CN115261454A

CN115261454A - 一种新的let-7d-5p和miR-140-5p的生物标志物面板诊断方法

Info

Publication number: CN115261454A
Application number: CN202210416141.6A
Authority: CN
Inventors: 戚应杰; 刘佳星; 李烨; 吴静
Original assignee: Hefei Infectious Disease Hospital Hefei Sixth People's Hospital
Current assignee: Hefei Infectious Disease Hospital Hefei Sixth People's Hospital
Priority date: 2022-04-20
Filing date: 2022-04-20
Publication date: 2022-11-01

Abstract

本发明属于标志物评估分析技术领域，具体为一种新的let‑7d‑5p和miR‑140‑5p的生物标志物面板诊断方法，包括步骤1：数据和样本收集，以“结核病”作为关键字，搜索GEO数据库中的数据集，从GEO数据库中下载了三个数据集，包括两个miRNA数据集和一个mRNA数据集，两个miRNA靶向公共数据库，包括mirtarbase和mirDB也被下载以进行分析；步骤2：miRNA差异分析，使用Limma(3.46.0)对每个miRNA数据集进行差异分析，其结构合理，采用逻辑回归法评估不同的生物标志物组合，以获得在诊断LTBI方面表现良好的生物标志物面板，由let‑7d‑5p和miR‑140‑5p建立的logistic回归模型具有区分LTBI和活动性结核病患者的能力。

Description

一种新的let-7d-5p和miR-140-5p的生物标志物面板诊断方法

技术领域

本发明涉及标志物评估分析技术领域，具体为一种新的let-7d-5p和miR-140-5p的生物标志物面板诊断方法。

背景技术

结核病是全球主要的死亡原因。根据世界卫生组织(WHO)发布的数据，2020年，有580万人新感染结核分枝杆菌(Mtb)，结核分枝杆菌可以在宿主的结核肉芽肿巨噬细胞中存活长期。主要的宿主免疫反应可以阻止细菌的生长和消除结核分枝杆菌。相反，结核分枝杆菌可以在宿主体内长时间停留，成为潜伏性结核感染(LTBI)。只有5-15％的LTBI患者将发展为活动性结核。结核菌素皮试(TST)和干扰素-γ释放试验(IGRA)是筛查结核分枝杆菌感染的常用方法，但它们不能区分LTBI患者和结核患者。

MicroRNA是一种内源性单链非编码小RNA，长度为18-22个核苷酸。它通过触发其靶标mRNA的翻译抑制或降解，参与多种疾病的发病机制。MicroRNA在结核病(TB)的进展中起着关键作用。结核病感染后，大量miRNA表达上调或下调，以调节细胞凋亡、自噬、炎症和先天免疫应答。越来越多的证据表明，miRNA可能成为诊断结核的新工具。

为此，我们筛选地理数据集，进行联合差异分析和目标基因富集分析，过滤疾病相关数据库后，我们筛选结核病相关的差异miRNA，验证qPCR的表达，并验证生物标志物的性能区分人群LTBI活动性结核病患者。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是提供一种新的let-7d-5p和miR-140-5p的生物标志物面板诊断方法，采用逻辑回归法评估不同的生物标志物组合，以获得在诊断LTBI方面表现良好的生物标志物面板，由let-7d-5p和miR-140-5p建立的logistic回归模型具有区分LTBI和活动性结核病患者的能力。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：

一种新的let-7d-5p和miR-140-5p的生物标志物面板诊断方法，其包括。

作为本发明所述的一种新的let-7d-5p和miR-140-5p的生物标志物面板诊断方法的一种优选方案，其中：。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：在ATBvsLTBI和LTBIvsHC中，对生长因子的反应是最丰富的术语，这表明这一术语可能对结核病感染的整个进展有重要影响。在我们的研究中，我们创造了S_影响来估计特定功能项中的miRNA值。这可以帮助研究人员过滤掉重要的mirna。我们认为大于0.01的miRNAs的影响是重要的miRNAs。在本研究中，HMDD数据库也被认为可以去除与结核病感染无关的miRNAs。结果表明，由let-7d-5p和miR-140-5p建立的logistic回归模型具有区分LTBI和活动性结核病患者的能力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将结合附图和详细实施方式对本发明进行详细说明，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明研究设计和数据分析工作流程；

图2为本发明差异表达mirna的火山图；

图3为本发明ATB与LTBI差异表达miRNA靶基因富集项的前20个富集项(不同的颜色代表不同的富集术语(GO/KEGG术语、规范途径、霍尔标记基因集等))

图4为本发明LTBI与HC差异表达miRNA靶基因富集术语(GO/术语、KEGG术语、典型途径、霍尔标记基因集等)；

图5为本发明4个mirna的PCR结果(将验证后的mirna的表达水平归一化至CR100-01(Log2相对水平)。采用曼-惠特尼-威尔克森分析对组间差异进行统计学分析。*P<0.05,**P<0.01.)；

图6为本发明训练集数据集的生物标志物面板的受试者工作特征(ROC)曲线sROC曲线(a：显示AUC值为0.93，检验集；b：显示AUC值为0.923)。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施方式的限制。

其次，本发明结合示意图进行详细描述，在详述本发明实施方式时，为便于说明，表示器件结构的剖面图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是示例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间尺寸。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步地详细描述。

实施例1

方法和材料

数据和样本收集

以“结核病”作为关键字，搜索GEO数据库中的数据集。选择搜索到的数据集的标准较少：

1.物种应该是人类

2.样本类型应为PBMC或全血

3.每个数据集包含ATB、LTBI和HC三组。

4.数据集应该归一化

从GEO数据库中下载了三个数据集，包括两个miRNA数据集和一个mRNA数据集，每个数据集的详细信息见表1。两个miRNA靶向公共数据库，包括mirtarbase(https:// mirtarbase.cuhk.edu.cn/)和mirDB(http://mirdb.org/)也被下载以进行分析(图1).

该研究使用了存储在安徽省医院摘自之前的一项题为“X级片或内容，研究结果最近公布.活动性结核(ATB)的诊断是基于临床表现、胸片和细菌培养结果。此外，我们还采用干扰素-伽马释放试验(IGRA)结果来区分潜伏性结核感染(LTBI)组和健康对照(HC)组。表2总结了参与者的基本临床特征。共收集了29例活化结核病感染(ATB)患者、25例潜伏结核病感染(LTBI)患者和30例健康对照患者的84份血清样本。

表1。公共数据集

表2。患有肺结核(PTB)、潜伏性结核感染(LTBI)和健康对照组的研究参与者的特征。

注：NA，不适用；IGRA，干扰素-伽马释放试验；ATB，活动性肺结核；LTBI，潜伏性肺结核感染；HC，健康对照；扫描电镜，平均标准误差。

miRNA差异分析

使用Limma(3.46.0)对每个miRNA数据集进行差异分析。采用p值(p<0.01)和折叠变化(|log2折叠变化|≥1)测定三组间差异表达的miRNAs(DEMs)。将来自两个miRNA数据集的DEMs结果合并为每个对照组的总DEMs，包括ATBvsLTBI和LTBIvsHC。

差异miRNA靶基因预测

利用两个公共miRNA靶基因数据库，包括mirtarbase和mirDB，获得DEMs的靶基因。mirtarbase包含mirna-靶标相互作用(MTIs)信息。收集到的MTIs通过报告者的研究进行了实验验证，如过表达或敲除mirna的蛋白印迹或微阵列分析。mirDB是一个用于miRNA靶标预测和功能注释的在线数据库。为了获得更精确的靶基因结果，基于大多数miRNA可以下调靶基因的理论，利用另一个mRNA公共数据集对DEMs的靶基因进行过滤。本研究通过计算miRNA表达倍数变化值和mRNA表达倍数变化值的乘积来筛选靶基因。

靶基因富集

在本研究中，我们使用了元景观，一个web富集工具，通过默认数据库和默认参数进行富集分析。之后，我们将ATB与LTBI和LTBI与HC前20富集结果交叉，以发现结核病感染过程中重要的重要富集结果。

根据富集结果过滤MiRNA

为了研究miRNA在富集功能中的作用，我们定义了单个miRNA影响评分(Sistict)来评估miRNA在特定功能项中的重要性(见公式1.1)。筛选单次影响评分低于0.01的mirna。此外，使用HMDD(人类miRNA疾病数据库)去除与其他疾病相关的miRNA。

(1.1)

注意，nmt表示miRNA靶基因的数量，n表示特定富集项中miRNA的总数

血清样本PCR验证

提取

为了对靶mirna进行定量分析，最终浓度为10^-4在RNA提取前，将PM商业外部对照miRNAs(Cat：CR100-01，中国北京)平均添加到ATB、LTBI和健康对照的每个血浆样本中，这是后续试验中应用的内参基因。

使用RNAprep纯血液试剂盒(Cat：DP433，天宁，北京，中国)从血浆样本中提取总RNA。简单地说，将900μL裂解溶液加入200μL血浆中并充分均质，然后均质样品在室温下孵育5min，使核蛋白复合物完整。将含有匀浆和0.2mL氯仿的试管大力摇晃，以促进蛋白质的变性和沉淀。在4℃下以12000×g离心15min后，将原始RNA以水溶液转移到新鲜的试管中，并按照制造商的说明进行纯化。

通过实时qRT-PCR定量候选miRNA

使用miRNAqPCR试剂盒(Cat：FP411-01，田根，北京，中国)根据CFX连接Tm实时系统(Bio-Rad，CA，美国)中的说明测定miRNA的表达水平。

使用miRcutePlusmiRNA第一链cDNA试剂盒(Cat：KR211-02，田根，北京，中国)从总RNA中合成第一链cDNA。随后，采用基因特异性引物进行实时荧光定量PCR，检测mirna的表达水平。本实验中使用的基因特异性引物列于表3。在95℃初始变性30s后，在95℃5s和60℃30s下分别进行40次扩增40次。在放大反应结束时有解离曲线。

获得的qRT-PCR数据采用2种方法进行计算^-△△CT方法，而靶基因miRNA的相对数量根据商业外对照miRNA的CT值的差异进行归一化。

采用PraphPadPrism(7.0版)对qRT-PCR结果进行分析。采用曼-惠特尼-威尔克森分析方法对组间差异进行统计学分析。P值<为0.05被认为有统计学意义。

表3。qPCR检测中使用的引物

识别miRNA标记物的模型构建

我们通过逻辑回归评估了不同的生物标志物组合，以获得一个在诊断LTBI方面表现良好的生物标志物面板。三次比较分别将数据随机分为两组，一组作为训练集，另一组作为测试集。

逐步逻辑回归模型用于选择诊断microRNA标记基于训练数据集，然后检查留一交叉验证测试集的样本被用来验证第一组使用逐步逻辑回归和模型建立评估使用接收机操作特征(ROC)曲线。

结果

差异表达的miRNAs分析

为了鉴定ATBvsLTBI和LTBI与HC中差异表达的miRNAs(DEMs)，将P值<0.05和|log2FC|≥1设置为临界标准。在GSE25435数据集中，ATBvsLTBI和LTBIvsHC共鉴定出139个dem，包括ATB与LTBI中51个上调miRNAs和39个下调miRNAs。然而，在GSE29190数据集中，只鉴定出了24个dem(表4)。利用火山图验证了dems的结果(图2)。结合两个数据集结果后，101个dem，包括57个上调的miRNAs和44个下调的miRNAs。97个dem，包括43个上调miRNAs和54个下调miRNAs。

a.GSE25435miRNA数据集ATB与LTBI差异分析；b。GSE25435miRNA数据集LTBIvsHC差异分析；c。GSE29190miRNA数据集ATB与LTBI差异分析；d。GSE29190miRNA数据集LTBIvsHC差异分析。值得注意的是，图中只标记了前10个上下差异mirna。

表4.两个数据集的miRNA差异分析结果

差异表达mirna的靶基因预测

从mirbas基和mirDB共获得86781对mirna靶基因，包括2459个mirna和8849个靶基因。由于miRNAs与靶基因的3‘utr结合并干扰翻译的生物学过程，miRNAs可以下调靶基因。去除上调mrna的miRNAs后，保留了2156个由89个miRNAs调控的靶基因，以及LTBI和HC之间由81个miRNAs调控的2139个靶基因。

金属富集分析

在ATB和LTBI富集结果中发现了对生长因子(GO：0070848)、癌症通路(hsa05200)、血管发育(GO：0001568)和激酶活性调节(GO：0043549)富集项。在LTBI和HC富集结果中，发现了一些富集的术语，如对生长因子的反应、受体酪氨酸激酶信号传导(R-HSA-9006934)、生长因子受体和第二信使(R-HSA-5663202)的癌症途径。在以前的研究中也发现了一些丰富的术语。在ATB与LTBI和LTBI与HC中均发现了癌症富集期的通路。微生物引起的乙型肝炎病毒等疾病可能导致肝癌。先前的研究发现，慢性结核病感染可导致其附近的DNA损伤。

ATB与LTBI和LTBI与HC对生长因子的反应最为丰富。这一术语可能在结核病感染的发展中发挥重要作用。一些生长因子如血管内皮生长因子(VEGF)在活动性结核患者中增加。先前的研究也表明，从系统中删除TGF-β1可以改善细菌清除和病变灭菌。此外，在ATB和LTBI中，由57个miRNAs调控的181个基因因对生长因子的响应而富集。由60个mirna调控的170个基因也在同一时期富集。

通过影响评分过滤的重要mirna

为了找到可以在最丰富的术语中发挥重要作用的重要mirna。我们定义了miRNA的影响评分来估计miRNA在特定方面的影响值。两个比较(ATBvsLTBI和LTBIvsHC)最丰富的术语共享11个miRNAs，包括hsa-miR-7d-5p-140-5p、hsa-miR-miR-155-5p、hsa-194-5p、hsa-m9R-hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-92a-3p。此外，从HMDD数据库中移除与结核病感染无关的miRNAs后，只剩下4个miR-hsa-miR-140-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-32-5p的miRNAs。通过qPCR验证了三组中4个mirna的表达情况(图5)。

MiRNAs分类移动建筑

训练集的模型是使用逻辑回归模型建立的：logit(P＝LTBI)＝-1.065+0.138*(hsa-let-7d-5p)-0.131*(hsa-miR-140-5p)。通过检验ROC曲线，利用来自测试集的数据验证了来自训练集的数据模型的诊断价值。对训练集和测试集的生物标志物面板的ROC曲线的AUC值分别为0.930(灵敏度＝为100％，specificity＝88.5％)和0.923(灵敏度＝为100％，specificity＝92.3％)(图6，表5)。

.表5两个miRNA面板的AUC、特异性和敏感性

讨论

据世卫组织估计，全球结核病潜伏感染人口接近20亿。LTBI的鉴定对于全球的结核病预防和控制非常重要。科学家们投入更多的研究是值得的。

来自外周血的生物标记物由于其易于操作，是临床应用的最佳选择，这也是我们选择数据集的主要考虑因素。在这里，我们使用了一种新的过滤筛选方法来寻找血清学诊断标志物，可以很好地区分LTBI人群和肺结核患者。

由于LTBI缺乏有效的诊断，在很大程度上阻碍了结核病临床诊断和治疗的发展。基于T细胞的干扰素γ释放试验(IGRA)已经有助于结核病的诊断，但它仍然不能区分那些LTBI患者和结核病患者。Wang等人开发了一种诊断LTBI的方法，添加IL-2作为额外的生物标志物，并结合IFN-γ来区分LTBI患者和结核病患者，以提高诊断性能(ROC分析的AUC为0.7494(95％CI：0.6419-0.8569，P<0.0001))。基于血液样本、miRNA、细胞因子和外周血蛋白的诊断标志物的研究也有可能被用作诊断性生物标志物。

miRNA的稳定性使其成为一种很好的具有高潜力的生物标志物。越来越多的证据表明，miRNAs在调节结核病感染中发挥着重要作用。Zhu等人发现，miR-18b的下调导致其靶基因HIF-1α的表达增加，促进炎症反应，清除巨噬细胞内的Mtb。Zhu等人发现，在Mtb感染过程中，miR-378d表达下调，通过靶向Rab10降低了Mtb的细胞内存活率。Yuan等研究发现，过表达mir-18a下调了其靶基因ATM，然后通过ATM通路和自噬过程促进细胞内Mtb的存活。miRNA的稳定性也证明了其作为生物标志物的潜力。

MiR-140-5p和let-7d-5p是本研究中结核病的重要诊断标志物。它们在其他疾病中也被广泛研究。在本研究中，miR-140-5p水平降低，miR-140-5p调节TLR4的表达此外，杨等人通过miR4-MyD88(ALI)调节急性肺损伤的炎症信号通路卓等评估miR-140-5p抑制细胞增殖，诱导肺癌细胞凋亡，阻碍了肺癌细胞的迁移和侵袭。..此外，Dong等人报道了miR-140-5p通过阻断Wnt1/β-连环蛋白信号通路的活性来抑制肺纤维化。

如Li等人的研究表明，let-7d-5p在A549细胞外泌体中表达上调，并参与了体内中癌性骨痛的产生和维持。Let-7d-5p在孤立性肺表现(PSP-BHD)中也表达上调，并抑制肺病变的修复反应。有研究表明，let-7d-5p可能通过TLR4/NF-κB信号通路在新生坏死性小肠结肠炎大鼠肠上皮细胞的炎症反应和凋亡中发挥抑制作用。特发性肺纤维化(AE-IPF)急性加重患者血浆中let-7d-5p的表达降低，提示let-7d-5p具有作为诊断和预测疾病进展的标志物的潜力。

然而，miR-140-5p和let-7d-5p在结核病发病机制中的作用尚未阐明。在本研究中，表达式他们中的一个下降的控制与健康对照组的血清进行比较。其靶基因在生长因子反应、血管发育和激酶活性调控等方面均有富集作用。它们是否通过调节炎症、细胞凋亡等过程参与了结核病的发病机制，仍有待进一步探讨。

对于大多数标记鉴定方法，使用差异表达的miRNAs或基因来鉴定标记。在本研究中，我们通过结合miRNA的功能，选择了不同不同组的miRNA标记物。一种新的方法被用来估计mirna在特定途径或富集项中的重要性。该方法可应用于其他旨在识别特定功能项中最重要的mirna的研究。

我们的研究旨在探索外周血中的生物标志物，它们被认为是具有很高价值的生物标志物，有利于进一步的大规模应用。然而，在我们的研究中使用的样本量不够，更需要使用更多的样本来验证这些目标。

虽然在上文中已经参考实施方式对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施方式中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施方式，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。

Claims

1.一种新的let-7d-5p和miR-140-5p的生物标志物面板诊断方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：数据和样本收集，以“结核病”作为关键字，搜索GEO数据库中的数据集，从GEO数据库中下载了三个数据集，包括两个miRNA数据集和一个mRNA数据集，两个miRNA靶向公共数据库，包括mirtarbase和mirDB也被下载以进行分析；

步骤2：miRNA差异分析，使用Limma(3.46.0)对每个miRNA数据集进行差异分析；采用p值(p<0.01)和折叠变化(|log2折叠变化|≥1)测定三组间差异表达的miRNAs(DEMs)；将来自两个miRNA数据集的DEMs结果合并为每个对照组的总DEMs，包括ATBvsLTBI和LTBIvsHC；

步骤3：差异miRNA靶基因预测，利用两个公共miRNA靶基因数据库，包括mirtarbase和mirDB，获得DEMs的靶基因；

步骤4：靶基因富集，使用元景观web富集工具，通过默认数据库和默认参数进行富集分析，之后，将ATB与LTBI和LTBI与HC前20富集结果交叉，以发现结核病感染过程中重要的重要富集结果；

步骤5：根据富集结果过滤MiRNA，研究miRNA在富集功能中的作用，定义了单个miRNA影响评分(Sistict)来评估miRNA在特定功能项中的重要性；筛选单次影响评分低于0.01的mirna；

步骤6：血清样本PCR验证，将900μL裂解溶液加入200μL血浆中并充分均质，然后均质样品在室温下孵育5min，使核蛋白复合物完整，将含有匀浆和0.2mL氯仿的试管大力摇晃，以促进蛋白质的变性和沉淀，在4℃下以12000×g离心15min后，将原始RNA以水溶液转移到新鲜的试管中，并按照制造商的说明进行纯化；

步骤7：通过实时qRT-PCR定量候选miRNA，；

步骤8：识别miRNA标记物的模型构建，逐步逻辑回归模型用于选择诊断microRNA标记基于训练数据集，然后检查留一交叉验证测试集的样本被用来验证第一组使用逐步逻辑回归和模型建立评估使用接收机操作特征(ROC)曲线；

步骤9：差异表达的miRNAs分析，为了鉴定ATBvsLTBI和LTBI与HC中差异表达的miRNAs(DEMs)，将P值<0.05和|log2FC|≥1设置为临界标准；在GSE25435数据集中，ATBvsLTBI和LTBIvsHC共鉴定出139个dem，包括ATB与LTBI中51个上调miRNAs和39个下调miRNAs；

步骤10：差异表达mirna的靶基因预测，从mirbas基和mirDB共获得86781对mirna靶基因，包括2459个mirna和8849个靶基因，由于miRNAs与靶基因的3‘utr结合并干扰翻译的生物学过程，miRNAs可以下调靶基因；去除上调mrna的miRNAs后，保留了2156个由89个miRNAs调控的靶基因，以及LTBI和HC之间由81个miRNAs调控的2139个靶基因；

步骤11：金属富集分析，在ATB和LTBI富集结果中发现了对生长因子(GO：0070848)、癌症通路(hsa05200)、血管发育(GO：0001568)和激酶活性调节(GO：0043549)富集项；

步骤12：通过影响评分过滤的重要mirna，为了找到可以在最丰富的术语中发挥重要作用的重要mirna，定义了miRNA的影响评分来估计miRNA在特定方面的影响值，两个比较(ATBvsLTBI和LTBIvsHC)最丰富的术语共享11个miRNAs，包括hsa-miR-7d-5p-140-5p、hsa-miR-miR-155-5p、hsa-194-5p、hsa-m9R-hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-92a-3p；此外，从HMDD数据库中移除与结核病感染无关的miRNAs后，只剩下4个miR-hsa-miR-140-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-32-5p的miRNAs。通过qPCR验证了三组中4个mirna的表达情况；

步骤13：MiRNAs分类移动建筑，训练集的模型使用逻辑回归模型建立的：logit(P＝LTBI)＝-1.065+0.138*(hsa-let-7d-5p)-0.131*(hsa-miR-140-5p)。通过检验ROC曲线，利用来自测试集的数据验证了来自训练集的数据模型的诊断价值。

2.根据权利要求1所述的一种新的let-7d-5p和miR-140-5p的生物标志物面板诊断方法，其特征在于：所述步骤1中选择搜索到的数据集的标准为：物种为人类；样本类型应为PBMC或全血；每个数据集包含ATB、LTBI和HC三组；数据集应该归一化。

3.根据权利要求1所述的一种新的let-7d-5p和miR-140-5p的生物标志物面板诊断方法，其特征在于：所述步骤七中，使用miRNAqPCR试剂盒(Cat：FP411-01，田根，北京，中国)根据CFX连接Tm实时系统(Bio-Rad，CA，美国)中的说明测定miRNA的表达水平；使用miRcutePlusmiRNA第一链cDNA试剂盒(Cat：KR211-02，田根，北京，中国)从总RNA中合成第一链cDNA；随后，采用基因特异性引物进行实时荧光定量PCR，检测mirna的表达水平；获得的qRT-PCR数据采用2种方法进行计算^-△△CT方法，而靶基因miRNA的相对数量根据商业外对照miRNA的CT值的差异进行归一化；采用PraphPadPrism(7.0版)对qRT-PCR结果进行分析；采用曼-惠特尼-威尔克森分析方法对组间差异进行统计学分析。

4.根据权利要求1所述的一种新的let-7d-5p和miR-140-5p的生物标志物面板诊断方法，其特征在于：所述步骤13中对训练集和测试集的生物标志物面板的ROC曲线的AUC值分别为0.930(灵敏度＝为100％，specificity＝88.5％)和0.923(灵敏度＝为100％，specificity＝92.3％)。