硫酸盐和/或其盐。

另外的化合物也可以是CO₂。特别地，可添加CO₂以获得碳酸饮料。

本发明所用的风味化合物可以是任何有用的风味化合物。风味化合物可以例如选自香气、植物提取物、植物浓缩物、植物部分和草本植物浸液。特别地，风味化合物可以是啤酒花。

制备携带本发明的HvLDI基因中的突变的大麦植物的方法

可以以任何有用的方式制备携带本发明的HvLDI基因中的突变的大麦植物。

例如，此类大麦植物可通过包括以下步骤的方法制备：

a.提供大麦谷粒；和

b.随机诱变所述大麦谷粒，

i.导致HvLDI的一个或多个环区中的脯氨酸变为不同的氨基酸的错义突变，其中所述环区对应于SEQ ID NO:1的位置25至44的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置56至62的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置77至78的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置91至111的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置124至147的氨基酸；或

ii.导致wt HvLDI的一个或多个α螺旋区中的酸性氨基酸变为非酸性氨基酸的错义突变，其中所述α螺旋区对应于SEQ ID NO:1的氨基酸45至55和SEQ ID NO:1的氨基酸63至76和SEQ ID NO:1的氨基酸79至90和/或SEQ ID NO:1的氨基酸112至123。

此类方法还可包括繁殖所述大麦植物/大麦谷粒的一个或多个步骤，以获得每个都携带所述突变的多个大麦植物/谷粒。

具体地，可以使用设计用于鉴定HvLDI基因中的突变的引物和探针，基本上如国际专利申请WO 2018/001884中所述制备和鉴定携带HvLDI基因中的特定突变的大麦植物。HvLDI的基因组序列可以使用SEQ ID NO:2的编码序列通过blast搜索从公共数据库中找到，或者可以在GenBank登录号DQ285564.1下找到。

还可以使用各种定点诱变方法来制备携带HvLDI基因中的突变的大麦植物，所述方法例如可以是基于SEQ ID NO:2的编码序列的序列设计的。在一个实施方案中，大麦植物使用CRISPR、TALEN、锌指、大范围核酸酶和如WO 2017/138986中所述的DNA切割抗生素中的任一种制备。在一个实施方案中，大麦植物使用CRISPR/cas9技术制备，例如使用RNA引导的Cas9核酸酶。这可以如Lawrenson等人,Genome Biology(2015)16:258；DOI10.1186/s13059-015-0826-7中所述进行，除了单引导RNA序列是基于HvLDI的基因序列设计的。在一个实施方案中，大麦植物使用TALEN和CRISPR/cas9技术的组合制备，例如使用RNA引导的Cas9核酸酶。这可以如Holme等人,2017中描述进行，除了TALEN和单引导RNA序列是基于本文提供的基因序列设计的。

在一个实施方案中，大麦植物使用同源定向修复、DNA切割核酸酶和供体DNA片段的组合制备。这可以如Sun等人,2016中所述进行，除了DNA切割核酸酶是基于本文提供的基因序列设计的，且供体DNA片段是基于本文提供的突变的大麦变体的编码序列设计的。

在本发明的一个实施方案中，目的是提供农艺学上有用的携带HvLDI基因中的突变的大麦植物。除了HvLDI基因中的突变以外，在产生可用于制麦和/或酿造和/或作为饮料基础的商业大麦品种的领域中，还可以考虑其他因素，例如谷核产量和大小，以及与制麦性能或酿造性能相关的其他参数。由于许多(如果不是所有)的相关性状已被证明处于遗传控制下，本发明还提供了现代的纯合高产制麦用栽培品种，其可以从与本出版物中公开的大麦植物杂交制备。熟练的大麦育种者将能够选择和培育大麦植物，其在与其他大麦植物杂交后将产生优良的栽培品种。或者，育种者可以利用本发明的植物进行进一步的诱变，以产生除了HvLDI基因的突变以外还携带另外的突变的新栽培品种。

本发明还包括携带HvLDI基因中的突变的大麦植物，其通过植物育种方法制备，包括自交、回交、与群体杂交等方法。本发明可以使用回交方法将HvLDI基因的突变引入另一个栽培品种。

加速植物育种过程的一种方法包括通过应用组织培养和再生技术对产生的突变体进行初始增殖。因此，本发明的另一个方面是提供细胞，其在生长和分化时产生携带HvLDI基因的突变的大麦植物。例如，育种可以包括传统杂交、制备可育的花药衍生植物或使用小孢子培养。

项

本发明可以通过以下项进一步定义。

1.一种大麦植物或其部分，其中所述大麦植物携带HvLDI基因中的突变，其中所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变是以下突变之一

a.导致突变体HvLDI多肽的一个或多个环区中的脯氨酸变为不同的氨基酸的错义突变，其中所述环区选自对应于SEQ ID NO:1的位置25至44的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置56至62的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置77至78的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置91至111的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置124至147的氨基酸；或

b.导致突变体HvLDI多肽的一个或多个α螺旋区中带负电荷的氨基酸变为不带负电荷的氨基酸的错义突变，其中所述α螺旋区选自对应于SEQ ID NO:1的位置45至55的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置63至76的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置79至90的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置112至123的氨基酸。

2.根据项1所述的大麦植物或其部分，其中所述突变体HvLDI多肽与SEQ ID NO:1的成熟wt HvLDI多肽具有至少90％的同一性。

3.根据项1或2中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述突变体HvLDI多肽与表1A和1B中列出的成熟wt HvLDI多肽或其天然变体具有98％的同一性。

4.根据项1至3中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述环区选自对应于SEQ ID NO:1的位置56至62的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置77至78的氨基酸和对应于SEQ ID NO:1的位置91至111的氨基酸。

5.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变体HvLDI多肽包含wt HvLDI的一个或多个环区中的脯氨酸至极性氨基酸的取代。

6.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变体HvLDI多肽包含HvLDI的一个或多个环区中的脯氨酸至丝氨酸的取代。

7.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变体HvLDI多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的位置60处的脯氨酸至不同氨基酸的取代。

8.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变体HvLDI多肽由具有在SEQ ID NO:1的位置60处的脯氨酸至不同氨基酸的取代的SEQ ID NO:1的LDI组成。

9.根据项7或8所述的大麦植物或其部分，其中脯氨酸被丝氨酸取代。

10.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变体HvLDI多肽包含在SEQ ID NO:1的氨基酸位置60处的脯氨酸这丝氨酸的取代。

11.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述突变体HvLDI多肽包含SEQ ID NO:3的位置25至142或SEQ ID NO:3的位置25至147的氨基酸序列，或由其组成。

12.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述突变体HvLDI多肽包含SEQ ID NO:4的位置25至142或SEQ ID NO:4的位置25至147的氨基酸序列，或由其组成。

13.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，所述突变体HvLDI多肽包含HvLDI的一个或多个α螺旋区中的带负电荷的氨基酸至带正电荷的氨基酸的取代。

14.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变体HvLDI多肽包含HvLDI的一个或多个α螺旋区中的带负电荷的氨基酸至赖氨酸的取代。

15.根据项13或14中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述带负电荷的氨基酸是谷氨酸(Glu)。

16.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变体HvLDI多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的位置68处的谷氨酸至不带负电荷的氨基酸的取代。

17.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变体HvLDI多肽由具有在SEQ ID NO:1的位置68处的谷氨酸至不带负电荷的氨基酸的取代的SEQ ID NO:1的LDI组成。

18.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变体HvLDI多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸位置68处的谷氨酸至赖氨酸的取代。

19.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述突变体HvLDI多肽包含SEQ ID NO:6的位置25至142或SEQ ID NO:6的位置25至147的氨基酸序列，或由其组成。

20.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分，其中当在相同条件下培养时，与除了携带编码wt HvLDI多肽的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的谷粒中测量的游离HvLD活性相比，所述大麦植物的谷粒具有高至少20％的游离HvLD活性。

21.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分，其中当在相同条件下制备时，与除了携带编码wt HvLDI多肽的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的发芽的谷粒中测量的游离HvLD活性相比，所述发芽的谷粒具有高至少20％的游离HvLD活性。

22.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分，其中当在相同条件下制备时，与除了携带编码wt HvLDI多肽的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的麦芽中测量的游离HvLD活性相比，从所述大麦植物制备的麦芽具有高至少20％的游离HvLD活性。

23.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分，其中当在相同条件下制备时，与除了携带编码wt HvLDI多肽的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的麦芽中测量的游离HvLD活性相比，所述游离HvLD活性高至少50％，例如高至少100％，优选高至少140％。

24.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分，其中当在相同条件下培养和制备时，与除了携带编码wt HvLDI多肽的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的谷粒或发芽的谷粒或麦芽中测量的游离/总％HvLD活性相比，来自所述大麦植物的谷粒或发芽的谷粒或麦芽分别具有高至少20％的游离/总％HvLD活性。

25.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述大麦植物携带HvLDI基因中的一个或多个突变，所述突变选自：

i.在对应于HvLDI基因的编码序列(SEQ ID NO:2)的核苷酸966的位置处的核苷酸C至T的突变；和

ii.在对应于HvLDI基因的编码序列(SEQ ID NO:2)的核苷酸967的位置处的核苷酸C至T的突变；和

iii.在对应于HvLDI基因的编码序列(SEQ ID NO:2)的核苷酸968的位置处的核苷酸C至T的突变；和

iv.在对应于HvLDI基因的编码序列(SEQ ID NO:2)的核苷酸990的位置处的核苷酸G至A的突变。

26.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述大麦植物携带HvLDI基因中的突变，所述突变由在对应于HvLDI基因的编码序列(SEQ ID NO:2)的核苷酸966的位置处的核苷酸C至T的突变组成。

27.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物是在NCIMB以登录号NCIMB 43581保藏的大麦植物或其子代。

28.根据项1至25中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述大麦植物携带HvLDI基因中的突变，所述突变由在对应于HvLDI基因的编码序列(SEQ ID NO:2)的核苷酸967的位置处的核苷酸C至T的突变组成。

29.根据项1至25中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述大麦植物携带HvLDI基因中的突变，所述突变由在对应于HvLDI基因的编码序列(SEQ ID NO:2)的核苷酸990的位置处的核苷酸G至A的突变组成。

30.根据项1至24中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述大麦植物携带HvLDI基因中的突变，所述突变由在对应于HvLDI基因的编码序列(SEQ ID NO:2)的核苷酸966的位置处的核苷酸C至T的突变和在对应于HvLDI基因的编码序列(SEQ ID NO:2)的核苷酸967的位置处的核苷酸C至T的突变组成。

31.根据项1至25中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述大麦植物携带HvLDI基因中的突变，所述突变由在对应于HvLDI基因的编码序列(SEQ ID NO:2)的核苷酸966的位置处的核苷酸C至T的突变和在对应于HvLDI基因的编码序列(SEQ ID NO:2)的核苷酸968的位置处的核苷酸C至T的突变组成。

32.根据项1至24中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述大麦植物携带HvLDI基因中的突变，所述突变由在对应于HvLDI基因的编码序列(SEQ ID NO:2)的核苷酸967的位置处的核苷酸C至T的突变和在对应于HvLDI基因的编码序列(SEQ ID NO:2)的核苷酸990的位置处的核苷酸G至A的突变组成。

33.根据项1至24中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述大麦植物携带HvLDI基因中的突变，所述突变由在对应于HvLDI基因的编码序列(SEQ ID NO:2)的核苷酸966的位置处的核苷酸C至T的突变和在对应于HvLDI基因的编码序列(SEQ ID NO:2)的核苷酸990的位置处的核苷酸G至A的突变组成。

34.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物是在NCIMB以登录号NCIMB 43582保藏的大麦植物或其子代。

35.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的谷粒具有至少45克，例如至少50克，例如至少55克的千粒重。

36.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中当在相同条件下生长时，所述大麦植物的谷粒具有除了携带编码wt HvLDI多肽的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的谷粒千粒重的至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％。

37.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的谷粒具有至少50％，例如至少55％，例如至少60％的淀粉含量。

38.根据前述项目中任一项所述的大麦植物，其中当在相同条件下生长时，所述大麦植物的谷粒具有除了携带编码wt HvLDI多肽的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的谷粒淀粉含量的至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％。

39.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物进一步包含一个或多个另外的基因中的突变，例如以下突变中的一个或多个：

a.编码LOX-1的基因中导致功能性LOX-1完全丧失的突变；

b.编码LOX-2的基因中导致功能性LOX-2完全丧失的突变；

c.编码MMT的基因中导致功能性MMT完全丧失的突变；

d.编码CslF6的基因中的突变，其中所述突变体基因编码具有降低的CslF6活性的突变体CslF6蛋白；

e.编码HRT基因的基因中导致HRT功能丧失的突变；

f.编码HBL12基因的基因中导致HBL功能丧失的突变；

g.编码WRKY38基因的基因中导致WRKY38功能丧失的突变；和

h.ant突变，例如Hvmyb10基因中的突变。

40.一种植物产品，其包含根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分。

41.根据项40所述的植物产品，其中所述植物产品选自：

a.从所述大麦植物的谷粒制备的麦芽；

b.从所述大麦植物的谷粒和/或从包含所述大麦植物的加工谷粒的麦芽制备的水性提取物，例如麦芽汁；和

c.从所述大麦植物或其部分制备的饮料，例如啤酒。

42.一种制备麦芽的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供根据项1至38中任一项所述的大麦植物的谷粒；

b.在预定条件下浸泡所述谷粒并使其发芽；

c.任选地，干燥所述发芽的谷粒。

43.根据项42所述的方法，其中所述浸泡和发芽包括以下步骤：

a.将根据项1至38中任一项所述的大麦植物的谷粒在水性溶液中、在使用含氧气体(例如纯氧或空气)的通气环境下温育5至10小时；

b.排出水性溶液，并使谷粒在空气中静置8至16小时，优选在通气环境下；

c.将谷粒在水性溶液中在使用含氧气体的通气环境下温育2至10小时；和

d.排出水性溶液，并将谷粒进行第二空气静置阶段8至20小时，优选在通气环境下。

其中在步骤a.之后的任何时间点，谷粒的含水量为至少20％，并且不进行项42的步骤c)。

44.根据项42或43所述的方法，其中所述浸泡和发芽步骤进行至多4天，例如至多3天，优选48至72小时。

45.一种制备水性提取物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供根据项1至39中任一项所述的大麦植物的谷粒和/或根据项42至44中任一项所述的方法生产的麦芽；

b.制备所述谷粒和/或所述麦芽的水性提取物，例如麦芽汁。

46.根据项45所述的方法，其中所述麦芽从它被生产出来直到被用于制备水性提取物始终保持至少20％的含水量。

47.根据项45所述的方法，其中当在相同条件下制备时，与除了携带编码wt HvLDI多肽的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的水性提取物相比，所述水性提取物具有多至少5％的总可发酵糖。

48.根据项45至46所述的方法，其中当在相同条件下制备时，与除了携带编码wtHvLDI多肽的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的水性提取物相比，所述水性提取物具有多至少10％的葡萄糖、果糖和/或麦芽三糖。

49.一种生产饮料的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供根据项1至39中任一项所述的大麦植物的谷粒和/或根据项42至44中任一项所述的方法生产的麦芽；和

b.从所述谷粒和/或麦芽制备水性提取物；或

b.将所述水性提取物加工成饮料。

50.根据项49所述的方法，其中步骤b.通过根据项45至48中任一项所述的方法进行。

51.一种制备大麦植物的方法，所述方法包括以下步骤

a.提供大麦谷粒；和

b.随机诱变所述大麦谷粒，

序列

SEQ ID NO:1

大麦的wt HvLDI的氨基酸序列，UniProt登录号Q2V8X0

SEQ ID NO:2

大麦的wt HvLDI的DNA序列，完整CDS，DQ285564.1

用粗体标示的ATG代表编码SEQ ID NO:1的起始密码子。用下划线标示的密码子对应于根据本发明进行突变的密码子

SEQ ID NO:3

大麦的突变体P60S HvLDI(HENZ-16a)的氨基酸序列

SEQ ID NO:4

大麦的突变体P60L HvLDI(HENZ-16b)的氨基酸序列

SEQ ID NO:5

大麦的突变体V66M HvLDI(HENZ-18)的氨基酸序列

SEQ ID NO:6

大麦的突变体E68K HvLDI(HENZ-31)的氨基酸序列

SEQ ID NO:7

大麦的wt HvLD的氨基酸序列，UniProt登录号Q9FYY0

SEQ ID NO:8

大麦的wt HvLD的核苷酸序列，GenBank登录号AF252635.1

参考文献

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Stahl et al.2007Plant Science 172(3):452-561

实施例

实施例1：筛选具有LDI基因中的特定突变的大麦突变体(Hv)

首先，制备了四种具有导致LDI中氨基酸残基被取代的特定突变的HvLDI(表2)。

表2：HvLDI突变体。

接下来，通过随机诱变制备HENZ-16a、HENZ-18、HENZ-31大麦植物突变体，随后通过基于ddPCR的方法进行鉴定，基本上如国际专利申请WO 2018/001884中所述进行。更具体地，制备随机诱变的大麦谷粒(亲本品种Paustian和Planet)池，然后制备有序文库，如国际专利申请WO 2018/001884(通过引用并入本文)中第66-69页的WS1和WS2以及实施例1至2中所述。

编码SEQ ID NO:1的HvLDI(UniProt登录号Q2V8X0)的野生型HvLDI基因用作野生型HvLDI的参考基因。

如国际专利申请WO 2018/001884第67-72页的WS3和WS4以及实施例3-15中所述，使用下表3中指定的引物和探针，对HENZ-16a、HENZ-16b、HENZ-18、HENZ-31大麦植物突变体进行鉴定和选择。

HENZ-16a、HENZ-16b和HENZ-18的背景即亲本植物是Paustian，HENZ-31的背景是Planet。Paustian和Planet大麦植物含有编码HvLDI多肽的野生型HvLDI基因。Paustian可从Sejet Plant Breeding,

67,8700Horsens DK获得。Planet可从RAGTSemences,Rue Emile Singla,12000Rodez,法国获得。

表3：为特定大麦植物突变体设计的引物和探针

实施例2：体外结合研究

方法

根据制造商的说明，使用市售的体外测定(Pullulanase/Limit-DextrinaseAssay Kit PullG6 Method，Megazyme，爱尔兰)来评估重组表达的HvLDI多肽抑制重组大麦极限糊精酶(HvLD)活性的能力。

用于测量极限糊精酶活性的PullG6方法基于定义为水溶性的底物，即4,6-O-苯亚甲基-4-硝基苯基-6³-α-D-麦芽三糖基-麦芽三糖(BPNPG3G3)，以及辅助酶α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。

底物中的1,6-α-键被极限糊精酶特异性水解，随后被α-葡糖苷酶和β-葡糖苷酶进一步水解为葡萄糖和4-硝基苯酚，并通过添加碱性溶液终止反应。400nm处的吸光度可以直接与极限糊精酶活性相关联。

为了合成高水平的可溶性重组HvLDI，将相应的基因(NS03)插入大肠杆菌表达载体pSol-SUMO(Lucigen,USA)。

用野生型HvLDI转化的或在pSol-SUMO中含有核苷酸突变的化学感受态大肠杆菌10G细胞用于异源表达。使用5mL固定化金属亲和色谱(IMAC)粗料柱(crude column)(GEHealthcare，USA)实现蛋白纯化，并通过TEV蛋白酶切割去除N末端标签。

在体外抑制测定之前，使用Pierce 660nm蛋白测定法(ThermoFisherScientific，USA)测定经富集、切割和浓缩的HvLDI的蛋白浓度。

在重组wt HvLD的情况下，将相应的基因(SEQ ID NO:7)插入到pET28a表达载体(Novagen，USA)(Now Merck biosciences，德国)中。在BL21(DE3)表达细胞(New EnglandBiolabs，USA)中进行表达。将蛋白在HisTrap FF金属亲和色谱柱(GE Heathcare,USA)中纯化，交换至PBS缓冲液中并浓缩至4.6mg/mL，然后用于测定。

为了在25μL的总反应体积中进行，将测定缩小规模。在初步实验中，1.5μM HvLD的终浓度在标准反应条件下产生良好的信号，具有检测抑制和激活(如果需要的话)的能力。在反应缓冲液(100mM马来酸钠，pH 5.5)中制备纯化的重组突变体或wt HvLDI的系列稀释液，并将10μL的每种稀释液与10μL的6μM重组HvLD在相同的缓冲液中混合。将混合物在室温下温育5分钟。通过将12.5μL HvLD/HvLDI添加到相同体积的P6试剂中使反应开始。反应在40℃下进行30分钟，然后通过添加187.5μL终止试剂[2％(w/v)Tris碱溶液，pH 9.0]来终止反应。将每个已停止反应的50μL等分试样转移到半面积、平底96孔微孔板上的各个孔中。在SpectraMax 340PC384酶标仪(Molecular Devices，USA)上从底部测量A400 nm，使用路径修正来校正体积上的微小差异。输出数据，减去背景(HvLD被相同体积的反应缓冲液代替)，并将吸光度相对于测定中HvLDI的浓度进行作图。使用GraphPad Prism(第4版，GraphPadSoftware，USA)测定半数最大抑制浓度(IC₅₀)。关于游离HvLD活性，参见图1。

结果

纯化的重组wt和突变体HvLDI用于市售酶测定中以检测游离HvLD活性。wt HvLDI和突变体HvLDI抑制重组表达的HvLD的效力通过测定期间释放的发色团的量来评估。对于所有测试的突变体，与wt相比，需要显著更高的浓度才能看到抑制效果(参见图1和表4)。

P60、V66M和E68K突变显示抑制HvLD的能力显著降低。即使在测试的最高浓度下，HvLDI-P60L也不能完全抑制HvLD。与wt-LDI大麦植物相比，需要远远更高浓度的HvLDI-P60L、HvLDI-P60S、HvLDI-V66M和HvLDI E68K才能实现对HvLD％活性的抑制。

表4

*WT是SEQ ID NO:1的LDI，与SEQ ID NO:1相关的突变已标示

**未计算标准偏差，但对图表的目检表明该数据是有用的实施例3：发芽测试

以下大麦植物HENZ-16、HENZ-18、HENZ-31、Paustian和Planet于新西兰2017/2018产季在标准条件下在田间种植，并在谷粒达到成熟后收获。

对所有大麦谷粒样品的发芽指数(G指数)、发芽势和水敏性参数进行了评估。数据基于用于4mL发芽测试的两个100个谷粒的样本大小和用于8mL发芽测试的一个100个大麦谷粒的样本大小，根据Analytical-EBC Method3.6.2Germinative Energy of Barley:BRFMethod,2004。

在湿盒中在具有两张滤纸(Whatman，1级，85mm，CAT编号1001-085)和4ml milli-Q水的培养皿上于20℃下温育24、48和72小时后，对正在发芽的谷粒进行计数。

G指数

G指数是3天时间段期间的发芽的指标，通过以下等式描述：10*(x+y+z)/(x+2*y+3*z)，其中x是在24小时计数的正在发芽的谷粒数量，y是在48小时计数的正在发芽的谷粒数量，z是在72小时计数的正在发芽的谷粒数量。

发芽势

发芽势描述了发芽试验中已发芽的谷粒占总谷粒的百分比。发芽势是根据基于每24小时(持续3天)的已发芽的谷粒计数的数据计算的。

水敏性

水敏性是通过对在具有8ml milli-Q水的培养皿上温育72小时后的已发芽的谷粒进行计数并与4mL进行比较：G Energy4ml–G Energy8ml来测量的。

结果

表5

与来自wt大麦植物的谷粒相比，来自HvLDI突变体大麦植物的谷粒在发芽指数(G指数)、发芽势和水敏性方面没有观察到显著差异。

实施例4：糊化温度

将以下大麦植物HENZ-16a、HENZ-31、Paustian和Planet于丹麦2017在标准条件下种植，并在谷粒达到成熟后收获。

使用实验室Retsch球磨机将大麦谷粒样品研磨成细粉。将大约115mg的大麦面粉与3倍重量的水混合，并将25uL的悬浮液移液至铝盘中。将盘不透气地密封。通过在差示扫描量热仪(DSC-1STARe System,Mettler-Toledo)中以10℃/分钟的加热速率将盘从40℃加热至90℃来确定糊化温度。将空盘用作参考。

结果：

表6

	GT(℃)
		HENZ-16a	61.5±0.1
Paustian	61.9±0.1
		HENZ-31	61.5±0.2
Planet	61.0±0.03

没有观察到糊化温度有显著差异。

实施例5：flex麦芽制麦工艺

将栽培品种Paustian或Planet的野生型谷粒以及如实施例1中所述的携带HvLDI中的突变的大麦植物的谷粒在浸泡前使用定制装置进行空气加速磨蚀一分钟以去除约3-4％的外壳。

将谷粒置于派莱克斯玻璃(plexiglass)圆筒中的水性溶液中，并持续用来自谷粒柱下方的大气空气进行通气。使用

50质量流量计和控制器(Sierra，CA，USA)设定气流，并使用Testo 735精密温度计(Testo，德国)测量温度。

将wt和突变的大麦谷粒在调节至1μM赤霉酸(GA₃，G7645，Sigma-Aldrich)、0.01％消泡剂-204(Sigma-Aldrich)和0.01％H₂O₂(Apoteket，丹麦)的水中温育24小时。在23℃下温育，并用90L/h的大气空气对谷粒进行通气。排液后，将谷粒用90L/h的大气空气通气24小时。

赤霉酸(GA)是一种植物激素，其可激活正在发芽的大麦中的糊粉层(aleuronelayer)。许多麦芽制造商在制麦过程中添加低浓度的GA。在此处，将GA补充至水中，用于在过程开始时温育谷粒。由赤霉酸(G7645，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)在无水乙醇中制备GA₃溶液并添加到水中。

在整个温育过程中，空气从箱底部穿过潮湿的谷物谷粒。在flex制麦过程中，谷粒不进行窑烧干燥，而是在没有任何干燥步骤的情况下进行研磨和糖化。

实施例6：VLB制麦工艺

将来自HENZ-16a和Paustian大麦植物的25kg大麦谷粒在柏林的VLB进行制麦。在18℃下进行浸泡，并在14.5℃下发芽5天。在将谷粒窑烧干燥之前，谷粒的目标含水量为43％。

实施例7：测定水解酶活性的方法

在发芽期间，大麦谷粒开始分泌多种水解酶，例如α-淀粉酶、极限糊精酶和(1,3；1,4)-β-葡聚糖酶。通常，可以以时间协调的方式检测这些酶活性。

样品制备

来自HENZ-16、HENZ-18、HENZ-31、Paustian和Planet的72小时发芽的谷粒样品是通过在湿盒中在带有两张滤纸(Whatman，1级，85mm，CAT编号1001-085)和4ml milli-Q水的培养皿上于20℃下发芽100个谷粒72小时来制备的。在实验中包括根据欧洲酿造大会(European Brewing Congress)标准EBC19制备的EBC19麦芽作为对照。

来自HENZ-16a、HENZ-31、Paustian和Planet的flex制麦的谷粒样品是根据实施例5中描述的方法制备的。

来自HENZ-16a和Paustian的VLB制麦的谷粒样品是根据实施例6中描述的方法制备的。

通过在冷冻干燥机(ScanVac CoolSafe 4L,LaboGene)中蒸发水72小时，将所有72小时发芽的谷粒和Flex制麦的样品冷冻和干燥。

在酶活性分析之前，使用标准Cyclotech研磨机(FOSS，丹麦)研磨所有样品以产生面粉。发芽大麦谷粒中酶活性的所有测量均在研磨样品后48小时内进行。

α-淀粉酶活性

根据来自爱尔兰Megazyme的Ceralpha方法(K-CERA)的缩小规模版本来测定α-淀粉酶活性，从250mg面粉开始。

结果

在来自HvLDI大麦植物突变体和对照大麦植物的正在发芽的谷粒、flex制麦的谷粒和VLB制麦的谷粒中发现相当的α-淀粉酶活性[U]/[g]。参见图2A、3A和4A。

β-淀粉酶活性

根据来自爱尔兰Megazyme的Betamyl-3方法(K-BETA3)的缩小规模版本来测定β-淀粉酶活性，从250mg面粉开始。

结果

在来自HvLDI大麦植物突变体和对照大麦植物的正在发芽的谷粒、flex制麦的谷粒和VLB制麦的谷粒中发现相当的β-淀粉酶活性[U]/[g]。参见图2B、3B和4B。

游离和总极限糊精酶活性

根据来自Megazyme的PullG6方法(K-PullG6)的缩小规模版本来测定极限糊精酶活性，从250mg面粉开始。在40℃下将面粉提取至2.5ml的0.1M马来酸pH 4.7中1小时(每15分钟定时混合一次)后，测量游离极限糊精酶活性，同时在40℃下将面粉提取至2.5ml的含25mM二硫苏糖醇的0.1M马来酸pH 4.7中1小时(每15分钟定时混合一次)后，测量总极限糊精酶活性。提取后，将样品在台式离心机(Heraeus Pico17离心机，Thermo Scientific^TM)中以10000rpm离心10分钟，并将上清液转移到500μl样品杯(Thermo Scientific^TM)中。使用定制测定在Gallery^TM Plus Beermaster Discrete Analyzer(Thermo Scientific^TM)中进行所述测定。将24μl上清液与24μl的PullG6底物一起温育，并让反应在37℃下进行1小时。通过添加240μlTrizma 2％终止反应，并根据来自Megazyme的PullG6方法(K-PullG6,Megazyme,爱尔兰)在减去反应空白后测量400nm处的吸光度。

结果

总极限糊精酶结果

与对照大麦植物相比，发现来自HvLDI大麦植物突变体的72小时发芽的谷粒和flex制麦的谷粒具有相当的总极限糊精酶活性[mU]/[g]。参见图2C和3C。经VLB制麦的谷粒中的总极限糊精酶活性与经比尔森制麦的谷粒中的总极限糊精酶活性相当。归因于用于经VLB制麦的谷粒的制麦条件，与标准比尔森麦芽相比，来自经VLB制麦的谷粒中的总极限糊精酶水平较低。参见图4C。

游离和游离/总极限糊精酶结果

与两种对照大麦植物Paustian和Planet以及HENZ-18和EBC19相比，来自HENZ-16a和HENZ-31大麦突变体的正在发芽的谷粒中的游离极限糊精酶活性以及游离/总极限糊精酶的比率更高(图2C)。

与两种对照大麦植物Paustian和Planet相比，来自HENZ-16a和HENZ-31大麦突变体的flex制麦的谷粒中的游离极限糊精酶活性以及游离/总极限糊精酶的比率更高(图3C)。

与对照大麦植物Paustian和比尔森麦芽相比，来自HENZ-16a大麦突变体的经VLB制麦的谷粒中的游离极限糊精酶活性以及游离/总极限糊精酶的比率更高(图4C)。

动力学测量结果

另外还对flex制麦的谷粒进行了动力学测量。

在于40℃下将flex制麦的面粉提取到0.1M马来酸pH 4.7中1小时后测量游离极限糊精酶的底物动力学，并在于40℃下将面粉提取到含有25mM二硫苏糖醇的0.1M马来酸pH4.7中1小时后测量总极限糊精酶的底物动力学。按照来自Megazyme的PullG6方法进行提取。

将50μl提取物与50μl PullG6底物以0-3mM的终浓度在测定管中于40℃下温育30分钟。然后用750μl Trizma 2％停止反应，并根据来自Megazyme的PullG6方法(K-PullG6，Megazyme，爱尔兰)在Genesys 10S UV-Vis分光光度计(Thermo Scientific^TM)中减去反应空白后测量400mm吸光度。使用公共可用网站ic50.tk，将数据拟合至Michaelis-Menten函数，且Km确定为反应达到Vmax一半时的底物浓度。

表7

与两种对照大麦植物Planet和Paustian相比，HENZ-16a和HENZ-31的游离HvLD的Km较低，参见表7。

在HENZ-16a、HENZ-31、Planet和Paustian中观察到总HvLDI的Km相似(表7)。

与Paustian相比，HENZ-16a中的游离极限糊精酶活性更高。另参见图5。

实施例8：麦芽汁中的糖化和糖分分析

使用标准Cyclotech研磨机(FOSS，丹麦)将VLB麦芽和干flex麦芽研磨成粉末。在实验中包括根据欧洲酿造大会标准EBC19制备的EBC19麦芽作为对照。

干flex麦芽的糖化

将70g干物质在水:麦芽粉比例5:1中混合，并根据以下糖化程序在Lochner糖化设备中进行糖化：52℃10分钟、65℃50分钟和78℃5分钟，以1度/分钟的温度爬升来间隔。这个过程也可以称为“糖化”。

VLB麦芽的糖化

将15g干物质在水:麦芽粉比例4:1中混合，并根据以下糖化程序在糖化机器人设备(Zinsser Analytics，德国)中进行糖化：52℃15分钟，65℃45分钟，72℃15分钟和78℃5分钟，以1度/分钟的温度爬升来间隔。这个过程也可以称为“糖化”。

测定了麦芽汁中可发酵糖例如果糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖，以及其他糖类的水平。对用0.1M NaOH中和的经过滤的麦芽汁进行分析。可溶性糖通过与脉冲电化学检测结合的高性能阴离子交换色谱法(High-Performance Anion-ExchangeChromatography Coupled with Pulsed Electrochemical Detection，HPAEC-PAD)来测定。

从干flex麦芽制备的麦芽汁中的糖分分析

结果如图6所示。图6A中的结果表明，与从Paustian的谷粒制备的麦芽汁相比，从HENZ-16a大麦突变体的谷粒制备的麦芽汁含有多8.2％的可发酵糖。

更具体地说，与从Paustian制备的麦芽汁中的葡萄糖、果糖、异麦芽糖、异麦芽三糖、麦芽糖、潘糖(panose)、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖和麦芽乳糖的水平相比，从HENZ-16a制备的麦芽汁中这些糖的水平更高(图6B)。

从干VLB麦芽制备的麦芽汁中的糖分分析

结果如图7所示。图7A中的结果表明，与从Paustian的谷粒制备的麦芽汁相比，从HENZ-16a大麦突变体的谷粒制备的麦芽汁含有多7.2％的可发酵糖(图7A)。

更具体地说，与从Paustian制备的麦芽汁中的葡萄糖、果糖、异麦芽糖、异麦芽三糖、麦芽糖、潘糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽七糖和麦芽乳糖的水平相比，从HENZ-16a制备的麦芽汁中这些糖的水平更高(图7B)。

实施例9：支链淀粉链长分布分析/聚合程度

丹麦产季2017

HENZ-16a、HENZ-18和HENZ-31、Planet和Paustian大麦植物于2017产季在丹麦的邻近地块种植。

新西兰产季2017/2018

HENZ-16a、HENZ-18和HENZ-31、Planet和Paustian大麦植物于2017/18产季在新西兰的邻近地块种植。如下所述分析收获的谷粒。

按照Shaik等人(2014)，从面粉(2mg)中分离出淀粉。淀粉用斯氏假单胞菌异淀粉酶(Pseudomonas spearoides isoamylase)和地衣芽孢杆菌短梗霉聚糖酶(Bacilluslicheniformis pullulanase)(Megazyme，爱尔兰)脱支，并按照Blennow等人(1998)使用CarboPac PA100分析柱在ICS-3000色谱系统(Dionex)中进行分析。

聚合程度和链长分布结果如图8和图9所示。

突变体(HENZ-8、HENZ-9、HENZ-16、HENZ-18和HENZ-31)的支链淀粉的链长分布谱与两种对照大麦植物Planet和Paustian基本上相同。链长的微小差异是标准技术变化的结果。

实施例10：产量和谷粒分析

产量

大麦植物在丹麦2018(2个重复)和新西兰2017/2018(3-8个重复)种植，并测量了大麦植物的产量。实验结果总结在表8中。

表8

未观察到突变大麦植物和对照之间有显著差异。

从新西兰2017/2018种植的大麦植物中分析谷粒重量。实验结果总结在表9中。

表9

蛋白质、水和淀粉含量

蛋白质、水和淀粉的谷粒含量是使用FOSS Infratec^TM NOVA仪器根据制造商说明并应用仪器供应商提供的对这些组件的校准来测量的。结果如下表10所示。

表10新西兰2017/2018

	蛋白质,％	水,％	淀粉,％
				HENZ-16	11,9±0,1	11,2±0,0	62,3±0,2
HENZ-18	13,3±0,0	11,3±0,0	60,0±0,2
				Paustian	11,4±0,1	11,1±0,1	62,8±0,1
HENZ-31	10,8±0,1	11,4±0,1	63,4±0,1
				Planet	11,5±0,2	11,2±0,1	62,9±0,2

结果表明，HENZ-16、HENZ-18、Paustian、HENZ-31和Planet在蛋白质含量、含水量和淀粉含量方面没有显著差异。

序列表

<110> 嘉士伯有限公司（Carlsberg A/S）

<120> 具有高极限糊精酶活性的大麦植物

<130> P5361PCT00

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 147

<212> PRT

<213> 大麦（Hordeum vulgare）

<400> 1

Met Ala Ser Asp His Arg Arg Phe Val Leu Ser Gly Ala Val Leu Leu

1 5 10 15

Ser Val Leu Ala Val Ala Ala Ala Thr Leu Glu Ser Val Lys Asp Glu

20 25 30

Cys Gln Pro Gly Val Asp Phe Pro His Asn Pro Leu Ala Thr Cys His

35 40 45

Thr Tyr Val Ile Lys Arg Val Cys Gly Arg Gly Pro Ser Arg Pro Met

50 55 60

Leu Val Lys Glu Arg Cys Cys Arg Glu Leu Ala Ala Val Pro Asp His

65 70 75 80

Cys Arg Cys Glu Ala Leu Arg Ile Leu Met Asp Gly Val Arg Thr Pro

85 90 95

Glu Gly Arg Val Val Glu Gly Arg Leu Gly Asp Arg Arg Asp Cys Pro

100 105 110

Arg Glu Glu Gln Arg Ala Phe Ala Ala Thr Leu Val Thr Ala Ala Glu

115 120 125

Cys Asn Leu Ser Ser Val Gln Glu Pro Gly Val Arg Leu Val Leu Leu

130 135 140

Ala Asp Gly

145

<210> 2

<211> 1286

<212> DNA

<213> 大麦（Hordeum vulgare）

<400> 2

ttattggaca ccaaatgtat cataaacttg ttttttcacc gacaaaatat tgctcctcca 60

tttcgcatta aaattgtcaa gcatgcttgc aacagtaaca cgaacattca taaaaaaaat 120

attttttaag aaaacattta ctattttttt gttactattc atctgggagc atgtgcttcc 180

ggaagccaaa atgccccttc caatatgccc cgtgtaaaag aaaccccttc tttcctaaaa 240

atatatatca tcgtccgtca tgatacgttt atgtattcaa cgaaaaatat tttcgcatgt 300

caccaaaaat gttttatatt acacaagtga acaaatatga taaactccct cgtgttaact 360

attttttctg tgaaataaaa ggatgacaat caaaacaaaa atgtagactg taaacaaaga 420

aaacattatt tcctagaaat aaaaaaaaag attagaggga tatgtattgt cgaaacacat 480

gaggactaga acaaaagaaa aagggaaatg agaaggaaaa aaggggtaac cattacccaa 540

agaaaacaga aagtaaacta gacgtgtcga agggaaacgg agtttgcagg ggcgttccaa 600

attcagttgc aagaacctcc aaataaacgc caacaagaaa gaaatgagca ttacttgcgc 660

gctttgcact cttatctcta gcatctcccg atacatacat acatgtagcc tagctgcaga 720

tcttgaatag ctattcttgc ccaccaggcc aagagattga accaacgacc aataaactag 780

tatcaacaat ggcatccgac catcgtcgct tcgtcctctc cggcgccgtc ttgctctcgg 840

tcctcgccgt cgccgccgcc accctggaga gcgtcaagga cgagtgccaa ccaggggtgg 900

acttcccgca taacccgtta gccacctgcc acacctacgt gataaaacgg gtctgcggcc 960

gcggtcccag ccggcccatg ctggtgaagg agcggtgctg ccgggagctg gcggccgtcc 1020

cggatcactg ccggtgcgag gcgctgcgca tcctcatgga cggggtgcgc acgccggagg 1080

gccgcgtggt tgagggacgg ctcggtgaca ggcgtgactg cccgagggag gagcagaggg 1140

cgttcgccgc cacgcttgtc acggcggcgg agtgcaacct atcgtccgtc caggagccgg 1200

gagtacgctt ggtgctactg gcagatggat gacgatcgaa atgcgccaag gtaatgaagc 1260

ggagtactgt atacagaata aaagta 1286

<210> 3

<211> 147

<212> PRT

<213> 大麦（Hordeum vulgare）

<400> 3

Met Ala Ser Asp His Arg Arg Phe Val Leu Ser Gly Ala Val Leu Leu

1 5 10 15

Ser Val Leu Ala Val Ala Ala Ala Thr Leu Glu Ser Val Lys Asp Glu

20 25 30

Cys Gln Pro Gly Val Asp Phe Pro His Asn Pro Leu Ala Thr Cys His

35 40 45

Thr Tyr Val Ile Lys Arg Val Cys Gly Arg Gly Ser Ser Arg Pro Met

50 55 60

Leu Val Lys Glu Arg Cys Cys Arg Glu Leu Ala Ala Val Pro Asp His

65 70 75 80

Cys Arg Cys Glu Ala Leu Arg Ile Leu Met Asp Gly Val Arg Thr Pro

85 90 95

Glu Gly Arg Val Val Glu Gly Arg Leu Gly Asp Arg Arg Asp Cys Pro

100 105 110

Arg Glu Glu Gln Arg Ala Phe Ala Ala Thr Leu Val Thr Ala Ala Glu

115 120 125

Cys Asn Leu Ser Ser Val Gln Glu Pro Gly Val Arg Leu Val Leu Leu

130 135 140

Ala Asp Gly

145

<210> 4

<211> 147

<212> PRT

<213> 大麦（Hordeum vulgare）

<400> 4

Met Ala Ser Asp His Arg Arg Phe Val Leu Ser Gly Ala Val Leu Leu

1 5 10 15

Ser Val Leu Ala Val Ala Ala Ala Thr Leu Glu Ser Val Lys Asp Glu

20 25 30

Cys Gln Pro Gly Val Asp Phe Pro His Asn Pro Leu Ala Thr Cys His

35 40 45

Thr Tyr Val Ile Lys Arg Val Cys Gly Arg Gly Leu Ser Arg Pro Met

50 55 60

Leu Val Lys Glu Arg Cys Cys Arg Glu Leu Ala Ala Val Pro Asp His

65 70 75 80

Cys Arg Cys Glu Ala Leu Arg Ile Leu Met Asp Gly Val Arg Thr Pro

85 90 95

Glu Gly Arg Val Val Glu Gly Arg Leu Gly Asp Arg Arg Asp Cys Pro

100 105 110

Arg Glu Glu Gln Arg Ala Phe Ala Ala Thr Leu Val Thr Ala Ala Glu

115 120 125

Cys Asn Leu Ser Ser Val Gln Glu Pro Gly Val Arg Leu Val Leu Leu

130 135 140

Ala Asp Gly

145

<210> 5

<211> 147

<212> PRT

<213> 大麦（Hordeum vulgare）

<400> 5

Met Ala Ser Asp His Arg Arg Phe Val Leu Ser Gly Ala Val Leu Leu

1 5 10 15

Ser Val Leu Ala Val Ala Ala Ala Thr Leu Glu Ser Val Lys Asp Glu

20 25 30

Cys Gln Pro Gly Val Asp Phe Pro His Asn Pro Leu Ala Thr Cys His

35 40 45

Thr Tyr Val Ile Lys Arg Val Cys Gly Arg Gly Pro Ser Arg Pro Met

50 55 60

Leu Met Lys Glu Arg Cys Cys Arg Glu Leu Ala Ala Val Pro Asp His

65 70 75 80

Cys Arg Cys Glu Ala Leu Arg Ile Leu Met Asp Gly Val Arg Thr Pro

85 90 95

Glu Gly Arg Val Val Glu Gly Arg Leu Gly Asp Arg Arg Asp Cys Pro

100 105 110

Arg Glu Glu Gln Arg Ala Phe Ala Ala Thr Leu Val Thr Ala Ala Glu

115 120 125

Cys Asn Leu Ser Ser Val Gln Glu Pro Gly Val Arg Leu Val Leu Leu

130 135 140

Ala Asp Gly

145

<210> 6

<211> 147

<212> PRT

<213> 大麦（Hordeum vulgare）

<400> 6

Met Ala Ser Asp His Arg Arg Phe Val Leu Ser Gly Ala Val Leu Leu

1 5 10 15

Ser Val Leu Ala Val Ala Ala Ala Thr Leu Glu Ser Val Lys Asp Glu

20 25 30

Cys Gln Pro Gly Val Asp Phe Pro His Asn Pro Leu Ala Thr Cys His

35 40 45

Thr Tyr Val Ile Lys Arg Val Cys Gly Arg Gly Pro Ser Arg Pro Met

50 55 60

Leu Val Lys Lys Arg Cys Cys Arg Glu Leu Ala Ala Val Pro Asp His

65 70 75 80

Cys Arg Cys Glu Ala Leu Arg Ile Leu Met Asp Gly Val Arg Thr Pro

85 90 95

Glu Gly Arg Val Val Glu Gly Arg Leu Gly Asp Arg Arg Asp Cys Pro

100 105 110

Arg Glu Glu Gln Arg Ala Phe Ala Ala Thr Leu Val Thr Ala Ala Glu

115 120 125

Cys Asn Leu Ser Ser Val Gln Glu Pro Gly Val Arg Leu Val Leu Leu

130 135 140

Ala Asp Gly

145

<210> 7

<211> 905

<212> PRT

<213> 大麦（Hordeum vulgare）

<400> 7

Met Ala Val Gly Glu Thr Gly Ala Ser Val Ser Ala Ala Glu Ala Glu

1 5 10 15

Ala Glu Ala Thr Gln Ala Phe Met Pro Asp Ala Arg Ala Tyr Trp Val

20 25 30

Thr Ser Asp Leu Ile Ala Trp Asn Val Gly Glu Leu Glu Ala Gln Ser

35 40 45

Val Cys Leu Tyr Ala Ser Arg Ala Ala Ala Met Ser Leu Ser Pro Ser

50 55 60

Asn Gly Gly Ile Gln Gly Tyr Asp Ser Lys Val Glu Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Ser Ala Gly Leu Pro Glu Thr Val Thr Gln Lys Phe Pro Phe Ile Ser

85 90 95

Ser Tyr Arg Ala Phe Lys Val Pro Ser Ser Val Asp Val Ala Ser Leu

100 105 110

Val Lys Cys Gln Leu Val Val Ala Ser Phe Gly Ala Asp Gly Lys His

115 120 125

Val Asp Val Thr Gly Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Asp Asp Met Phe

130 135 140

Ala Tyr Thr Gly Pro Leu Gly Ala Val Phe Ser Glu Asp Ser Val Ser

145 150 155 160

Leu His Leu Trp Ala Pro Thr Ala Gln Gly Val Ser Val Cys Phe Phe

165 170 175

Asp Gly Pro Ala Gly Pro Ala Leu Glu Thr Val Gln Leu Lys Glu Ser

180 185 190

Asn Gly Val Trp Ser Val Thr Gly Pro Arg Glu Trp Glu Asn Arg Tyr

195 200 205

Tyr Leu Tyr Glu Val Asp Val Tyr His Pro Thr Lys Ala Gln Val Leu

210 215 220

Lys Cys Leu Ala Gly Asp Pro Tyr Thr Arg Ser Leu Ser Ala Asn Gly

225 230 235 240

Ala Arg Thr Trp Leu Val Asp Ile Asn Asn Glu Thr Leu Lys Pro Ala

245 250 255

Ser Trp Asp Glu Leu Ala Asp Glu Lys Pro Lys Leu Asp Ser Phe Ser

260 265 270

Asp Ile Thr Ile Tyr Glu Leu His Ile Arg Asp Phe Ser Ala His Asp

275 280 285

Gly Thr Val Asp Ser Asp Ser Arg Gly Gly Phe Arg Ala Phe Ala Tyr

290 295 300

Gln Ala Ser Ala Gly Met Glu His Leu Arg Lys Leu Ser Asp Ala Gly

305 310 315 320

Leu Thr His Val His Leu Leu Pro Ser Phe His Phe Ala Gly Val Asp

325 330 335

Asp Ile Lys Ser Asn Trp Lys Phe Val Asp Glu Cys Glu Leu Ala Thr

340 345 350

Phe Pro Pro Gly Ser Asp Met Gln Gln Ala Ala Val Val Ala Ile Gln

355 360 365

Glu Glu Asp Pro Tyr Asn Trp Gly Tyr Asn Pro Val Leu Trp Gly Val

370 375 380

Pro Lys Gly Ser Tyr Ala Ser Asp Pro Asp Gly Pro Ser Arg Ile Ile

385 390 395 400

Glu Tyr Arg Gln Met Val Gln Ala Leu Asn Arg Ile Gly Leu Cys Val

405 410 415

Val Met Asp Val Val Tyr Asn His Leu Asp Ser Ser Gly Pro Cys Gly

420 425 430

Ile Ser Ser Val Leu Asp Lys Ile Val Pro Gly Tyr Tyr Val Arg Arg

435 440 445

Asp Thr Asn Gly Gln Ile Glu Asn Ser Ala Ala Met Asn Asn Thr Ala

450 455 460

Ser Glu His Phe Met Val Asp Arg Leu Ile Val Asp Asp Leu Leu Asn

465 470 475 480

Trp Ala Val Asn Tyr Lys Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Gly

485 490 495

His Ile Met Lys Arg Thr Met Met Arg Ala Lys Ser Ala Leu Gln Ser

500 505 510

Leu Thr Thr Asp Ala His Gly Val Asp Gly Ser Lys Ile Tyr Leu Tyr

515 520 525

Gly Glu Gly Trp Asp Phe Ala Glu Val Ala Arg Asn Gln Arg Gly Ile

530 535 540

Asn Gly Ser Gln Leu Asn Met Ser Gly Thr Gly Ile Gly Ser Phe Asn

545 550 555 560

Asp Arg Ile Arg Asp Ala Ile Asn Gly Gly Asn Pro Phe Gly Asn Pro

565 570 575

Leu Gln Gln Gly Phe Asn Thr Gly Leu Phe Leu Glu Pro Asn Gly Phe

580 585 590

Tyr Gln Gly Asn Glu Ala Asp Thr Arg Arg Ser Leu Ala Thr Tyr Ala

595 600 605

Asp Gln Ile Gln Ile Gly Leu Ala Gly Asn Leu Arg Asp Tyr Val Leu

610 615 620

Ile Ser His Thr Gly Glu Ala Lys Lys Gly Ser Glu Ile His Thr Phe

625 630 635 640

Asp Gly Leu Pro Val Gly Tyr Thr Ala Ser Pro Ile Glu Thr Ile Asn

645 650 655

Tyr Val Ser Ala His Asp Asn Glu Thr Leu Phe Asp Val Ile Ser Val

660 665 670

Lys Thr Pro Met Ile Leu Ser Val Asp Glu Arg Cys Arg Ile Asn His

675 680 685

Leu Ala Ser Ser Met Met Ala Leu Ser Gln Gly Ile Pro Phe Phe His

690 695 700

Ala Gly Asp Glu Ile Leu Arg Ser Lys Ser Ile Asp Arg Asp Ser Tyr

705 710 715 720

Asn Ser Gly Asp Trp Phe Asn Lys Leu Asp Phe Thr Tyr Glu Thr Asn

725 730 735

Asn Trp Gly Val Gly Leu Pro Pro Ser Glu Lys Asn Glu Asp Asn Trp

740 745 750

Pro Leu Met Lys Pro Arg Leu Glu Asn Pro Ser Phe Lys Pro Ala Lys

755 760 765

Gly His Ile Leu Ala Ala Leu Asp Ser Phe Val Asp Ile Leu Lys Ile

770 775 780

Arg Tyr Ser Ser Pro Leu Phe Arg Leu Ser Thr Ala Asn Asp Ile Lys

785 790 795 800

Gln Arg Val Arg Phe His Asn Thr Gly Pro Ser Leu Val Pro Gly Val

805 810 815

Ile Val Met Gly Ile Glu Asp Ala Arg Gly Glu Ser Pro Glu Met Ala

820 825 830

Gln Leu Asp Thr Asn Phe Ser Tyr Val Val Thr Val Phe Asn Val Cys

835 840 845

Pro His Glu Val Ser Met Asp Ile Pro Ala Leu Ala Ser Met Gly Phe

850 855 860

Glu Leu His Pro Val Gln Val Asn Ser Ser Asp Thr Leu Val Arg Lys

865 870 875 880

Ser Ala Tyr Glu Ala Ala Thr Gly Arg Phe Thr Val Pro Gly Arg Thr

885 890 895

Val Ser Val Phe Val Glu Pro Arg Cys

900 905

<210> 8

<211> 2718

<212> DNA

<213> 大麦（Hordeum vulgare）

<400> 8

atggcggtcg gggagaccgg cgcctccgtc tccgcagccg aggccgaggc cgaggccacc 60

caggcgttca tgccggacgc cagggcgtac tgggtgacga gcgacctcat cgcctggaac 120

gtcggcgagc tggaagcgca gtccgtctgc ctgtacgcca gcagagccgc cgcgatgagc 180

ctctcgccgt cgaatggcgg catccaaggc tacgactcca aggttgagct gcaaccggag 240

agcgccgggc tcccggaaac cgtgacccag aagttccctt tcatcagcag ttacagagca 300

ttcaaggtcc cgagctctgt cgacgtcgcc agccttgtga aatgccaact ggtcgtcgct 360

tctttcggcg ctgacgggaa acacgtagat gttactggac tgcaattacc cggcgtgctg 420

gatgatatgt tcgcatacac gggaccgctc ggtgcggttt tcagcgagga ctctgtgagc 480

ctgcaccttt gggctcctac agcacagggc gtgagcgtgt gcttctttga tggtccagca 540

ggccctgcgc tagagacggt gcagctcaag gagtcaaatg gtgtttggag tgtcactgga 600

ccaagagagt gggaaaaccg gtactatttg tatgaagtcg acgtgtatca tccaactaag 660

gcgcaggttc tgaaatgttt agctggtgac ccttatacta gaagcctttc tgcaaatgga 720

gcgcgtacct ggttggttga cattaacaat gagacattga agccggcttc ctgggatgaa 780

ttggctgatg agaagccaaa acttgattcc ttctctgaca taaccatcta tgaattgcac 840

attcgtgatt ttagcgccca cgatggcaca gtggacagtg actctcgtgg aggatttcgt 900

gcatttgcat atcaggcctc ggcaggaatg gagcacctac ggaaattatc tgatgctggt 960

ttgactcatg tgcatttgtt gccaagcttt cattttgctg gcgttgacga cattaagagc 1020

aactggaaat ttgtcgatga gtgtgaacta gcaacattcc ctccagggtc agatatgcaa 1080

caagcagcag tagtagctat tcaggaagag gacccttata attgggggta taaccctgtg 1140

ctctgggggg ttccaaaagg aagctatgca agtgaccctg atggcccgag tcgaattatt 1200

gaatatcgtc agatggtcca ggccctcaat cgcataggtc tttgtgttgt catggatgtt 1260

gtatacaatc atctagactc aagtggcccc tgcggtatca gctcagtgct tgacaagatt 1320

gttcctgggt actatgttag aagggatact aatggccaga ttgagaacag tgcagctatg 1380

aacaatacag caagtgagca tttcatggtt gataggttaa tcgtggatga ccttttgaac 1440

tgggcagtaa actacaaagt tgacgggttc agatttgatc ttatgggcca tatcatgaaa 1500

cgcacaatga tgagagcaaa atctgctctt caaagcctta caacagatgc acatggagtt 1560

gatggttcaa aaatatactt gtatggtgaa ggatgggact tcgctgaagt tgcacgcaat 1620

caacgtggaa taaatgggtc ccagcttaat atgagtggaa cggggattgg tagcttcaat 1680

gatagaatcc gggatgctat taatgggggt aatccctttg gtaatccgct ccagcaaggc 1740

ttcaatactg gtctgttctt agagccgaat gggttttatc agggcaatga agcagatacc 1800

aggcgctcgc tcgctactta tgctgaccaa atacagattg gactagctgg taatctgagg 1860

gattatgtac taatatctca tactggagaa gctaagaagg gatcagaaat tcacactttt 1920

gatggattac cagtaggcta tactgcgtcc ccaatagaaa cgataaacta tgtttctgct 1980

catgacaatg agactctatt tgatgttatc agtgtgaaga ccccaatgat cctttcagtt 2040

gatgagagat gcaggataaa tcatttggcc tccagcatga tggcattatc ccagggaata 2100

cccttcttcc acgctggtga cgagatacta agatctaagt ccatcgaccg agattcatat 2160

aactctggtg attggtttaa caagcttgat tttacctatg aaacaaacaa ttggggtgtt 2220

gggcttcctc caagtgaaaa gaacgaagat aattggcccc tgatgaaacc aagattggaa 2280

aatccgtctt ttaaacctgc aaaaggacac attcttgctg ccctagacag ttttgttgac 2340

atcttgaaga tcagatactc atctccactt tttcgtctca gtacagcaaa tgacattaag 2400

caaagggtac gctttcacaa cacagggccc tccttagtcc caggtgttat tgtcatgggc 2460

attgaagatg cacgaggtga gagccccgag atggctcaat tagacacgaa cttctcttat 2520

gtcgtaaccg tcttcaatgt gtgtccgcac gaagtgtcca tggatatccc cgctctcgct 2580

tcgatggggt ttgaactgca tcctgtgcag gtgaattcat cagatacttt ggtgaggaaa 2640

tcggcgtacg aggccgcgac gggcaggttc accgtgcccg gaagaaccgt gtcagtcttt 2700

gtcgaacctc ggtgttga 2718

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> HENZ-16a正向引物

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(19)

<223> HENZ-16a正向引物

<400> 9

ctacgtgata aaacgggtc 19

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> HENZ-16a反向引物

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(15)

<223> HENZ-16a反向引物

<400> 10

ccgctccttc accag 15

<210> 11

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> HENZ-16a FAM探针

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(13)

<223> HENZ-16a FAM探针

<400> 11

cggctggaac cgc 13

<210> 12

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> HENZ-16a HEX探针

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(13)

<223> HENZ-16a HEX探针

<400> 12

ccggctggga ccg 13

<210> 13

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> HENZ-18正向引物

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(12)

<223> HENZ-18正向引物

<400> 13

gccgcggtcc ca 12

<210> 14

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> HENZ-18反向引物

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(15)

<223> HENZ-18反向引物

<400> 14

cagtgatccg ggacg 15

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> HENZ-18 FAM探针

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(17)

<223> HENZ-18 FAM探针

<400> 15

atgctgatga aggagcg 17

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> HENZ-18 HEX探针

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(16)

<223> HENZ-18 HEX探针

<400> 16

atgctggtga aggagc 16

<210> 17

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> HENZ-31正向引物

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(12)

<223> HENZ-31正向引物

<400> 17

gccgcggtcc ca 12

<210> 18

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> HENZ-31反向引物

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(15)

<223> HENZ-31反向引物

<400> 18

cagtgatccg ggacg 15

<210> 19

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> HENZ-31 FAM探针

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(16)

<223> HENZ-31 FAM探针

<400> 19

tggtgaagaa gcggtg 16

<210> 20

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> HENZ-31 HEX探针

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(15)

<223> HENZ-31 HEX探针

<400> 20

tggtgaagga gcggt 15

Claims

1.一种大麦植物或其部分，其中所述大麦植物携带HvLDI基因中的突变，其中突变的HvLDI基因编码突变体HvLDI多肽，其中所述突变是以下突变之一

2.根据权利要求1所述的大麦植物或其部分，其中所述突变体HvLDI多肽与成熟的wtHvLDI多肽或其天然变体除了在指定位置的突变以外其他均相同。

3.根据前述权利要求中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述突变体HvLDI多肽包含来自SEQ ID NO:3的位置25至142的氨基酸序列或来自SEQ ID NO:3的位置25至147的氨基酸序列或由以上组成，或由来自SEQ ID NO:4的位置25至142的氨基酸序列或来自SEQID NO:4的位置25至147的氨基酸序列组成。

4.根据前述权利要求中任一项所述的大麦植物或其部分，其中所述突变体HvLDI多肽包含来自SEQ ID NO:6的位置25至142的氨基酸序列或来自SEQ ID NO:6的位置25至147的氨基酸序列，或由以上组成。

5.根据前述权利要求中任一项所述的大麦植物或其部分，其中当在相同条件下培养和制备时，与除了携带编码wt HvLDI多肽的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的谷粒中测量的游离HvLD活性相比，来自所述大麦植物的谷粒或发芽的谷粒或麦芽具有高至少20％的游离HvLD活性。

6.一种大麦植物或其部分，其中所述大麦植物携带HvLDI基因中的一个或多个突变，所述突变选自：

7.根据前述权利要求中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的谷粒具有至少45克，例如至少50克，例如至少55克的千粒重。

8.根据前述权利要求中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的谷粒具有至少50％，例如至少55％，例如至少60％的淀粉含量。

9.根据前述权利要求中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物进一步包含一个或多个另外的基因中的突变，所述突变选自：

a.编码LOX-1的基因中导致功能性LOX-1完全丧失的突变；

b.编码LOX-2的基因中导致功能性LOX-2完全丧失的突变；

c.编码MMT的基因中导致功能性MMT完全丧失的突变；

e.编码HRT基因的基因中导致HRT功能丧失的突变；

f.编码HBL12基因的基因中导致HBL功能丧失的突变；

g.编码WRKY38基因的基因中导致WRKY38功能丧失的突变；和

h.ant突变，例如Hvmyb10基因中的突变。

10.一种植物产品，其包含根据前述权利要求中任一项所述的大麦植物或其部分。

11.根据权利要求10所述的植物产品，其中所述植物产品选自：

a.由所述大麦植物的谷粒制备的麦芽；

c.从所述大麦植物或其部分制备的饮料，例如啤酒。

12.一种制备麦芽的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供根据权利要求1至9中任一项所述的大麦植物的谷粒；

b.在预定条件下浸泡所述谷粒并使其发芽；

c.任选地，干燥发芽的谷粒。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述浸泡和发芽包括以下步骤：

a.将根据权利要求1至9中任一项所述的大麦植物的谷粒在水性溶液中在通气环境下温育5至10小时；

b.排出水性溶液，并使谷粒空气静置8至16小时，优选在通气环境下；

c.将谷粒在水性溶液中在通气环境下温育2至10小时；和

d.排出水性溶液，并将谷粒进行第二空气静置阶段8至20小时，优选在通气环境下，同时保持温度在20至28℃的范围内；

其中在步骤a.之后的任何时间点，谷粒的含水量为至少20％。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述浸泡和发芽在48至72小时的范围内进行，并且省略权利要求12的步骤c.。

15.一种制备水性提取物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供根据权利要求1至9中任一项所述的大麦植物的谷粒和/或根据权利要求12至14生产的麦芽；

b.制备所述谷粒和/或所述麦芽的水性提取物，例如麦芽汁。

16.根据权利要求15所述的方法，其中当在相同条件下制备时，与除了携带编码wtHvLDI多肽的HvLDI基因以外具有相同基因型的大麦植物的水性提取物相比，所述水性提取物具有多至少10％的葡萄糖、果糖和/或麦芽三糖。

17.一种生产饮料的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供根据权利要求1至9中任一项所述的大麦植物的谷粒和/或根据权利要求12至14生产的麦芽和/或根据权利要求15或16的方法生产的水性提取物；

b.将所述水性提取物加工成饮料。