CN115210374B - 用于在样品制备期间搅拌流体的改进的涡旋产生器 - Google Patents

Abstract

公开了一种用于自动化细胞裂解以及核酸纯化和处理的设备、涡旋产生器组件和方法。涡旋产生器组件包括样品保持器，该样品保持器具有裂解孔、至少一个洗涤孔、和洗脱孔。涡旋产生器组件还包括样品保持器盖，该样品保持器盖具有多个振动棒以用于在样品保持器的孔中产生涡旋。设备包括马达，该马达操作旋转凸轮以引起振动棒振动并在保持流体和磁珠的孔中产生涡旋，其中，涡旋速度足以克服磁珠之间的磁吸引力并将磁珠分散在溶液中，以收集核酸，诸如DNA。

Description

用于在样品制备期间搅拌流体的改进的涡旋产生器

技术领域

本文的公开内容总体上涉及细胞裂解以及核酸纯化和分离的领域。更特别地，本公开内容涉及一种多孔样品保持器和具有振动棒的盖，其在分子诊断中的核酸提取领域中具有实用性。

背景技术

在针对使用磁珠进行细胞裂解和核酸分离的一些实验方案（protocol）中，通过移液管系统将样品与细胞裂解缓冲液和一定量的磁珠一起移动到多孔板内的孔、或样品保持器。磁珠被功能化，例如用二氧化硅表面功能化，以允许核酸分子（诸如，DNA）的选择性结合。重复一连串外部振动混合、磁珠分离、上清液抽吸和稀释/洗涤步骤。这些可在同一个孔中执行，或者可针对各种步骤孔到孔地移动磁珠。也可采用加热样品保持器的孔中的一个或多个孔来促进裂解和/或结合。样品转移、洗涤和洗脱步骤需要单独的抽吸和分配末端，以避免交叉污染。

在容纳于孔内的样品流体中使用磁珠以从样本中捕获和提取核酸需要磁性装置作为完成工作流程的工具。可在插入到孔中的探针内部使用磁体，以在转移到另一个孔之前收集磁珠。也可在孔外部使用磁体来操纵磁珠。通过磁运动和摇动孔本身以及通过涡旋混合来操纵流体中的磁体也是已知的。

有效混合在用于样品制备的细胞裂解和洗涤步骤中至关重要，以确保从样品中提取足够数量和质量的核酸。涡旋混合是最有效的混合技术之一，但在没有庞大设置的情况下，难以在小体积中产生涡旋。

在分子诊断领域中，对于用于裂解细胞和纯化样品以进行扩增子检测的高效且成本有效的系统和方法存在需求。进一步对于在多个处理步骤中混合磁珠存在需求，混合磁珠使液体处理、污染和试剂携带减少到最低程度。

发明内容

公开了一种用于使用磁性摆动和机械摆动两者从样本中提取核酸以提高混合的速度和效率的系统和方法。多孔样品保持器中的涡旋产生由振动棒执行。附接至悬臂并插入到孔中的振动棒可在具有小体积的流体的非常有限的空间中产生高速涡旋。驱动单元或摆动源是与悬臂上的突片相互作用的旋转凸轮（或非圆形轮廓动作，诸如旋转正齿轮）。在实施例中，振动棒方法不振动容器或管，而是简单地利用棒的振动将摆动能量直接转移到流体，使得在非常小的有限空间中产生高速涡旋。而且，用于靶核酸提取的磁珠可利用棒振动进行物理搅拌，从而导致在真实生物样品（即，全血）中较少的聚集。可使用在样品保持器外部的磁性体使磁珠和相关联的核酸分子在孔之间移动。

可轻松灵活地组装样品保持器和盖。样品保持器是孔的阵列，在处理和孔到孔地移动期间所述孔保持流体和磁珠。样品保持器盖是对应于部分或全部孔的振动棒的阵列。

附图说明

下文参考附图详细描述所公开技术的图示性实施例，附图通过引用并入本文，并且其中：

图1是根据本公开内容的样品裂解和核酸提取设备的透视图。

图2是根据本公开内容的涡旋产生器组件的样品保持器的透视图。

图3A是根据本公开内容的涡旋产生器组件的样品保持器盖的透视图。

图3B是根据本公开内容的图3A的样品保持器盖的底部透视图。

图4A是根据本公开内容的涡旋产生器组件的底部透视图。

图4B是图4A的一部分的详细视图。

图5是根据本公开内容的涡旋产生器组件的截面图。

图6是图示根据本公开内容的使用具有涡旋产生器组件的样品裂解和核酸提取设备的方法的流程图。

具体实施方式

本文公开了一种用于从生物样品中提取核酸（诸如DNA分子）的设备。使用目前公开和描述的设备使得能够以特别适合于自动化样品制备技术的方式在孔之间进行磁珠的简化的、容易的和可靠的混合和转移。在实施例中，磁珠可以是具有表面改性的磁性微米或纳米颗粒，该表面改性结合在生物样本的样品制备过程期间释放的靶核酸。在本文所描述的系统和方法中，磁场是样品和/或磁珠处理和运输的唯一驱动力。消除了液体处理，从而使交叉污染和液体携带减少到最低程度。使用单个模块沿着消耗性样品保持器的内部塑料表面拖动磁珠来在消耗性样品保持器内孔到孔地转移磁珠，从而提供改进的清洁和干燥。在另外的实施例中，消耗性样品保持器是独立的，不需要清洁该系统的其他部件，由此使生物危害暴露减少到最低程度。

图1图示了根据本公开内容的用于从样本中提取核酸的设备100的示例性实施例。设备100包括总体上以102、104、106和108指示的基部。基部102用于将涡旋产生器组件110与加热块106和108一起保持在适当位置。在图1的实施例中，第二涡旋产生器组件112通过加热块106和加热块104保持在适当位置。加热块104、106和108各自包括用于接收裂解孔的腔部114和用于接收涡旋产生器组件110或112的洗脱孔的腔部116，参考图2对它们进行更详细的讨论。如图1中所示，加热块104的腔部114是空的，但可接收第三涡旋产生器组件的裂解孔。在下文所描述的步进马达的运动范围内，可按顺序连接任何数量的涡旋产生器组件。

设备100还包括步进马达118。对马达118的选择性致动引起旋转凸轮120旋转并将旋转运动转变为振动棒122的线性运动。在示例性实施例中，旋转凸轮以大约5 Hz至20 kHz旋转。旋转凸轮120和振动棒122之间的接触角也可进行微调以优化孔内的涡旋。水平致动器（未示出）沿着由轴线130限定的x轴移动马达118，从而在样品处理期间沿着涡旋产生器组件110和112重新定位马达118。马达118还可包括用于沿着z轴移动马达118的竖直致动器。

另外，设备100可包括在涡旋产生器组件110和112外部的磁体124，该磁体可由步进马达126沿所有三个x、y和z轴选择性地平移。磁体124可沿着x轴沿着涡旋产生器组件110、112移动，沿着由轴线130限定的y轴更靠近和更远离容器的侧壁移动，以便分别吸引和释放设置在容器内的磁珠，并且沿着z轴竖直地移动，如随后将讨论的。马达118和126的操作和摆动可针对优化和不同的操作模式而为同步的或单独的。

涡旋产生器组件110、112的实施例在图2至图4中示出。涡旋产生器组件也可称为多孔板或样品保持器，以与样品保持器盖一起用于细胞裂解和核苷酸纯化。图2图示了根据本公开内容的样品保持器200的实施例，该样品保持器具有本体构件和从本体构件的底板沿向下方向延伸的多个孔。在该实施例中，本体构件是通道202，并且处理孔（processwell）包括裂解孔204、洗涤孔206、208、210、212、214和洗脱孔216。通道202可帮助抑制工作流体的意外流出样品保持器200。

裂解孔204设置在样品保持器200的第一端201处，而洗涤孔设置在第一端和相对的第二端203（洗脱孔216位于该第二端处）中间。每个孔从通道202的底板沿基本上正交的方向延伸，并且具有经由通道底板中的孔口与通道连通的内部体积。所图示的孔口是圆形的并且与底板表面共面，不过还设想具有不同形状和取向的实施例。孔口也沿着底板表面基本上共线并且以样品保持器的纵向对称轴线218为中心。

为了优化涡旋产生，裂解孔204可具有比洗涤孔大的体积，以便为生物样品、裂解缓冲液和磁珠提供足够的空间。相反，洗脱孔216可具有比洗涤孔小的体积，以便使对最终核酸产物的稀释减少到最低程度，并且可以以锥形截面为特征以促进用移液器或用于转移流体的其他装置取出产物。

样品保持器200的裂解孔204可经受加热，具体取决于用其实施的裂解过程的特性。例如，裂解孔204的下段（lower extent）的外表面可被构造成被接收于在整体结构外部的加热器内。这种加热器可以是放置在保持器下方的加热块108，其将裂解孔204的下段的外表面接收在腔部114内并且将裂解孔204加热所需的或期望的时间段。类似地，样品保持器200的洗脱孔216可用在整体结构外部的另一个加热器（诸如，加热块106的腔部116）来加热，具体取决于用其实施的洗脱过程。加热块可提供高达大约120°C的温度。

在一个实施例中，孔预先填充有适当的缓冲液和其他组分，且然后密封住，例如利用在使用的时候移除的剥离层。在另一个实施例中，孔各自具有逐渐变细的下段。这使得多个样品保持器能够竖直地堆叠，由此第一保持器的裂解孔的外表面被接收在下面的第二保持器的裂解孔内。类似地，第一保持器的洗涤孔的外表面各自被接收在下面的第二保持器的相应洗涤孔内。

样品保持器200可设置有保持特征，诸如从通道202的上边沿突出的突片220或在样品保持器200任一侧上从样品保持器延伸的其他侧向突出部。在诸如加热和涡旋产生之类的过程期间，当外部装置相对于样品保持器200移动时，保持特征可由外部可释放的夹持机构选择性地接合，由此将多孔板相对于外部装置保持在固定位置中。在将样品、缓冲液、磁珠或其他组分引入孔中期间或在移液系统向下按压在洗脱孔216的内表面上时洗脱产物取回期间，保持特征也可以是有用的。替代地，样品保持器200以及相关联的加热块和支撑结构（即，基部102）可被构造成相对于马达118和126侧向水平平移，因此消除了使转子混合器和相关联部件能够水平平移的需求。

在实施例中，样品保持器200可在单件中处理从1500到3 μL的宽范围的流体量，因为生物样本的样品制备过程可在来自全血、血浆、血清、粪便、尿液、痰液、拭子的不同基质当中广泛变化。样品保持器200提供了覆盖所有那些但不限于上述样本类型的灵活性。在实施例中，样品保持器200可在一个聚合物模制件中包括七个隔室，聚合物选自例如聚丙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、环烯烃共聚物、聚碳酸酯或聚丙烯酸酯。

在实施例中，对于利用不同填充液体的不同应用，样品保持器200中的孔的体积大小的范围为从1.5至2.0 mL到50至200 μL。这些隔室能够利用不同的编程被指派给裂解、孵育、洗涤、干燥和提取功能。

图3A图示了在实施例中用于与图2的样品保持器200一起使用的样品保持器盖300。样品保持器盖300包括被大小和形状确定为用于插入到通道202中的基部构件302。基部构件302可以以多种方式保持在通道202内。它可被大小确定为以摩擦配合适贴地配合到通道202中，它可卡入通道202中，或者它可使用一个或多个夹子与通道202保持在一起。在实施例中，基部构件302包括从基部构件302沿向下方向延伸的多个振动棒304、306。如图3A中所示，振动棒304对应于样品保持器200的洗涤孔206、208、210、212和214，然而，可提供任何数量的振动棒。振动棒306旨在用于插入到裂解孔204中，且因此按比例大于振动棒304，正如裂解孔204按比例大于洗涤孔206-214一样。振动棒304、306定位在基部构件302上，以便当基部构件302插入到通道202中时在相应孔的内部体积中大致居中。

以308指示的突片对应于每个振动棒304、306，并且结合图1的旋转凸轮120用于引起振动棒304、306振动。突片308相对于振动棒304、306从基部构件302沿向上方向延伸。突片308还延伸到基部构件302的边沿310之上以与旋转凸轮120接合。在实施例中，突片308可凹陷到边沿310之下，并且旋转凸轮120可定位成略微向下延伸到盖300中以与突片308接合。

图3B示出了样品保持器盖300的底部透视图。每个振动棒304在悬臂312的一端处附接至基部构件302。突片308位于每个悬臂312的相对侧上，如图3A中所示。通过控制旋转凸轮120，悬臂312允许振动棒304以可选择的速度和持续时间振动。

图4A示出了经组合以形成涡旋产生器组件110、112的样品保持器200和样品保持器盖300的一部分的底部透视图。图4B中示出了更加详细的视图400。

图4B示出了涡旋产生器组件110的特写仰视图。样品保持器200被透明地示出，因此可图示样品保持器盖300的细节。样品保持器盖300已插入到样品保持器中并使用卡扣机构402保持就位。机构402被描绘为样品保持器盖300上的突片，其插入并保持在样品保持器200上的槽中，但可使用其他机构和设计。还设想用于将样品保持器盖保持在样品保持器中的其他机构。

振动棒404附接至悬臂406，该悬臂已通过切除口区域408和410由基部构件302的底板形成。在实施例中，切除口区域412允许以较少的能量损失执行从旋转凸轮120通过突片308到振动棒404的摆动/振动。它还可提供用于液体分配和抽吸的通路（access）。切除口区域408、410和412产生悬臂406，该悬臂能够响应旋转凸轮120与突片308的接合而上下摆动。如上文参考图1和图3所解释的，来自旋转凸轮120运动的摆动驱动力与悬臂406的相对侧上的突片308（在该视图中不可见）接合，这导致棒端414处发生振动，如由运动箭头416所示的。振动棒404的设计引起振动能量直接转移到样品保持器200中的流体，从而在样品保持器200中的流体中产生涡旋418。进一步地，棒的尺寸允许在非常有限且小的体积中产生涡旋。

棒404沿着它的从基部构件延伸到其末端（如棒端414处所示）的长度具有不对称的截面。在棒端414的任一侧上的凸缘420和422改善了涡旋418的产生。虽然已示出了代表性截面和凸缘布置，但这是出于图示的目的，并且设想振动棒404的其他设计。振动棒的形状和尺寸可针对不同的流体和混合方法进行定制，而无需改变整个系统。

图5示出了涡旋产生器组件，其中样品保持器盖300插入于样品保持器200中。裂解孔204以截面示出，以图示振动棒404和突片308的位置。旋转凸轮120与突片308接合以将振动赋予给振动棒404。当步进马达118在相邻的突片之间移动时，旋转凸轮120与相邻的振动棒接合。由于振动棒404的悬臂附接，所以振动棒404的振动运动将在棒端414处最大。这可在一些类型的样品流体中提供改进的流体处理和较少的聚集。可通过控制旋转凸轮120的旋转速率和长度来提供涡旋混合的进一步定制。

参考图1，现在将描述设备100的操作。步进马达118引起旋转凸轮120旋转并将旋转运动转变为振动棒122的线性运动。水平致动器（未示出）在样品处理期间沿着涡旋产生器组件110和112重新定位马达118。步进马达126包括致动器，这些致动器用于沿三个方向移动磁体124：水平地沿着x轴移动磁体124以沿着涡旋产生器组件110重新定位磁体124、水平地沿着y轴从更靠近和更远离组件110的位置移动磁体124、以及竖直地沿着z轴移动磁体124。可独立地控制马达118和126，使得磁性摆动和机械摆动两者都可用于混合和操纵样品保持器中的磁珠和流体。

图6是操作设备100的部件的方法的流程图。并非所有步骤都需要按下文所描述的顺序实践，也无需利用全部步骤，具体取决于实施例。

步骤602包括将样品、磁珠和其他流体或缓冲液放置在样品保持器200中。在步骤602的示例中，一种或多种洗涤缓冲液被装载到洗涤孔206、208、210、212、214中，洗脱缓冲液被装载到洗脱孔216中，并且裂解缓冲液被装载到裂解孔204中。磁珠也被引入裂解孔204中。在一个示例中，可优化磁珠的材料以用于从血液样品中提取基因组DNA，但是它的组成可变化以适合其他类型的体液或组织或者用于提取其他类型的核酸，诸如RNA。然后，生物样品被装载到裂解孔中，从而获得准备好用于涡旋产生的裂解混合物。典型的样品包括血液、痰液、毛发和其他体液和组织，可选地例如通过冷冻、均质化或研磨进行预处理。本领域技术人员将认识到，缓冲液和其他反应物的选择可根据样品的类型和磁珠而变化，以提供用于核酸提取的最佳条件。虽然该图示的过程描绘了装载裂解孔以形成裂解混合物的特定顺序，但是可采用其他顺序，诸如在添加磁珠之前将样品设置到裂解孔中。例如，在实施例中，样品保持器200可预先装载有流体或者可用移液器系统来添加这些流体。

步骤604包括将样品保持器盖300安装在样品保持器200上。在步骤604的示例中，样品保持器盖300可被卡入或以其他方式牢固地保持在样品保持器200中。

步骤606包括将旋转凸轮120移动到样品保持器200的裂解孔204上面的位置中。在步骤606的示例中，旋转凸轮120定位成使得其将与插入到裂解孔204中的振动棒306的突片308接触。

步骤608包括将旋转凸轮120操作选定的时间段以在裂解孔204中引起涡旋。在步骤608的示例中，用于旋转的旋转速度和时间长度两者都是可选择的，具体取决于被混合的样品，并且混合可连续地抑或间歇地执行。对于涡旋产生步骤的至少一部分，旋转凸轮120以足以克服磁珠之间的吸引力的速率旋转，由此释放磁珠以绕裂解混合物打旋并在细胞裂解后结合到分散在裂解混合物中的核酸分子。在示例性实施例中，旋转凸轮以大约5 Hz至20 kHz旋转。在实施例中，磁体124也可沿着x、y或z轴中的任一者与旋转凸轮120协同地移动，以促进涡旋产生和混合。

步骤610包括致动磁体124以将磁珠和相关联的核酸移动到相邻孔。在步骤610的示例中，磁体124由马达126移动到与裂解孔204的侧壁相邻的位置中，以便吸引设置在孔内的磁珠。然后，致动马达126以沿着运动箭头128将磁体124竖直地移动到裂解孔204的孔口，水平地跨越通道202的底板到达相邻的洗涤孔206，然后竖直地向下进入洗涤孔206中。然后，磁体124可沿着y轴水平地移动以将磁珠释放到孔206中的洗涤流体中。在实施例中，通道202的底板低于样品保持器盖300的基部构件302的底板，使得磁珠可在样品保持器200中孔到孔地移动，而没有来自样品保持器盖的干扰。

步骤612包括沿着x轴将旋转凸轮水平地移动到突片308，该突片连接至插入到洗涤孔206中的振动棒304。在步骤614中，重复步骤608-612，直到到达涡旋产生器组件110、112的最后一个孔。在样品保持器200的每个孔中，可实施类似于在裂解孔204内执行的过程的过程。在已完成期望数量的洗涤步骤之后，致动磁体124以将磁珠移动到样品保持器200的洗脱孔216中，在该洗脱孔中，核酸从磁珠洗脱到洗脱缓冲液中。

如所预期的，可在所图示的使裂解孔204的内容物产生涡旋的步骤608之前或期间加热该裂解孔的内容物。在步骤610中移除磁珠之后，可通过移液系统抽吸裂解孔和洗涤孔中的液体残余物并将其分配到废物接收器中。在实施例中，这可通过移除样品保持器盖300或通过图4B的切除口区域412来完成。类似地，洗脱孔216可在取出最终核苷酸产物溶液之前的任何时间经历加热。

上文所描述的实施例具有几个优点。本系统利用驱动源的容易微调的速度和低成本组件，在有限且小的体积中提供了改进的涡旋产生。由于有效混合对于qPCR的样品制备至关重要，因此该混合发明能够导致PCR化验的时间、效率、吞吐量和质量的显著改进。振动源是连接至凸轮轴的简单马达。这允许速度选择的灵活性和成本节约。一个驱动源有利于驱动不同位置中的涡旋混合。

进一步地，具有呈阵列的多个振动棒的涡旋产生器组件具有低的生产成本，并且容易通过稍微改变棒的形状和尺寸来修改和优化涡旋产生。在实施例中，上文所使用的设备和方法可并入在高吞吐量液体处理机器人中，使得可同时搅拌具有例如96、192、384个孔的板上的每个孔。这可降低使用一次性移液器末端进行液体上下处理的多个批次的成本，并且具有更好且更快的混合。多个吞吐量只需要单个机械摆动源。在另一个实施例中，可使用多个机械摆动源。

在实施例中，如本文所描述的系统和方法可在有磁珠或没有磁珠的情况下使用。通过对磁性和机械驱动单元的同步运动进行编程，可实现具有最少等待时间操作的高速处理。加热元件可与如上文所描述的混合、孵育和磁珠处理步骤结合使用。可单独选择的温度设定、混合强度、速度和磁珠处理允许根据各种应用和条件进行定制。

根据上文包含的教导，本领域技术人员能够对本文所描述和图示的部分和步骤的细节、材料和布置作出许多改变。将理解，某些特征和子组合是实用的，并且可在不参考其他特征和子组合的情况下使用，并且被设想为在权利要求的范围内。因此，将理解，以下权利要求将不限于本文所公开的实施例，并且能够包括除了那些具体描述的实践之外的实践，并且将在法律允许的范围内被广义地解释。附加地，各个附图中列出的所有步骤并非都需要按所描述的特定顺序来实施。

Claims (7)

1.一种样品裂解和核酸提取设备，其包括：

(i)涡旋产生器组件，所述涡旋产生器组件包括：

样品保持器，其包括形成从所述样品保持器的第一端延伸到相对的第二端的通道的本体构件，所述样品保持器还包括从所述通道的底板沿向下方向延伸的多个孔，每个孔具有内部体积；以及

样品保持器盖，其包括基部构件，所述基部构件包括：底板，其从所述样品保持器盖的第一端延伸到相对端；以及多个振动棒，当所述基部构件插入到所述通道中时，所述多个振动棒从所述基部构件的底板沿向下方向延伸到所述多个孔中的对应一个的所述内部体积中；

(ii)用于保持所述涡旋产生器组件的基部，

(iii)旋转凸轮，其附接至马达并且被构造成将振动运动赋予给所述多个振动棒中的一个或多个；以及

(iv)水平致动器，其附接至所述马达并且被构造成在相邻的棒之间选择性地赋予所述马达的水平运动。

2.根据权利要求1所述的设备，其还包括马达，所述马达被构造成选择性地使磁体水平地移动成更靠近和更远离与所述涡旋产生器组件相邻的第一位置、以及选择性地赋予所述磁体沿着样品保持器孔的表面的竖直运动。

3.根据权利要求2所述的设备，其中，所述马达还被构造成赋予所述磁体沿着所述样品保持器的表面在相邻的孔之间的水平运动。

4.根据权利要求3所述的设备，其中，所述多个孔还包括裂解孔、至少一个洗涤孔、和洗脱孔。

5.根据权利要求4所述的设备，其还包括被构造成加热所述涡旋产生器组件的所述裂解孔的裂解孔加热块。

6.根据权利要求4所述的设备，其还包括被构造成加热所述涡旋产生器组件的所述洗脱孔的洗脱孔加热块。

7.一种用于从生物样品中分离核酸的系统，所述系统包括：根据权利要求1所述的设备，其中，所述样品保持器的所述多个孔包括裂解孔、至少一个洗涤孔、和洗脱孔；以及所述样品保持器盖包括插入到所述样品保持器的所述多个孔中的至少一个中的多个振动棒。