CN115250971A - 一种斑马鱼心肌缺氧模型的建立方法及应用 - Google Patents

一种斑马鱼心肌缺氧模型的建立方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种斑马鱼心肌缺氧模型的建立方法及应用，属于动物模型制备技术领域，主要为挑选发育正常的3dpf斑马鱼，分为空白对照组和模型组，模型组置于空气氧含量按体积分数计为0.1％以下的条件下培养，空白对照组在空气正常含氧条件下培养，培养时间为1.5‑4.5h，培养温度为26‑30℃；与空白对照组相比，若模型组斑马鱼心率、心室短轴缩短率、射血分数和心搏量都降低，并有显著差异，得到斑马鱼心肌缺氧模型；本发明提供的构建方法，易于操作，节省时间；该模型可用于抗心肌缺氧活性药物的筛选及其作用机制研究。

Description

一种斑马鱼心肌缺氧模型的建立方法及应用
技术领域
本发明具体涉及一种斑马鱼心肌缺氧模型的建立方法及应用，属于动物模型制备技术领域。
背景技术
心肌缺氧是指各种原因引起冠状动脉供血供氧不能满足心肌所需导致心肌的供需失衡而出现心肌缺血缺氧等一系列临床表现。氧是心肌细胞活动必不可少的物质，缺氧的直接后果是心肌细胞有氧代谢减弱，产能减小，使心脏活动时必需的能量供应不足，引起心绞痛、心功能下降等，同时代谢的废物也不能被有效及时地清除，易产生不利影响。随着人们生活方式的变化，我国心肌缺血患病率逐渐升高，已成为中老年人的常见病和多发病，且呈现出年轻化趋势，严重威胁患者的生命健康。轻者出现心绞痛、心律失常等现象，严重者导致心肌梗死甚至死亡。抗心肌缺氧药物筛选仍是目前药物研发领域的重要内容。
目前文献已经报道了许多哺乳动物模型用于抗心肌缺氧的药物发现和机制研究。中国专利文献CN109700557A(申请号CN201910200489.X)公开了一种大鼠急性心肌缺血动物模型的建立方法，采用改良结扎前降支的方法成功复制出大鼠急性心肌缺血模型。中国专利文献 CN212575011U(申请号CN202020426921.5)公开了一种大鼠急性心肌缺血实验模型，该模型能够固定不同体型的大鼠，方便对大鼠进行操作，从而提高实验效率。另一中国专利文献 CN113425443A(申请号CN202110671941.8)公开了一种SD大鼠心肌缺血模型的构建方法，该模型提高了大鼠心肌缺血模型构建的成功率，降低了模型构建的操作难度，缩短了模型构建的操作时间。以上专利文献都是利用大鼠建立的心肌缺血模型，其本质为心肌缺氧，这些方法培养成本高、繁殖周期长，很难实现化合物活性的快速、高通量筛选。
斑马鱼作为一种理想的脊椎模式生物，与其他哺乳动物模型比，斑马鱼具有体积小，易观察，产卵量高，繁殖周期短，药物用量少，以及与人类高度遗传保守(包括与人类87％的基因同源)等优势。斑马鱼和人类心脏在形态学、心率和心脏动作电位持续时间上也有相似之处。因此，利用斑马鱼研究人类心血管疾病具有较好的适用性及良好的发展前景。
外文文献《A Novel Zebrafish Larvae Hypoxia/Reoxygenation Model forAssessing Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury》Xiaoyan Zou等人建立了一种斑马鱼缺氧/复氧模型来模拟心肌缺血/再灌注损伤，该方法设计了一个缺氧室，通过向水中泵入氮气去除溶解氧来制备低氧水，斑马鱼胚胎被转移到一个装有低氧水的烧杯中，将此烧杯放入装满水的水箱中，并用一个更大的倒置的烧杯盖住，以防止空气交换，为了维持低氧应激，每隔3h将胚胎转移到一个装有用同样方法制备的低氧水的新烧杯中。该方法存在以下几个缺陷：(1)对2dpf 斑马鱼进行24～72h不同时间的缺氧处理，优选出缺氧处理时间为48h，操作过程复杂导致建模时间长，难以实现高通量筛选；(2)低氧水的DO为0～1.2mg/L，向水中泵入氮气时，充气口附近与远处水域中溶氧量差异大，难以保证水中溶氧量均一；(3)每隔3h将斑马鱼胚胎转移一次，转移过程中低氧水与空气接触时会快速复氧，从而导致水中溶氧量有不同程度的升高；(4)所用评价指标为心率、舒张期面积、收缩期面积和面积变化分数，只能反映出心室横截面积变化，无法直接反映出心脏泵血功能。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提出了一种斑马鱼心肌缺氧模型的建立方法及应用。
术语说明：
dpf(days post fertilization)：生物学专用术语，指受精后的天数。如1dpf指受精后1天的胚胎。
本发明的技术方案如下：
一种斑马鱼心肌缺氧模型的建立方法，包括以下步骤：
(1)挑选发育正常的3dpf斑马鱼Tg(cmlc:EGFP)，随机分为空白对照组和模型组，斑马鱼培养密度为4-6条/mL斑马鱼培养用水，模型组置于空气氧含量按体积分数计为0.1％以下的条件下培养，培养时间为1.5-4.5h，培养温度为26-30℃；空白对照组在空气正常含氧条件下培养，其余实验条件均与模型组保持一致；
(2)麻醉步骤(1)中培养结束的斑马鱼，记录斑马鱼15-60s心跳次数，计算心率，并对斑马鱼进行录像保存；
(3)利用图像处理软件分别统计步骤(2)中，斑马鱼收缩末期与舒张末期的心室短轴长度和心室长轴长度，计算心室短轴缩短率、射血分数、心搏量；
(4)利用数据处理软件分析数据，分析比较空白对照组与模型组差异的显著性，与空白对照组相比，若模型组斑马鱼心率、心室短轴缩短率、射血分数和心搏量都降低，并有显著差异，则模型组构建成功，得到斑马鱼心肌缺氧模型。
根据本发明优选的，步骤(1)中，斑马鱼培养密度为4条/mL斑马鱼培养用水。
根据本发明优选的，挑选发育正常的3dpf的Tg(cmlc:EGFP)斑马鱼，移入6孔培养板中，随机分为空白对照组和模型组，空白组与模型组都是每孔20条，每孔移入5mL斑马鱼培养用水。
根据本发明优选的，步骤(1)中模型组置于厌氧培养盒中培养，盒内空气中的氧含量按体积分数计＜0.1％。
所述厌氧培养盒为常规市售产品，盒内含有氧气吸收剂，可以吸收厌氧培养盒中的O2，同时产生CO2保持厌氧培养盒内部与外部压力相等，且不会产生高温，氧气指示剂为粉红色指示氧气含量按体积分数计＜0.1％。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述斑马鱼培养用水配方为：5mM NaCl，0.17mMKCl， 0.33mM CaCl2，0.33mM MgSO4·7H2O，按体积分数计3％苯硫脲溶液，所述苯硫脲溶液的摩尔浓度为6.57mM。
根据本发明优选的，步骤(1)中培养时间为2.5h。
根据本发明优选的，步骤(1)中培养温度为28℃。
根据本发明优选的，步骤(2)中，麻醉剂采用质量浓度为0.3‰的三卡因，浸泡30s进行麻醉。
根据本发明优选的，步骤(2)中，记录斑马鱼20s心跳次数。
根据本发明优选的，步骤(3)中，利用图像处理软件Image-Pro Plus 5.1对采集图像进行统计。
根据本发明优选的，步骤(4)中，利用数据处理软件GraphPad Prism 8分析数据。
根据本发明优选的，步骤(4)中，利用数据处理软件分析数据，分析比较空白对照组与模型组差异的显著性，与空白对照组相比，模型组斑马鱼同时达到心率降低4.5％以上，心室短轴缩短率降低35％以上、射血分数降低25％以上、心博量降低35％以上，则模型组构建成功，得到斑马鱼心肌缺氧模型。
进一步优选的，步骤(4)中，与空白对照组相比，模型组斑马鱼同时达到心率降低5-27％，心室短轴缩短率降低36-69％、射血分数降低30-52％、心博量降低41-72％，则模型组构建成功，得到斑马鱼心肌缺氧模型。
上述方法制备的斑马鱼心肌缺氧模型在评价治疗心肌缺氧药物质量中的应用。
根据本发明优选的，所述斑马鱼心肌缺氧模型在评价化学药物、中药单体化合物、中药提取物质量中的应用。
进一步优选的，所述斑马鱼心肌缺氧模型在评价依达拉奉、丹酚酸B、心可舒片质量中的应用。
有益效果
1.本发明首次提供了一种快速制备构建斑马鱼心肌缺氧模型的方法，本发明提供的斑马鱼心肌缺氧模型构建方法，易于操作，节省时间。
2.本发明提供的斑马鱼心肌缺氧模型可以用于抗心肌缺氧活性药物的筛选及其作用机制研究，可有效地提高动物模型实验效率、降低实验成本。
附图说明
图1为不同鱼龄的斑马鱼缺氧致死所需时间统计图。
图2为不同缺氧时间处理后的斑马鱼的心率、心室短轴缩短率、射血分数及心搏量的柱状图；
图中：Ctrl为空白对照组；
与空白对照组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。
图3为缺氧1h处理后的斑马鱼的心率、心室短轴缩短率、射血分数及心搏量的柱状图；
图中：Ctrl为空白对照组，Model为模型组；
与空白对照组相比，###表示P<0.001。
图4为缺氧1h处理后的斑马鱼心室收缩期面积、舒张期面积及面积变化分数的柱状图；
图中：Ctrl为空白对照组，Model为模型组；
与空白对照组相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案做进一步的解释说明，但本发明的保护范围不限于此。
材料来源
本发明所用斑马鱼为山东省科学院生物研究所斑马鱼药物筛选平台提供，也可由国家斑马鱼资源中心购买；厌氧培养盒(AnaeroPack Rectangular Jar 2.5L)、氧气吸收剂(AnaeroPack- Anaero)、氧气指示剂(Anaero-indicator)购自日本MITSUBISHI GASCHEMICAL COMPANY, INC；实施例中涉及的其他药品及材料，若无特殊说明，均为普通市售产品。
斑马鱼培养用水(即养鱼水)的配方为：5mM NaCl，0.17mM KCl，0.33mM CaCl2，0.33mM七水硫酸镁，按体积分数计3％苯硫脲溶液，所述苯硫脲溶液的摩尔浓度为6.57mM。
本发明涉及的计算公式如下：
心室体积＝0.523×(短轴长度)^2×长轴长度；
心室短轴缩短率(％)＝(舒张末期宽度-收缩末期宽度)/舒张末期宽度×100％；
每搏输出量＝舒张末期体积-收缩末期体积；
射血分数(％)＝每搏输出量/心室舒张末期体积×100％；
心搏量＝每搏输出量×心率；
面积＝3.14×长轴长度×短轴长度/4；
面积变化分数＝(舒张期面积-收缩期面积)/舒张期面积×100％。
实验例1
斑马鱼缺氧致死所需时间的统计方法，包括如下步骤：
在体式显微镜下挑选发育正常的2、3、4dpf的Tg(cmlc:EGFP)斑马鱼，移入6孔培养板中，每孔20条，每孔移入5mL斑马鱼培养用水，置于厌氧培养盒内，进行缺氧培养，培养温度为28℃，直至斑马鱼身体发白、心跳缺失，记录缺氧致死所需时间，见图1。
由图1可以看出随着鱼龄增大，缺氧致死所需时间减少，斑马鱼心脏缺氧耐受性越来越差，4dpf的斑马鱼鱼龄过大，缺氧致死所需时间过短，不适用于制备斑马鱼心肌缺氧模型。而2dpf的斑马鱼需脱膜后才可以进行实验，并且2dpf的斑马鱼缺氧致死所需时间过长，造成斑马鱼心肌缺氧模型的制备过程过长，因此也不适用于制备斑马鱼心肌缺氧模型；而3dpf 的斑马鱼不需要进行脱膜，并且缺氧致死所需时间适中，适用于制备斑马鱼心肌缺氧模型。
实施例1
一种斑马鱼心肌缺氧模型的建立方法，包括以下步骤：
(1)挑选发育正常的3dpf的Tg(cmlc:EGFP)斑马鱼，移入6孔培养板中，随机分为空白对照组和模型组，空白组1个孔，模型组3个孔，每孔20条，每孔移入5mL斑马鱼培养用水。模型组记为Model组，模型组置于厌氧培养盒内，在缺氧条件下培养，培养温度为28℃，培养时间分别为1.5、2.5、3.5h；空白对照组记为Ctrl组，空白对照组在空气正常含氧状态下培养，培养温度为28℃。
(2)步骤(1)中斑马鱼培养结束后，将各组斑马鱼用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉 30s，置于涂有4％甲基纤维素的载玻片上，固定斑马鱼于俯卧体位，于倒置荧光显微镜下记录各组斑马鱼20s心跳次数，并对斑马鱼进行录像保存；
(3)利用图像处理软件Image-Pro Plus 5.1分别统计各组斑马鱼收缩末期与舒张末期的心室短轴长度和心室长轴长度，计算心室短轴缩短率、射血分数、心搏量；
(4)利用数据处理软件GraphPad Prism 8分析数据，以Mean±SEM表示，分析比较各组差异的显著性。
结果显示，与空白对照组相比，模型组缺氧1.5、2.5、3.5h时斑马鱼心率分别显著降低了5％、12％、25％，心室短轴缩短率分别显著降低了43％、69％、49％，射血分数分别显著降低了30％、52％、39％，心搏量分别显著降低了41％、72％、67％，引起斑马鱼心功能下降，模型组与空白组有显著性差异，说明缺氧1.5、2.5、3.5h都成功建立斑马鱼心肌缺氧模型，如图2所示，其中缺氧2.5h时最显著。
对比例1
与实施例1不同之处，在于模型组在缺氧条件下培养，培养时间为1h，其他条件相同。结果如图3所示，与空白对照组相比，模型组缺氧1h时斑马鱼仅在心率上显著降低了10％，心室短轴缩短率、射血分数、心搏量分别降低了13％、4％、3％，并没有显著引起斑马鱼心功能下降，说明没有成功建立斑马鱼心肌缺氧模型。
与空白对照组相比，模型组缺氧1h时斑马鱼心室收缩期面积和舒张期面积显著升高，如图4所示。但心室短轴缩短率、射血分数、心搏量没有显著性差异，并没有显著引起斑马鱼心功能下降，说明没有成功建立斑马鱼心肌缺氧模型，仅靠心室收缩期面积、舒张期面积和面积变化分数这几个指标无法直接反映出心脏泵血功能，不能准确判断是否成功建立斑马鱼心肌缺氧模型。
对比例2
与实施例1不同之处，在于本申请发明人将斑马鱼养鱼水加入到密闭容器中，然后向斑马鱼养鱼水中充入氮气至养鱼水中溶解氧浓度降至0mg/L，迅速将发育正常的3dpf的Tg(cmlc:EGFP)斑马鱼加入该养鱼水中，斑马鱼培养密度与实施例1相同，进行缺氧培养，培养温度为28℃，观察发现斑马鱼缺氧状态不一致，容易导致组内差异大，实验结果不稳定，无法构建斑马鱼心肌缺氧模型。
应用例
本发明所述的斑马鱼心肌缺氧模型在评价化学药物、中药单体化合物和中药提取物中的应用，步骤如下：
(1)在体式显微镜下挑选发育正常的2dpf的Tg(cmlc:EGFP)斑马鱼，移入6孔培养板中，随机分为空白对照组、模型组和三个不同给药组，每组1个孔，每孔20条。
(2)空白对照组移入5mL斑马鱼培养用水，培养温度为28℃，培养24h，即为光照14h，黑暗10h，然后继续在空气正常含氧状态下培养2.5h，记为Ctrl组；模型组移入5mL斑马鱼培养用水，培养温度为28℃，培养24h，即为光照14h，黑暗10h，然后置于厌氧培养盒内，进行缺氧培养，缺氧培养时间为2.5h，记为Model组；给药组分别移入5mL用斑马鱼培养用水配制的20μM依达拉奉溶液、100μM丹酚酸B溶液和200μg/mL心可舒片提取物溶液，药物处理时间为24h，即为光照14h，黑暗10h，然后置于厌氧培养盒内，进行缺氧培养，缺氧培养时间为2.5h，分别记为Edaravone组、Sal B组、XKS组。
(3)步骤(2)中斑马鱼培养结束后，将各组斑马鱼用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉 30s，置于涂有4％甲基纤维素的载玻片上，固定斑马鱼于俯卧体位，于倒置荧光显微镜下记录各组斑马鱼20s心跳次数，并对斑马鱼进行录像保存；
(4)利用图像处理软件Image-Pro Plus 5.1分别统计各组斑马鱼收缩末期与舒张末期的心室短轴长度和心室长轴长度，计算心室短轴缩短率、射血分数、心搏量；
(5)利用数据处理软件GraphPad Prism 8分析数据，以Mean±SEM表示，分析比较各组差异的显著性。
所述心可舒片提取物的制备方法，包括如下步骤：
取心可舒片样品，研磨成粉，称定，加入10倍量甲醇，常温浸泡30min，超声提取30min，进行抽滤，保留提取液，将药渣重复提取2次，保留提取液，然后合并提取液，将提取液减压浓缩至1/10体积，转移至水浴蒸至浸膏，然后将浸膏真空干燥，制得心可舒片提取物。
与空白对照组相比，模型组斑马鱼心率、心室短轴缩短率、射血分数、心搏量分别显著降低了26％、45％、37％、56％，引起斑马鱼心功能下降，说明成功建立斑马鱼心肌缺氧模型；与模型组相比，Edaravone组、Sal B组、XKS组斑马鱼心率分别显著升高了11％、16％、20％，心室短轴缩短率分别显著升高了67％、64％、69％，射血分数分别显著升高了51％、46％、50％，心搏量分别显著升高了67％、44％、48％，引起斑马鱼心功能恢复，说明Edaravone 组、Sal B组、XKS组三种不同药物在此给药剂量下具有抗心肌缺氧活性。
本发明首次提供了一种快速制备构建斑马鱼心肌缺氧模型的方法，本发明提供的斑马鱼心肌缺氧模型构建方法，易于操作，节省时间；本发明与临床紧密贴合，经过大量的实验研究，提供了一种能直接反映出心脏收缩功能及泵血功能的斑马鱼心肌缺氧模型构建方法，本发明提供的斑马鱼心肌缺氧模型可以用于抗心肌缺氧活性药物的筛选及其作用机制研究，可有效地提高动物模型实验效率、降低实验成本。

Claims (10)

1.一种斑马鱼心肌缺氧模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)挑选发育正常的3dpf斑马鱼，随机分为空白对照组和模型组，斑马鱼培养密度为4-6条/mL斑马鱼培养用水，模型组置于空气氧含量按体积分数计为0.1％以下的条件下培养，培养时间为1.5-4.5h，培养温度为26-30℃；空白对照组在空气正常含氧条件下培养，其余实验条件均与模型组保持一致；
(2)麻醉步骤(1)中培养结束的斑马鱼，记录斑马鱼15-60s心跳次数，计算心率，并对斑马鱼进行录像保存；
(3)利用图像处理软件分别统计步骤(2)中，斑马鱼收缩末期与舒张末期的心室短轴长度和心室长轴长度，计算心室短轴缩短率、射血分数、心搏量；
(4)利用数据处理软件分析数据，分析比较空白对照组与模型组差异的显著性，与空白对照组相比，若模型组斑马鱼心率、心室短轴缩短率、射血分数和心搏量都降低，并有显著差异，则模型组构建成功，得到斑马鱼心肌缺氧模型。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)中，斑马鱼培养密度为4条/mL斑马鱼培养用水。
3.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)中模型组置于厌氧培养盒中培养，盒内空气中的氧含量按体积分数计＜0.1％。
4.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)中，所述斑马鱼培养用水配方为：5mMNaCl，0.17mM KCl，0.33mM CaCl2，0.33mM MgSO4·7H2O，按体积分数计3％苯硫脲溶液，所述苯硫脲溶液的摩尔浓度为6.57mM。
5.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)中培养时间为2.5h。
6.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(4)中，利用数据处理软件分析数据，分析比较空白对照组与模型组差异的显著性，与空白对照组相比，模型组斑马鱼同时达到心率降低4.5％以上，心室短轴缩短率降低35％以上、射血分数降低25％以上、心博量降低35％以上，则模型组构建成功，得到斑马鱼心肌缺氧模型。
7.如权利要求6所述方法，其特征在于，步骤(4)中，与空白对照组相比，模型组斑马鱼同时达到心率降低5-27％，心室短轴缩短率降低36-69％、射血分数降低30-52％、心博量降低41-72％，则模型组构建成功，得到斑马鱼心肌缺氧模型。
8.权利要求1-7任一项所述方法制备的斑马鱼心肌缺氧模型在评价治疗心肌缺氧药物质量中的应用。
9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述斑马鱼心肌缺氧模型在评价化学药物、中药单体化合物、中药提取物质量中的应用。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述斑马鱼心肌缺氧模型在评价依达拉奉、丹酚酸B、心可舒片质量中的应用。
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