CN115252897A - 一种顺序和持续释放多肽和因子的软骨组织修复支架及其制备方法 - Google Patents

一种顺序和持续释放多肽和因子的软骨组织修复支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种顺序和持续释放多肽和因子的软骨组织修复支架及其制备方法，属于软骨组织工程技术领域。本发明在蚕丝蛋白多孔支架孔壁物理吸附TGF‑β1，该生长因子可以促进BMSC软骨分化，随后在该支架孔壁涂一层含有谷氨酸‑脯氨酸‑亮氨酸‑谷氨酰胺‑亮氨酸‑赖氨酸‑甲硫氨酸多肽(E7)的甲基丙烯酰化丝蛋白(SFMA)和甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)涂层，其中E7多肽可以招募BMSC，制备的支架通过涂层中HAMA的快速降解和E7本身的自扩散可以实现E7的首先释放招募BMSC，再利用涂层中SFMA的缓慢降解实现TGF‑β1的持续释放促进BMSC软骨分化，达到理想的软骨修复效果。

Description

一种顺序和持续释放多肽和因子的软骨组织修复支架及其制 备方法
技术领域
本发明涉及软骨组织工程技术领域，尤其涉及一种顺序和持续释放多肽和因子的软骨组织修复支架及其制备方法。
背景技术
关节软骨(AC)组织的健康是保证人们正常生活的基础。同时，关节软骨组织无血管、淋巴、神经组织，其自我修复能力有限。因此，软骨一旦发生损伤通常需要借助外界治疗手段完成软骨组织的修复。通常修复方法包括关节镜清创、微骨折或骨髓刺激、自体软骨细胞移植、自体或者同种异体移植物等治疗手段。这些手段可以在短期内减轻软骨损伤者疼痛，但依然存在诸多问题，比如自体软骨来源不足，异体软骨免疫排斥，生成纤维软骨，长期修复效果不佳等问题，远远不能满足临床应用的需求。
近年来，随着组织工程学和生物材料研究的不断发展，组织工程技术作为组织修复的重要手段，已被广泛应用到软骨组织修复的研究中。软骨组织工程学技术将负载具有分化能力的干细胞或者软骨细胞的支架或者水凝胶，结合生物化学因素(活性因子)植入缺损部位最终达到修复的目的。尽管在植入前使用细胞接种的支架可以在一定程度上再生和修复软骨损伤，但是这些方法仍然受到有限的细胞来源、过高的成本、疾病传播的风险和复杂的生产实践的限制。
内源性细胞募集策略是一种前瞻性疗法，更方便且临床软骨组织工程的成本更低，并且该策略还可以避免种子细胞体外培养的需要和病原体传播的风险。该策略基于活性因子和无细胞支架的组合，可有效特异性地募集多个内源性干/祖细胞(ESPC)并改善局部微环境，利用人体自身的再生潜力。虽然，自体ESPC具有自发迁移到缺损部位参与软骨修复的能力，但是细胞总体数量不足，同时软骨分化能力也有限，导致不足以实现软骨缺损的完全修复。
发明内容
本发明的目的在于提供一种顺序和持续释放多肽和因子的软骨组织修复支架及其制备方法，本发明的修复支架能够促进内生骨髓间充质干细胞(BMSC)的招募和BMSC的软骨分化。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种顺序和持续释放多肽和因子的软骨组织修复支架的制备方法，包括以下步骤：
将蚕丝蛋白多孔支架浸泡到TGF-β1因子溶液中进行吸附，取出蚕丝蛋白多孔支架于-40℃放置12～24h，最后冷冻干燥，得到吸附TGF-β1因子的蚕丝蛋白多孔支架；
将甲基丙烯酰化丝蛋白溶液、甲基丙烯酰化透明质酸溶液、谷氨酸-脯氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸多肽和光引发剂混合，得到涂层混合溶液；
将所述吸附TGF-β1因子的蚕丝蛋白多孔支架浸泡到所述涂层混合溶液中，然后取出，进行紫外照射，固化成型后，得到软骨组织修复支架前驱体；
将所述软骨组织修复支架前驱体在-40℃放置12～24h，随后冻干，得到顺序和持续释放多肽和因子的软骨组织修复支架。
优选的，所述TGF-β1因子溶液中TGF-β1因子的浓度为300ng/mL。
优选的，所述TGF-β1因子溶液由TGF-β1因子溶于PBS缓冲液得到。
优选的，所述吸附的时间为0.5～1h。
优选的，所述甲基丙烯酰化丝蛋白溶液的浓度为20～50mg/mL；所述甲基丙烯酰化透明质酸溶液的浓度为10～20mg/mL；所述甲基丙烯酰化丝蛋白溶液和甲基丙烯酰化透明质酸溶液的体积比为2:1。
优选的，所述涂层混合溶液中谷氨酸-脯氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸多肽的浓度为0.1mg/mL。
优选的，所述光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐；所述光引发剂的质量为甲基丙烯酰化丝蛋白、甲基丙烯酰化透明质酸、谷氨酸-脯氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸多肽和光引发剂总质量的0.3％。
优选的，所述紫外照射的时间为30min。
优选的，所述吸附TGF-β1因子的蚕丝蛋白多孔支架在涂层混合溶液中的浸泡时间为0.5～1h。
本发明提供了上述方案所述制备方法制备得到的顺序和持续释放多肽和因子的软骨组织修复支架，包括蚕丝蛋白多孔支架，吸附于所述蚕丝蛋白多孔支架孔壁上的TGF-β1因子，以及附着于所述蚕丝蛋白多孔支架孔壁上的谷氨酸-脯氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸多肽的甲基丙烯酰化丝蛋白和甲基丙烯酰化透明质酸涂层；所述甲基丙烯酰化丝蛋白和甲基丙烯酰化透明质酸形成聚合物。
本发明提供了一种顺序和持续释放多肽和因子的软骨组织修复支架的制备方法，包括以下步骤：将蚕丝蛋白多孔支架浸泡到TGF-β1因子溶液中进行吸附，取出蚕丝蛋白多孔支架于-40℃放置12～24h，最后冷冻干燥，得到吸附TGF-β1因子的蚕丝蛋白多孔支架；将甲基丙烯酰化丝蛋白溶液、甲基丙烯酰化透明质酸溶液、谷氨酸-脯氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸多肽和光引发剂混合，得到涂层混合溶液；将所述吸附TGF-β1因子的蚕丝蛋白多孔支架浸泡到所述涂层混合溶液中，然后取出，进行紫外照射，固化成型后，得到软骨组织修复支架前驱体；将所述软骨组织修复支架前驱体在-40℃放置12～24h，随后冻干，得到顺序和持续释放多肽和因子的软骨组织修复支架。
本发明在蚕丝蛋白多孔支架孔壁物理吸附TGF-β1，该生长因子可以促进BMSC软骨分化，随后在该支架孔壁涂一层含有谷氨酸-脯氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸多肽(E7)的甲基丙烯酰化丝蛋白(SFMA)和甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)涂层，其中E7多肽可以招募BMSC，制备的支架通过涂层中HAMA的快速降解和E7本身的自扩散可以实现E7的首先释放招募BMSC，再利用涂层中SFMA的缓慢降解实现TGF-β1的持续释放促进BMSC软骨分化，达到理想的软骨修复效果。
此外，本发明还具有以下有益效果：
1)力学性能优异。由于蚕丝蛋白自身的分级结构，力学性能优越。
2)生物活性和生物相容性较好。蚕丝蛋白和透明质酸的成分都是由天然组分构成。蚕丝已在临床上被用作手术缝合线多年。透明质酸是关节软骨细胞外基质的天然组成部分。
3)涂层的分级可控降解。涂层的降解速度应该以多肽和活性因子释放顺序和持续时间为原则，且以可控的方式降解。涂层主要由SFMA和HAMA构成，利用HAMA快速降解的特点实现涂层前期快速降解释放招募干细胞多肽，并且可以通过HAMA的分子量和浓度控制其降解速(分子量和浓度越低，降解速度越快)度；而SFMA主要由不溶于水的silk II和溶于水的silk I构成，silk II里含有β-sheet结构，β-sheet结构的产生，会增加silk的降解时间，这种β-sheet结构，可通过加热、超声或者乙醇处理而增加，从而调控silk的降解时间，实现涂层持续可控降解，进而实现TGF-β1因子的缓释作用。
4)安全无毒。本发明制备软骨组织修复支架所使用的材料都是天然来源的材料，且降解产物安全无毒。
5)制作工艺简洁，成本低廉。本复合材料制作工艺简单，便于生产，且用于支架的蚕丝蛋白来源广泛，成本低。
附图说明
图1为本发明涂层的体外降解规律曲线；
图2为本发明软骨修复支架的兔子膝关节软骨缺损修复大体观图；
图3为本发明支架体内软骨修复后的组织学和免疫学评价图。
具体实施方式
本发明提供了一种顺序和持续释放多肽和因子的软骨组织修复支架的制备方法，包括以下步骤：
将蚕丝蛋白多孔支架浸泡到TGF-β1因子溶液中进行吸附，取出蚕丝蛋白多孔支架于-40℃放置12～24h，最后冷冻干燥，得到吸附TGF-β1因子的蚕丝蛋白多孔支架；
将甲基丙烯酰化丝蛋白溶液、甲基丙烯酰化透明质酸溶液、谷氨酸-脯氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸多肽和光引发剂混合，得到涂层混合溶液；
将所述吸附TGF-β1因子的蚕丝蛋白多孔支架浸泡到所述涂层混合溶液中，然后取出，进行紫外照射，固化成型后，得到软骨组织修复支架前驱体；
将所述软骨组织修复支架前驱体在-40℃放置12～24h，随后冻干，得到顺序和持续释放多肽和因子的软骨组织修复支架。
在本发明中，未经特殊说明，所用原料均为本领域熟知的市售商品。
本发明将蚕丝蛋白多孔支架浸泡到TGF-β1因子溶液中进行吸附，取出蚕丝蛋白多孔支架于-40℃放置12～24h，最后冷冻干燥，得到吸附TGF-β1因子的蚕丝蛋白多孔支架。
在本发明中，所述蚕丝蛋白多孔支架的制备方法优选参照申请号为201911257846.2的专利公开的“一种组织工程软骨支架的制备方法”制备，该专利最终制备得到的丝蛋白支架即为本申请的蚕丝蛋白多孔支架。
在本发明中，所述TGF-β1因子溶液中TGF-β1因子的浓度优选为300ng/mL，所述TGF-β1因子溶液优选由TGF-β1因子溶于PBS缓冲液得到。本发明对所述TGF-β1因子溶液的用量没有特殊要求，能够将蚕丝蛋白多孔支架完全浸没即可。在本发明中，所述吸附的时间优选为0.5～1h。完成吸附后，本发明取出蚕丝蛋白多孔支架于-40℃放置12h，最后冷冻干燥。本发明将蚕丝蛋白多孔支架于-40℃放置12h目的是为了使TGF-β1因子静电吸附到支架孔壁上。在本发明中，所述冷冻干燥优选在冷冻干燥机中进行，所述冷冻干燥的温度优选为-50℃，时间优选为24h。
本发明将SFMA溶液、HAMA溶液、E7多肽和光引发剂混合，得到涂层混合溶液。
在本发明中，所述FMA溶液优选由FMA溶于超纯水得到；所述HAMA溶液优选由HAMA溶于超纯水得到。在本发明中，所述SFMA溶液的浓度优选为20～50mg/mL，更优选为25～45mg/mL，进一步优选为30～40mg/mL；所述HAMA溶液的浓度优选为10～20mg/mL，更优选为12～18mg/mL，进一步优选为14～16mg/mL。在本发明中，所述SFMA溶液和HAMA溶液的体积比优选为2:1。
在本发明中，所述涂层混合溶液中E7多肽的浓度优选为0.1mg/mL。
在本发明中，所述光引发剂优选为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐；所述光引发剂的质量优选为SFMA、HAMA、E7多肽和光引发剂总质量的0.3％。在本发明中，所述混合优选包括：先将SFMA溶液和HAMA溶液混合，然后向所得混合溶液中加入E7多肽和光引发剂，得到涂层溶液。
得到涂层溶液后，本发明将所述吸附TGF-β1因子的蚕丝蛋白多孔支架浸泡到所述涂层混合溶液中，然后取出，进行紫外照射，固化成型后，得到软骨组织修复支架前驱体。
在本发明中，所述吸附TGF-β1因子的蚕丝蛋白多孔支架在涂层混合溶液中的浸泡时间优选为0.5～1h。在本发明中，所述紫外照射的时间优选为30min。本发明对所述紫外照射的波长没有特殊要求，采用本领域熟知的波长即可。本发明在所述紫外照射过程中，光引发剂促进SFMA和HAMA分子上的双键发生聚合反应。
得到软骨组织修复支架前驱体后，本发明将所述软骨组织修复支架前驱体在-40℃放置12～24h，随后冻干，得到顺序和持续释放多肽和因子的软骨组织修复支架。
由于前期涂层溶液将支架的孔填满，本发明在-40℃放置12h，目的是为了再造孔。在本发明中，所述冻干优选在冷冻干燥机中进行。在本发明中，所述冻干的温度优选为-50℃，时间优选为24h。
本发明提供了上述方案所述制备方法制备得到的顺序和持续释放多肽和因子的软骨组织修复支架，包括蚕丝蛋白多孔支架，吸附于所述蚕丝蛋白多孔支架孔壁上的TGF-β1因子，以及附着于所述蚕丝蛋白多孔支架孔壁上的谷氨酸-脯氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸多肽的甲基丙烯酰化丝蛋白和甲基丙烯酰化透明质酸涂层；所述甲基丙烯酰化丝蛋白和甲基丙烯酰化透明质酸形成聚合物。
本发明在蚕丝蛋白多孔支架孔壁物理吸附TGF-β1，该生长因子可以促进BMSC软骨分化，随后在该支架孔壁涂一层含有谷氨酸-脯氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸多肽(E7)的甲基丙烯酰化丝蛋白(SFMA)和甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)涂层，其中E7多肽可以招募BMSC，制备的支架通过涂层中HAMA的快速降解和E7本身的自扩散可以实现E7的首先释放招募BMSC，再利用涂层中SFMA的缓慢降解实现TGF-β1的持续释放促进BMSC软骨分化，达到理想的软骨修复效果。
下面结合实施例对本发明提供的顺序和持续释放多肽和因子的软骨组织修复支架及其制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
蚕丝蛋白支架的制备，所述的“蚕丝蛋白”是一种天然纤维蛋白，该蚕丝蛋白来源于蚕茧；蚕丝蛋白软骨组织工程支架通过以下步骤制备得到：
1)10gNaHCO3溶解在2L超纯水中配成0.5％的NaHCO3溶液，加热至沸腾；
2)10g剪碎的蚕茧投入NaHCO3溶液中(沸腾)，煮1h；
3)将已经煮了1h的蚕丝捞出，在超纯水中冲洗5次；
4)捞出蚕丝，展开放于干净的托盘上，放置在45℃烘箱中，烘干；
5)称8g干燥的蚕丝溶于100mLLiBr(9.3mol/L)，水浴锅40℃煮(3h)至溶解；
6)双层纱布过滤溶好的蚕丝蛋白溶液至锥形瓶中；
7)将过滤好的蚕丝蛋白溶液装入截留分子量为8000～14000的透析袋中，在超纯水中透析3天；
8)将透析好的蚕丝蛋白溶液装入离心管中同时放入离心机中，以12000r/min的转速转离心15分钟；
9)将离心好的蚕丝蛋白溶液装入截留分子量为4500的透析袋中，再将透析袋放入重量体积百分浓度为10％w/v的聚乙二醇(PEG)溶液中反透析，将蚕丝蛋白浓度浓缩至5～6％w/v，得到所需要的蚕丝蛋白溶液；
10)将重量体积百分浓度为5.5％w/v的SF溶液与1mmol/g乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)和0.25v/v％四甲基乙二胺(TEMED)搅拌，使其均匀混合30min；
11)将混合好的溶液装入2.5mL的针管内，将针管放置在4℃冰箱内预冷1h；
12)随后将针管放置在-10℃的恒温反应器中，放置24h；
13)随后将针管取出，放在室温水中解冻12h；
14)将针管内的含水支架取出，放置-40℃冰箱24h，随后在冷冻干燥机
中冻干24h，最终得到需要的蚕丝蛋白支架；
15)将蚕丝蛋白多孔支架侵泡在浓度为300ng/mL的TGF-β1因子中1h，随后取出支架，放置-40℃冰箱12h，随后在冷冻干燥机中冻干；
16)配制SFMA(30mg/mL)溶液和HAMA(10mg/mL)溶液，按体积比2:1混合，随后加入E7多肽(在涂层混合溶液中的浓度为0.1mg/mL)和苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP，占溶质总质量的0.3％)；得到涂层混合溶液；
17)将15)中的冻干支架浸泡在16)的涂层混合溶液中30分钟，取出支架在紫外灯下照射30分钟，使涂层溶液完全固化成型；
18)将涂层固化后的支架放置-40℃冰箱12h，随后在冷冻干燥机中冻干24h得到需要的多孔支架。
实施例2
1)～15)同实施例1；
16)配制SFMA(25mg/mL)溶液和HAMA(12mg/mL)溶液，按体积比2:1混合，随后加入E7多肽(在涂层混合溶液中的浓度为0.1mg/mL)和苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP，占溶质总质量的0.3％)；得到涂层混合溶液；
17)～18)同实施例1。
性能测试：
1、缓释性能测试：
配制1U/mL的蛋白酶(XIV型来自灰色链霉菌(3.5U/mg)，Sigma Aldrich，美国)。将实施例1中的涂层混合溶液冻干，冻干的涂层材料分别置于1mL酶溶液中，每3天更换一次酶溶液。在1、3、7和14天后取出降解样品并用去离子水洗涤，冻干并称重用于分析。使用以下公式计算重量损失：
降解率(％)＝(W0-Wf)/W0×100％
W0是支架的初始重量，Wf是不同时间点后支架剩余重量。
结果如图1所示。由图1可知，前期HAMA降解速度比较快，后期SFMA缓慢降解，表明该光固化涂层具有梯度降解的性能特点，该特点利于负载药物的前期缓释。
2、软骨缺损修复实验
实验过程如下：对于支架软骨缺损修复实验，兔子被随机分为三组(每只兔子的1个膝盖)：单独的微骨折(MF组)、纯蚕丝蛋白多孔支架组(SF)和丝蛋白负载双活性支架组(SF-TGF-β1-E7，实施例1制备得到)。麻醉、常规准备和造模与支架招募干细胞过程相似。制备标准微骨折，然后植入适合的支架与缺损相匹配。进行膝关节强制屈伸以确认支架在缺损处的定位。单独进行微骨折作为对照组。最后缝合关节，肌注青霉素预防感染。手术后，兔子可以在单独的笼子里自由活动，并喂食标准食物和水。6、12周后，处死兔子对各修复软骨进行大体观察(手机拍照)，结果如图2所示。图2中，a为兔子软骨缺损模型的总体实验设计图；b为兔膝关节软骨缺损的宏观评价图，圆圈表示原始缺陷边缘；c为ICRS宏观评估分数。
由图2可知：在植入后6周，MF组中软骨缺陷基本没有被填充，软骨缺陷与周围软骨没有再生软骨形成。与MF组相比，SF组和SF-TGF-β1-E7组表现更佳。在术后12周时，与6周相比三组的软骨缺损均有所改善。MF组软骨缺损被部分填充，而且新软骨组织与周围软骨整合较差。相反，SF组和SF-TGF-β1-E7组的软骨缺损被填充的更完整和均匀，修复组织表面也非常光滑并且与周围宿主软骨更好地结合在一起。因此，从大体观可以看出SF组和SF-TGF-β1-E7组软骨修复效果非常理想。
3、测试过程如下：6、12周后，处死兔子进行进一步组织学研究。组织学标本用PBS洗涤并在4℃下在4％多聚甲醛(pH 7.4)中固定48小时，然后在20％EDTA(pH 7.2)中脱钙两个月。脱钙标本在分级乙醇中脱水，并包埋在石蜡中。连续切片(6毫米厚)通过手术部位的中心向矢状切开，并根据标准方案用苏木精和伊红(H&E)、番红固绿(Safranin-O/FastGreen)组织学评价和二型胶原(Col II)进行免疫学评价。
结果如图3所示，表明丝蛋白支架负载双活性物质组(SF-TGF-β1-E7)相对于无材料组(MF)和纯丝蛋白支架组(MF)可以更好的原位再生天然软骨，并且原位沉积更多更均匀的软骨组织成分即二型胶原(Col II)和糖胺聚糖(GAGs)。SF-TGF-β1-E7组的软骨缺损修复效果最好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种顺序和持续释放多肽和因子的软骨组织修复支架的制备方法，包括以下步骤：
将蚕丝蛋白多孔支架浸泡到TGF-β1因子溶液中进行吸附，取出蚕丝蛋白多孔支架于-40℃放置12～24h，最后冷冻干燥，得到吸附TGF-β1因子的蚕丝蛋白多孔支架；
将甲基丙烯酰化丝蛋白溶液、甲基丙烯酰化透明质酸溶液、谷氨酸-脯氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸多肽和光引发剂混合，得到涂层混合溶液；
将所述吸附TGF-β1因子的蚕丝蛋白多孔支架浸泡到所述涂层混合溶液中，然后取出，进行紫外照射，固化成型后，得到软骨组织修复支架前驱体；
将所述软骨组织修复支架前驱体在-40℃放置12～24h，随后冻干，得到顺序和持续释放多肽和因子的软骨组织修复支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述TGF-β1因子溶液中TGF-β1因子的浓度为300ng/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述TGF-β1因子溶液由TGF-β1因子溶于PBS缓冲液得到。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述吸附的时间为0.5～1h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酰化丝蛋白溶液的浓度为20～50mg/mL；所述甲基丙烯酰化透明质酸溶液的浓度为10～20mg/mL；所述甲基丙烯酰化丝蛋白溶液和甲基丙烯酰化透明质酸溶液的体积比为2:1。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述涂层混合溶液中谷氨酸-脯氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸多肽的浓度为0.1mg/mL。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐；所述光引发剂的质量为甲基丙烯酰化丝蛋白、甲基丙烯酰化透明质酸、谷氨酸-脯氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸多肽和光引发剂总质量的0.3％。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述紫外照射的时间为30min。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述吸附TGF-β1因子的蚕丝蛋白多孔支架在涂层混合溶液中的浸泡时间为0.5～1h。
10.权利要求1～9任一项所述制备方法制备得到的顺序和持续释放多肽和因子的软骨组织修复支架，包括蚕丝蛋白多孔支架，吸附于所述蚕丝蛋白多孔支架孔壁上的TGF-β1因子，以及附着于所述蚕丝蛋白多孔支架孔壁上的谷氨酸-脯氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸多肽的甲基丙烯酰化丝蛋白和甲基丙烯酰化透明质酸涂层；所述甲基丙烯酰化丝蛋白和甲基丙烯酰化透明质酸形成聚合物。
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