CN115252783A - 一种具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于放疗增敏制剂的技术领域,公开了一种具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂及其制备与应用。所述抗肿瘤纳米制剂,包括钌铜纳米材料,特别是聚乙二醇修饰的钌铜纳米材料;钌铜纳米材料中钌元素与铜元素的质量比为(0.7~0.98):(0.02~0.3)。本发明还公开了抗肿瘤纳米制剂的制备方法。本发明的抗肿瘤纳米制剂具有纳米酶催化效应,具有良好的类过氧化氢酶和类过氧化物酶双重催化活性,增加肿瘤细胞中氧气和活性氧的含量。同时,本发明的制剂还具有放疗增敏的特性,能够在相同辐照剂量下吸收更多的X射线能量。本发明将制剂与X射线联用,具有较好的抗肿瘤效果。本发明的制剂用于制备基于放疗增敏效应杀伤肿瘤的产品。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物医学领域,具体涉及一种具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂及其制备与应用。
背景技术
癌症被普遍认为是人类健康的最大威胁。目前,化疗和手术治疗仍是临床上最主要的癌症治疗方法。然而,这些治疗方法往往副作用大、复发率高,且治疗效果不佳。放射治疗可以通过放射线(包括放射性同位素产生的α、β、γ射线以及各种加速器产生的电子线、质子束、X射线和其他粒子束等)产生大量能量,被肿瘤细胞吸收后会破坏其DNA,从而抑制肿瘤细胞的生长,达到对其产生杀伤作用的效果。
然而,由于高能射线的杀伤存在非特异性,放疗过程也会对肿瘤周围的正常细胞和组织造成不可避免的损伤。为了降低这种副作用,实际应用中放疗采用的照射剂量不能过高,这也会导致肿瘤杀伤不完全,治疗效果不佳等缺陷,限制着放射治疗的应用。因此,迫切需要开发出具有放疗增敏功能的试剂,相比于常规试剂,其能够在同等辐照剂量下吸收更多的射线能量,确保在较低的辐照剂量下仍能够对肿瘤细胞达到可观的治疗效果。
近年来,随着纳米科技在生物医学领域的深入发展,具有良好生物安全性的多功能纳米材料在放射治疗应用中表现出了良好的能力。因此开发多功能纳米制剂和采用协同治疗的方法成为了提高放疗疗效和安全性的策略。纳米酶作为一种纳米制剂,受到了广泛关注。纳米酶被定义为具有酶催化特性的纳米材料,是一类人工模拟酶。其酶促反应动力特征具有高活性与广谱性,并且保留了纳米材料自身高稳定性与低成本等特性。因而可以将纳米酶应用于肿瘤治疗领域,其在肿瘤微环境下仍然能够保持较高的催化能力。特别地,很多纳米酶的催化底物是谷胱甘肽和过氧化氢,而这两种物质在大多数肿瘤细胞中都是过表达的,而催化产物是活性氧和氧气,这无疑为纳米酶的肿瘤治疗应用提供了天然的便利,达到非侵入性治疗的目的。
而现有的纳米制剂在对肿瘤进行放射治疗的过程中存在明显的缺点,比如由于放疗增敏的能力有限,这些制剂在较低剂量的辐照下无法有效对肿瘤细胞造成杀伤需要在较高辐照剂量下才能发挥作用。然而高剂量的射线照射下会对正常细胞组织造成严重的副作用,限制了这些纳米制剂的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂及其制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂的应用。所述具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂用于制备基于放疗增敏效应杀伤肿瘤的产品(药物或试剂盒)或组合物。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂,包括钌铜纳米材料,特别是聚乙二醇修饰的钌铜纳米材料。
所述的钌铜纳米材料中钌元素与铜元素的质量比为(0.7~0.98):(0.02~0.3),优选为(0.8~0.9):(0.1~0.2),更优选为(0.83~0.87):(0.13~0.15)。
所述钌铜纳米材料的平均粒径为2~5nm,优选为2~3nm。
所述聚乙二醇修饰的钌铜纳米材料是由氨基聚乙二醇(PEG-NH2)与钌铜纳米材料反应得到。
氨基聚乙二醇的MW为4000~10000。
所述钌铜纳米材料通过如下方法制备得到:将水溶性钌盐、水溶性铜盐、还原剂以及聚乙烯吡咯烷酮在溶剂中进行加热反应,获得钌铜纳米材料。
所述水溶性钌盐为三水氯化钌或氯化钌中一种以上。
所述水溶性铜盐为二水氯化铜或氯化铜中一种以上。
所述还原剂为安息香。所述溶剂为乙二醇。
所述加热反应的条件为175~185℃。所述反应的时间为4~6h。
所述水溶性钌盐、水溶性铜盐、还原剂以及聚乙烯吡咯烷酮的质量比为265:(40~100):2120:(5000~11000),优选为265:50:2120:(9800~10100)。
所述聚乙烯吡咯烷酮的Mw为8000~11000。
所述反应在真空或保护性氛围下进行。所述的保护性气体为氮气或氩气。
反应完后进行后续处理。所述后续处理是指反应完后冷却,采用无水乙醇和丙酮的混合液进行离心,洗涤。
所述的无水乙醇和丙酮的体积比为1:(3~5)。所述的离心的条件为:14000~15000转/分钟离心30~50分钟。
所述洗涤为多次洗涤,洗涤次数为3次以上。
所述水溶性钌盐与溶剂的质量体积比为(4~6)mg:5mL。
所述的钌铜纳米材料为球型钌铜纳米颗粒。
所述的钌铜纳米材料的保存方式可以为:将得到的钌铜纳米材料超声分散在水中或者冻干,然后保存于4℃冰箱。
所述聚乙二醇修饰的钌铜纳米材料的制备方法,包括以下步骤:
在水中,钌铜纳米材料与氨基聚乙二醇(PEG-NH2)进行反应,获得聚乙二醇修饰的钌铜纳米材料。
钌铜纳米材料与氨基聚乙二醇(PEG-NH2)的质量比为1:(5~15)。
所述反应在搅拌的条件下进行;所述搅拌的转速为400~600转/分钟。
所述反应的条件为室温下反应8~15h。
反应完后进行离心,洗涤。离心的转速为12000~14000rpm。
洗涤完后,将聚乙二醇修饰的钌铜纳米材料分散于水中,保存。
所述聚乙二醇修饰的钌铜纳米材料的制备的具体步骤:将钌铜纳米材料分散于水中,然后加入氨基聚乙二醇于室温条件下进行反应,反应结束后,离心,洗涤。
所述具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂的制备方法,包括以下步骤:
1)将水溶性钌盐、水溶性铜盐、还原剂以及聚乙烯吡咯烷酮在溶剂中进行加热反应,获得钌铜纳米材料。
所述具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂的制备方法,还包括以下步骤:
在水中,钌铜纳米材料与氨基聚乙二醇(PEG-NH2)进行反应,获得聚乙二醇修饰的钌铜纳米材料。
一种基于放疗增敏效应的抗肿瘤组合物,包括上述具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂和X射线。
所述的肿瘤优选为乳腺癌。
所述具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂的有效浓度为1~15μg mL-1。
所述的射线优选为X射线(X-Ray)。
所述的X射线照射剂量优选为2~6Gy。
钌铜纳米材料在产生活性氧和氧气中的应用。
所述具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂能够抑制癌细胞的增殖生长以及迁移能力。
本发明的抗肿瘤纳米制剂中钌铜纳米材料具有类过氧化氢酶和类过氧化物酶双重纳米酶效应,能同时催化过氧化氢生成氧气和活性氧。本发明的制剂具有放疗增敏效应,能够有效提升放射敏感性,而纳米酶催化效应能够对肿瘤细胞起到协同治疗的作用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:本发明的纳米制剂的纳米酶催化能力,利用其自身拥有的放疗增敏效应联合X射线实现对耐药肿瘤的协同治疗。
附图说明
图1是实施例1中所得RuCu的透射电镜图;图中右上角为高分辨率透射电镜图;
图2是实施例1中所得RuCu的能量色散X射线光谱图,其中左上角第一幅图为高角环形暗场扫描透射电镜图像,另外三幅图为能量色散X射线光谱图,比例尺:20nm;
图3是实施例1中所得RuCu的水合粒径分布图;
图4是实施例1中所得RuCu的X射线衍射图谱;
图5是实施例1中所得RuCu的铜2p(a),钌3p(b)及全谱的X射线光电子能谱;
图6是实施例1和实施例2中所得产物的Zeta表面电位图;
图7是实施例1和实施例2中所得产物的傅里叶变换红外吸收图谱;
图8是实施例2中所得P-RuCu分别静置于PBS或DMEM培养基(含10%胎牛血清)中1周内的水合粒径变化图和照片图;
图9是实施例2中所得P-RuCu对小鼠血红细胞造成的溶血率和照片图;
图10是探究P-RuCu的类过氧化氢酶能力结果图;其中,图A为不同浓度的P-RuCu加入至1mM过氧化氢溶液中的结果图;图B为不同浓度的P-RuCu加入至100μM过氧化氢溶液中的结果图;图中“con”表示对照组;
图11是探究P-RuCu在不同pH条件下的类过氧化物酶相对催化活性结果图;
图12是探究P-RuCu的类过氧化物酶能力结果图;其中,图A为改变P-RuCu组成的结果图;图B为改变P-RuCu浓度的结果图;图C为改变过氧化氢溶液浓度的结果图;图D为改变TMB探针浓度的结果图;图中“con”表示对照组;
图13是P-RuCu类过氧化物酶活性的动力学测定结果图;其中,图A是以过氧化氢溶液为底物的结果图;图B是以TMB为底物的结果图;
图14是DMPO/·OH加合物在不同反应体系中的电子自旋共振谱图;
图15是P-RuCu在MDA-MB-231细胞中处理不同时长后的含量变化图;
图16是P-RuCu与不同种类的内吞抑制剂在MDA-MB-231细胞中共孵育12h后的含量变化图;
图17是P-RuCu与NAC同MDA-MB-231细胞共孵育细胞内的活性氧含量检测荧光图,比例尺:100μm;
图18是P-RuCu-Cy5.5在MDA-MB-231细胞孵育后的溶酶体共定位荧光图,比例尺:75μm;
图19是P-RuCu处理MDA-MB-231细胞后的氧气含量检测荧光图,比例尺:25μm;
图20是P-RuCu与MDA-MB-231细胞共孵育24h的HIF-1α蛋白水平变化的westernblot检测结果图;
图21是P-RuCu与X射线联合处理后MDA-MB-231细胞内的活性氧含量检测荧光图;
图22是P-RuCu与X射线联合处理后MDA-MB-231细胞内的活性氧含量检测流式统计图;A为曲线图,B为柱状图;
图23是P-RuCu与X射线联合处理后MDA-MB-231细胞活性变化结果图;
图24是P-RuCu处理后HUVEC细胞活性变化结果图;
图25是P-RuCu与X射线联合处理后MDA-MB-231细胞内的DNA损伤水平检测荧光图;
图26是P-RuCu与X射线联合处理后4T1细胞内的DNA损伤水平检测荧光图;
图27是P-RuCu与X射线联合处理后MDA-MB-231细胞克隆形成结果图;其中,图A是显微镜拍照图;图B是统计图;
图28是P-RuCu与X射线联合处理后MDA-MB-231细胞迁移结果图;其中,图A是显微镜拍照图;图B是统计图;
图29是P-RuCu与X射线联合治疗荷瘤鼠后的小鼠体重统计结果图;
图30是P-RuCu与X射线联合治疗荷瘤鼠后的相对肿瘤体积变化图;
图31是P-RuCu与X射线联合治疗荷瘤鼠后的肿瘤拍照图;
图32是P-RuCu与X射线联合治疗荷瘤鼠后的肿瘤重量图;
图33是P-RuCu与X射线联合治疗荷瘤鼠后肿瘤组织的TUNEL和H&E染色照片图,比例尺:200μm;
图34是P-RuCu与X射线联合治疗荷瘤鼠后小鼠的血液化学特征统计图;
图35是P-RuCu与X射线联合治疗荷瘤鼠后小鼠重要器官的H&E染色照片图,比例尺:200μm。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件。下述实施例中所使用的各原料以及试剂,除特别指出的以外,均可由市售获得。在钌铜纳米材料的制备过程中,将水溶性钌盐、水溶性铜盐混合于溶剂中,加入还原剂以及聚乙烯吡咯烷酮混匀,在搅拌的条件下进行加热反应,获得钌铜纳米材料。所述的混匀为采用超声的方式混合均匀。所述的超声的时间优选为60~110分钟。
实施例1、钌和铜质量比为0.85:0.15的钌铜纳米材料(RuCu)的制备与表征
首先,准确称取三水氯化钌265mg,二水氯化铜50mg于含有250mL乙二醇容器中,搅拌均匀;随后,加入安息香2.12g以及聚乙烯吡咯烷酮10g(聚乙烯吡咯烷酮K15,其Mw为10000),超声1h使原料充分溶解在乙二醇中,混合物形成黑色澄清溶液。将该混合物体系匀速(600rpm)搅拌并升温至180℃后,保持反应5h,在反应过程中混合物的颜色会逐渐加深。冷却至室温后,将反应液置于离心管中,再向管中加入至少三倍体积的无水乙醇/丙酮混合液(体积比1/4)作为洗脱液,混合均匀后,转速为14500rpm,离心40min。离心结束后,倒去上层液体,反复洗涤至少两次。最后,将所得到的产品(RuCu)冻干后保存4℃冰箱以方便后续使用。
本实施例所得产物的透射电子显微镜图和能量色散X射线光谱图如图1和图2所示,从图中可以看出所得产物尺寸均匀、分散性好,每个颗粒的平均粒径为2~3nm,表面有明显的晶格条纹。此外,图3是实施例1中所得RuCu的水合粒径分布图;图4是实施例1中所得RuCu的X射线衍射图谱。如图3所示,钌铜纳米材料的平均水合粒径约为12nm,且其结晶能力也可以通过X射线衍射图谱反映,如图4所示。钌铜纳米材料在X射线光电子能谱出现了钌元素和铜元素不同轨道电子的特征吸收峰,具体的图谱见图5。
实施例2、修饰有氨基聚乙二醇的钌铜纳米材料(P-RuCu)的制备与表征
在室温下准确称取实施例1制备的钌铜纳米材料10mg溶解于含5mL超纯水的容器中,随后加入100mg氨基聚乙二醇(MW为5000),超声15min以保证体系分散均匀。随后在室温下继续搅拌过夜以保证配体成功连接到了钌铜纳米材料表面上。为了洗去过量的氨基聚乙二醇,将此混合物转移至离心管中,设置条件为13000rpm,室温离心30min。离心结束后弃去上清,再加入10mL超纯水超声5min,随后反复清洗两次,最后得到接有氨基聚乙二醇作为配体的钌铜纳米材料,保存至水相中,放置于4℃冰箱。
本实施例所得产物(P-RuCu)的Zeta电位如图6所示,其傅里叶红外光谱的特征吸收峰出现了RuCu和氨基聚乙二醇的吸收峰,具体的图谱见图7。图8是实施例2中所得P-RuCu分别静置于PBS或DMEM培养基(含10%胎牛血清)中1周内的水合粒径变化图。P-RuCu具有良好的稳定性,如图8所示,其水合粒径在PBS和DMEM(含10%FBS)中静置7天内没有发现明显变化。同时,P-RuCu还具有良好的生物安全性,如图9所示,钌铜纳米材料不会对小鼠血红细胞造成明显的溶血现象。图9是实施例2中所得P-RuCu对小鼠血红细胞造成的溶血率图。
实施例3、检测P-RuCu的类过氧化氢酶催化能力
图10是探究P-RuCu的类过氧化氢酶能力结果图;其中,图A为不同浓度的P-RuCu加入至1mM过氧化氢溶液中的结果图;图B为不同浓度的P-RuCu加入至100μM过氧化氢溶液中的结果图。
如图10所示,在控制溶液pH为6.5的条件下,无论添加的过氧化氢溶液终浓度为1mM或者100μM,随着P-RuCu浓度的不断上升,溶液中氧气含量也随之有明显增加,显示出了P-RuCu具有优异的类过氧化氢酶能力。
实施例4、检测P-RuCu的类过氧化物酶的pH依赖性
向反应瓶中加入500μL不同pH的PBS缓冲液(pH控制在1.0~8.0),随后继续加入终浓度为1.5mM的TMB与4mM的过氧化氢。轻轻搅拌混合均匀后,加入10μg mL-1的P-RuCu至反应瓶中,随即通过紫外-可见光分光光度计进行观测。如图11所示,P-RuCu的最佳类过氧化物酶催化pH为4.0。图11是探究P-RuCu在不同pH条件下的类过氧化物酶相对催化活性结果图。
实施例5、检测P-RuCu的类过氧化物酶催化能力
图12是探究P-RuCu的类过氧化物酶能力结果图;其中,图A为改变P-RuCu组成的结果图(其他条件:pH:4.0;TMB终浓度:1mM;过氧化氢终浓度:1mM;反应时长:200s;各类材料终浓度:2μg mL-1);图B为改变P-RuCu浓度的结果图(其他条件:pH:4.0;TMB终浓度:1mM;过氧化氢终浓度:1mM;反应时长:200s);图C为改变过氧化氢溶液浓度的结果图(其他条件:pH:4.0;TMB终浓度:1mM;材料终浓度:1μg mL-1;反应时长:200s);图D为改变TMB探针浓度的结果图(其他条件:pH:4.0;过氧化氢终浓度:1mM;材料终浓度:2μg mL-1;反应时长:200s)。
如图12所示,通过控制变量的方法,分别改变了P-RuCu的组成、浓度、过氧化氢溶液浓度以及TMB的浓度,发现当把材料比例控制在Ru0.85Cu0.15时类过氧化物酶效应最强,且氧化态TMB在652nm处的吸光度值在200s内均随着这三种浓度的上升而不断增大,表明P-RuCu的类过氧化物酶效应具有浓度依赖特性。同时,我们发现通过控制反应条件,P-RuCu在极低的浓度下(2μg mL-1)即可具备十分明显的类过氧化物酶催化效应,证实了其极灵敏的催化能力。
实施例6、分析P-RuCu的酶促反应动力学
通过建立米氏方程(Michaelis-Menten Equation)推导得出P-RuCu催化的米氏方程常数(KM)和最大反应速度(Vmax)等重要的稳态催化动力学参数。KM和Vmax通过将初始反应速度(ν)和底物浓度数据拟合到米氏方程中,并按照下述公式进行推导:
ν=(Vmax)×[S])/(KM+[S]) (1–1)
公式(1–1)中,[S]为底物浓度,ν为初始反应速度,可按下式计算:
ν=ΔA/(Δt×ε×l) (1–2)
公式(1–2)中,ΔA表示652nm处的吸光度变化,Δt表示初始反应时间(s),ε为比色底物的摩尔吸光系数。对氧化态的TMB,在652nm处的ε为39000M-1cm-1。l表示光在比色皿中传播的路径长度(cm)。
因此,根据式(1–1)和式(1–2),如图13所示,得到P-RuCu表示类过氧化物酶活性的米氏方程常数(KM)和最大反应速度(Vmax),a、b图分别表示以过氧化氢或者TMB作为底物时得到的不同KM和Vmax。可以发现,当以过氧化氢作为底物时,钌铜纳米材料Vmax为81.7nM s-1,KM为0.25mM;当以TMB作为底物时,其Vmax和KM分别为99.08nM s-1和0.07mM,显示出其与催化底物出色的结合能力,以及优异反应催化速度。
图13是P-RuCu类过氧化物酶活性的动力学测定结果图。其中,图A是以过氧化氢溶液为底物的结果图(以过氧化氢作为底物时,通过建立米氏方程(Michaelis-MentenEquation)推导得到P-RuCu的催化反应曲线);图B是以TMB为底物的结果图(以TMB作为底物时,通过建立米氏方程(Michaelis-Menten Equation)推导得到P-RuCu的催化反应曲线)。
实施例7、检测P-RuCu催化产生羟自由基的能力
采用5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)作为捕捉剂,其能够通过电子自旋共振的方法检测羟自由基的生成。把电子自旋共振仪设置为以下参数:微波频率(9056.478MHz);调制频率(100kHz);调制振幅(2G);微波功率(1mW)。随后,向PBS缓冲液中依次加入终浓度为100mM的DMPO,20μg mL-1的P-RuCu,以及4mM的过氧化氢溶液。将上述体系至于电子自旋共振仪中,检测5分钟内吸收峰的变化情况。图14是DMPO/·OH加合物在不同反应体系中的电子自旋共振谱图。如图14所示,在同时加入过氧化氢和P-RuCu后出现了羟自由基的特征峰,证明羟自由基的产生。
实施例8、检测P-RuCu的细胞吸收能力
将人乳腺癌MDA-MB-231细胞(购自ATCC)接种在6孔细胞培养板中,密度约6×105细胞/孔,过夜培养。待细胞贴壁后,向培养板中加入浓度为5μg mL-1的P-RuCu,与细胞共孵育不同的时间(2,4,8,12,24h)。孵育完毕后,加入PBS,去除细胞表面残留的培养基,加入胰蛋白酶消化并收集细胞,随后用王水把细胞消解掉。具体操作如下:把细胞转移到西林瓶内并至于热台上,温度为220℃,加入1mL王水消解。当王水接近挥发完全时,再补充1mL王水至西林瓶中,反复补充直到所有细胞被消解,体系为无色或微黄色澄清溶液。此时关闭热台,冷却至室温后,向瓶中溶液添加适量超纯水后转移,并定容至2mL。随后利用ICP–MS方法检测溶液中钌和铜元素的含量。图15是P-RuCu在MDA-MB-231细胞中处理不同时长后的含量变化图。
如图15所示,在加入5μg mL-1的P-RuCu后,处理2h的时间细胞的含量内并无明显提升,而在处理4~24h后,其含量均维持在一个相对较高的水平,并且在处理12h后含量最高,这表明P-RuCu拥有良好的进入细胞的能力。
实施例9、探究P-RuCu进入细胞的渠道
加入不同种类的内吞抑制剂预处理后,再加入5μg mL-1的P-RuCu共孵育12h后利用ICP-MS方法检测MDA-MB-231细胞内的材料含量。图16是P-RuCu与不同种类的内吞抑制剂在MDA-MB-231细胞中共孵育12h后的含量变化图。如图16所示,加入三种不同终浓度的内吞抑制剂(genistein:50μM;cytochalasin D:10μM;chlorpromazine:20μM)后均能明显降低细胞内的钌铜纳米材料含量,尤其是chlorpromazine,其具有最佳的抑制作用。这表明钌铜纳米材料进入MDA-MB-231细胞的方式主要是通过内吞作用实现的。
实施例10、探究P-RuCu在细胞内的活性氧产生能力
将人乳腺癌细胞MDA-MB-231(购自ATCC)和小鼠乳腺癌细胞4T1(购自ATCC)于24孔细胞培养板中接种,过夜培养。次日向培养板内添加500μL含P-RuCu(终浓度为5μgmL-1)的培养液,继续在培养箱内孵育6h。随即加入Opti-MEM培养基(无双抗和血清)作为溶液制备DCFH-DA活性氧检测剂(终浓度为10μΜ)处理细胞。将孔板置于培养箱内避光孵育约25分钟后置于荧光显微镜下进行拍照,检测活性氧通道的荧光强度。
图17是P-RuCu与NAC同MDA-MB-231细胞共孵育细胞内的活性氧含量检测荧光图。如图17所示,在用5μg mL-1的P-RuCu处理后,绿色荧光极大增强,表明材料出色的产生活性氧的能力。N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为一种抗氧化剂,含有巯基结构,能够抑制细胞中总活性氧的含量。加入终浓度约5mM的NAC与5μg mL-1的P-RuCu共孵育后,细胞中活性氧的产生得到了极大的抑制,甚至比对照组的水平更低。这表明钌铜纳米材料能够在MDA-MB-231细胞中提升活性氧水平,具有灵敏的类过氧化物酶活性。
实施例11、探究P-RuCu与溶酶体的共定位检测
将MDA-MB-231细胞接种在共聚焦小皿中置于培养箱内过夜培养,密度约为1×105细胞/皿。次日添加2mL含修饰有Cy5.5的钌铜纳米材料(终浓度5μg mL-1)的培养液,继续避光孵育4h后加入PBS洗涤三遍。随后用Opti-MEM培养基配制终浓度为50nM的溶酶体绿色荧光探针(LysoTracker Green)检测剂和5μg mL-1的Hoechst检测剂分别对溶酶体和细胞核进行避光染色25分钟和10分钟,加入PBS洗涤后用共聚焦显微镜观察相应荧光信号的变化。图18是P-RuCu-Cy5.5在MDA-MB-231细胞孵育后的溶酶体共定位荧光图。
如图18所示,代表材料的红色荧光区域和代表溶酶体的绿色荧光区域能够良好地重合在一起,证明P-RuCu能够被溶酶体捕获。由于P-RuCu发挥类过氧化物酶的活性与pH环境息息相关,而溶酶体相比于肿瘤细胞质基质是更加酸性的环境,这有利于P-RuCu进一步发挥出更加类过氧化物酶催化的能力。
实施例12、探究P-RuCu在细胞内的氧气产生能力
1、利用荧光显微镜进行检测
把MDA-MB-231于24孔细胞培养板中接种,使细胞密度大约在3~5×104细胞/孔,过夜培养。次日添加500μL含P-RuCu(终浓度5μg mL-1)的培养液,继续孵育6h后去除培养基。随即用终浓度为30μM的[Ru(dpp)3]2+Cl2作为氧气探针处理细胞4h后,用Hoechst 33342染色10分钟,用PBS洗涤三遍,再在每孔中加入适量Opti-MEM培养基,放置于荧光显微镜下进行拍照,检测氧气通道的荧光强度。图19是P-RuCu处理MDA-MB-231细胞后的氧气含量检测荧光图。如图19所示,首先配制[Ru(dpp)3]2+Cl2探针,其具有红色荧光,并且与氧气结合后红色荧光会猝灭。加入5μg mL-1P-RuCu后,相比对照组,其红色荧光强度明显下降,这代表P-RuCu能够在MDA-MB-231细胞中产生氧气,具有优异的类过氧化氢酶能力。
2、利用免疫印迹实验进行检测
通过免疫印迹Western blotting实验检验了细胞内HIF-1α蛋白的表达含量。这是一种对氧气敏感的蛋白,氧气的产生对其表达有抑制作用,可以用于检测细胞内的氧气水平。图20是P-RuCu与MDA-MB-231细胞共孵育24h的HIF-1α蛋白水平变化的western blot检测结果图。如图20所示,在加入不同浓度的P-RuCu(0,1.25,2.5,5,10μg mL-1)与MDA-MB-231共孵育24h后,HIF-1α的表达含量逐渐降低,且呈浓度依赖性,β-actin蛋白作为内参蛋白。这表明细胞内的氧气含量随着P-RuCu的浓度增加而不断上升,说明其出色的产氧能力以及类过氧化氢酶。
实施例13、探究P-RuCu在X射线照射下增强活性氧产生的能力
把MDA-MB-231细胞于24孔细胞培养板中接种,使细胞密度大约在3~5×104细胞/孔,过夜培养。次日去除原培养基,并加入5μg mL–1的P-RuCu与细胞共孵育6h。处理完毕后,将孔板暴露于剂量为4Gy的X射线下进行辐照处理,随后置于荧光显微镜下观察活性氧通路。图21是P-RuCu与X射线联合处理后MDA-MB-231细胞内的活性氧含量检测荧光图。如图21所示,在4Gy剂量的X射线照射下,用活性氧检测剂DCFH-DA染色发现,细胞内有十分明显的绿色荧光,这说明了大量活性氧的产生。相比于单独加入钌铜纳米材料组(P-RuCu)以及单独用X射线辐照组(X-Ray),发现材料与辐照处理的联合治疗组(P-RuCu+X-Ray)的绿色荧光比前两组明显更强,这表明了P-RuCu在X射线联合作用下能产生更多的活性氧。
同时,细胞经相同处理后,可以利用流式手段进行检测细胞内活性氧的变换情况。图22是P-RuCu与X射线联合处理后MDA-MB-231细胞内的活性氧含量检测流式统计图。如图22所示,P-RuCu+X-Ray联合治疗组的荧光信号远高于P-RuCu组或者X-Ray组,这一结果也与荧光显微镜观测到的相符,表明了钌铜纳米材料在X射线照射下更出色的活性氧产生能力。
实施例14、探究P-RuCu的放疗增敏能力
把MDA-MB-231细胞和人脐静脉内皮细胞HUVEC分别接种在96孔细胞培养板中过夜培养,密度约为1×105细胞/孔。次日去除原培养基,并加入不同浓度的P-RuCu(0,0.625,1.25,2.5,5,10μg mL–1)与细胞共孵育24h,随后使用CCK-8试剂盒检测细胞活性,利用酶标仪检测每孔在450nm波长处的吸光度值,并分析计算细胞的相对活性。图23是P-RuCu与X射线联合处理后MDA-MB-231细胞活性变化结果图;图24是P-RuCu处理后HUVEC细胞活性变化结果图。
如图23所示,5μg mL–1的P-RuCu以及单独用4Gy的X射线辐照组(X-Ray)处理MDA-MB-231细胞后均能不同程度抑制细胞活性,而加入5μg mL–1的P-RuCu联合4Gy的X射线处理后,细胞活性的抑制程度明显上升,体现了P-RuCu良好的放疗增敏能力。同时,这种处理方案不会对正常细胞造成明显损伤,如图24所示,体现了P-RuCu的安全性。
实施例15、探究P-RuCu在X射线照射下的DNA损伤能力
把MDA-MB-231细胞和4T1细胞分别接种在共聚焦小皿中过夜培养,密度约为1×105细胞/皿。把细胞分为四组进行不同处理:对照组(Cont),X射线处理组(X-ray),钌铜纳米材料处理组(P-RuCu)以及X射线照射下的钌铜纳米材料处理组(P-RuCu+X-ray)。次日去除原培养基,并加入5μg mL–1的钌铜纳米材料与细胞共孵育24h,并对需要辐照的细胞施加4Gy的X射线。孵育完毕后,加入适量的4%多聚甲醛处理10分钟,然后用0.3%Triton X-100渗透20分钟。细胞在1%BSA封闭1h后,用γ-H2AX抗体按1:500的比例加入细胞中,在4摄氏度条件下孵育过夜。次日用DAPI试剂在室温避光环境下孵育5分钟,最后用共聚焦显微镜观察相关的免疫荧光信号。图25是P-RuCu与X射线联合处理后MDA-MB-231细胞内的DNA损伤水平检测荧光图;图26是P-RuCu与X射线联合处理后4T1细胞内的DNA损伤水平检测荧光图。
如图25和26所示,绿色荧光代表DNA的损伤水平,可见对照组(Cont)几乎没有DNA损伤,单独加入钌铜纳米材料的实验组(P-RuCu)和单独暴露在X射线下的实验组(X-Ray)有一定的DNA损伤能力,但不是特别显著;而联合治疗组中(P-RuCu+X-Ray)绿色荧光相比前两组实验组大幅上升,得到明显增强。用DAPI试剂进行细胞核染色后发现,代表细胞核的蓝色荧光和代表DNA双螺旋破坏的绿色荧光能够较好地重合在一起,这说明DNA损伤产生的位置位于细胞核中,表明P-RuCu具有一定的DNA损伤能力,并且暴露在X射线下后,这种损伤能力得到大幅度提升,体现出其优异的放疗增敏效应。
实施例16、探究P-RuCu在X射线照射下对细胞克隆的抑制能力
将MDA-MB-231细胞的单细胞悬液(500个细胞)于6孔板中铺板过夜。把细胞分为四组进行不同处理:对照组(Cont),X射线处理组(X-ray),钌铜纳米材料处理组(P-RuCu)以及X射线照射下的钌铜纳米材料处理组(P-RuCu+X-ray)。次日加入5μg mL–1的钌铜纳米材料与细胞共孵育24h,并对需要辐照的细胞施加4Gy的X射线。对照组除了常规换液外没有进行任何额外处理。处理结束后用PBS洗涤细胞表面以除去附在细胞表面的P-RuCu,最后用DMEM培养基(含10%FBS)培养10天,培养过程中注意保持培养基充足,并及时补充新鲜培养基。处理完毕后用4%多聚甲醛常温下固定细胞约25分钟,再用PBS洗涤两次。随即用0.1%的结晶紫染色液(1mL/孔)在室温下染色30分钟。处理完毕后加入PBS洗涤使背景干净,随即晾干,最后将孔板置于显微镜下拍照收集图片,并记录孔板中细胞克隆的数量。图27是P-RuCu与X射线联合处理后MDA-MB-231细胞克隆形成结果图;其中,图A是显微镜图;图B是统计图;
如图27所示,P-RuCu组和X-Ray组均能在一定程度上抑制细胞克隆形成,而P-RuCu联合X射线组中这种抑制能力得到极大提升。这与上述的DNA损伤结果以及细胞水平产生活性氧的结果相匹配,反应出P-RuCu作为放疗增敏剂出色的抑癌性质。
实施例17、探究P-RuCu在X射线照射下对细胞迁移的抑制能力
提前用笔在24孔细胞培养板背面标记参考线。把MDA-MB-231细胞接种在24孔板中培养过夜。次日,当只有单层细胞贴壁,且密度在90%以上时,使用200μL枪头按照参考线划过细胞,随后用PBS洗涤,以去除细胞残留。用显微镜观察细胞划痕的宽度,记为0h。此时加入P-RuCu(5μg mL–1)处理细胞24h。处理结束后用PBS清洗干净细胞表面后,加入DMEM培养基(含10%FBS)覆盖细胞,用显微镜比较用24h钌铜纳米处理后的细胞划痕宽度变化。计算分析两组内MDA-MB-231细胞迁移能力变化。图28是P-RuCu与X射线联合处理后MDA-MB-231细胞迁移结果图;其中,图A是显微镜图;图B是统计图。
如图28所示,P-RuCu组和X-Ray组均能在一定程度上抑制细胞迁移形成,而P-RuCu联合X射线组中这种抑制能力得到极大提升,反应出P-RuCu作为在X射线作用下具有更加出色的抑制细胞迁移的能力。
实施例18、检测P-RuCu在动物体内肿瘤水平上的杀伤
在雌性裸鼠(体重约22g,购自于北京维通利华)右翼皮下分别注射100μl(3×106个)MDA-MB-231细胞构建肿瘤模型。当肿瘤体积生长到70—100mm3时(记为第0天),把全部小鼠按照6只/组随机分为4组,不同组间的小鼠施加有区别的治疗方法。4组分别是对照组(注射生理盐水,每只小鼠100μL)、X射线组(3Gy,1.23Gy/min)、钌铜纳米材料组(3mg kg-1,每只小鼠100μL)和钌铜纳米材料联合X射线处理组。以上组别的每只小鼠每次皮下注射相应药物后根据实验需求进行辐照,在第1天和第3天进行皮下给药并照射X射线,进行为期12天的治疗,每两天记录小鼠体重(图29)以及肿瘤体积(图30)。治疗结束后,牺牲小鼠剥取肿瘤拍照(图31)并进行称重(图32)。
图29是P-RuCu与X射线联合治疗荷瘤鼠后的小鼠体重统计结果图;图30是P-RuCu与X射线联合治疗荷瘤鼠后的相对肿瘤体积变化图;图31是P-RuCu与X射线联合治疗荷瘤鼠后的肿瘤拍照图;图32是P-RuCu与X射线联合治疗荷瘤鼠后的肿瘤重量图。
可以看出,P-RuCu和X射线本身对MDA-MB-231肿瘤有较好的治疗效果,而将二者联合使用后,治疗效果极大提升,达到最佳,体现出明显的放疗增敏效应。
实施例19、检测P-RuCu动物水平治疗后肿瘤组织的凋亡水平
在实施例18中MDA-MB-231荷瘤鼠治疗结束后,取每组的部分肿瘤组织进行石蜡切片,利用凋亡试剂盒进行TUNEL染色(购于碧云天)。图33是P-RuCu与X射线联合治疗荷瘤鼠后肿瘤组织的TUNEL和H&E染色图。如图33所示,肿瘤模型中肿瘤细胞的凋亡结果与治疗后的肿瘤称重结果相符,P-RuCu联合X射线处理组有较高的细胞凋亡水平。
实施例20、检测P-RuCu对小鼠肝肾功能的影响
选用12只Balb\c磁性裸鼠,并按照3只/组随机分为四组,按照实验需求对小鼠进行钌铜纳米材料(3mg kg-1,每只小鼠100μL)的单次皮下注射,对照组注射相同体积的生理盐水,并根据实验需求相应进行3Gy的X射线辐照。24h后,进行眼球取血,取血完毕,用脱臼的手段来牺牲实验小鼠。随后分离血清,把装有血液样品的离心管在常温下静置1h,观察血液凝结成块以后,设置离心转速为3000转\分钟,在4℃离心10分钟,置于冰上保存。在当天利用自动生化分析仪检测每个血清样品中的丙氨酸转氨酶(ALT),白蛋白(ALB),天冬氨酸转氨酶(AST),肌酐(Crea),尿素(BUN)以及总胆红素(TBIL)含量。图34是P-RuCu与X射线联合治疗荷瘤鼠后小鼠的血液化学特征统计图。如图34所示,与对照组组比较,P-RuCu处理组,X射线处理组及P-RuCu联合X射线处理组的肝肾功能指标没有明显的差异,说明P-RuCu不会对小鼠体内脏器造成明显影响。
实施例21、检测P-RuCu对小鼠重要器官的影响
选用12只Balb\c磁性裸鼠,并按照3只/组随机分为四组,按照实验需求对小鼠进行钌铜纳米材料(3mg kg-1,每只小鼠100μL)的单次皮下注射,对照组注射相同体积的生理盐水,并根据实验需求相应进行3Gy的X射线辐照。24h后牺牲小鼠,取小鼠的心、肝、脾、肺、肾等重要器官,进行切片H&E染色观察。图35是P-RuCu与X射线联合治疗荷瘤鼠后小鼠重要器官的H&E染色图。如图35所示,P-RuCu处理组,X射线处理组及P-RuCu联合X射线处理组与对照组无明显差别,说明P-RuCu不会对小鼠体内脏器造成明显的损伤。
钌铜纳米材料在产生活性氧和氧气中的应用。
所述的活性氧检测试剂为TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)和DMPO(5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物)的至少一种。
内吞抑制剂、抗氧化剂中的至少一种在抑制钌铜纳米材料进行乳腺癌治疗中的应用。
所述的内吞抑制剂优选为内吞抑制剂Genistein(金雀异黄素)、Cytochalasin D(细胞松弛素D)、Chlorpromazine(盐酸氯丙嗪)。所述的抗氧化剂优选为抗氧化剂NAC(N-乙酰半胱氨酸)。
Claims (10)
1.一种具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂,其特征在于:包括钌铜纳米材料;
所述钌铜纳米材料中钌元素与铜元素的质量比为(0.7~0.98):(0.02~0.3)。
2.根据权利要求1所述具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂,其特征在于:
所述钌铜纳米材料中钌元素与铜元素的质量比为(0.8~0.9):(0.1~0.2);
所述钌铜纳米材料的平均粒径为2~5nm;
所述钌铜纳米材料通过如下方法制备得到:将水溶性钌盐、水溶性铜盐、还原剂以及聚乙烯吡咯烷酮在溶剂中进行加热反应,获得钌铜纳米材料。
3.根据权利要求2所述具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂,其特征在于:所述水溶性钌盐为三水氯化钌或氯化钌中一种以上;
所述水溶性铜盐为二水氯化铜或氯化铜中一种以上;
所述还原剂为安息香;所述溶剂为乙二醇;
所述加热反应的条件为175~185℃;所述反应的时间为4~6h;
所述水溶性钌盐、水溶性铜盐、还原剂以及聚乙烯吡咯烷酮的质量比为265:(40~100):2120:(5000~11000);
所述聚乙烯吡咯烷酮的Mw为8000~11000;
所述反应在真空或保护性氛围下进行;
反应完后进行后续处理;所述后续处理是指反应完后冷却,采用无水乙醇和丙酮的混合液进行离心,洗涤;所述的无水乙醇和丙酮的体积比为1:(3~5)。
4.根据权利要求1所述具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂,其特征在于:包括聚乙二醇修饰的钌铜纳米材料。
5.根据权利要求4所述具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂,其特征在于:所述聚乙二醇修饰的钌铜纳米材料是由氨基聚乙二醇PEG-NH2与钌铜纳米材料反应得到;所述钌铜纳米材料如权利要求1或2所定义。
6.根据权利要求5所述具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂,其特征在于:所述聚乙二醇修饰的钌铜纳米材料具体通过以下方法制备:
在水中,钌铜纳米材料与氨基聚乙二醇PEG-NH2进行反应,获得聚乙二醇修饰的钌铜纳米材料;
钌铜纳米材料与氨基聚乙二醇PEG-NH2的质量比为1:(5~15);
所述反应的条件为室温下反应8~15h;氨基聚乙二醇的MW为4000~10000。
7.根据权利要求1~6任一项所述具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)将水溶性钌盐、水溶性铜盐、还原剂以及聚乙烯吡咯烷酮在溶剂中进行加热反应,获得钌铜纳米材料;
或者所述具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂的制备方法,包括以下步骤:
1)将水溶性钌盐、水溶性铜盐、还原剂以及聚乙烯吡咯烷酮在溶剂中进行加热反应,获得钌铜纳米材料;
2)在水中,钌铜纳米材料与氨基聚乙二醇PEG-NH2进行反应,获得聚乙二醇修饰的钌铜纳米材料。
8.根据权利要求7所述具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂的制备方法,其特征在于:
步骤2)中所述反应在搅拌的条件下进行;所述搅拌的转速为400~600转/分钟;
步骤2)中反应完后进行离心,洗涤;离心的转速为12000~14000rpm。
9.根据权利要求1~6任一项所述具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂的应用,其特征在于:所述具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂用于制备基于放疗增敏效应杀伤肿瘤的产品。
10.一种基于放疗增敏效应的抗肿瘤组合物,其特征在于:包括具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂和X射线;
所述具有放疗增敏效应的抗肿瘤纳米制剂如权利要求1~6任一项所定义。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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