CN115212346A - 一种三维多孔结构细胞培养支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于新材料和生物技术领域，具体公开了一种三维多孔结构细胞培养支架的制备方法，其支架基体主要组分按重量份算：聚己内酯60‑85份、聚乙烯醇缩丁醛5‑20份、壳聚糖2‑10份、聚丙烯酸钠2‑10份和环氧大豆油1‑5份，采用3D打印技术获得微米级有序微孔，经造孔制备后获得微纳级微孔，经过凝胶修饰改性并交联后获得凝胶相的网络贯穿的多孔结构，并采用介孔二氧化硅负载烟酸引入到培养支架中之后，明显的提高了支架的亲水性、生物相容性、细胞的贴壁粘附性及增殖生长性等，本文介绍的细胞培养支架具有良好的高效性、无毒性、可生物降解性等有点。

Description

一种三维多孔结构细胞培养支架的制备方法
技术领域
本发明属于新材料和生物技术领域，具体涉及一种三维多孔结构细胞培养支架的制备方法。
背景技术
随着3D打印技术的不断发展、应用和推广，使用和体验的人越来越多，应用的领域也是越来越广泛了。如何将3D打印应用于细胞培养也已成为又一个热点，例如，骨折、骨损、骨肿瘤等骨科医疗科学的骨细胞研究，皮组织细胞、口腔细胞、内脏各器官细胞等的培养，越来越多的科研人员都在研究，也报道或上市了一些产品。
传统的细胞培养装置、设备或支架都属于二维的平面培养模式，虽然在一定程度上可以满足很大一部分的产业需求，但也存在一些不足或缺陷，比如细胞在培养过程中增殖后细胞出现拥挤，部分无黏附着床空间，暴露在培养液表面等。三维培养支架的出现很好地解决了二维培养所存在的不足与缺陷，三维支架丰富的网络空间结构可以给细胞的增殖和黏附提供更大的附着比表面积，提高细胞的产量和质量，减少细胞之间彼此的接触和抑制，具有模拟人体或动物体的三维结构生长环境，有利于细胞与细胞之间及细胞与细胞外质之间的交互作用及代谢产物的排除，有利于细胞的分化及原属性功能的表达。
目前，大部分的三维培养支架以蛋白、明胶、凝胶糖类、海藻酸盐类等为原料，还有部分加入天然可降解或易降解高分子材料加以辅助，采用冷冻成型、模具成型、凝胶点胶或打印成型、静电纺丝成型等得到三维细胞培养支架。这类三维培养支架都有一个明显的缺陷就是支架的力学性能较差，脆性大，强度不够；再者，也不利于营养物深度传输和细胞代谢物的排除，不利于细胞与支架的分离和获取，且支架难以回收利用。此外，目前部分采用聚己内酯作为支架基体，由于其疏水性，不利于细胞的附着贴壁，且后期对聚己内酯支架的修饰也具有很大难度，如基体骨架的表面粗糙度、凝胶不易被牢固修饰在支架表面，且被修饰的凝胶过少起不了很好的作用，过多则会出现不利于营养物深度传输和细胞代谢物的排除，也不利于细胞与支架的分离和获取等不良影响；故此，亟待开发一种既具有良好的细胞亲和性、粘附性，又具有可实现的细胞分离获取性，还具有可靠力学性能的三维细胞培养支架来满足生产发展的需求。
中国专利（CN201510783345.3）公开了三维细胞培养支架及其制备方法，其特征为，所述的原料为透明聚苯乙烯与透明苯乙烯-丁二烯无规共聚物以质量比为（90-60）：（10-40）的复合物；其原料为疏水性的材料，不利于细胞的黏附，而经过等离子处理后会提升一定的细胞黏附率；此外聚苯乙烯与透明苯乙烯-丁二烯无规共聚物都为不可降解或难降解的高分子聚合物，不利于用后处理；而本申请采用的聚己内酯复合材料，既具有良好细胞相容性、亲水性、生物可降解性，并结合凝胶的优点而修饰到支架中，大大的提高了培养支架的细胞黏附性，也保持了培养支架原有的力学性能和易分离等性能，还保持了培养支架的可生物自然降解特性，用后处理不对环境产生伤害，填埋、堆肥或再利用均可。
中国专利（CN202110722057.2）公开了用于修复跟腱缺损的3D打印支架及其制备方法，其特征为，所述的原料为Pluronic-F127与聚己内酯的酸性混合液，采用其所述的3D电流体喷射打印的方法制备得到打印支架，此液体打印方法类似于进程有序的直写静电纺丝，此方法不利于打印厚度比较大的支架，其打印的交接点每一层都交接两次，会高出其平面，厚度越厚则越明显，液体打印完经过蒸发干燥之后会出现明显的收缩，得到的支架相对也是比较柔软，其横向网络结构有很多被堆积在一起，也降低了其的比表面积及细胞可附着的场所。
中国专利（CN202110518519.9）公开了一种3D打印支架及制备方法和应用，其特征为，所述的原料为间充质干细胞外泌体和细胞外基质凝胶的混合物，通过3D打印平台光固化成型，与本申请所述的采用线材进行3D打印得到的细胞培养支架，不管是在成型的方法还是所用的原料都完全不一样，不具有可比性。
中国专利（CN201711312219.5）公开了一种作为骨修复生物材料3D打印支架及其制备方法，其特征为，所述的3D打印支架各粉体质量百分比为β-磷酸三钙55-80%、煅自然铜10-30%、聚丙烯酸钠2-10%、羧甲基丙基纤维素2-10%，通过水作为液剂，分别按一定顺序将四种原料加入其中，得到打印浆料，在通过打印浆料挤出打印成型，得到半成品，再经过1100℃的高温烧结，得到支架成品，此方法制备的培养支架经过高温煅烧后，里面的有机成分都将气化排出，形成一定的孔道或粗糙的表面，一般情况下经1100℃后是不会存留下聚丙烯酸钠和羧甲基丙基纤维素等有机物了，且100目（150μm）的煅自然铜粉末相对来说，其粒径稍微过大，在直径为200μm的喷头中打印，很容易会出现堵头的现象，不利于高质量的打印，且其用到的聚丙烯酸钠与本申请所用聚丙烯酸钠的用途完全不一样，实现打印制备支架的方法也完全不一样。
中国专利（CN202110823078.3）公开了具有长效抗菌和自润滑功能的3D打印支架的制备方法，其特征为，所述的原料质量分数为PEEK粉末87-95份、氧化锌2-5份、纳米银1-3份、沸石咪唑酯骨架结构材料2-5份，350-370℃高温双螺杆混合10-30min后制备成线材，再打印成支架，通过表面处理得到PEEK-NH2支架，再接枝透明质酸或者海藻酸钠分子，得到PEEK-CHO支架，再浸入到蛋白溶液中反应后得到长效抗菌和自润滑功能的3D打印PEEK支架；与本申请相比，PEEK属于不可生物降解的高温聚合物材料，而本申请所用的聚己内酯为可生物自然降解的低温（熔点58℃左右）聚合物；其采用PEEK作为基材主要针对骨骼关节等的支撑作用，需要较好的力学强度，而本申请所用聚己内酯支架主要用于细胞的培养与部分损伤的修复，具有较好的降解性和吸收性，针对的目标不一样；其采用纳米银、氧化锌等作为抗菌的添加剂，而本申请采用具有天然性的壳聚糖作为抗菌添加剂，保存了支架的可自然生物降解的特性；且本申请对支架的修饰也与其不一样，在基体的混合过程中就已经加入了可以与海藻酸钠-丙烯酸钠反应的聚丙烯酸钠，相对其表面采用浓硫酸和浓硝酸的处理获取-NO2基团、再采用SnCl2处理获取-NH2基团、再与透明质酸或者海藻酸钠分子接枝后在对透明质酸或者海藻酸钠分子进行氧化处理获取-CHO基团、最后浸没到有抗生素的蛋白溶液中反应获取得到长效抗菌和自润滑功能的3D打印PEEK支架的过程，本申请凝胶修饰的培养支架获取的更加的简易便利，无毒无害，且本申请采用的离子交换交联的原理与其所采用的原理完全不一样，更加的温和。
中国专利（CN201911030009.6）公开了含镓聚己内酯/生物玻璃多孔骨修复3D打印支架及其在感染性骨缺损修复中的应用，其特征为，所述的原料百分含量为聚己内酯50-80%、含镓生物玻璃20-50%，将原料采用二氯甲烷或三氯甲烷溶解混合后加入料筒进行液体方式的低温打印，或将原料先进行高温预混合后再加入高温料筒中进行所述的高温打印；不管是所述的低温打印还是高温打印，其形式都需要在料筒中形成液体或低粘性流体，因此一些无机颗粒会慢慢的由于重力的作用而往下沉淀，导致打印喷头容易堵塞以及影响混合物料的不均匀，就目前3D打印技术来看，与此方法相比，线材形式的3D打印方式会更稳定些，不管是物料均匀度的稳定性还是打印喷嘴出料均匀量的稳定性。
中国专利（CN201811020895.X）公开了一种3D打印PCL-PMMA-万古霉素抗感染骨支架及制备方法和应用，其特征为，所述的制备过程为将MMA与PMMA粉末混合后再加入万古霉素搅拌混合，再加入到3D打印PCL支架中填充到支架空隙内，最后取出并去除表面多余骨水泥后得到所需支架；通过过氧化苯甲酰作为交联剂或引发剂使得PMMA-万古霉素混合物中的某些物质基团与PCL交联，或者是使得丙烯酸酯之间深度交联反应，首先过氧化苯甲酰本身具有毒性，在反应后难去除，其次该方法原理与本申请所介绍的凝胶修饰的原理完全不一样，应用的重点也不一样，不具有可比性。
中国专利（CN201811019502.3）公开了一种3D打印PCL-PDA-AgNPs抗感染骨组织工程支架及其制备方法和应用，其特征为，所述的制备过程为将PCL熔融加热至液态再挤压打印成型而得到PCL 3D打印支架，再将PCL 3D打印支架加入到DA-Tris-HCl溶液中搅拌获取3D打印PCL-PDA支架，并将3D打印PCL-PDA支架加入到银氨溶液中搅拌反应获取3D打印PCL-PDA-AgNPs支架；首先，其所述的修饰或反应方法与本申请介绍的方法原理不一样；其次，其PCL支架的打印方式也不一样，首先将纯的PCL高温熔融成液体后再进行打印，与本申请的复合材料做成线材再打印有一定差别；再者，其所述的采用纳米银或银离子作为抗菌防腐，与本申请介绍的采用壳聚糖作为抗菌添加成分，不管从降解或者吸收的特性上壳聚糖都更具有天然性和环保性；此外，聚乙烯吡咯烷酮作为分散剂，与银氨溶液中的银离子也有很大可能形成聚乙烯吡咯烷酮的银离子络合物，出现沉淀或析出，影响体系的正常配比或反应过程。
中国专利（CN201710418923.2）公开了一种聚己内酯-磷酸三钙骨组织工程支架的构建及其表面粗糙化处理方法，其特征为，所述的原料为PCL与TCP的质量比为8：2，混合后造粒，再通过3D打印技术打印成网格状PCL-TCP支架，再经过有机溶剂蚀刻，有机溶剂为无水乙醇、丙酮、二氯甲烷的混合溶液；PCL与TCP粉末之间混合时在不添加分散剂的条件下，均匀性会差一些；采用无水乙醇、丙酮、二氯甲烷的混合溶液对PCL基体材料的蚀刻属于一种化学腐蚀，容易造成有毒有机溶剂的残留，如二氯甲烷、丙酮都属于毒性较强的有机溶剂；此外，其材料组分含量和配比以及造孔或粗糙化的原理都与本申请介绍的不一样，更没有对支架做后续的凝胶修饰。
中国专利（CN202110590593.1）公开了一种载5-FU的抗肿瘤复合材料支架的制备方法，其特征为，所述的原料质量百分数为氟尿嘧啶粉末0.5-2%、聚己内酯粒料98-99.5%，经过混合再经挤出机挤出成线材，在经线材3D打印技术打印得到所需复合材料支架；其材料组分含量和配比以及应用的对象领域都与本申请介绍的完全不一样，后期也没有做一些修饰等的后处理，且本申请中的组分中也不可能加入类似于氟尿嘧啶类似的有毒的药物来抑制DNA、RNA的复制与合成，这些都不是本申请介绍所希望的。
发明内容
针对以上的问题，本发明提供了一种三维多孔结构细胞培养支架的制备方法，采用介孔二氧化硅负载烟酸引入到培养支架中之后，明显的提高了支架的亲水性、生物相容性、细胞的贴壁粘附性及增殖生长性等。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
一种三维多孔结构细胞培养支架的制备方法，包括如下步骤：
1）介孔二氧化硅的制备：
将一定量黄原胶加入到水中，控制温度至55-65℃分散溶解，再加入一定量十二烷基二甲基氧化胺，分散均匀，并将体系pH值调节至6.5-7.5，得到模板悬浮乳液；
其中，水、黄原胶和十二烷基二甲基氧化胺的质量比为（50-200）：（1-5）：（1-5）；
将所得模板悬浮乳液升温至65-75℃，保持搅拌状态，同时缓慢加入一定量正硅酸乙酯，加入完成后继续搅拌反应3-5h，反应过程中保持体系pH值为6.5-7.5，然后进行冷却、过滤、洗涤、干燥得到反应产物，将反应产物置于马弗炉中，先升温至190-210℃处理1.5-2.5h，再进一步升温至780-820℃高温处理4-6h，然后自然冷却至室温，研磨细化，得到介孔二氧化硅，优选粒径尺寸为50-800nm；
其中，正硅酸乙酯与模板剂（黄原胶和十二烷基二甲基氧化胺的质量总和）的质量之比为（10-20）：（1-4）；
优选的，采用浓度0.3-0.8wt%的盐酸或0.3-0.8wt%的氢氧化钠溶液调节pH值；
2）介孔二氧化硅的氨基化：
将3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷溶解到乙醇-水混合液中，控制温度在55-65℃，在搅拌的条件下缓慢加入一定量所述介孔二氧化硅，并将pH值控制在8-10，进行氨基化改性反应3-5h，然后冷却、过滤、洗涤、干燥、研磨细化，得到氨基化介孔二氧化硅；
其中，所用乙醇-水混合液中乙醇与水的质量比为5：1；所用3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷与乙醇-水混合液的质量比为（1-5）：100；所用介孔二氧化硅与3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷溶液的质量比（1-5）：50；
3）烟酸的负载：
将一定量烟酸加入到水中，温度控制在85-95℃，充分溶解，得到烟酸溶液；在搅拌的条件下，将一定量所述氨基化介孔二氧化硅缓慢加入到所述烟酸溶液中，控制温度在85-95℃，搅拌分散10-20min，再进行超声处理15-30min，抽真空使真空压力保持在0.1-0.3MPa的范围内，并继续保持超声处理40-80min，然后停止搅拌、超声和加热，在保持真空压力条件下自然冷却至室温、结晶，并静置1-2h，再重复以上加热、搅拌、超声、抽真空、结晶的操作2-4次，完成多次重结晶后，最后室温密封静置8-24h，过滤，然后依次用0.2-5 wt %的碳酸钠水溶液和蒸馏水洗涤，再进行真空干燥、研磨细化，得到负载烟酸的介孔二氧化硅；
其中，烟酸溶液中所用烟酸与水的质量比为（1-10）：50；超声处理的同时进行缓慢搅拌，超声处理温度控制85-95℃；所用氨基化介孔二氧化硅与烟酸溶液的质量比为（1-5）：（30-100）；
4）3D打印复合线材的制备：
配备以下重量份计的原料：聚己内酯60-85份、聚乙烯醇缩丁醛5-20份、壳聚糖2-10份、聚丙烯酸钠2-10份和环氧大豆油1-5份；
优选的，所述的聚己内酯分子量为30000-150000，所述的聚乙烯醇缩丁醛分子量为30000-80000；所述的聚丙烯酸钠分子量为10000-50000；所述的壳聚糖分子量为5000-30000；
首先，将所述聚己内酯加入到乙酸乙酯中，在75-85℃搅拌分散，使充分溶解；再加入所述聚乙烯醇缩丁醛，在75-85℃继续搅拌分散，使充分溶解并混合均匀；再加入所述环氧大豆油，在75-85℃继续搅拌分散，充分溶解并混合均匀，得到基体混合液；其中，聚己内酯与乙酸乙酯的质量比为（1-3）：（2-10）；
其次，将所述壳聚糖加入pH值为5-7的乙酸水溶液中，充分溶解、分散均匀，再加入所述聚丙烯酸钠，在55-65℃充分溶解、分散均匀，然后浓缩、干燥，研磨成复合粉末；其中，所用壳聚糖与乙酸水溶液的质量比为1：40-60；
然后，将所述复合粉末加入到所述基体混合液中，分散均匀，得到复合材料混合液；再将复合材料混合液真空干燥，切粒，真空干燥，得到复合材料粒子，将所得复合材料粒子熔融挤出，得到3D打印复合线材；
其中，熔融挤出所用单螺杆挤出机的温度设置为：一段90-110℃、二段95-120℃、三段90-115℃、机头段90-110℃，螺杆挤出速度为20-30rpm，冷却：前段为10-15℃的循环水冷却、后段为16℃以下的风冷，干燥为50℃的吹风干燥；
5）水凝胶制备：
将凝胶物料加入到水中，充分溶解得到凝胶溶液，备用；
其中，凝胶物料与水的质量之比为（1-5）：（20-50），凝胶物料包括海藻酸钠和丙烯酸钠，二者质量比为（3-10）：（1-3），除此之外，还可包括羧酸类化合物及其盐、磺酸类化合物及其盐、丙烯酸类化合物及其盐或蛋白类，可以对支架进行较好的修饰；
在搅拌的条件下，将一定量所述负载烟酸的介孔二氧化硅缓慢加入到凝胶溶液中，分散均匀得到凝胶混合溶液；其中所用负载烟酸的介孔二氧化硅与凝胶溶液的质量比为（1-3）：（10-50）；
6）细胞培养支架制备：
将所得到的3D打印复合线材根据设计好的结构模型打印出细胞培养支架，将所述细胞培养支架浸泡到适量乙醇中，于40-50℃静置20-40min，再低速（3-15rpm）搅拌0.5-2h，然后超声处理3-10min，继续搅拌2-4h，取出细胞培养支架并用乙醇清洗，然后更换新的乙醇重复进行多次上述操作，然后将细胞培养支架真空干燥，得到造孔后的细胞培养支架；
将造孔后的细胞培养支架加入适量水中，于40-60℃浸泡20-40min，冷却后取出，将细胞培养支架表面的水去除，浸入到所述凝胶混合溶液中，于35-50℃超声处理30-90秒，再浸泡40-80min，冷却后静置40-80min，取出支架进行真空干燥，冷却后再置于0.5-2wt%的氯化钙水溶液中，先进行常温浸泡2-4h，再进行超声处理30-90秒，再继续常温浸泡8-12h，取出再置于适量的水中常温浸泡2-4h，取出再重复多次进行以上的氯化钙水溶液和水处理操作，完成后进行真空干燥，即得到一种新型的三维多孔结构细胞培养支架。
本发明的技术方案具有以下有益效果：
（1）本发明采用十二烷基二甲基氧化胺为活性剂与黄原胶共同作为介孔二氧化硅的模板剂，黄原胶本身具有多糖多官能团的活性结构，也具有很好的分散性、悬浮性和乳化性等，在体系酸碱度的pH值为7的环境下进行悬浮乳化，在加入正硅酸乙酯时，十二烷基二甲基氧化胺和黄原胶同时与其发生发应，十二烷基二甲基氧化胺与正硅酸乙酯反应过程使得二氧化硅微球形成众多介孔微孔结构，而黄原胶除了分散悬浮乳化作用外，本身也作为孔道模板的一部分，在作用形成微孔的同时也进入到反应过程中的孔道中，进行着孔道扩孔的作用，使得获得的介孔微球具有更大或者更合适的孔道；并且此反应过程中都比较温和，以水作为溶剂，所用原材料都相对环保，具有很强的实用性和推广性；
（2）本发明采用3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷对介孔二氧化硅的外表面、浅孔道或内孔道进行有机改性，使得介孔二氧化硅实现氨基化，获得丰富的氨基基团，氨基基团对烟酸药物等具有很好的吸引作用；经过超声振动和抽真空负压的作用下，在排除介孔二氧化硅孔道中空气的同时也在缓慢的载入烟酸溶液，再经过多次的重结晶方法，使得烟酸不断的往孔道内生长，得到良好的载药微球；其中，同时进行超声振动、抽真空、搅拌等步骤，比采用其中单一方法步骤所得的载药效果更好，效率更高；
（3）本发明所述的多孔培养支架首先采用3D打印的技术打印制造出三维贯穿的有序多孔结构支架；再采用无水乙醇浸泡溶出聚乙烯醇缩丁醛进而造孔，所造的孔为支架基体的连续无序的三维贯穿结构的微孔；然后采用海藻酸钠及丙烯酸钠作为凝胶表面修饰基体，采用加热和钙离子等条件进行交联，此处的多重交联主要包括海藻酸钠之间的交联、丙烯酸钠之间的交联、聚丙烯酸钠之间的较量以及三者之间的两两交联或三者同时交联，所得到的为三维网络贯穿结构。其中，采用3D打印所得的有序大孔结构有利于细胞的分散和载入以及增殖后细胞的过滤回收或细胞产物的回收，相对一些无序复杂的小孔道，有序的大孔结构的载入和回收的效率会更高；将聚乙烯醇缩丁醛等去除后得到连续的孔道，有利于基体复合材料中聚丙烯酸钠在浸泡在水中吸水延伸提供一定的伸展空间，也为后面水凝胶的修饰和交联提供更充足更优异的交联空间，也使得所得的交联强度更好，修饰的水凝胶与支架的结合更牢固，保护其在细胞培养繁殖过程中和后期回收产物过程中不易剥落或脱落，提高培养支架的整体性能；而对培养支架进行水凝胶的修饰所形成凝胶网络结构表面层，其一是进一步的提高支架表面的亲水性或浸润程度，使得其与细胞具有更好的亲和性，其二是丰富凝胶网络结构也在提供更多的附着三维空间之外还增强细胞在支架上的粘附性，提高了细胞在支架上的贴壁率，有利于细胞的生存和增殖等；加入负载烟酸的介孔二氧化硅微球，其一是使得烟酸有一个合适的缓释过程，可以适量的持续提供烟酸，其二是加入烟酸后对细胞的生长和增殖有很好的促进作用，提高细胞培养的效率，当然也可以根据培养支架的特性或细胞培养的要求而载入其它各种药物或试剂或影响因子。因此，本发明中介绍的3D打印有序孔、溶出聚乙烯醇缩丁醛等支架基体的无序孔、水凝胶修饰后得到的凝胶网络结构，三者之间具有相辅相成的作用，是一个有机的整体或体系，缺失其中的某一部分都会对培养支架的整体性能产生很大的影响。
（4）本发明采用括聚己内酯、聚乙烯醇缩丁醛、壳聚糖、聚丙烯酸钠、环氧大豆油作为原辅料制备3D打印复合材料。聚己内酯是一种生物可降解的生物材料，作为支架的主要基体材料；聚乙烯醇缩丁醛主要有两方面的作用原理，一是作为支架基体制备无序多孔的造孔剂，二是在溶剂溶解和混合过程中与聚己内酯基体形成了类似于“海海结构”的紧密结构，在加工过程中，特别是在水冷却的步骤过程中，因为其优异的疏水性能，而起到对聚丙烯酸钠的保护，保护其不易吸水或溶解到水中，从而也保障了所得复合材料或线材的组分含量及均匀度，在本发明的线材加工中起到重要的作用；壳聚糖作为天然的高分子，具有优异的生物相容性和抗菌性，在本发明的复合材料中起到抗菌的作用，以及作为基体的增强作用，提高支架的力学强度；聚丙烯酸钠也是生物材料中的一种，在食品的加工中可以作为食品的添加剂加入到食品当中，无毒无害，绿色环保，在与壳聚糖混合时均匀分散结合在一起，加工到复合材料中后经3D打印制备出培养支架，其一，作为水凝胶可以使培养支架具有良好的亲水性，也为后面水凝胶修饰提供可反应的活性基团，使水凝胶修饰和结合更加牢固与高效，其二，本身也具有凝絮或络合的性能，可以保护壳聚糖在浸入水溶液后不易析出脱落，保证培养支架抗菌性保持稳定；最后，环氧大豆油也是一种天然的大分子有机物，无毒无害，绿色环保，主要作用是增塑，提高复合材料的可塑性，能以更低的熔融温度实现加工，降低不良率，提高打印质量。另外，本发明复合材料之间是相辅相成，相互作用，原辅料之间不易替代，如聚乙烯醇缩丁醛疏水并不溶于水，但却能溶于乙醇和乙酸乙酯，因此能与聚己内酯在乙酸乙酯中混溶，在加工过程中具有疏水功能，保障线材的质量，在打印得到支架中时却又能被乙醇溶解出来获得多孔结构，又如聚丙烯酸钠亲水又能溶于水，但却不能溶于乙醇，而且本身还带有可反应的活性基团，因此在乙醇溶解聚乙烯醇缩丁醛时能保证自身不被明显影响，又保证了其与壳聚糖共同对培养支架基体的增强，而浸泡到水中时又能吸水膨胀延伸至孔道中或支架基体表面表现出其亲水性，在于水凝胶表面改善修饰时又能提供其本身具有的可反应活性基团，使得修饰的水凝胶结合的更牢固，极大的改善了培养支架对细胞的亲和性或粘附性等。
（5）本发明采用3D打印技术及水凝胶制备技术相互结合制备得到细胞培养支架，制备过程相对无毒无害或低毒，所采用的原辅料也相对绿色环保，所得到的培养支架相对成本较低，制备工艺方法也相对简单方便，具有很好的实用性和使用性，对细胞培养的方式方法或培养效率都具有十分有益的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的部分实施例。
图1为本发明三维多孔结构细胞培养支架的制备工艺流程图。
图2为本发明中制备的介孔二氧化硅的TEM电镜图。
图3为本发明中负载烟酸介孔二氧化硅的TEM电镜图。
图4为本发明实施例1-7中不同打印孔径培养支架的照片图。
图5为本发明对比例1和实施例3（未造孔）的3D打印培养支架光学电镜图。
图6为本发明实施例3中未造孔、已造孔和凝胶修饰的3D打印培养支架光学电镜图。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书（包括任何附加权利要求、摘要和附图）中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。其中，以下实施例中所用材料如下，但本发明不限于此：
负载烟酸的介孔二氧化硅，其制备步骤：
（1）介孔二氧化硅制备：将黄原胶加入到去离子水中，升温至60℃搅拌分散，充分溶解，再加入十二烷基二甲基氧化胺，继续搅拌分散，采用质量分数为0.5%的盐酸溶液和质量分数为0.5%的氢氧化钠溶液作为酸碱调试剂，将体系酸碱度的pH值调节为7，得到稳定的模板悬浮乳液，其中去离子水、黄原胶和十二烷基二甲基氧化胺的质量之比为100：1：2；将模板悬浮乳液升温至70℃，保持搅拌状态，再慢慢加入正硅酸乙酯，加入完成后继续搅拌反应4h，过程中保持反应体系中的pH值为7左右，然后进行冷却，过滤，洗涤，干燥，得到反应产物，其中正硅酸乙酯与模板剂（黄原胶和十二烷基二甲基氧化胺的质量总和）的质量之比为10：1；最后将反应产物置于马弗炉中先升温至200℃处理2h，再升温至800℃高温处理5h，自然冷却至室温，研磨细化，得到介孔二氧化硅。
（2）氨基化介孔二氧化硅：将3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷充分溶解到乙醇-水混合液中，得到改性溶液；将改性溶液温度设置为60℃，在搅拌的条件下，将介孔二氧化硅缓慢加入到改性溶液中进行氨基化改性反应，PH值保持为9，搅拌反应4h，冷却，过滤，洗涤，干燥，研磨细化，得到氨基化介孔二氧化硅；其中乙醇与水的质量之比为5：1，3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷与乙醇-水的质量之比为3：100，介孔二氧化硅与改性溶液的质量之比2：50。
（3）烟酸的负载：将烟酸加入到蒸馏水中，温度设置为90℃，搅拌充分溶解，得到烟酸溶液，其中烟酸与蒸馏水的质量之比为3：50；将一定量经氨基化的介孔二氧化硅在搅拌的条件下缓慢的加入到烟酸溶液中，保持90℃，搅拌分散15min，再移至超声处理设备中进行超声处理20min，并进行缓慢搅拌，超声处理设备温度设置为90℃，其中氨基化介孔二氧化硅与烟酸溶液的质量之比为3：100；将真空抽气泵的管道连接到反应器的抽气端口出密封连接，开启真空抽气泵，保持真空压力在0.1-0.3MPa的范围内，保持缓慢搅拌，保持超声处理，保持温度90℃，继续负载处理60min，然后停止搅拌，停止超声处理，关闭保温加热，在继续抽真空的条件下自然冷却至室温、结晶，静置2h，再重复上述升温、搅拌、超声、抽真空、结晶操作4次，完成多次重结晶后，最后室温密封静置24h，过滤，先用2wt%碳酸钠水溶液清洗2次，再用蒸馏水清洗5次，再将过滤物置于温度设置为80℃的真空干燥箱中真空干燥12h，研磨细化，得到负载烟酸的介孔二氧化硅，其中烟酸的负载量（质量含量）为31.2%。
水凝胶的制备，其制备步骤：将凝胶物料加入到蒸馏水中，先超声分散处理3min，再加热到50℃，搅拌60min，充分溶解，冷却至室温，得到凝胶溶液，备用；其中凝胶物料与蒸馏水的质量之比为1：40，凝胶物料为海藻酸钠和丙烯酸钠的混合物，并且海藻酸钠与丙烯酸钠的质量之比为8：1；再将负载烟酸的介孔二氧化硅在搅拌的条件下缓慢加入到凝胶溶液中，常温搅拌1h，充分分散均匀，得到凝胶混合溶液，其中负载烟酸的介孔二氧化硅与凝胶溶液的质量之比为1：25。
3D打印复合线材的制备：复合材料按重量份计，包括聚己内酯78份、聚乙烯醇缩丁醛10份、壳聚糖5份、聚丙烯酸钠5份、环氧大豆油2份；首先，将聚己内酯加入到适量乙酸乙酯中，温度设置为80℃，保温静置60min后，搅拌分散30min，充分溶解；再加入聚乙烯醇缩丁醛，保温搅拌分散30min，充分溶解并混合；再加入环氧大豆油，保温搅拌分散30min，充分溶解并混合，得到基体混合液；其次，将壳聚糖加入采用乙酸调节的pH值为5-7的水溶液中，搅拌分散30min，充分溶解混合分散，再加入聚丙烯酸钠粉末，温度设置为60℃，搅拌溶解2h，充分混合分散，并将其蒸发干燥，研磨成500目及以上的复合粉末；然后，将复合粉末加入到基体混合液中，搅拌分散30min，分散至均匀，得到复合材料混合液，其中壳聚糖、聚丙烯酸钠与水的质量之比为1：1：50；再将复合材料混合液倒入到合适平底容器中，置于90℃的真空干燥箱中真空干燥12h，再降低温度至60℃后真空干燥4h，取出，自然冷却至室温，采用切粒装置进行切粒，切粒的粒径保持为0.5-4mm，将切好的切粒再置于温度设置为50℃的真空干燥箱中真空干燥8h，得到复合材料粒子；然后，将复合材料粒子加入到单螺杆挤出机中加热熔融挤出，冷却，干燥，收集，得到3D打印复合线材；其中，单螺杆温度设置为：一段90℃、二段95℃、三段90℃、机头段90℃，螺杆挤出速度为25rpm，冷却：前段为12℃的循环水冷却、后段为16℃以下的风冷，干燥为50℃的吹风干燥。
实施例1
采用3D打印设备根据结构模型设计打印出打印孔径为0.1mm的细胞培养支架；将培养支架浸泡入到适量无水乙醇中，温度设置为45℃，静置30min，再低速搅拌1h，再置于超声处理设备中超声处理5min，取出，继续搅拌3h，冷却，取出细胞培养支架，用无水乙醇浸泡清洗，同理，更换新的无水乙醇，温度设置为45℃，静置30min，再低速搅拌1h，再置于超声处理设备中超声处理5min，取出，继续搅拌3h，冷却，取出细胞培养支架，用无水乙醇浸泡清洗，根据此方法重复操作4次，完成后，置于45℃的真空干燥箱中真空干燥12h，得到造孔后的细胞培养支架；将造孔后的细胞培养支架浸泡到适量的蒸馏水中，温度设置为50℃，浸泡30min，冷却，取出，擦干造孔后的细胞培养支架表面的水，再将其浸入到前面制备好的凝胶混合溶液，温度设置为40℃，先超声处理1min，再继续浸泡1h，冷却，静置1h，取出，置于50℃的真空干燥箱中真空干燥30min，自然冷却，取出，再进入到适量的质量分数为1%的氯化钙水溶液中，先常温浸泡3h，再超声处理1min，再继续常温浸泡10h，完成后，取出，清洗，再置于适量的蒸馏水中，常温浸泡2h，取出，同理，再次将其浸入到质量分数为1%的氯化钙水溶液中，先常温浸泡3h，再超声处理1min，再继续常温浸泡10h，完成后，取出，清洗，再置于适量的蒸馏水中，常温浸泡2h，取出，根据此方法重复3次，完成后，置于50℃的真空干燥箱中真空干燥60min，自然冷却，取出，得到一种新型的三维多孔结构细胞培养支架。
实施例2
采用3D打印设备根据结构模型设计打印出打印孔径为0.2mm的细胞培养支架；将培养支架浸泡入到适量无水乙醇中，温度设置为45℃，静置30min，再低速搅拌1h，再置于超声处理设备中超声处理5min，取出，继续搅拌3h，冷却，取出细胞培养支架，用无水乙醇浸泡清洗，同理，更换新的无水乙醇，温度设置为45℃，静置30min，再低速搅拌1h，再置于超声处理设备中超声处理5min，取出，继续搅拌3h，冷却，取出细胞培养支架，用无水乙醇浸泡清洗，根据此方法重复操作4次，完成后，置于45℃的真空干燥箱中真空干燥12h，得到造孔后的细胞培养支架；将造孔后的细胞培养支架浸泡到适量的蒸馏水中，温度设置为50℃，浸泡30min，冷却，取出，擦干造孔后的细胞培养支架表面的水，再将其浸入到前面制备好的凝胶混合溶液，温度设置为40℃，先超声处理1min，再继续浸泡1h，冷却，静置1h，取出，置于50℃的真空干燥箱中真空干燥30min，自然冷却，取出，再进入到适量的质量分数为1%的氯化钙水溶液中，先常温浸泡3h，再超声处理1min，再继续常温浸泡10h，完成后，取出，清洗，再置于适量的蒸馏水中，常温浸泡2h，取出，同理，再次将其浸入到质量分数为1%的氯化钙水溶液中，先常温浸泡3h，再超声处理1min，再继续常温浸泡10h，完成后，取出，清洗，再置于适量的蒸馏水中，常温浸泡2h，取出，根据此方法重复3次，完成后，置于50℃的真空干燥箱中真空干燥60min，自然冷却，取出，得到一种新型的三维多孔结构细胞培养支架。
实施例3
采用3D打印设备根据结构模型设计打印出打印孔径为0.3mm的细胞培养支架；将培养支架浸泡入到适量无水乙醇中，温度设置为45℃，静置30min，再低速搅拌1h，再置于超声处理设备中超声处理5min，取出，继续搅拌3h，冷却，取出细胞培养支架，用无水乙醇浸泡清洗，同理，更换新的无水乙醇，温度设置为45℃，静置30min，再低速搅拌1h，再置于超声处理设备中超声处理5min，取出，继续搅拌3h，冷却，取出细胞培养支架，用无水乙醇浸泡清洗，根据此方法重复操作4次，完成后，置于45℃的真空干燥箱中真空干燥12h，得到造孔后的细胞培养支架；将造孔后的细胞培养支架浸泡到适量的蒸馏水中，温度设置为50℃，浸泡30min，冷却，取出，擦干造孔后的细胞培养支架表面的水，再将其浸入到前面制备好的凝胶混合溶液，温度设置为40℃，先超声处理1min，再继续浸泡1h，冷却，静置1h，取出，置于50℃的真空干燥箱中真空干燥30min，自然冷却，取出，再进入到适量的质量分数为1%的氯化钙水溶液中，先常温浸泡3h，再超声处理1min，再继续常温浸泡10h，完成后，取出，清洗，再置于适量的蒸馏水中，常温浸泡2h，取出，同理，再次将其浸入到质量分数为1%的氯化钙水溶液中，先常温浸泡3h，再超声处理1min，再继续常温浸泡10h，完成后，取出，清洗，再置于适量的蒸馏水中，常温浸泡2h，取出，根据此方法重复3次，完成后，置于50℃的真空干燥箱中真空干燥60min，自然冷却，取出，得到一种新型的三维多孔结构细胞培养支架。
实施例4
采用3D打印设备根据结构模型设计打印出打印孔径为0.4mm的细胞培养支架；将培养支架浸泡入到适量无水乙醇中，温度设置为45℃，静置30min，再低速搅拌1h，再置于超声处理设备中超声处理5min，取出，继续搅拌3h，冷却，取出细胞培养支架，用无水乙醇浸泡清洗，同理，更换新的无水乙醇，温度设置为45℃，静置30min，再低速搅拌1h，再置于超声处理设备中超声处理5min，取出，继续搅拌3h，冷却，取出细胞培养支架，用无水乙醇浸泡清洗，根据此方法重复操作4次，完成后，置于45℃的真空干燥箱中真空干燥12h，得到造孔后的细胞培养支架；将造孔后的细胞培养支架浸泡到适量的蒸馏水中，温度设置为50℃，浸泡30min，冷却，取出，擦干造孔后的细胞培养支架表面的水，再将其浸入到前面制备好的凝胶混合溶液，温度设置为40℃，先超声处理1min，再继续浸泡1h，冷却，静置1h，取出，置于50℃的真空干燥箱中真空干燥30min，自然冷却，取出，再进入到适量的质量分数为1%的氯化钙水溶液中，先常温浸泡3h，再超声处理1min，再继续常温浸泡10h，完成后，取出，清洗，再置于适量的蒸馏水中，常温浸泡2h，取出，同理，再次将其浸入到质量分数为1%的氯化钙水溶液中，先常温浸泡3h，再超声处理1min，再继续常温浸泡10h，完成后，取出，清洗，再置于适量的蒸馏水中，常温浸泡2h，取出，根据此方法重复3次，完成后，置于50℃的真空干燥箱中真空干燥60min，自然冷却，取出，得到一种新型的三维多孔结构细胞培养支架。
实施例5
采用3D打印设备根据结构模型设计打印出打印孔径为0.6mm的细胞培养支架；将培养支架浸泡入到适量无水乙醇中，温度设置为45℃，静置30min，再低速搅拌1h，再置于超声处理设备中超声处理5min，取出，继续搅拌3h，冷却，取出细胞培养支架，用无水乙醇浸泡清洗，同理，更换新的无水乙醇，温度设置为45℃，静置30min，再低速搅拌1h，再置于超声处理设备中超声处理5min，取出，继续搅拌3h，冷却，取出细胞培养支架，用无水乙醇浸泡清洗，根据此方法重复操作4次，完成后，置于45℃的真空干燥箱中真空干燥12h，得到造孔后的细胞培养支架；将造孔后的细胞培养支架浸泡到适量的蒸馏水中，温度设置为50℃，浸泡30min，冷却，取出，擦干造孔后的细胞培养支架表面的水，再将其浸入到前面制备好的凝胶混合溶液，温度设置为40℃，先超声处理1min，再继续浸泡1h，冷却，静置1h，取出，置于50℃的真空干燥箱中真空干燥30min，自然冷却，取出，再进入到适量的质量分数为1%的氯化钙水溶液中，先常温浸泡3h，再超声处理1min，再继续常温浸泡10h，完成后，取出，清洗，再置于适量的蒸馏水中，常温浸泡2h，取出，同理，再次将其浸入到质量分数为1%的氯化钙水溶液中，先常温浸泡3h，再超声处理1min，再继续常温浸泡10h，完成后，取出，清洗，再置于适量的蒸馏水中，常温浸泡2h，取出，根据此方法重复3次，完成后，置于50℃的真空干燥箱中真空干燥60min，自然冷却，取出，得到一种新型的三维多孔结构细胞培养支架。
实施例6
采用3D打印设备根据结构模型设计打印出打印孔径为0.8mm的细胞培养支架；将培养支架浸泡入到适量无水乙醇中，温度设置为45℃，静置30min，再低速搅拌1h，再置于超声处理设备中超声处理5min，取出，继续搅拌3h，冷却，取出细胞培养支架，用无水乙醇浸泡清洗，同理，更换新的无水乙醇，温度设置为45℃，静置30min，再低速搅拌1h，再置于超声处理设备中超声处理5min，取出，继续搅拌3h，冷却，取出细胞培养支架，用无水乙醇浸泡清洗，根据此方法重复操作4次，完成后，置于45℃的真空干燥箱中真空干燥12h，得到造孔后的细胞培养支架；将造孔后的细胞培养支架浸泡到适量的蒸馏水中，温度设置为50℃，浸泡30min，冷却，取出，擦干造孔后的细胞培养支架表面的水，再将其浸入到前面制备好的凝胶混合溶液，温度设置为40℃，先超声处理1min，再继续浸泡1h，冷却，静置1h，取出，置于50℃的真空干燥箱中真空干燥30min，自然冷却，取出，再进入到适量的质量分数为1%的氯化钙水溶液中，先常温浸泡3h，再超声处理1min，再继续常温浸泡10h，完成后，取出，清洗，再置于适量的蒸馏水中，常温浸泡2h，取出，同理，再次将其浸入到质量分数为1%的氯化钙水溶液中，先常温浸泡3h，再超声处理1min，再继续常温浸泡10h，完成后，取出，清洗，再置于适量的蒸馏水中，常温浸泡2h，取出，根据此方法重复3次，完成后，置于50℃的真空干燥箱中真空干燥60min，自然冷却，取出，得到一种新型的三维多孔结构细胞培养支架。
实施例7
采用3D打印设备根据结构模型设计打印出打印孔径为1.0mm的细胞培养支架；将培养支架浸泡入到适量无水乙醇中，温度设置为45℃，静置30min，再低速搅拌1h，再置于超声处理设备中超声处理5min，取出，继续搅拌3h，冷却，取出细胞培养支架，用无水乙醇浸泡清洗，同理，更换新的无水乙醇，温度设置为45℃，静置30min，再低速搅拌1h，再置于超声处理设备中超声处理5min，取出，继续搅拌3h，冷却，取出细胞培养支架，用无水乙醇浸泡清洗，根据此方法重复操作4次，完成后，置于45℃的真空干燥箱中真空干燥12h，得到造孔后的细胞培养支架；将造孔后的细胞培养支架浸泡到适量的蒸馏水中，温度设置为50℃，浸泡30min，冷却，取出，擦干造孔后的细胞培养支架表面的水，再将其浸入到前面制备好的凝胶混合溶液，温度设置为40℃，先超声处理1min，再继续浸泡1h，冷却，静置1h，取出，置于50℃的真空干燥箱中真空干燥30min，自然冷却，取出，再进入到适量的质量分数为1%的氯化钙水溶液中，先常温浸泡3h，再超声处理1min，再继续常温浸泡10h，完成后，取出，清洗，再置于适量的蒸馏水中，常温浸泡2h，取出，同理，再次将其浸入到质量分数为1%的氯化钙水溶液中，先常温浸泡3h，再超声处理1min，再继续常温浸泡10h，完成后，取出，清洗，再置于适量的蒸馏水中，常温浸泡2h，取出，根据此方法重复3次，完成后，置于50℃的真空干燥箱中真空干燥60min，自然冷却，取出，得到一种新型的三维多孔结构细胞培养支架。
对比例1
将纯的聚己内酯制备成可打印的3D打印线材，采用3D打印设备根据结构模型设计打印出打印孔径为0.3mm的细胞培养支架。
性能评测：
实施例1-7及对比例1所得到3D打印培养支架样品的评价结果，如表1所示。
表1 实施例与对比例培养支架样品测试结果
Figure 24083DEST_PATH_IMAGE001
。
测试结果：根据实施例1-7的测试结果可以看出，随着打印孔径的增大，接触角先缓慢减少后再快速减少直至为零，在一定的条件下，接触角越小也说明了亲水性越好，而实施例1、2、3、4中接触角随着打印孔径的缓慢增加而缓慢减少，孔径越大，其对水的表面张力也有所减少，而后实施例4、5、6、7中快速减低是因为打印孔径也在快速的增大，在实施例6的时候，打印孔径过大及其培养支架本身就具有较好的亲水性，故此其表面张力不足以支撑起水珠，因此水珠直接浸入到培养支架里面，故此出现接触角为零，实施例7也是与之同理；压缩强度及拉伸强度均随着打印孔径的增大而减少，其中实施例1、2、3的强度都较好；吸水率随着打印孔径的增大先增大后减少，其中实施例2、3的吸水率均在20%以上，表现出较好的吸水作用；在相同的条件下，打印孔径的大小对细胞的平均贴壁率也有一定的影响，随着打印孔径的增加，细胞平均贴壁率先增加后减少，其中实施例2、3、4的贴壁率都达到了90%以上。
而从实施例3和对比例1比较中得出，相同的打印孔径，对比例为纯的聚己内酯制备得到，未经过凝胶修饰等处理，在接触角的对比中，实施例3为19°，对比例1为114°，从对比例1的接触角中可以明显看出其具有明显的疏水性，这也符合聚己内酯的本身属性，而从实施例3中可以明显看出其具有良好的亲水性，且与对比例1相差非常大；从压缩强度和拉伸强度上，实施例3均弱于对比例1，但两者相差不是太明显；从吸水率上看，实施例3（23.4%）的吸水率是对比例1（1.6%）吸水率的14倍之多，也间接的说明了实施例3的亲水性、吸水性和浸润性都要比对比例1好很多；在细胞毒性上，实施例3和对比例1都均为无毒，也符合聚己内酯作为无毒无害的生物降解材料的一个特性，但在细胞平均贴壁率上，实施例3的平均贴壁率为93.4%，对比例1的贴壁率为16.2%，由此也可以明显的看出实施例3具有更好更优异的细胞贴壁效果。
附图中的图2为本发明制备得到的介孔二氧化硅，图3为负载烟酸后的介孔二氧化硅，从二图的对比中可以明显看到，图2具有明显树形或星形孔道阴影，而图3中的孔道则变得模糊，几乎难以明显分辨，且其表面得凹坑等都被填充的相对比较平整，由此也说明了烟酸成功的负载到了介孔二氧化硅中。
附图中的图5为本发明对比例1和实施例3（未造孔）的3D打印培养支架光学电镜图，由图中可以看出对比例1和实施例3（未造孔）所采用3D打印方法制备得到的培养支架的整体外形结构差异极少，其中实施例3的基体复合材料与对比例1的纯聚己内酯打印出来的略显不同，其表面相对粗糙一些，纯聚己内酯打印出来的更平整光滑些；而图6为本发明实施例3中未造孔、已造孔和凝胶修饰的3D打印培养支架光学电镜图，从图中可以明显看到已造孔后的培养支架的基体出现了大量无规的孔道和凹坑，且基体支柱也出现了一些缩放和变形，也使得支架基体变得更加的粗糙，有利于复合材料内部聚丙烯酸钠分子的吸水伸展和外部凝胶的表面修饰，而且从“凝胶修饰”后的图中也可以看出，打印培养支架的有序孔中发生了明显的变化，孔径变小了，孔形变得不规则了，这也说明了凝胶成功的修饰到了培养支架的表面上去。
上述实施例为本发明较佳的实施方式的一部分，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种三维多孔结构细胞培养支架的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）介孔二氧化硅的制备：
将一定量黄原胶加入到水中，控制温度至55-65℃分散溶解，再加入一定量十二烷基二甲基氧化胺，分散均匀，并将体系pH值调节至6.5-7.5，得到模板悬浮乳液；
将所得模板悬浮乳液升温至65-75℃，保持搅拌状态，同时加入一定量正硅酸乙酯，加入完成后继续搅拌反应3-5h，反应过程中保持体系pH值为6.5-7.5，然后进行冷却、过滤、洗涤、干燥得到反应产物，将反应产物置于马弗炉中，先升温至190-210℃处理1.5-2.5h，再进一步升温至780-820℃高温处理4-6h，然后自然冷却至室温，研磨细化，得到介孔二氧化硅；
（2）介孔二氧化硅的氨基化：
将3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷溶解到乙醇-水混合液中，控制温度在55-65℃，在搅拌的条件下加入一定量所述介孔二氧化硅，并将pH值控制在8-10，进行氨基化改性反应3-5h，然后冷却、过滤、洗涤、干燥、研磨细化，得到氨基化介孔二氧化硅；
（3）烟酸的负载：
将一定量烟酸加入到水中，温度控制在85-95℃，充分溶解，得到烟酸溶液；
在搅拌的条件下，将一定量所述氨基化介孔二氧化硅缓慢加入到所述烟酸溶液中，控制温度在85-95℃，搅拌分散10-20min，再进行超声处理15-30min，抽真空使真空压力保持在0.1-0.3MPa的范围内，并继续保持超声处理40-80min，然后停止搅拌、超声和加热，在保持真空压力条件下自然冷却至室温、结晶，并静置1-2h，再重复以上加热、搅拌、超声、抽真空、结晶的操作2-4次，完成多次重结晶后，最后室温密封静置8-24h，过滤，然后依次用0.2-5 wt %的碳酸钠水溶液和蒸馏水洗涤，再进行真空干燥、研磨细化，得到负载烟酸的介孔二氧化硅；
（4）3D打印复合线材的制备：
配备以下重量份计的原料：聚己内酯60-85份、聚乙烯醇缩丁醛5-20份、壳聚糖2-10份、聚丙烯酸钠2-10份和环氧大豆油1-5份，制备3D打印复合线材；
（5）水凝胶制备：
将凝胶物料加入到水中，充分溶解得到凝胶溶液，备用；
在搅拌的条件下，将一定量所述负载烟酸的介孔二氧化硅缓慢加入到凝胶溶液中，分散均匀得到凝胶混合溶液；其中所用负载烟酸的介孔二氧化硅与凝胶溶液的质量比为（1-3）：（10-50）；
（6）细胞培养支架制备：
将所得到的3D打印复合线材根据设计好的结构模型打印出细胞培养支架，将所述细胞培养支架浸泡到适量乙醇中，于40-50℃静置20-40min，再低速搅拌0.5-2h，然后超声处理3-10min，继续搅拌2-4h，取出细胞培养支架并用乙醇清洗，然后更换新的乙醇重复进行多次上述操作，然后将细胞培养支架真空干燥，得到造孔后的细胞培养支架；
将造孔后的细胞培养支架加入适量水中，于40-60℃浸泡20-40min，冷却后取出，将细胞培养支架表面的水去除，浸入到所述凝胶混合溶液中，于35-50℃超声处理30-90秒，再浸泡40-80min，冷却后静置40-80min，取出支架进行真空干燥，冷却后再置于0.5-2wt%的氯化钙水溶液中，先进行常温浸泡2-4h，再进行超声处理30-90秒，再继续常温浸泡8-12h，取出再置于适量的水中常温浸泡2-4h，取出再重复多次进行以上的氯化钙水溶液和水处理操作，完成后进行真空干燥，即得到一种新型的三维多孔结构细胞培养支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：采用浓度0.3-0.8wt%的盐酸或0.3-0.8wt%的氢氧化钠溶液调节pH值。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所用水、黄原胶和十二烷基二甲基氧化胺的质量比为（50-200）：（1-5）：（1-5）；所用正硅酸乙酯与黄原胶和十二烷基二甲基氧化胺质量总和的质量之比为（10-20）：（1-4）。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所用乙醇-水混合液中乙醇与水的质量比为5：1；所用3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷与乙醇-水混合液的质量比为（1-5）：100；所用介孔二氧化硅与3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷溶液的质量比（1-5）：50。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，烟酸溶液中所用烟酸与水的质量比为（1-10）：50；超声处理的同时进行缓慢搅拌，超声处理温度控制85-95℃；所用氨基化介孔二氧化硅与烟酸溶液的质量比为（1-5）：（30-100）。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，所述的聚己内酯分子量为30000-150000，所述的聚乙烯醇缩丁醛分子量为30000-80000；所述的聚丙烯酸钠分子量为10000-50000；所述的壳聚糖分子量为5000-30000。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中采用以下步骤制备3D打印复合线材：
首先，将所述聚己内酯加入到乙酸乙酯中，在75-85℃搅拌分散，使充分溶解；再加入所述聚乙烯醇缩丁醛，在75-85℃继续搅拌分散，使充分溶解并混合均匀；再加入所述环氧大豆油，在75-85℃继续搅拌分散，充分溶解并混合均匀，得到基体混合液；其中，聚己内酯与乙酸乙酯的质量比为（1-3）：（2-10）；
其次，将所述壳聚糖加入pH值为5-7的乙酸水溶液中，充分溶解、分散均匀，再加入所述聚丙烯酸钠，在55-65℃充分溶解、分散均匀，然后浓缩、干燥，研磨成复合粉末；其中，所用壳聚糖与乙酸水溶液的质量比为1：40-60；
然后，将所述复合粉末加入到所述基体混合液中，分散均匀，得到复合材料混合液；再将复合材料混合液真空干燥，切粒，真空干燥，得到复合材料粒子，将所得复合材料粒子熔融挤出，得到3D打印复合线材。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：熔融挤出所用单螺杆挤出机的温度设置为：一段90-110℃、二段95-120℃、三段90-115℃、机头段90-110℃，螺杆挤出速度为20-30rpm，冷却：前段为10-15℃的循环水冷却、后段为16℃以下的风冷，干燥为50℃的吹风干燥。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（5）中，凝胶物料与水的质量之比为（1-5）：（20-50），凝胶物料包括海藻酸钠和丙烯酸钠，二者质量比为（3-10）：（1-3）。
10.权利要求1-9任一项所述制备方法所得三维多孔结构细胞培养支架在细胞培养或骨损修复中的应用。
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