CN115209905A - 用于提高耐药性呼吸道细菌的易感性并降低其抗生素耐药性的外源性一氧化氮 - Google Patents

用于提高耐药性呼吸道细菌的易感性并降低其抗生素耐药性的外源性一氧化氮 Download PDF

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Abstract

公开了针对广泛的细菌和铜绿假单胞菌生物膜的抗微生物组合物和调配物。在一方面，所述组合物和所述调配物不会产生耐药性。在一方面，所述组合物和所述调配物与抗生素组合减缓了抗生素耐药性的发展并且极大地提高了细菌对多类抗生素的易感性。

Description

用于提高耐药性呼吸道细菌的易感性并降低其抗生素耐药性 的外源性一氧化氮
相关申请的交叉引用
本申请要求分别于2020年2月14日和2020年12月15日提交的美国临时专利申请第62/976,738号和第63/125,865号的优先权和权益，所述美国临时专利申请出于所有目的特此通过引用整体并入。
技术领域
本公开涉及针对广泛的细菌和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生物膜而不会产生耐药性的抗微生物组合物和调配物。本公开进一步涉及在与抗生素组合时减缓抗生素耐药性的发展并极大地提高细菌对多类抗生素的易感性的抗微生物组合物和调配物。
ESKAPE病原体(粪肠球菌(Enterococcus faecium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、铜绿假单胞菌和肠杆菌(Enterobacter spp.))能够“逃脱”抗生素作用，通常具有多药耐药性(MDR)，并且是世界范围内医院感染的主要原因[Santajit,S.和Indrawattana,N.ESKAPE病原体的抗微生物剂耐药性机制(Mechanisms ofAntimicrobial Resistance in ESKAPE Pathogens).《国际生物医学研究(BiomedRes.Int.)》2016,1-8(2016)；Ciofu,O.和Tolker-Nielsen,T.铜绿假单胞菌生物膜对抗微生物剂的耐受性和耐药性——铜绿假单胞菌如何逃避抗生素(Tolerance and Resistanceof Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents—How P.aeruginosaCan Escape Antibiotics).《微生物学前沿(Front.Microbiol.)》10,913(2019)；Mulani,M.S.,Kamble,E.E.,Kumkar,S.N.,Tawre,M.S.和Pardesi,K.R.抗微生物剂耐药性时代抗击ESKAPE病原体的新策略：综述(Emerging Strategies to Combat ESKAPE Pathogens inthe Era of Antimicrobial Resistance:A Review).《微生物学前沿》10,(2019)]。呼吸道感染通常包含ESKAPE病原体，如铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，它们具有高突变性和内在耐药性[Ciofu,O.和Tolker-Nielsen,T.铜绿假单胞菌生物膜对抗微生物剂的耐受性和耐药性——铜绿假单胞菌如何逃避抗生素.《微生物学前沿》10,913(2019)；Davies,E.V.,James,C.E.,Brockhurst,M.A.和Winstanley,C.人工痰液模型中铜绿假单胞菌的进化多样性(Evolutionary diversification of Pseudomonas aeruginosa in an artificialsputum model).《BMC微生物学(BMC Microbiol.)》17,3(2017)；Fernández-Barat,L.等人经过2周的抗假单胞菌治疗后，来自囊性纤维化肺的铜绿假单胞菌群体的表型转变(Phenotypic shift in Pseudomonas aeruginosa populations from cystic fibrosislungs after 2-week antipseudomonal treatment).《囊性纤维化杂志(J.Cyst.Fibros.)》16,222-229(2017)]。另外，这些病原体形成被气道粘液保护的生物膜，在所述气道粘液处，抗生素部分由于扩散差和生物活性低而失去其功效[Davies,E.V.,James,C.E.,Brockhurst,M.A.和Winstanley,C.人工痰液模型中铜绿假单胞菌的进化多样性.《BMC微生物学》17,3(2017)；Caraher,E.M.等人当浮游培养或作为生物膜培养囊性纤维化病原体洋葱伯克霍尔德菌群时，重组人乳铁蛋白对其生长和抗生素易感性的影响(Theeffect of recombinant human lactoferrin on growth and the antibioticsusceptibility of the cystic fibrosis pathogen Burkholderia cepacia complexwhen cultured planktonically or as biofilms).《抗菌剂与化疗杂志(JAntimicrob.Chemother.)》60,546-554(2007)；Cullen,L.和McClean,S.慢性呼吸道感染期间细菌的适应性(Bacterial adaptation during chronic respiratory infections).《病原体(Pathogens)》4,66-89(2015)；Müller,L.等人人类气道粘液改变铜绿假单胞菌生物膜对妥布霉素的易感性，但不改变对粘菌素的易感性(Human airway mucus alterssusceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms to tobramycin,but notcolistin).《抗菌剂与化疗杂志》73,2762-2769(2018)；Mendelman,P.M.等人囊性纤维化痰液中氨基糖苷类的渗透、失活和功效(Aminoglycoside penetration,inactivation,andefficacy in cystic fibrosis sputum).《美国呼吸道疾病评论(Am.Rev.Respir.Dis.)》132,761-765(1985)]。一氧化氮(NO)是一种参与免疫应答的内源产生的自由基物质，先前已被证明可降低气道粘液粘度，并对几种ESKAPE病原体发挥广谱抗菌和抗生物膜作用[Reighard,K.P.,Hill,D.B.,Dixon,G.A.,Worley,B.V.和Schoenfisch,M.H.使用释放一氧化氮的壳寡糖对铜绿假单胞菌生物膜的破坏和根除(Disruption and eradication ofP.aeruginosa biofilms using nitric oxide-releasing chitosanoligosaccharides).《生物结垢(Biofouling)》31,775-87(2015)；Ahonen,M.J.R.,Hill,D.B.和Schoenfisch,M.H.作为粘液溶解剂的释放一氧化氮的藻酸盐(Nitric oxide-releasing alginates as mucolytic agents).《ACS生物材料科学与工程(ACSBiomater.Sci.Eng.)》5,3409-3418(2019)；Schairer,D.O.,Chouake,J.S.,Nosanchuk,J.D.和Friedman,A.J.一氧化氮释放疗法作为抗微生物剂的潜力(The potential ofnitric oxide releasing therapies as antimicrobial agents).《毒力(Virulence)》3,271-279(2012)；Hetrick,E.M.等人释放一氧化氮的二氧化硅纳米颗粒的杀菌功效(Bactericidal efficacy of nitric oxide-releasing silica nanoparticles).《ACS纳米(ACS Nano)》2,235-246(2008)]。
本文描述了这一技术问题的解决方案。
发明内容
细菌的抗生素耐药性是一个主要的全球性威胁，并且是医疗护理相关发病率和死亡率的主要原因[Friedman,N.D.,Temkin,E.和Carmeli,Y.抗生素耐药性的负面影响(Thenegative impact of antibiotic resistance).《临床微生物学与传染(Clin.Microbiol.Infect.)》22,416-422(2016)；Ragheb,M.N.等人抑制抗生素耐药性的演变(Inhibiting the Evolution of Antibiotic Resistance).《分子细胞(Mol.Cell)》73,157-165.e5(2019)]。据美国疾病控制中心称，到2050年，耐药性感染预计将导致1000万人死亡[疾病控制中心.2013年美国的抗生素耐药性威胁(Centers for DiseaseControl.Antibiotic Resistance Threats in the United States,2013).《美国的抗生素耐药性威胁(Antibiotic Resistant Threats in the United States)》(2013)]。耐药性呼吸道感染特别难以治疗，因为它们在气道粘液内形成保护性生物膜并且可以存活数十年[Kovach,K.等人感染囊性纤维化肺的生物膜的进化适应性通过调节多糖产生来促进机械韧性(Evolutionary adaptations of biofilms infecting cystic fibrosis lungspromote mechanical toughness by adjusting polysaccharide production).《npj生物膜和微生物组(npj Biofilms Microbiomes)》3,(2017)]。迫切需要能够完全根除耐药性感染(甚至是下气道深处的感染)的新型抗微生物剂，以及用于对抗抗生素耐药性细菌增加的策略。在这里，本申请人证明了一氧化氮表现为广谱抗微生物剂并提高了抗生素功效。单独使用时，一氧化氮杀死了广泛的细菌和铜绿假单胞菌生物膜，而不会产生耐药性。与抗生素组合，一氧化氮减缓了抗生素耐药性的发展，并极大地改善了细菌对多类抗生素的易感性。目前市场上没有一种抗微生物剂将广谱抗微生物功效、生物膜杀灭、与常规抗生素协同作用以及增加抗生素易感性组合在“一体化(all-in-one)”疗法中。如本文所描述的，一氧化氮与抗生素的组合使用可以根除众多耐抗生素感染，甚至是那些受病态气道保护的感染。
设想了以下实施例。
实施例1.一种增加微生物对至少一种抗生素的易感性的方法，所述方法包括：使所述微生物与释放一氧化氮的壳寡糖(COS/NO)接触一定时间段，并且使所述微生物与所述至少一种抗生素接触。所述接触可以是同时的、顺序的或其组合。
实施例2.根据实施例1所述的方法，其中所述微生物选自由以下组成的属：肠球菌属(Enterococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)和肠杆菌属(Enterobacter)。
实施例3.根据实施例1所述的方法，其中所述微生物选自由以下组成的组：粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷白氏杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌。
实施例4.根据实施例1至3中任一项所述的方法，其中所述COS/NO：具有相对于所述微生物的最小抑制浓度(MIC)；并且以选自以下的量提供：约0.1至约4MIC、约0.2至约4MIC、约0.25至约4MIC、约0.3至约4MIC、约0.4至约4MIC、约0.5至约4MIC、约0.6至约4MIC、约0.7至约4MIC、约0.75至约4MIC、约0.8至约4MIC、约0.9至约4MIC、约1至约4MIC、约2至约4MIC、约3至约4MIC、约0.1至约3MIC、约0.1至约2MIC、约0.1至约1MIC、约0.1至约0.9MIC、约0.1至约0.8MIC、约0.1至约0.75MIC、约0.1至约0.7MIC、约0.1至约0.6MIC、约0.1至约0.5MIC、约0.1至约0.4MIC、约0.1至约0.3MIC、约0.1至约0.25MIC、约0.1至约0.2MIC、约0.1MIC、约0.2MIC、约0.25MIC、约0.3MIC、约0.4MIC、约0.5MIC、约0.6MIC、约0.7MIC、约0.75MIC、约0.8MIC、约0.9MIC、约1MIC、约2MIC、约3MIC和约4MIC。
实施例5.根据实施例1到4中任一项所述的方法，其中所述至少一种抗生素：具有相对于所述微生物的最小抑制浓度(MIC)；并且以选自以下的量提供：约0.1至约4MIC、约0.2至约4MIC、约0.25至约4MIC、约0.3至约4MIC、约0.4至约4MIC、约0.5至约4MIC、约0.6至约4MIC、约0.7至约4MIC、约0.75至约4MIC、约0.8至约4MIC、约0.9至约4MIC、约1至约4MIC、约2至约4MIC、约3至约4MIC、约0.1至约3MIC、约0.1至约2MIC、约0.1至约1MIC、约0.1至约0.9MIC、约0.1至约0.8MIC、约0.1至约0.75MIC、约0.1至约0.7MIC、约0.1至约0.6MIC、约0.1至约0.5MIC、约0.1至约0.4MIC、约0.1至约0.3MIC、约0.1至约0.25MIC、约0.1至约0.2MIC、约0.1MIC、约0.2MIC、约0.25MIC、约0.3MIC、约0.4MIC、约0.5MIC、约0.6MIC、约0.7MIC、约0.75MIC、约0.8MIC、约0.9MIC、约1MIC、约2MIC、约3MIC和约4MIC。
实施例6.根据实施例1至5中任一项所述的方法，其中所述时间段选自由以下组成的组：至少0.25小时、至少0.5小时、至少0.75小时、至少1小时、至少1.25小时、至少1.5小时、至少1.75小时、至少2小时、至少2.25小时、至少2.5小时、至少2.75小时、至少3小时、至少3.25小时、至少3.5小时、至少3.75小时、至少4小时、至少4.25小时、至少4.5小时、至少4.75小时、至少5小时、至少5.25小时、至少5.5小时、至少5.75小时、至少6小时、至少6.25小时、至少6.5小时、至少6.75小时、至少7小时、至少7.25小时、至少7.5小时、至少7.75小时和至少8小时。
实施例7.根据实施例1至6中任一项所述的方法，其中所述易感性增加是与单独接触所述COS/NO或单独接触所述至少一种抗生素相比，在所述与所述COS/NO接触一定时间段并且随后与所述至少一种抗生素接触之后，所述至少一种微生物的活力降低，所述活力以每单位体积的菌落形成单位(CFU)测量。
实施例8.根据实施例1至7中任一项所述的方法，其中所述至少一种微生物处于生物膜中。
实施例9.根据实施例1至8中任一项所述的方法，其中所述COS/NO处于组合物中，所述组合物被调配用于：局部、口腔、鼻腔、眼部、鞘内、肠胃外、腹膜内、静脉内、皮下或肌内施用。
实施例10.根据实施例1至9中任一项所述的方法，其中所述至少一种抗生素处于组合物中，所述组合物被调配用于：局部、口腔、鼻腔、眼部、鞘内、肠胃外、腹膜内、静脉内、皮下或肌内施用。
实施例11.根据实施例1至10中任一项所述的方法，其中所述调配物呈糊剂、液体、乳膏、凝胶、膏剂、泡沫剂、气雾剂、洗剂、软膏、肥皂、洗发剂、外科手术盖布、缝合线、绷带、纱布或医疗植入物的形式。
实施例12.根据实施例1至11中任一项所述的方法，其中所述至少一种抗生素选自由以下组成的组：氨基糖苷类(aminoglycosides)、安沙霉素类(ansamycins)、β-内酰胺类(beta-lactams)、碳头孢烯类(carbacephems)、碳青霉烯类(carbapenems)、头孢菌素类(cephalosporins)、氟喹诺酮类(fluoroquinolones)、糖肽类(glycopeptides)、林可酰胺类(lincosamides)、大环内酯类(macrolides)、单内酰环类(monobactams)、噁唑烷酮类(oxazolidinones)、青霉素类(penicillins)、氯霉素类(phenicols)、多肽类(polypeptides)、喹诺酮类(quinolones)、链阳菌素类(streptogramins)、磺胺类(sulfonamides)和四环素类(tetracyclines)。
实施例13.根据实施例1至12中任一项所述的方法，其中所述至少一种抗生素选自由以下组成的组：氨曲南(aztreonam)、头孢他啶(ceftazidime)、环丙沙星(ciprofloxacin)、粘菌素(colistin)、美罗培南(meropenem)和妥布霉素(tobramycin)。
实施例14.一种减少微生物对至少一种抗生素的耐药性的发展或进展的方法，所述方法包括：使所述微生物与释放一氧化氮的壳寡糖(COS/NO)接触一定时间段，并且随后使所述微生物与所述至少一种抗生素接触。
实施例15.根据实施例14所述的方法，其中所述微生物选自由以下组成的属：肠球菌属、葡萄球菌属、克雷白氏杆菌属、不动杆菌属、假单胞菌属和肠杆菌属。
实施例16.根据实施例14所述的方法，其中所述微生物选自由以下组成的组：粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷白氏杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌。
实施例17.根据实施例141至16中任一项所述的方法，其中所述COS/NO：具有相对于所述微生物的最小抑制浓度(MIC)；并且以选自以下的量提供：约0.1至约4MIC、约0.2至约4MIC、约0.25至约4MIC、约0.3至约4MIC、约0.4至约4MIC、约0.5至约4MIC、约0.6至约4MIC、约0.7至约4MIC、约0.75至约4MIC、约0.8至约4MIC、约0.9至约4MIC、约1至约4MIC、约2至约4MIC、约3至约4MIC、约0.1至约3MIC、约0.1至约2MIC、约0.1至约1MIC、约0.1至约0.9MIC、约0.1至约0.8MIC、约0.1至约0.75MIC、约0.1至约0.7MIC、约0.1至约0.6MIC、约0.1至约0.5MIC、约0.1至约0.4MIC、约0.1至约0.3MIC、约0.1至约0.25MIC、约0.1至约0.2MIC、约0.1MIC、约0.2MIC、约0.25MIC、约0.3MIC、约0.4MIC、约0.5MIC、约0.6MIC、约0.7MIC、约0.75MIC、约0.8MIC、约0.9MIC、约1MIC、约2MIC、约3MIC和约4MIC。
实施例18.根据实施例14至17中任一项所述的方法，其中所述至少一种抗生素：具有相对于所述微生物的最小抑制浓度(MIC)；并且以选自以下的量提供：约0.1至约4MIC、约0.2至约4MIC、约0.25至约4MIC、约0.3至约4MIC、约0.4至约4MIC、约0.5至约4MIC、约0.6至约4MIC、约0.7至约4MIC、约0.75至约4MIC、约0.8至约4MIC、约0.9至约4MIC、约1至约4MIC、约2至约4MIC、约3至约4MIC、约0.1至约3MIC、约0.1至约2MIC、约0.1至约1MIC、约0.1至约0.9MIC、约0.1至约0.8MIC、约0.1至约0.75MIC、约0.1至约0.7MIC、约0.1至约0.6MIC、约0.1至约0.5MIC、约0.1至约0.4MIC、约0.1至约0.3MIC、约0.1至约0.25MIC、约0.1至约0.2MIC、约0.1MIC、约0.2MIC、约0.25MIC、约0.3MIC、约0.4MIC、约0.5MIC、约0.6MIC、约0.7MIC、约0.75MIC、约0.8MIC、约0.9MIC、约1MIC、约2MIC、约3MIC和约4MIC。
实施例19.根据实施例14至18中任一项所述的方法，其中所述时间段选自由以下组成的组：至少0.25小时、至少0.5小时、至少0.75小时、至少1小时、至少1.25小时、至少1.5小时、至少1.75小时、至少2小时、至少2.25小时、至少2.5小时、至少2.75小时、至少3小时、至少3.25小时、至少3.5小时、至少3.75小时、至少4小时、至少4.25小时、至少4.5小时、至少4.75小时、至少5小时、至少5.25小时、至少5.5小时、至少5.75小时、至少6小时、至少6.25小时、至少6.5小时、至少6.75小时、至少7小时、至少7.25小时、至少7.5小时、至少7.75小时和至少8小时。
实施例20.根据实施例14至19中任一项所述的方法，其中所述易感性增加是与单独接触所述COS/NO或单独接触所述至少一种抗生素相比，在所述与所述COS/NO接触一定时间段并且随后与所述至少一种抗生素接触之后，所述至少一种微生物的活力降低，所述活力以每单位体积的菌落形成单位(CFU)测量。
实施例21.根据实施例14至20中任一项所述的方法，其中所述至少一种微生物处于生物膜中。
实施例22.根据实施例14至21中任一项所述的方法，其中所述COS/NO处于组合物中，所述组合物被调配用于：局部、口腔、鼻腔、眼部、鞘内、肠胃外、腹膜内、静脉内、皮下或肌内施用。
实施例23.根据实施例14至22中任一项所述的方法，其中所述至少一种抗生素处于组合物中，所述组合物被调配用于：局部、口腔、鼻腔、眼部、鞘内、肠胃外、腹膜内、静脉内、皮下或肌内施用。
实施例24.根据实施例14至23中任一项所述的方法，其中所述调配物呈糊剂、液体、乳膏、凝胶、膏剂、泡沫剂、气雾剂、洗剂、软膏、肥皂、洗发剂、外科手术盖布、缝合线、绷带、纱布或医疗植入物的形式。
实施例25.根据实施例14至24中任一项所述的方法，其中所述至少一种抗生素选自由以下组成的组：氨基糖苷类、安沙霉素类、β-内酰胺类、碳头孢烯类、碳青霉烯类、头孢菌素类、氟喹诺酮类、糖肽类、林可酰胺类、大环内酯类、单内酰环类、噁唑烷酮类、青霉素类、氯霉素类、多肽类、喹诺酮类、链阳菌素类、磺胺类和四环素类。
实施例26.根据实施例14至25中任一项所述的方法，其中所述至少一种抗生素选自由以下组成的组：氨曲南、头孢他啶、环丙沙星、粘菌素、美罗培南和妥布霉素。
在一个或多个实施例中，实施例1的释放一氧化氮的壳寡糖(COS/NO)由美国专利第US 9850322号(通过引用并入本文)中公开的以下结构表示：
所述COS/NO包括至少一个式I结构单元：
Figure BDA0003827493510000071
和任选的至少一个式II结构单元：
Figure BDA0003827493510000081
其中
如果存在的话，则R1、R2、R3和R4各自独立地选自由以下组成的组：氢；C1-5烷基(C═O)—，当C1-5烷基是甲基时，Me(C═O)—是酰基Ac；以及C1-5烷基；
在每种情况下，
Figure BDA0003827493510000082
是单键或双键，
其中在每种情况下，如果它是双键，则连接到双键-O的R1、R2、R3或R4不存在；当R1不存在时，R5是氢、羟基、C1-5烷基或C1-5烷氧基；当R3不存在时，R6是氢、羟基、C1-5烷基或C1-5烷氧基；
其中在每种情况下，如果它是单键，则连接到双键-O的R1、R2、R3或R4存在；当R1存在时，R5是氢；
当R3存在时，R6是氢；
Q是—(CRcRd)v—；
其中Rc和Rd独立地是氢或C1-5烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、正丁基、异丁基和戊基。优选地，Rc和Rd独立地是氢、甲基或乙基；并且v为2到6的整数；优选地，v为2；
p为1到100，优选地1到50；更优选地1到25；最优选地1到10的整数；
A是
Figure BDA0003827493510000083
其中L是S、O或N；并且G在每种情况下独立地是氢，或者与L一起形成一氧化氮供体；
X是氢、C1-5烷基或与N一起形成一氧化氮供体；
B是氢或—Y—Z，其中Y是间隔子，并且Z是聚合物或端基；或者B不存在；
D是—NRaRb，其中Ra和Rb独立地选自由以下组成的组：氢；甲酰基；C1-5烷基(C═O)—，当C1-5烷基是甲基时，Me(C═O)—是酰基Ac；C1-5烷基以及C1-5烷基酯；
或者D是
Figure BDA0003827493510000091
如果存在的话，则R1、R2、R3和R4的有用值各自独立地选自由氢和C1-5烷基组成的组。当R1、R2、R3和R4中的一个或多个是C1-5烷基时，它选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、正丁基、异丁基和戊基。优选地，如果存在的话，则R1、R2、R3和R4是氢或甲基。最优选地，如果存在的话，则R1、R2、R3和R4是氢。
在所有实施例中，
Figure BDA0003827493510000092
在每种情况下是单键或双键。优选地，在所有情况下它均为单键。
Q是—(CRcRd)v—；其中Rc和Rd独立地是氢或C1-5烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、正丁基、异丁基和戊基。优选地，Rc和Rd独立地是氢、甲基或乙基。v的有用值为2到6的整数。优选地，v为2。
p的有用值包含1到100的任何整数。优选地，p为1到50的整数。更优选地，p为1到25的整数。最优选地，p为1到10的整数，如1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
L的有用值是N、S和O。优选地，L是N或S。在G出现的每种情况下，它独立地是氢或一氧化氮供体。由于一氧化氮供体有助于COS/NO上可利用的NO的量，所以优选的是，G是一氧化氮供体。在优选的实施例中，存在于COS/NO上的G的至少30％是一氧化氮供体。更优选地，存在于COS/NO上的G的至少50％是一氧化氮供体。甚至更优选地，存在于COS/NO上的G的至少90％是一氧化氮供体。最优选地，存在于COS/NO上的G的至少95％是一氧化氮供体。
X的有用值是氢、C1-5烷基或一氧化氮供体。由于一氧化氮供体有助于COS/NO上可利用的NO的量，所以优选的是，X是一氧化氮供体。在优选的实施例中，存在于COS/NO上的X的至少30％是一氧化氮供体。更优选地，存在于COS/NO上的X的至少50％是一氧化氮供体。甚至更优选地，存在于COS/NO上的X的至少90％是一氧化氮供体。最优选地，存在于COS/NO上的X的至少95％是一氧化氮供体。
B的有用值是氢、—Y—Z，其中Y是间隔子，并且Z是单体或聚合物，或者B是端基。当L是O或S时，B也可以不存在。如本文所使用的，端基是聚合物或单体末端处的任何封端基团。这些基团是本领域已知的。优选地，当B是端基时，它是氢、羟基或C1-5烷基。
Z的有用值包含本领域已知的单体和聚合物，尤其是用于活性药物成分的那些单体和聚合物。尤其有用的聚合物或单体包含：
Figure BDA0003827493510000104
Figure BDA0003827493510000102
其中在每种情况下，j是1到100的整数。
本文公开的式中有用的间隔子Y包含本领域已知的间隔子或接头，尤其是用于活性药物成分中的那些间隔子或接头。尤其有用的间隔子包含以下：
Figure BDA0003827493510000103
其中Rp、Rq和Rt在每种情况下独立地是氢或羟基；并且k为1到20的整数。
使用本文公开的策略，寡糖上存在的任何仲氨基可以如本文所描述的那样修饰以形成释放NO的寡糖。直接连接到糖主链部分的仲氨基或侧接在糖主链部分上的仲氨基可以用NO释放部分官能化。
有用的NO释放部分包含本领域已知的任何NO释放基团。尤其有用的是NO释放基团的残基，即NO供体，与COS/NO上的N、S或O共价结合。NO供体与COS/NO上的与NO供体结合的原子一起形成选自由以下组成的组的部分：二醇二氮烯鎓(diazeniumdiolate)、作为例如亚硝基硫醇基团的一部分的-NO、亚硝胺、羟基亚硝胺、羟胺、羟基脲和其组合。优选地，NO释放部分是二醇二氮烯鎓。这些基团可以以盐的形式存在。
在一些实施例中，NO供体是由以下表示的N-二醇二氮烯鎓(即，1-氨基-取代的乙氮烯-1-正离子-1，2-二醇盐)：
Figure BDA0003827493510000111
在若干个实施例中，NXQB由以下之一表示：
Figure BDA0003827493510000112
Figure BDA0003827493510000113
以及
Figure BDA0003827493510000114
在若干个实施例中，NXQAB由以下表示：
Figure BDA0003827493510000115
Figure BDA0003827493510000121
在若干个实施例中，所述COS/NO由以下表示：
Figure BDA0003827493510000122
在若干个实施例中，所述COS/NO的可释放一氧化氮总储存量为每毫克COS/NO至少0.5μmol NO。在若干个实施例中，所述COS/NO的可释放一氧化氮总储存量在每毫克COS/NO约0.5μmol至2.5μmol NO的范围内。在若干个实施例中，实现了更大的每毫克NO释放量，例如每毫克COS/NO至少约2.5μmol、约3.0μmol、约3.5μmol、约4.0μmol、约4.5mol、约5μmol或更大量的NO。在若干个实施例中，所述COS/NO的一氧化氮释放半衰期在介于约0.7-4.2小时之间的范围内。在若干个实施例中，实现了更长的半衰期，例如约5小时、约6小时、约8小时、约10小时或介于所列时间之间的任何时间。在若干个实施例中，所述COS/NO在4小时后的总NO释放量在介于每毫克所述COS/NO约0.1-4.0μmol NO的范围内，包含每毫克所述COS/NO约0.3-2.0μmol NO、每毫克所述COS/NO约0.1-3.0μmol NO、每毫克所述COS/NO约1.5-4μmolNO或每毫克所述COS/NO约0.7-3.0μmol NO(或其间的任何范围，包含端点)。
附图说明
为了进一步理解本公开的性质、目的和优点，应参考以下详细描述，结合以下附图阅读，其中相同的附图标记表示相同的元件。
图1示出了一氧化氮增加细胞通透性。(a)COS/NO通过产生多种反应性副产物对细胞膜施加亚硝化和氧化应激。更具通透性的细胞膜将允许改善抗生素和其它疏水分子的扩散。(b)暴露于PBS(实心条柱)、1mg/mL的COS/NO(条纹条柱)、4mg/mL的COS/NO(带点条柱)或25％DMSO(棋盘条柱)后的荧光染料NPN荧光。(c)暴露于妥布霉素或粘菌素后铜绿假单胞菌菌株K中的荧光染料NPN荧光。
图2示出了COS/NO和抗生素的组合对铜绿假单胞菌的易感菌株有协同作用。(a)暴露于COS/NO和妥布霉素的组合(实心条柱)或COS/NO和粘菌素的组合(条纹条柱)的PAK的24小时时间杀伤测定。(b)用暴露于COS/NO(实心条柱)、妥布霉素(条纹条柱)、COS/NO和妥布霉素(带点条柱)或PBS(棋盘条柱)的铜绿假单胞菌的MDR菌株进行的24小时时间杀伤测定。
图3示出了在未进行NO预处理(实线)或进行25％(短划线)或100％(点线)COS/NOMIC下的NO预处理4小时的情况下暴露于抗生素后的PAK活力。误差代表≥3个生物学重复的平均值的标准偏差。
图4示出了铜绿假单胞菌生物膜的一氧化氮预处理使妥布霉素易感性提高。(a)在未进行预处理(实心条柱)或进行NO预处理1小时(条纹条柱)、2小时(带点条柱)或4小时(棋盘条柱)的情况下暴露于妥布霉素后的PAK生物膜活力。(b-e)在未进行预处理(实心条柱)或进行NO预处理4小时(条纹条柱)的情况下暴露于妥布霉素后的MDR铜绿假单胞菌生物膜活力。误差代表≥3个生物学重复的平均值的标准偏差。
图5示出了连续暴露于NO的亚抑制剂量不会导致PAK或ATCC MRSA的MIC的任何变化。(a)PAK的针对妥布霉素(实线)、NO(长虚线)或与在其MIC的25％下的COS/NO同时递送的妥布霉素(短虚线)的MIC。(b)ATCC MRSA的针对妥布霉素(实线)、NO(长虚线)或与在其MIC的25％下的COS/NO同时递送的妥布霉素(短虚线)的MIC。通过化学发光测定来自COS/NO的NO剂量。
图6示出了在pH 7.4的PBS中COS/NO的NO释放动力学和总量。(a)NO释放的瞬时通量。(b)随时间的推移释放的总NO。误差代表n≥3个单独测量的平均值的标准偏差。
图7示出了氧化氘中COS/NO的代表性1H NMR。
图8示出了5kDa壳聚糖(蓝色)和COS/NO(红色)的代表性FT-IR。
图9示出了一氧化氮预处理铜绿假单胞菌的MDR种使得妥布霉素易感性得到提高。(a-d)在进行(虚线)和未进行(实线)NO预处理的情况下暴露于妥布霉素后的铜绿假单胞菌活力。误差代表≥3个生物学重复的平均值的标准偏差。
图10示出了一氧化氮预处理MDR ESKAPE病原体使得妥布霉素易感性得到提高。(a-d)在进行(虚线)和未进行(实线)NO预处理的情况下暴露于妥布霉素后的ESKAPE病原体活力。误差代表≥3个生物学重复的平均值的标准偏差。
图11示出了铜绿假单胞菌生物膜的一氧化氮预处理使妥布霉素易感性提高。(a)在未进行预处理(实心条柱)或进行NO预处理1小时(条纹条柱)、2小时(带点条柱)或4小时(棋盘条柱)的情况下暴露于妥布霉素后的PAK生物膜活力。(b-e)在未进行预处理(实心条柱)或进行NO预处理4小时(条纹条柱)的情况下暴露于妥布霉素后的MDR铜绿假单胞菌生物膜活力。误差代表≥3个生物学重复的平均值的标准偏差。
图12示出了NO预处理铜绿假单胞菌生物膜并未显著降低活力。误差代表n≥3个单独测量的平均值的标准偏差。
具体实施方式
在进一步描述本主题公开之前，应当理解，本公开不限于下文所描述的本公开的特定实施例，因为可以对特定实施例作出变化且其仍落入所附权利要求书的范围内。应当理解，本文所采用的术语是用于描述特定实施例的目的，并且不意图为限制性的。相反，本公开的范围将由所附权利要求来确定。
在本说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一种/一个(a/an)”和“所述”包含多个提及物。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解相同的含义。
材料和方法
材料
中等分子量壳聚糖购自Primex公司(冰岛锡格品菲厄泽(SiglufjordurIceland))。硝酸钾、HEPES、妥布霉素、乙醇胺、对甲氧基苯甲醛和对甲苯磺酰氯购自密理博西格玛公司(Millipore Sigma)(密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))。氩气、氮气(N2)、一氧化氮(NO)校准品(25.87ppm余量N2)和纯NO(99.5％)气瓶购自Airgas National Welders公司(北卡罗来纳州罗利(Raleigh,NC))。使用Millipore Milli-Q UV梯度A10系统(马萨诸塞州贝德福德(Bedford,MA))将蒸馏水纯化到电阻率为18.2MΩcm并且总有机物含量≤10ppb。
细菌菌株和培养基
实验室的铜绿假单胞菌菌株K(PAK)由北卡罗来纳大学教堂山分校(北卡罗来纳州教堂山)微生物学和免疫学系(the Department of Microbiology and Immunology atthe University of North Carolina at Chapel Hill(Chapel Hill,NC))的MatthewWolfgang教授捐赠。金黄色葡萄球菌(ATCC#29213)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant S.aureus，MRSA,ATCC#33591)和洋葱伯克霍尔德菌群(BCC,ATCC#25416)从美国典型组织培养物保藏中心(American Type Tissue CultureCollection，ATCC)(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas,VA))获得。铜绿假单胞菌(AR 229、AR230、AR 237和AR 239)和肺炎克雷白氏杆菌(AR 542)的临床多药耐药菌株从CDC&FDA抗生素耐药性分离株库(CDC&FDA Antibiotic Resistant Isolate Bank)(佐治亚州亚特兰大(Atlanta,GA))获得。胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)和胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)从碧迪公司(Becton,Dickinson,and Company)(新泽西州富兰克林湖(Franklin Lakes,NJ))获得。
释放一氧化氮的壳寡糖的合成
如前所述制备仲胺修饰的壳寡糖[Ahonen,M.J.R.,Hill,D.B.和Schoenfisch,M.H.作为粘液溶解剂的释放一氧化氮的藻酸盐(Nitric oxide-releasing alginates asmucolytic agents).《ACS生物材料科学与工程》5,3409-3418(2019)]。简而言之，将中等分子量壳聚糖(5g)在85℃下在过氧化氢(100mL，15％)中氧化降解1小时。过滤所得溶液以去除不溶性组分，并且用乙醇使壳寡糖沉淀，通过离心收集，并真空干燥。随后通过甲苯磺酰化亲核取代反应用氨乙基席夫碱官能团修饰壳寡糖，以产生仲胺修饰的壳寡糖(COS)。将胺修饰的壳聚糖(45mg)溶解在水(450μL)、甲醇(2.55mL)和甲醇钠(甲醇中的5.4mM，75μL)的混合物中，并且随后在不断搅拌的情况下放置到Parr氢化容器中。通过三次短氩气吹扫(10秒，7巴)以及随后的三次长氩气吹扫(10分钟，7巴)去除氧气。用NO气体(10巴)为反应器加压3天。执行相同的吹扫程序以去除未反应的NO。使释放NO的壳寡糖(COS/NO)在乙醇中沉淀，通过离心收集，真空干燥，并在-20℃下储存在真空密封袋中。用NMR和FTIR证实了合成成功，并与以前发表的文献进行比较[Ahonen,M.J.R.,Hill,D.B.和Schoenfisch,M.H.作为粘液溶解剂的释放一氧化氮的藻酸盐(Nitric oxide-releasing alginates asmucolytic agents).《ACS生物材料科学与工程》5,3409-3418(2019)]。支持信息中提供了代表性数据(图7和图8)。
一氧化氮释放动力学和总量
用Zysense化学发光一氧化氮分析仪(科罗拉多州博尔德的NOA公司(NOA,Boulder,CO))实时测量NO释放。将大约1mg COS/NO添加到30mL PBS(10mM，pH 7.4)中，并通过使氮气以200毫升/分钟鼓泡通过溶液，将其输送到仪器中。当测量结果低于10ppb NO/mgCOS时，停止分析。
单一药剂最小抑制测定
将细菌的冷冻储备液在TSB(3mL)中重建并培养过夜。将细菌的过夜培养物(3mL)接种到新鲜TSB(30mL)中，并且生长到108CFU/mL。将细菌在TSB中稀释到106CFU/mL的最终浓度，并暴露于COS/NO或抗生素(氨曲南、头孢他啶、环丙沙星、粘菌素、美罗培南和妥布霉素)的系列稀释液中24小时。用刃天青测定评估抑制作用，并且最小抑制浓度(MIC)定义为防止刃天青还原(即颜色从蓝色变为粉红色)所需的抗菌剂的最低浓度。
棋盘测定
如前所述，采用棋盘法实验性地确定COS/NO和每种抗生素(氨曲南、头孢他啶、环丙沙星、粘菌素、美罗培南和妥布霉素)组合的功效[Privett,B.J.等人一氧化氮和磺胺嘧啶银盐对革兰氏阴性、革兰氏阳性和耐抗生素病原体的协同作用(Synergy of nitricoxide and silver sulfadiazine against gram-negative,gram-positive,andantibiotic-resistant pathogens).《分子药剂学(Mol.Pharm.)》7,2289-2296(2010)]。简而言之，将最终浓度为106CFU/mL的细菌在TSB中用一系列抗微生物剂组合在37℃下温育24小时。每种被测抗微生物剂的最高浓度为2×MIC。对浓度经逐步2倍稀释的六种额外剂量进行了评估，得到了针对每种细菌菌株测试的COS/NO与每种抗生素的共计49种组合。在与刃天青温育后，所述系列中既不支持细菌生长也不发生变色的最低药物浓度被确定为最有效的抑制浓度。根据Elion等人的报道，使用等式1计算分级杀菌浓度指数(ΣFIC)[Elion,G.B.,Singer,S.和Hitchings,G.H.核酸衍生物的拮抗剂：VIII.生化相关的抗代谢药组合的协同作用(Antagonists of Nucleic Acid Derivatives:VIII.Synergism incombinations of biochemically related antimetabolites).《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》208,477-488(1954)]，其中MICA和MICB分别是在单一药剂测定中针对药剂A和B确定的值，并且MICAB和MICBA是通过棋盘测定确定的构成最有效抑制组合的药剂A和B的浓度。针对每种细菌菌株和每种药物组合至少一式两份地进行棋盘测定。
Figure BDA0003827493510000161
基于ΣFIC值，使用以下标准对组合进行表征：<0.25为高度协同；≤0.5为协同；≤1为相加；≤4为无差异；>4为拮抗。
组合时间杀伤测定
进行24小时时间杀伤测定，以便定量探测每种抗生素-NO组合的效果随时间的变化[Belley,A.等人通过时间杀伤方法评估奥利万星与其它抗微生物剂的组合对金黄色葡萄球菌的协同作用(Assessment by time-kill methodology of the synergisticeffects of oritavancin in combination with other antimicrobial agents againstStaphylococcus aureus).《抗微生物剂与化疗(Antimicrob.Agents Chemother.)》52,3820-3822(2008)]。将TSB中最终浓度为106CFU/mL的浮游细菌用COS/NO和抗生素的组合以1×MIC温育。在0、3、6和24小时等分取样，连续稀释，并使用Eddy Jet螺旋铺板机(纽约州法明代尔的IUL公司(IUL；Farmingdale,NY))对数地铺板在TSA板上。通过使用Flash&Go菌落计数器(纽约州法明代尔的IUL公司)对菌落数量进行计数来评估细菌活力。协同作用被定义为与仅使用最具活性的单一药剂相比，组合用药24小时后菌落计数降低了2个对数，而拮抗作用被定义为与最具活性的单一药剂相比，组合用药24小时后菌落计数增加2个对数[Belley,A.等人(2008)]。无差异被定义为与最具活性的单一药剂相比，组合用药后菌落计数的增加或减少少于2个对数。
相对于浮游细菌进行的一氧化氮预处理
如前所述，在TSB中培养细菌并稀释到最终浓度106CFU/mL，并且在1打兰小瓶中用亚抑制浓度(1/4×MIC)的COS/NO温育1、2或4小时，添加到抗生素(即氨曲南、粘菌素、美罗培南或妥布霉素)的系列稀释液中，并温育20小时。暴露后，将孔在无菌MilliQ水中连续稀释，并螺旋铺板在TSA上。通过菌落计数评估活力。
对于组合测定，将TSB中最终浓度为106CFU/mL的细菌用亚抑制浓度(1/4×MIC)的COS/NO在15mL离心管中温育4小时，并且随后在TSB中用一系列抗生素组合在37℃下温育24小时。测试的最高抗生素浓度为2×MIC。对浓度经逐步2倍稀释的六种额外剂量进行了评估，得到了针对每种铜绿假单胞菌菌株测试的妥布霉素与粘菌素或氨曲南的共计49种组合。在与刃天青温育后，所述系列中既不支持细菌生长也不发生变色的最低药物浓度被确定为最有效的抑制浓度。使用等式1计算ΣFIC。针对每种菌株至少一式两份地进行棋盘测定，并且使用前述标准进行表征。
NPN摄取测定
PAK、ATCC MRSA、ATCC BCC和AR 542的外膜通透性用从Helander及其同事改进的NPN测定进行评估[Helander,I.M.和Mattila-Sandholm,T.革兰氏阴性细菌透化的荧光测定评估(Fluorometric assessment of Gram-negative bacterial permeabilization).《应用微生物学杂志(J.Appl.Microbiol.)》88,213-219(2000)]。简而言之，每天在丙酮溶液中制备新鲜的4560μM NPN储备液，并将其在pH 7.4的PBS中稀释到456μM。在TSB中将细菌培养到108CFU/mL的浓度，通过离心(5,000x g，持续5分钟)收集，并重悬于PBS中。将细菌添加到1打兰小瓶中的COS/NO或DMSO中，并在37℃下振荡温育。温育10分钟后，取出一部分暴露溶液(196μL)并将其添加到黑色孔板中，并添加4μL NPN(PBS中的456μM)。分别在350nm和460nm的激发波长和发射波长下立即测量荧光。减去缓冲液中的背景NPN荧光。
最小生物膜根除浓度测定
在TSB中将细菌培养到108CFU/mL的浓度，并在96孔板中的200μL TSB中稀释到106CFU/mL。将板振荡温育3天，直到形成易于从生长培养基中分离的非表面附着的粘性聚集体。取出生物膜(100μL)，将所述生物膜轻轻注射到PBS(200μL)中以取出松散附着的浮游细胞，并添加到无菌96孔板中。向孔中添加PBS或溶解在PBS(100μL)中的测试药剂，并振荡温育24小时。从孔板中取出生物膜(100μL)，添加到900μL无菌MilliQ水中，并通过移液和涡旋破碎。将经破碎的生物膜连续稀释并螺旋铺板在TSA上。通过菌落计数评估活力。最小生物膜根除浓度(MBEC)被定义为将活力降低5个对数(即从108降低到103CFU/mL)所需的测试药剂的最低浓度。
利用一氧化氮进行的生物膜预处理
如前所述的那样使生物膜生长，并暴露于1/4×MBEC下的COS/NO 1、2或4小时。然后将生物膜从其96孔板中取出，添加到含有溶解于PBS(100μL)中的妥布霉素的新的96孔板中，并温育20小时。在900μL无菌MilliQ水中通过移液和涡旋破碎生物膜，连续稀释，并螺旋铺板在TSA上。通过菌落计数评估活力。
连续传代耐药性测定
将TSB中最终浓度为106CFU/mL的细菌用COS/NO和/或妥布霉素的系列稀释液温育24小时。通过测量600nm处的吸光度来评估生长。将具有最高浓度测试药剂和对应于超过108CFU/mL的OD600的孔在TSB中稀释到106cfu/mL，并用新鲜的COS/NO或妥布霉素溶液温育24小时。单次传代定义为一次暴露、温育以及随后的稀释。将细菌传代持续至多70天。
实例
一氧化氮代表了抗生素耐药性威胁的潜在解决方案。作为双原子自由基，NO在生理条件下迅速产生若干活性氧或氮物质，所述活性氧或氮物质通过多种机制(例如，脂质过氧化、蛋白质脱氨，图1，小图A)杀死细菌[Hetrick,E.M.等人释放一氧化氮的二氧化硅纳米颗粒的杀菌功效(Bactericidal efficacy of nitric oxide-releasing silicananoparticles).《ACS纳米》2,235-246(2008)；Wink,D.A.等人一氧化氮及其先驱物的DNA脱氨能力和基因毒性(DNA deaminating ability and genotoxicity of nitricoxideand its progenitors).《科学(Science)》(80-.).254,1001-1003(1991)；Barraud,N.,Kelso,M.,Rice,S.和Kjelleberg,S.一氧化氮：生物膜扩散的关键介质及其在感染性疾病中的应用(Nitric Oxide:A Key Mediator of Biofilm Dispersal with Applicationsin Infectious Diseases).《当前药物设计(Curr.Pharm.Des.)》21,31-42(2014)]。NO通过破坏细胞膜和增加通透性发挥杀菌作用的主要机制之一，其他人已经用原子力显微术和共聚焦显微术证明了这一点[Hetrick,E.M.等人释放一氧化氮的二氧化硅纳米颗粒的杀菌功效(Bactericidal efficacy of nitric oxide-releasing silica nanoparticles).《ACS纳米》2,235-246(2008)；Deupree,S.M.和Schoenfisch,M.H.使用原子力显微术对一氧化氮对革兰氏阴性病原体的抗微生物作用进行形态分析(Morphological analysis of theantimicrobial action of nitric oxide on Gram-negative pathogens using atomicforce microscopy).《生物材料学报(Acta Biomater.)》5,1405-1415(2009)]，并且本申请人在本文中通过疏水性荧光团NPN和结晶紫染料的摄取增加来证明(图1，小图B、C)。膜损伤使得通常不能穿透膜的化合物更容易穿过，并且NO介导的膜损伤可以增加抗生素的扩散(图1，小图A)。先前的工作已经证明，协同作用的多种情况可归因于细胞通透性和抗生素摄取的增加[Bollenbach,T.抗微生物相互作用：药物发现和耐药性演变的机制和意义(Antimicrobial interactions:mechanisms and implications for drug discoveryand resistance evolution).《微生物学当前观点(Curr.Opin.Microbiol.)》27,1-9(2015)；Khalil,H.,Chen,T.,Riffon,R.,Wang,R.和Wang,Z.聚乙烯亚胺与不同种类抗生素对铜绿假单胞菌的耐药性临床分离株的协同作用(Synergy between Polyethylenimineand Different Families of Antibiotics against a Resistant Clinical Isolate ofPseudomonas aeruginosa).《抗微生物剂与化疗》52,1635-1641(2008)]。
因此，ESKAPE病原体对抗生素的易感性可以通过利用NO的破坏能力来提高，NO同时发挥杀菌作用。因为NO作为高反应性气体天然地存在，所以本申请人通过水溶性壳聚糖供体将NO递送到溶液中，所述水溶性壳聚糖供体在生理条件下以爆发式释放谱释放NO(图6和表1)。先前我们实验室已经将释放一氧化氮的壳聚糖(COS/NO)用于根除浮游细菌和生物膜[Lu,Y.,Slomberg,D.L.和Schoenfisch,M.H.作为抗菌剂的释放一氧化氮的壳寡糖(Nitric Oxide-Releasing Chitosan Oligosaccharides as AntibacterialAgents).《生物材料(Biomaterials)》35,1716-1724(2014)；Reighard,K.P.和Schoenfisch,M.H.释放一氧化氮的壳寡糖在有氧和无氧条件下对铜绿假单胞菌的抗菌作用(Antibacterial actionof nitric oxide-releasing chitosan oligosaccharides against Pseudomonasaeruginosa under aerobic and anaerobic conditions).《抗微生物剂与化疗》59,6506-6513(2015)]，并且作为杀菌剂而言，COS/NO优于NO气体[Hall,J.R.等人一氧化氮递送方式影响抗菌作用(Mode of nitric oxide delivery affects antibacterial action).《ACS生物材料科学与工程》acsbiomaterials.9b01384(2019)]
N-二醇二氮烯鎓NO供体配体用于促进NO储存和从化学修饰的壳寡糖(COS/NO)中释放。美国专利第98503222号和第10759877号中公开了另外的配体，所述专利通过引用并入本文。当N-二醇二氮烯鎓在生理pH下分解(即质子化，图7)时，壳聚糖生物聚合物每个仲胺释放两个NO分子，其中NO发挥广谱杀菌作用。
表1：通过化学发光测定pH 7.4的PBS中COS/NO的NO释放。
Figure BDA0003827493510000201
a释放的总NO。b最大NO释放通量。cNO释放半衰期。dNO释放持续时间。e4小时后释放的总NO。
一氧化氮和抗生素的组合
抗生素-COS/NO组合的效果最先在浮游铜绿假单胞菌菌株K(PAK)中使用经典的棋盘测定进行研究[Caleffi-Ferracioli,K.R.,Maltempe,F.G.,Siqueira,V.L.D.和Cardoso,R.F.通过棋盘刃天青法快速检测结核分枝杆菌中的药物相互作用(Fastdetection of drug interaction in Mycobacterium tuberculosis by a checkerboardresazurin method).《结核病(Tuberculosis)》93,660-663(2013)；Privett,B.J.等人一氧化氮和磺胺嘧啶银盐对革兰氏阴性、革兰氏阳性和耐抗生素病原体的协同作用(Synergyof nitric oxide and silver sulfadiazine against gram-negative,gram-positive,and antibiotic-resistant pathogens).《分子药剂学》7,2289-2296(2010)]。棋盘测定使用分级抑制浓度指数(ΣFIC)将抗微生物剂组合表征为协同、相加、无差异或拮抗。ΣFIC值是使用评估每种测试药剂组合以及单独使用时的抑制作用的等式计算的，并且当组合的效果大于单个药剂的效果之和时，产生协同作用。当组合的效果比单个药剂更差时，就会出现相反的效果，即拮抗作用，这对于临床应用来说是危险的和不期望的。
在六种被测试的抗生素-NO组合中没有观察到拮抗作用，并且大多数被归类为协同或相加相互作用(表2)。这些数据表明，NO可以与多类抗生素组合使用，并且不太可能干扰抗生素的作用机制。棋盘测定的观察结果得到了24小时时间杀伤测定中获得的定量数据的支持，其中COS/NO和妥布霉素或粘菌素以其相应的最小抑制浓度(MIC)组合并作用24小时[Ciacci,N.等人粘菌素和N-乙酰半胱氨酸对嗜麦芽寡养单胞菌的体外协同作用(Invitro Synergism of Colistin and N-acetylcysteine against Stenotrophomonasmaltophilia).《抗生素(Antibiotics)》8,101(2019)]。通过量化暴露后的活力，COS/NO与抗生素之间的相互作用可以被表征为协同、无差异或拮抗。与最具活性的单一药剂相比，粘菌素-NO组合和妥布霉素-NO组合都使活力下降≥2个对数，这被定义为协同。因此，抗生素-NO组合针对PAK比单一药剂更有效。
表2：抗生素与COS/NO组合针对PAK的分级抑制浓度指数中位数。数据代表≥3个生物学重复。
Figure BDA0003827493510000211
为了更严格地评估作为潜在的组合疗法的COS/NO，对从美国疾病控制中心获得的多药耐药铜绿假单胞菌分离株进行了检查。两个菌株(PA 229和PA 237)对妥布霉素易感，而另外两个菌株(PA 230和PA 239)是耐妥布霉素的并且具有用于氨基糖苷修饰酶的多个基因(表3)。妥布霉素易感菌株(PA 229和PA 237)被妥布霉素-NO组合协同杀灭，而妥布霉素与NO之间的相互作用在耐妥布霉素菌株中无差异(图2)。妥布霉素的杀菌作用并没有随着NO的同时加入而显著提高，这可能是由于氨基糖苷修饰酶的失活作用引起的。然而，没有抗生素-NO组合出现拮抗作用；所有的相互作用都是协同、相加或无差异，甚至在MDR铜绿假单胞菌菌株中也是如此。
表3：MDR铜绿假单胞菌分离株耐药性的分子机制。a
Figure BDA0003827493510000212
a数据来自CDC和FDA抗生素耐药性分离株库
一氧化氮预处理
因为NO提高了细菌细胞的通透性，所以NO暴露可以通过降低细胞膜的屏障作用来改善抗生素的杀菌作用。因此，对24小时时间杀伤测定进行了修改，以包含在添加抗生素之前暴露于COS/NO 4小时。通过首先将铜绿假单胞菌暴露于低剂量的NO(MIC的25％)，在所有被测试的菌株和抗生素中抗生素的杀菌作用显著提高(表4)。与未进行NO预处理相比，进行NO预处理的PAK对氨曲南、粘菌素、美罗培南和妥布霉素(图3和表4)的易感性降低了3至5个对数。另外，即使是多药耐药铜绿假单胞菌菌株，在NO预处理后也对妥布霉素更易感(表4和图9)。使用24小时时间杀伤测定的分类标准，NO与抗生素的所有组合都实现了协同杀菌作用。
表4：在进行或未进行NO预处理的情况下暴露于抗生素后细菌活力的对数差异。a
Figure BDA0003827493510000221
a在25％的NO最小抑制浓度下进行NO预处理4小时。b从在未进行NO预处理的情况下暴露于抗生素后的细菌活力对数中减去在进行NO预处理的情况下暴露于抗生素后的细菌活力对数。c分类：协同≥2个对数，无差异<2个对数，拮抗>-2个对数。
在其它被测试的ESKAPE病原体(即，肺炎克雷白氏杆菌AR 542、ATCC金黄色葡萄球菌和ATCC MRSA)和内在耐药的洋葱伯克霍尔德菌群中观察到类似的趋势，其中通过添加NO观察到妥布霉素易感性显著提高(表4和图10)。这些数据表明，NO可以用于增加多种多药耐药病原体的抗生素易感性。在进行NO预处理的情况下，金黄色葡萄球菌和MRSA两者对妥布霉素的易感性增加，表明NO的“敏化作用”并不仅针对革兰氏阴性菌。无论作用机制如何，一氧化氮都能提高所有被测试的抗生素在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中的杀菌功效，无论耐药谱如何。
铜绿假单胞菌生物膜的一氧化氮预处理
生物膜固有地抵抗抗生素的渗透和作用，这主要是由于保护性基质和封闭细菌的代谢状态的改变引起的。先前已经证明一氧化氮破坏铜绿假单胞菌生物膜，并且流变学分析表明生物膜基质经过NO处理后受到损害[Reighard,K.P.,Hill,D.B.,Dixon,G.A.,Worley,B.V.和Schoenfisch,M.H.使用释放一氧化氮的壳寡糖对铜绿假单胞菌生物膜的破坏和清除(Disruption and eradication of P.aeruginosa biofilms using nitricoxide-releasing chitosan oligosaccharides).《生物结垢》31,775-87(2015)；Howlin,R.P.等人低剂量一氧化氮作为靶向抗生物膜辅助疗法以治疗囊性纤维化中的慢性铜绿假单胞菌感染(Low-Dose Nitric Oxide as Targeted Anti-biofilm Adjunctive Therapyto Treat Chronic Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis).《分子疗法(Mol.Ther.)》25,2104-2116(2017)]。使铜绿假单胞菌生物膜生长3天，并在添加妥布霉素之前使其暴露于25％的最小生物膜根除浓度(MBEC)下的COS/NO中4小时。在进行持续不到4小时的NO预处理的情况下观察到妥布霉素易感性的最小变化(图11，小图A)。然而，所有被测试的包含耐妥布霉素菌株的铜绿假单胞菌生物膜在NO预处理后对妥布霉素明显更易感(图11和表5)。值得注意的是，NO预处理不会显著影响生物膜的活力(图12)。这些数据表明，NO预处理提高了包含耐妥布霉素菌株的铜绿假单胞菌菌株的抗生素易感性。
表5：在进行或未进行NO预处理的情况下暴露于妥布霉素后铜绿假单胞菌生物膜活力的对数差异。a
Figure BDA0003827493510000231
a在25％的NO最小抑制浓度下进行NO预处理4小时。b从在未进行NO预处理的情况下暴露于抗生素后的细菌活力对数中减去在进行NO预处理的情况下暴露于抗生素后的细菌活力对数。c分类：协同≥2个对数，无差异<2个对数，拮抗>-2个对数。
在利用一氧化氮的情况下的连续传代
持续暴露于亚抑制浓度的抗生素中会导致耐药性细菌的产生[Spellberg,B.等人耐抗生素感染的流行：美国传染病学会呼吁医学界采取行动(The Epidemic ofAntibiotic-Resistant Infections:A Call to Action for the Medical Communityfrom the Infectious Diseases Society of America).《临床传染病(Clin.Infect.Dis.)》46,155-164(2008)；Ghosh,S.和LaPara,T.M.在农场动物中使用低剂量抗生素对土壤细菌中抗生素耐药性细菌的增殖和持久性的影响(The effects ofsubtherapeutic antibiotic use in farm animals on the proliferation andpersistence of antibiotic resistance among soil bacteria).《国际微生物生态学学会期刊(ISME J.)》1,191-203(2007)]，因此已经表达了对产生对NO的耐药性的担忧。我们实验室之前进行的一项研究表明，二氧化硅纳米颗粒以亚抑制浓度递送的外源性NO不会导致任何被测试细菌的任何表型变化(即MIC)[Privett,B.J.,Broadnax,A.D.,Bauman,S.J.,Riccio,D.A.和Schoenfisch,M.H.对细菌对外源性一氧化氮的耐药性的检查(Examinationof Bacterial Resistance to Exogenous Nitric Oxide).《一氧化氮(Nitric Oxide)》26,126-173(2012)]。因为先前的工作表明耐药性的发展取决于抗生素暴露参数[Martinez,J.L.和Baquero,F.突变频率和抗生素耐药性(Mutation Frequencies andAntibiotic Resistance).《抗微生物剂与化疗》44,1771-1777(2000)]，所以本申请人研究了重复暴露于亚抑制浓度的COS/NO的影响。经过10次连续传代，铜绿假单胞菌和MRSA的COS/NO的MIC保持不变(图4)。平行暴露于妥布霉素引起妥布霉素MIC增加和可观察到的生长率下降，但是COS/NO以25％的MIC伴随妥布霉素一起递送减缓或预防了妥布霉素耐药性。同样，在70或30次传代后，本申请人也没有发现铜绿假单胞菌或MRSA中COS/NO的MIC发生变化(表6)。较厚的细胞膜或细胞壁可以提供对NO的耐受性，因为与革兰氏阴性菌相比，革兰氏阳性菌需要更高剂量的NO才能根除，但持续暴露于亚致死浓度不会产生对NO的耐药性。因此，NO不仅可以提高抗生素的杀菌功效，而且它们的组合使用还可以减缓抗生素耐药性的发展。
表6：在n次传代后作为单一药剂的NO和妥布霉素的最小抑制浓度，以及妥布霉素与25％MIC的COS/NO组合递送时的最小抑制浓度。a
Figure BDA0003827493510000241
a单次传代被定义为暴露于测试药剂的系列稀释液中24小时，随后稀释到106CFU/mL。b通过化学发光确定的来自COS/NO的NO的剂量。c与25％MIC的COS/NO同时递送时妥布霉素的MIC。
一氧化氮提高了抗生素在浮游细菌和生物膜细菌中的作用，这种现象的发生与细菌种类、抗生素作用机制或耐药性的分子机制无关。目前市场上没有一种抗微生物剂将广谱抗微生物功效、生物膜杀灭、与常规抗生素协同作用以及逆转抗生素耐药性组合在“一体化”疗法中。在一个抗生素管理必须受到严格控制且多药耐药物种大量存在的世界，这些数据表明抗生素治疗的未来将发生巨大变化。未来研究将研究抗生素-NO在如离体猪肺模型等复杂感染模型中的作用[Harrison,F.,Muruli,A.,Higgins,S.和Diggle,S.P.开发用于研究铜绿假单胞菌的生长毒性和信号传导的离体猪肺模型(Development of an ex vivoporcine lung model for studying growth Virulence,and signaling of pseudomonasaeruginosa).《感染与免疫(Infect.Immun.)》82,3312-3323(2014)]。在解决耐药性感染中并入基于NO的疗法可以允许使用先前无效的抗生素治疗，改善临床结果并减缓耐药性的扩散。
本说明书中所引用的所有文献都通过引用并入本文，如同具体地和单独地指示将每个文献通过引用并入一样。对任何文献的引用是针对其在提交日之前的公开内容，并且不能理解为承认本公开因先前的发明而无权先于此类文献。
应当理解，上述元件中每一个，或者两个或更多个一起也可以在不同于上述类型的其它类型的方法中找到有用的应用。无需进一步分析，前述内容将如此充分地揭示本公开的要点，以至于其他人可以通过应用现有知识，在不省略从现有技术的观点来看清楚地构成所附权利要求中阐述的本公开的一般或具体方面的必要特性的特征的情况下，容易地将其适用于各种应用。前述实施例仅以实例方式呈现；本公开的范围仅由以下权利要求限定。

Claims (40)

1.一种增加微生物对至少一种抗生素的易感性的方法，所述方法包括：
使所述微生物与释放一氧化氮的壳寡糖(COS/NO)和
所述至少一种抗生素接触。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触是顺序的，其中顺序接触包括接触所述释放一氧化氮的壳寡糖(COS/NO)一定时间段，并且随后使所述生物体与所述至少一种抗生素接触。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述微生物选自由以下组成的属：肠球菌属(Enterococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)和肠杆菌属(Enterobacter)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述微生物选自由以下组成的组：粪肠球菌(Enterococcus faecium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和肠杆菌(Enterobacter spp.)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述COS/NO：
具有相对于所述微生物的最小抑制浓度(MIC)；并且
以选自以下的量提供：约0.1至约4MIC、约0.2至约4MIC、约0.25至约4MIC、约0.3至约4MIC、约0.4至约4MIC、约0.5至约4MIC、约0.6至约4MIC、约0.7至约4MIC、约0.75至约4MIC、约0.8至约4MIC、约0.9至约4MIC、约1至约4MIC、约2至约4MIC、约3至约4MIC、约0.1至约3MIC、约0.1至约2MIC、约0.1至约1MIC、约0.1至约0.9MIC、约0.1至约0.8MIC、约0.1至约0.75MIC、约0.1至约0.7MIC、约0.1至约0.6MIC、约0.1至约0.5MIC、约0.1至约0.4MIC、约0.1至约0.3MIC、约0.1至约0.25MIC、约0.1至约0.2MIC、约0.1MIC、约0.2MIC、约0.25MIC、约0.3MIC、约0.4MIC、约0.5MIC、约0.6MIC、约0.7MIC、约0.75MIC、约0.8MIC、约0.9MIC、约1MIC、约2MIC、约3MIC和约4MIC。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述至少一种抗生素：
具有相对于所述微生物的最小抑制浓度(MIC)；并且
以选自以下的量提供：约0.1至约4MIC、约0.2至约4MIC、约0.25至约4MIC、约0.3至约4MIC、约0.4至约4MIC、约0.5至约4MIC、约0.6至约4MIC、约0.7至约4MIC、约0.75至约4MIC、约0.8至约4MIC、约0.9至约4MIC、约1至约4MIC、约2至约4MIC、约3至约4MIC、约0.1至约3MIC、约0.1至约2MIC、约0.1至约1MIC、约0.1至约0.9MIC、约0.1至约0.8MIC、约0.1至约0.75MIC、约0.1至约0.7MIC、约0.1至约0.6MIC、约0.1至约0.5MIC、约0.1至约0.4MIC、约0.1至约0.3MIC、约0.1至约0.25MIC、约0.1至约0.2MIC、约0.1MIC、约0.2MIC、约0.25MIC、约0.3MIC、约0.4MIC、约0.5MIC、约0.6MIC、约0.7MIC、约0.75MIC、约0.8MIC、约0.9MIC、约1MIC、约2MIC、约3MIC和约4MIC。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述时间段选自由以下组成的组：至少0.25小时、至少0.5小时、至少0.75小时、至少1小时、至少1.25小时、至少1.5小时、至少1.75小时、至少2小时、至少2.25小时、至少2.5小时、至少2.75小时、至少3小时、至少3.25小时、至少3.5小时、至少3.75小时、至少4小时、至少4.25小时、至少4.5小时、至少4.75小时、至少5小时、至少5.25小时、至少5.5小时、至少5.75小时、至少6小时、至少6.25小时、至少6.5小时、至少6.75小时、至少7小时、至少7.25小时、至少7.5小时、至少7.75小时和至少8小时。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述易感性增加是与单独接触所述COS/NO或单独接触所述至少一种抗生素相比，在所述与所述COS/NO接触一定时间段并且随后与所述至少一种抗生素接触之后，所述微生物的活力降低，所述活力以每单位体积的菌落形成单位(CFU)测量。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述微生物处于生物膜中。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述COS/NO处于组合物中，所述组合物被调配用于：局部、口腔、鼻腔、眼部、鞘内、肠胃外、腹膜内、静脉内、皮下或肌内施用。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述至少一种抗生素处于组合物中，所述组合物被调配用于：局部、口腔、鼻腔、眼部、鞘内、肠胃外、腹膜内、静脉内、皮下或肌内施用。
12.根据权利要求10至11中任一项所述的方法，其中所述调配物呈糊剂、液体、乳膏、凝胶、膏剂、泡沫剂、气雾剂、洗剂、软膏、肥皂、洗发剂、外科手术盖布、缝合线、绷带、纱布或医疗植入物的形式。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述至少一种抗生素选自由以下组成的组：氨基糖苷类(aminoglycosides)、安沙霉素类(ansamycins)、β-内酰胺类(beta-lactams)、碳头孢烯类(carbacephems)、碳青霉烯类(carbapenems)、头孢菌素类(cephalosporins)、氟喹诺酮类(fluoroquinolones)、糖肽类(glycopeptides)、林可酰胺类(lincosamides)、大环内酯类(macrolides)、单内酰环类(monobactams)、噁唑烷酮类(oxazolidinones)、青霉素类(penicillins)、氯霉素类(phenicols)、多肽类(polypeptides)、喹诺酮类(quinolones)、链阳菌素类(streptogramins)、磺胺类(sulfonamides)和四环素类(tetracyclines)。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述至少一种抗生素选自由以下组成的组：氨曲南(aztreonam)、头孢他啶(ceftazidime)、环丙沙星(ciprofloxacin)、粘菌素(colistin)、美罗培南(meropenem)和妥布霉素(tobramycin)。
15.一种减少微生物对至少一种抗生素的耐药性的发展或进展的方法，所述方法包括：
使所述微生物与释放一氧化氮的壳寡糖(COS/NO)和所述至少一种抗生素接触。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述使所述微生物与释放一氧化氮的壳寡糖(COS/NO)和所述至少一种抗生素接触提供了协同的杀微生物效应。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中使所述微生物与所述释放一氧化氮的壳寡糖(COS/NO)和所述至少一种抗生素接触同时发生、顺序发生或其任何组合。
18.根据权利要求17中任一项所述的方法，其中顺序接触包括接触所述释放一氧化氮的壳寡糖(COS/NO)一定时间段，并且随后使所述生物体与至少一种抗生素接触。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中所述微生物选自由以下组成的属：肠球菌属、葡萄球菌属、克雷白氏杆菌属、不动杆菌属、假单胞菌属和肠杆菌属。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中所述微生物选自由以下组成的组：粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷白氏杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌。
21.根据权利要求15至20中任一项所述的方法，其中所述COS/NO：
具有相对于所述微生物的最小抑制浓度(MIC)；并且
以选自以下的量提供：约0.1至约4MIC、约0.2至约4MIC、约0.25至约4MIC、约0.3至约4MIC、约0.4至约4MIC、约0.5至约4MIC、约0.6至约4MIC、约0.7至约4MIC、约0.75至约4MIC、约0.8至约4MIC、约0.9至约4MIC、约1至约4MIC、约2至约4MIC、约3至约4MIC、约0.1至约3MIC、约0.1至约2MIC、约0.1至约1MIC、约0.1至约0.9MIC、约0.1至约0.8MIC、约0.1至约0.75MIC、约0.1至约0.7MIC、约0.1至约0.6MIC、约0.1至约0.5MIC、约0.1至约0.4MIC、约0.1至约0.3MIC、约0.1至约0.25MIC、约0.1至约0.2MIC、约0.1MIC、约0.2MIC、约0.25MIC、约0.3MIC、约0.4MIC、约0.5MIC、约0.6MIC、约0.7MIC、约0.75MIC、约0.8MIC、约0.9MIC、约1MIC、约2MIC、约3MIC和约4MIC。
22.根据权利要求15至21中任一项所述的方法，其中所述至少一种抗生素：
具有相对于所述微生物的最小抑制浓度(MIC)；并且
以选自以下的量提供：约0.1至约4MIC、约0.2至约4MIC、约0.25至约4MIC、约0.3至约4MIC、约0.4至约4MIC、约0.5至约4MIC、约0.6至约4MIC、约0.7至约4MIC、约0.75至约4MIC、约0.8至约4MIC、约0.9至约4MIC、约1至约4MIC、约2至约4MIC、约3至约4MIC、约0.1至约3MIC、约0.1至约2MIC、约0.1至约1MIC、约0.1至约0.9MIC、约0.1至约0.8MIC、约0.1至约0.75MIC、约0.1至约0.7MIC、约0.1至约0.6MIC、约0.1至约0.5MIC、约0.1至约0.4MIC、约0.1至约0.3MIC、约0.1至约0.25MIC、约0.1至约0.2MIC、约0.1MIC、约0.2MIC、约0.25MIC、约0.3MIC、约0.4MIC、约0.5MIC、约0.6MIC、约0.7MIC、约0.75MIC、约0.8MIC、约0.9MIC、约1MIC、约2MIC、约3MIC和约4MIC。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中所述时间段选自由以下组成的组：至少0.25小时、至少0.5小时、至少0.75小时、至少1小时、至少1.25小时、至少1.5小时、至少1.75小时、至少2小时、至少2.25小时、至少2.5小时、至少2.75小时、至少3小时、至少3.25小时、至少3.5小时、至少3.75小时、至少4小时、至少4.25小时、至少4.5小时、至少4.75小时、至少5小时、至少5.25小时、至少5.5小时、至少5.75小时、至少6小时、至少6.25小时、至少6.5小时、至少6.75小时、至少7小时、至少7.25小时、至少7.5小时、至少7.75小时和至少8小时。
24.根据权利要求15至23中任一项所述的方法，其中所述减少所述发展或进展包括通过与单独接触所述COS/NO或单独接触所述至少一种抗生素相比，在所述与所述COS/NO接触一定时间段并且随后与所述至少一种抗生素接触之后降低所述微生物的活力来增加所述微生物对所述至少一种抗生素的易感性，所述活力以每单位体积的菌落形成单位(CFU)测量。
25.根据权利要求15至24中任一项所述的方法，其中所述微生物处于生物膜中。
26.根据权利要求15至25中任一项所述的方法，其中所述COS/NO处于组合物中，所述组合物被调配用于：局部、口腔、鼻腔、眼部、鞘内、肠胃外、腹膜内、静脉内、皮下或肌内施用。
27.根据权利要求15至26中任一项所述的方法，其中所述至少一种抗生素处于组合物中，所述组合物被调配用于：局部、口腔、鼻腔、眼部、鞘内、肠胃外、腹膜内、静脉内、皮下或肌内施用。
28.根据权利要求26至27中任一项所述的方法，其中所述调配物呈糊剂、液体、乳膏、凝胶、膏剂、泡沫剂、气雾剂、洗剂、软膏、肥皂、洗发剂、外科手术盖布、缝合线、绷带、纱布或医疗植入物的形式。
29.根据权利要求15至28中任一项所述的方法，其中所述至少一种抗生素选自由以下组成的组：氨基糖苷类、安沙霉素类、β-内酰胺类、碳头孢烯类、碳青霉烯类、头孢菌素类、氟喹诺酮类、糖肽类、林可酰胺类、大环内酯类、单内酰环类、噁唑烷酮类、青霉素类、氯霉素类、多肽类、喹诺酮类、链阳菌素类、磺胺类和四环素类。
30.根据权利要求15至29中任一项所述的方法，其中所述至少一种抗生素选自由以下组成的组：氨曲南、头孢他啶、环丙沙星、粘菌素、美罗培南和妥布霉素。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述(COS/NO)包括至少一个式(I)结构单元，
Figure FDA0003827493500000051
和任选的至少一个式(II)结构单元，
Figure FDA0003827493500000052
其中
如果存在的话，则R1、R2、R3和R4各自独立地选自由以下组成的组：氢；C1-5烷基(C═O)—，当C1-5烷基是甲基时，Me(C═O)—是酰基Ac；以及C1-5烷基；
在每种情况下，
Figure FDA0003827493500000054
是单键或双键，
其中在每种情况下，如果
Figure FDA0003827493500000053
是双键，则连接到双键-O的R1、R2、R3或R4不存在；
当R1不存在时，R5是氢、羟基、C1-5烷基或C1-5烷氧基；
当R3不存在时，R6是氢、羟基、C1-5烷基或C1-5烷氧基；
其中在每种情况下，如果---是单键，则连接到双键-O的R1、R2、R3或R4存在；
当R1存在时，R5是氢；
当R3存在时，R6是氢；
Q是—(CRcRd)v—；
其中Rc和Rd独立地是氢或C1-5烷基；并且v为2到6的整数；
p为1到100的整数；
A是
Figure FDA0003827493500000061
其中L是S、O或N；并且G在每种情况下独立地是氢，或者与L一起形成一氧化氮供体；
X是氢、C1-5烷基或与N一起形成一氧化氮供体；
B是氢或—Y—Z，其中Y是间隔子，并且Z是聚合物或端基；或者B不存在；
D是—NRaRb，其中Ra和Rb独立地选自由以下组成的组：氢；甲酰基；C1-5烷基(C═O)—，当C1-5烷基是甲基时，Me(C═O)—是酰基Ac；C1-5烷基以及C1-5烷基酯；
或者D是
Figure FDA0003827493500000062
32.根据权利要求31所述的方法，其中
R1、R2、R3、R4、R5和R6各自是氢；
Figure FDA0003827493500000064
是单键；
Q是—(CRcRd)v—；其中Rc和Rd是氢，并且v为2；
p为1到10的整数；
A是
Figure FDA0003827493500000063
其中L是N，并且G是氢；
X与N一起形成一氧化氮供体；
B是氢；并且
D是—NRaRb，其中Ra和Rb各自是氢。
33.根据权利要求32所述的方法，其中p为1。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述一氧化氮供体与所述COS/NO上的与所述一氧化氮供体结合的原子一起选自由以下组成的组：二醇二氮烯鎓(diazeniumdiolate)、亚硝基硫醇、亚硝胺、羟基亚硝胺、羟胺、羟基脲和其组合。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述一氧化氮供体是二醇二氮烯鎓。
36.根据权利要求31至35中任一项所述的方法，其中如在pH 7.4和37℃下的水性缓冲液中测定的，所述COS/NO的可释放一氧化氮总储存量为每毫克所述COS/NO至少0.5μmolNO。
37.根据权利要求31至36中任一项所述的方法，其中如在pH 7.4和37℃下的水性缓冲液中测定的，所述COS/NO的可释放一氧化氮总储存量在每毫克所述COS/NO约0.5μmolNO至2.5μmolNO的范围内。
38.根据权利要求31至37中任一项所述的方法，其中如在pH 7.4和37℃下的水性缓冲液中测定的，所述COS/NO的一氧化氮释放半衰期在介于约0.7-4.2小时之间的范围内。
39.根据权利要求31至38中任一项所述的方法，其中如在pH 7.4和37℃下的水性缓冲液中测定的，所述COS/NO的一氧化氮释放半衰期超过约1小时。
40.根据权利要求31至39中任一项所述的方法，其中如在pH 7.4和37℃下的水性缓冲液中测定的，所述COS/NO在4小时后的总NO释放量在介于每毫克所述COS/NO约0.3μmolNO至2.0μmolNO之间的范围内。
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