CN115267025B - 测定载四甲基七叶葶菌蜕的载药量和载药情况的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种测定载四甲基七叶葶菌蜕的载药量和载药情况的方法。该方法包括以下步骤：制备菌蜕；制备载药菌蜕；采用SDS裂解超声破碎法对载药菌蜕进行破碎；采用HPLC检测载药菌蜕的载药量；显微镜观察载药菌蜕的载药情况。同时，本发明提供了一种定量检测四甲基七叶葶的HPLC方法，绘制标准曲线，通过峰面积计算四甲基七叶葶的含量，该方法的色谱条件为：以C18‑AQ色谱柱为固定相，以流动相A和流动相B为流动相进行梯度洗脱，其中流动相A为磷酸溶液，流动相B为乙腈溶液；检测波长为254nm，该方法操作简单，灵敏度高，检测结果精准度高。

Description

测定载四甲基七叶葶菌蜕的载药量和载药情况的方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种测定载四甲基七叶葶菌蜕的载药量和载药情况的方法。
背景技术
大肠杆菌Nissle1917(简称ECN)作为“Mutaflor”的主要成分制成药物干粉，临床上用于治疗炎症性肠病(简称IBD)。菌蜕载药系统暂处于研究阶段，常用作疫苗制备，例如作为灭活疫苗、基因工程疫苗或DNA疫苗载体，同时菌蜕载药系统具有一定的载药功能常用于治疗肿瘤，比如可用于增强化疗药物的靶向性减少对其他细胞的毒性。四甲基七叶葶为香豆素衍生物，具有强大的抗氧化和抗炎活性，目前四甲基七叶葶在IBD治疗中仍处于研究阶段。
现有技术“Estimation of Anti-neoplastic Drug Doxorubicin in BacterialGhost Matrix by New“Environmentally Benign”RP-HPLC Method:A Step TowardsSustainable Development of Pharmaceutical Industry”公开了一种菌蜕内HPLC测定的方法，其用HPLC测定阿霉素在菌蜕内的载药量，阿霉素是一种广谱抗生素，可用于靶组织的抗菌。然而该HPLC法具有以下缺点：1)该HPLC法无法测定碱性药物，所用的裂解液含有硫酸，易与碱性药物产生反应从而影响载药量测定，而用于治疗肠道炎症的药物例如磺胺类药物往往是碱性的。2)该现有技术采用SDS破坏细胞膜，通过溶解膜蛋白破坏膜结构，同时采用高温+硫酸的方式破坏细胞膜(高温使蛋白质变性；硫酸腐蚀破坏细胞膜)，因为药物与菌蜕内部是靠静电吸附作用结合的，该破膜方法对膜破坏并不充分，会使得药物仍结合在细菌膜碎片上，且离心后药物可能还保留在沉淀中。3)该现有技术未对载药的菌蜕进行直观的显微观察，即使药物经过洗涤，是否有多余药物游离于菌蜕外部未知。
有鉴于此，本专利以四甲基七叶葶为內载药物，提供了一种四甲基七叶葶的HPLC检测方法，可用于治疗IBD的药物的载药情况和载药量的测定。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种定量检测四甲基七叶葶的HPLC方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
定量检测四甲基七叶葶的HPLC方法，所述方法包括以下步骤：
(1)配制甲基七叶葶的标准品A-E，HPLC检测，绘制标准曲线；
(2)配制甲基七叶葶的待测样品，HPLC检测，得到峰面积；
(3)根据步骤(2)所得峰面积，计算四甲基七叶葶的含量；
所述方法的色谱条件为：以C18-AQ色谱柱为固定相，以流动相A和流动相B为流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为磷酸溶液，所述流动相B为乙腈溶液；检测波长为254nm；所述梯度洗脱程序为：
在0分钟，设置流动相A体积分数为80％，流动相B体积分数为20％；
在7分钟，设置流动相A体积分数为20％，流动相B体积分数为80％；
在10分钟，设置流动相A体积分数为20％，流动相B体积分数为80％；
在15分钟，设置流动相A体积分数为80％，流动相B体积分数为20％；
在20分钟，设置流动相A体积分数为80％，流动相B体积分数为20％。
进一步，所述标准品A-E浓度依次为1.0mg/ml、0.8mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml和0.1mg/ml。
进一步，所述流动相流速为1mL/min；所述色谱柱柱温为30℃。
进一步，进样量为10μL。
进一步，所述所述流动相A为0.1％磷酸溶液。
进一步，所述C18-AQ色谱柱的长度为250mm，内径为4.6mm，填料颗粒直径为5.0μm。
进一步，所述四甲基七叶葶出峰的保留时间为6.600min。
进一步，步骤(3)具体为：将步骤(2)中每组实验做3个平行，将每组HPLC得到峰面积通过标准曲线计算得到浓度，再乘以体积得到1mg菌蜕的载药量，并以此绘制标准曲线。
进一步，四甲基七叶葶的标准曲线为Y＝1.025*107*X，R2＝0.9998，Y表示峰面积，单位为mV；X表示浓度，单位为mg/ml。
本发明的目的之二在于提供一种测定搭载四甲基七叶葶的ECN菌蜕的载药量的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种测定搭载四甲基七叶葶的ECN菌蜕的载药量的方法，所述方法包括以下步骤：
S1：制备菌蜕；
S2：制备载药菌蜕；
S3：采用SDS裂解超声破碎法对S2所得载药菌蜕进行破碎；
S4：采用前述定量检测四甲基七叶葶的HPLC方法检测载药菌蜕的载药量；
S5：显微镜观察所述载药菌蜕的载药情况。
进一步，S2中，菌蜕载药浓度分别为1.25mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml和20mg/ml；菌蜕载药浓度根据载药量而定。
进一步，S2具体为：精密称取的1mg的ECN菌蜕悬浮于不同浓度的四甲基七叶葶DMSO溶液中，涡旋仪800rpm室温涡旋1h，12000rpm离心10min，弃上清后加水洗涤2次，置于-20℃保存10min后，冻干机过夜冻干12h，制得不同浓度的冻干粉，即载四甲基七叶葶ECN菌蜕。
进一步，S3中，SDS裂解液由EDTA、SDS和Tris-HCl缓冲液组成，所述EDTA浓度为1mM，所述Tris-HCl缓冲液浓度为50mM，所述SDS质量分数为5％。
其中，EDTA螯合金属离子解体蛋白质复合体，SDS破坏蛋白质二级、三级结构；所述Tris-HCl缓冲液pH为8.1。
进一步，S3具体为：将S2制得的不同浓度的冻干粉分别加入200ul SDS裂解液，并在涡旋仪上(800rpm)涡旋10min，金属浴70℃裂解10min后，加无菌水溶液至2ml，用超声破碎仪超声破碎(10min，5s/5s)，超声的目的是为了让药物充分溶于水溶液中，离心(13000rpm)10min，取上清液用于HPLC测定。
进一步，标准曲线y＝0.0044x-0.0062，R2＝0.9892，y表示载药量，单位为mg；X表示四甲基七叶葶的浓度，单位为mg/ml。
进一步，S5中，利用荧光和激光共聚焦显微镜对菌蜕搭载四甲基七叶葶进行观察，验证是否有游离的四甲基七叶葶在液体中，判断洗涤能否洗净游离药物，确保HPLC检测结果的准确性。本专利利用用显微镜观察内载药，根据激发波段的不同以观察自发荧光内载药物的联用。
进一步，所述方法适用于菌蜕搭载任一荧光药物的载药情况和载药量的测定，所述荧光药物为自发荧光药物、间接发荧光药物中的任一种或多种。
本发明的目的之三在于提供一种测定ECN菌蜕內载药物载药量和载药情况的方法，该方法可用于配合筛选能与ECN菌蜕联用治疗IBD的新型抗炎荧光药物。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种测定ECN菌蜕內载药物载药量和载药情况的方法，所述內载药物包括自发荧光药物和/或间接发荧光药物；所述方法包括以下步骤：
S1：制备菌蜕；
S2：菌蜕搭载药物；
S3：载药菌蜕破碎：采用SDS裂解超声破碎法对ECN菌蜕进行破碎；
S4：HPLC法检测初始浓度与载药量的关系；
S5：显微镜观察载药情况。
进一步，所述自发荧光药物为香豆素类衍生物、蒽环类药物中的任一种或多种；所述间接发荧光药物包括FITC标记的药物、Cy3标记的药物、抗生素、抗癌药物中的任一种或多种。
进一步，所述內载药物包括亮菌甲素、四甲基七叶葶、环孢霉素、头孢氨苄、多肽药物、顺铂、紫杉醇中的任一种或多种。
本发明的有益效果在于：
1.本专利公开的检测方法可用于菌蜕搭载任何自发荧光药物和/或间接发荧光的药物的载药情况和载药量的研究，此方法可用于配合筛选能与ECN菌蜕联用治疗IBD的新型抗炎荧光药物。
2.本专利利用SDS碱性裂解超声破碎法对菌蜕进行破壁，减少了硫酸等溶液的使用，更加环保安全，对治疗IBD的碱性药物无反应，同时超声波能通过调整功率产生不同的剪切力，对细菌膜碎片破坏达到可控，使得药物完全释放通过HPLC检测更准确。
3.本专利提供了一种四甲基七叶葶的HPLC检测方法，该方法操作简单，灵敏度高，检测结果精准度高。
附图说明
图1为实施例1的色谱图；
图2为实施例1的四甲基七叶葶标准曲线图；
图3为孵育初始四甲基七叶葶浓度与菌蜕载药量的关系图；
图4为荧光显微镜明场图；
图5为荧光显微镜UV照射和明场merge图；
图6为绿光、紫外波段光照射的菌蜕图，其中，图6-A为绿光激发DID标记的菌蜕图，图6-B为绿光和UV激发merge菌蜕图。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
实施例1.HPLC法测定四甲基七叶葶
1.色谱条件
色谱柱：La Chrom，C18-AQ(250mm×4.6mm I.D，5.0μm)；柱温：30℃；检测波长：254nm；流动相：A＝0.1％磷酸，B＝乙腈；流速：1mL/min；进样量：10μL，流动相A和B按表1程序进行梯度洗脱。
表1.梯度洗脱程序
时间(min) A(％) B(％)
0 80 20
7 20 80
10 20 80
15 80 20
20 80 20
2.制备标准曲线
精确称取四甲基七叶葶标准品100mg，用水溶解并于100ml容量瓶中定容，作为标准贮备溶液(1.0mg/ml)，并作为标准品A(1.0mg/ml)。量取标准品A(1.0mg/ml)40ml于50ml容量瓶中，再加水定容，制备标准品B(0.8mg/ml)。量取标准品B(0.8mg/ml)25ml于50ml容量瓶中，加水定容制备标准品C(0.4mg/ml)。同理制备标准品D(0.2mg/ml)、标准品E(0.1mg/ml)。HPLC色谱仪精密吸取10μl注入，记录色谱图，以四甲基七叶葶峰面积(Y，mV)对浓度(X，mg/ml)进行线性回归，得线性方程：Y＝1.025*107*X，R2＝0.9998。色谱图如图1所示，保留时间为6.600min；标准曲线图如图2所示，四甲基七叶葶在0.1-1mg/ml浓度范围内与峰面积有良好的线性关系。
实施例2.菌蜕搭载自发荧光药物和/或间接发荧光药物的载药情况和载药量研究
(1)制备菌蜕；
(2)菌蜕搭载药物；
(3)载药菌蜕破碎：采用SDS裂解超声破碎法对ECN菌蜕进行破碎；
(4)HPLC检测初始浓度与载药量的关系；
(5)显微镜观察载药情况，不发光药物则省去显微观察步骤。
此套流程可用于菌蜕搭载任何自发荧光药物和/或间接发荧光的药物的载药情况和载药量的研究，自发荧光药物例如香豆素衍生物亮菌甲素、蒽环类药物阿霉素等；间接发荧光的药物例如FITC、Cy3等标记的药物(环孢霉素等)，头孢氨苄、多肽药物等抗生素，以及顺铂、紫杉醇等抗癌药物。此方法可用于配合筛选能与ECN菌蜕联用治疗IBD的新型抗炎荧光药物。
实施例3.菌蜕搭载四甲基七叶葶的载药情况和载药量研究
1.ECN菌蜕搭载四甲基七叶葶干粉
制备浓度为1.25，2.5，5，10，15，20mg/ml的四甲基七叶葶DMSO溶液，浓度根据载药量而定，浓度与载药量曲线如图3所示。精密称取的1mg的ECN菌蜕悬浮于四甲基七叶葶DMSO溶液中，涡旋仪800rpm室温涡旋1h，12000rpm离心10min，弃上清后加水洗涤2次，置于-20℃保存10min后，冻干机过夜冻干12h，制得不同浓度的冻干粉。
2.搭载四甲基七叶葶的ECN菌蜕裂解
将步骤1.中制得的不同浓度的冻干粉分别加入200ul SDS裂解液(EDTA 1mM，SDS5％，50mM Tris-HCl(pH8.1))，并在涡旋仪上(800rpm)涡旋10min，金属浴70℃裂解10min后，加无菌水溶液至2ml，用超声破碎仪超声破碎(10min，5s/5s)，离心(13000rpm)10min，取上清液用于HPLC测定。
3.HPLC测定上清液中四甲基七叶葶含量
将步骤2.中每组实验做3个平行，将每组HPLC得到峰面积通过标准曲线计算得到浓度，再乘以体积得到1mg菌蜕的载药量。标准曲线计算得到孵育初始四甲基七叶葶浓度与菌蜕载药量的关系如图3所示。标准曲线为：y＝0.0044x-0.0062，R2＝0.9892，此曲线可用于不同初始四甲基七叶葶浓度制备得到1mg菌蜕的载药量。20mg/ml近乎是四甲基七叶葶在DMSO中的最大溶解度，因此载药量与初始浓度在此范围内是线性的，当四甲基七叶葶浓度为20mg/ml时，1mg菌蜕载药量为0.0818mg。
4.显微镜观察菌蜕载药情况
利用荧光和激光共聚焦显微镜对菌蜕搭载四甲基七叶葶进行观察，验证是否有游离的四甲基七叶葶在液体中，判断洗涤能否洗净游离药物，完全洗涤对于HPLC测定载药量精确度十分重要。
(1)荧光显微镜观察ECN菌蜕搭载四甲基七叶葶
将搭载四甲基七叶葶的ECN菌蜕干粉重悬在水溶液中，取10ul在载玻片上烘干，用荧光显微镜(物镜X100)油镜观察。由于四甲基七叶葶在紫外光照射下自发荧光，因此得到明场图和紫外波段光照射图，详见图4和图5。图4和图5中，箭头所指为载药菌蜕，通过图5可知，只有未搭载的菌蜕以及有浅蓝色的载药菌蜕，没有游离的浅蓝色四甲基七叶葶沉淀，洗涤完全。
(2)菌蜕搭载四甲基七叶葶激光共聚焦显微镜观察
DID是一种专门染色细胞膜的探针，将菌蜕用DID染色后，与四甲基七叶葶共孵育(步骤同1.)制备干粉。将搭载四甲基七叶葶的DID标记菌蜕干粉重悬在水溶液中，取10ul在载玻片上烘干，用激光共聚焦显微镜油镜观察。由于DID标记菌蜕用绿光激发，四甲基七叶葶在紫外光照射下自发荧光(浅蓝色)，因此用绿光以及紫外波段光照射可得2张菌蜕图，如图6所示。图6中，白色箭头所指为载药菌蜕，红色箭头所指为未载药菌蜕。由图6可知，无浅蓝色游离的四甲基七叶葶沉淀，洗涤完全。
菌蜕也可以不用DID标记，直接明场和UV波段进行观察，效果与荧光显微镜类似，流程更加简便。

Claims (7)

1.一种测定搭载四甲基七叶葶的ECN菌蜕的载药量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1：制备菌蜕；
S2：制备载药菌蜕；
S3：采用SDS裂解超声破碎法对S2所得载药菌蜕进行破碎；
S4：采用HPLC方法检测载药菌蜕的载药量；
S5：显微镜观察所述载药菌蜕的载药情况；
所述S3中，SDS裂解液由EDTA、SDS和Tris-HCl缓冲液组成，所述EDTA浓度为1mM，所述Tris-HCl缓冲液浓度为50mM，所述SDS质量分数为5％；
所述HPLC方法包括以下步骤：
(1)配制甲基七叶葶的标准品A-E，HPLC检测，绘制标准曲线；
(2)配制甲基七叶葶的待测样品，HPLC检测，得到待测样品的峰面积；
(3)根据步骤(2)所得峰面积，计算四甲基七叶葶的含量；
所述HPLC方法的色谱条件为：以C18-AQ色谱柱为固定相，以流动相A和流动相B为流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为磷酸溶液，所述流动相B为乙腈溶液；检测波长为254nm；所述梯度洗脱程序为：
在0分钟，设置流动相A体积分数为80％，流动相B体积分数为20％；
在7分钟，设置流动相A体积分数为20％，流动相B体积分数为80％；
在10分钟，设置流动相A体积分数为20％，流动相B体积分数为80％；
在15分钟，设置流动相A体积分数为80％，流动相B体积分数为20％；
在20分钟，设置流动相A体积分数为80％，流动相B体积分数为20％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准品A-E浓度依次为1.0mg/ml、0.8mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml和0.1mg/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相流速为1mL/min；所述色谱柱柱温为30℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述四甲基七叶葶出峰的保留时间为6.600min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，四甲基七叶葶的标准曲线为Y＝1.025*107*X，R2＝0.9998，Y表示峰面积，单位为mV；X表示浓度，单位为mg/ml。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中，菌蜕载药浓度分别为1.25mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml和20mg/ml。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，标准曲线y＝0.0044x-0.0062，R2＝0.9892，y表示载药量，单位为mg；X表示四甲基七叶葶的浓度，单位为mg/ml。
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