CN115197956A - Dna数据存储方法及其应用 - Google Patents

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CN115197956A CN202210634272.1A CN202210634272A CN115197956A CN 115197956 A CN115197956 A CN 115197956A CN 202210634272 A CN202210634272 A CN 202210634272A CN 115197956 A CN115197956 A CN 115197956A
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Abstract

本申请提供DNA数据存储方法及其应用。本申请的第一方面，提供DNA数据存储方法，该DNA数据存储方法包括以下步骤：将数据基因插入到质粒；将质粒转入产芽孢细菌；诱导产芽孢细菌形成孢子。根据本申请实施例的DNA数据存储方法，至少具有如下有益效果：本申请采用产芽孢细菌的活细胞进行DNA数据存储，产芽孢细菌孢子的结构中所具有的独特成分和特性可以为存储于其中的DNA数据提供良好的保护，防止降解。孢子表面的多层蛋白质可以限制外来物质进入内部，并且具有修复功能以维持存储的DNA数据的稳定性。此外，孢子在没有营养的情况下处于休眠状态，因而可以长时间保持存活。

Description

DNA数据存储方法及其应用
技术领域
本申请涉及合成生物学技术领域，尤其是涉及DNA数据存储方法及其应用。
背景技术
在传统的硬盘上实现大量信息存储需要付出昂贵的存储和维护成本，对此，DNA数据存储提供了极具吸引力的替代方案。据报道，DNA作为存储介质时，其信息密度比其它主流存储设备的信息密度要高出6个数量级左右，可以达到每克近4550亿GB的数据量，并且成本更低。而且近十年的技术更新使得DNA测序和合成方面的进步远远快于摩尔定律的预测，因此，DNA作为常规商业电子数据存储介质有着非常巨大的潜力。尽管DNA存储在存储容量、保质期和年平均数据支出方面具有很大优势，但DNA分子本质上仍然是生物分子，在稳定性方面难以保证。
为此，现有的解决DNA存储稳定性问题的方法包括脱水、低温、稳定剂以及封装等。在这些方法中，通过封装对DNA进行保护是目前最持久的方法，然而，以这些方式存储DNA虽然在一定程度上解决了稳定性问题，但氧化和水解等环境压力造成的降解仍然可能会导致DNA链断裂，从而导致无法忽视的读取错误，而且存储和读取时步骤繁琐。例如，采用硅壳对DNA进行封装后，需要氢氟酸腐蚀外壳后才可提取核酸，这种读取方式会对存储介质造成永久损坏而且不能反复利用。为此，有必要提供一种能够长期稳定存储，并且数据读取时简单方便的DNA存储方案。
发明内容
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种DNA数据存储方法及其应用，该方法可以长期稳定存储，并且数据读取时简单方便。
本申请的第一方面，提供DNA数据存储方法，该DNA数据存储方法包括以下步骤：
将数据基因插入到质粒；
将质粒转入产芽孢细菌；
诱导产芽孢细菌形成孢子。
根据本申请实施例的DNA数据存储方法，至少具有如下有益效果：
本申请实施例采用产芽孢细菌的活细胞进行DNA数据存储，产芽孢细菌孢子的结构中所具有的独特成分和特性可以为存储于其中的DNA数据提供良好的保护，提高其面对外部极端环境的稳定性。孢子表面的多层蛋白质可以限制外来物质进入内部，并且具有修复功能以维持存储的DNA数据的稳定性。此外，孢子在没有营养的情况下处于休眠状态，因而可以长时间保持存活。
其中，数据基因是指通过特定的编码方式携带有数据的DNA分子的序列，例如通过直接转换、线性分组码、喷泉码、卷积码等本领域所熟知的方式将待存储的数据转化为DNA分子的序列作为数据基因的载荷。根据编码方式的不同，在存储和后续读取时可以有不同的容错率。在其中一些具体的实施方式中，编码方式采用如图2的c所示的四碱基编码方式，N1～N4前后四个碱基作为一个编码子来对应数字、字母、标点符号中的一个。具体而言，利用224种组合编码子来表示104个字符，每个字符至少分配有两种组合，例如AAAC、ATAC、ACAC三个组合都用于表示小写字母a，以此减少编码序列重复并降低意外碱基突变的风险。在其中一些实施方式中，数据基因在载荷的上下游还设有引物序列，从而方便后续读取。在其中一些实施方式中，数据基因在引物序列内、载荷的上下游还设有地址序列和结束索引序列中的至少一种，不同的载荷序列对应不同的地址序列和/或结束索引序列，从而在后续读取时可以针对特定数据进行检索并扩增读取。
在其中一些实施方式中，质粒为穿梭质粒。一般质粒的稳定性受宿主细胞的影响，通常在大肠杆菌中较为稳定而在部分产芽孢细菌例如枯草芽孢杆菌中较不稳定，因而采用穿梭质粒的方式，将其在大肠杆菌中构建成功后再转入产芽孢细菌中表达。为此，在穿梭质粒上需要包含至少一个筛选标记(如一个或多个)，筛选标记具体可以采用抗性基因，例如包括至少一个抗性基因作为原核筛选标记(如氨苄青霉素抗性AmpR、氯霉素抗性CamR、卡那霉素抗性KanR、四环素抗性TetR、红霉素抗性ErmR等)。
在其中一些实施方式中，质粒包括至少一个操纵子系统，至少一个操纵子系统分别用于启动作为结构基因的至少一个数据基因的转录。
在其中一些实施方式中，质粒包括多个操纵子系统，多个操纵子系统分别用于启动作为结构基因的多个数据基因的转录。利用多个操纵子系统进行选择性转录，在默认情况下具有调控作用，可以防止基因表达溢出，减轻宿主细菌代谢负担。具体的，可以通过将多个操纵子系统在质粒上顺反位设置或多级系统调控的方式来实现。此外，在进行特定诱导的情况下可得到比未诱导更高的转录水平，有利于后期数据筛选以及读取。其中，多个具体可以优选为2，3，4，5或更多个。可以理解的是，根据具体需要，多个数据基因可以相同或不同。
在其中一些实施方式中，操纵子系统选自乳酸链球菌肽操纵子系统、乳糖操纵子系统、木糖操纵子系统、阿拉伯糖操纵子系统、鼠李糖操纵子系统、四环素操纵子系统中的至少一种。
在其中一些实施方式中，操纵子系统包括乳酸链球菌肽操纵子系统、乳糖操纵子系统和木糖操纵子系统中的至少一种。在其中一些实施方式中，操纵子系统包括乳酸链球菌肽操纵子系统和乳糖操纵子系统，或包括乳酸链球菌肽操纵子系统和木糖操纵子系统，或包括乳糖操纵子系统和木糖操纵子系统。在一些实施方式中，操纵子系统包括乳酸链球菌肽操纵子系统、乳糖操纵子系统和木糖操纵子系统。
在其中一些实施方式中，质粒包括起始位点、筛选标记、至少一个操纵子系统的操纵基因和存储级联组件。在其中一些实施方式中，存储级联组件包括至少一个操纵子系统的启动子，至少一个数据基因插入到对应操纵子系统的启动子的下游，从而作为对应的结构基因。如前所述，筛选标记具体可以采用抗性基因。
在其中一些实施方式中，乳酸链球菌肽操纵子系统、乳糖操纵子系统和木糖操纵子系统对应的启动子在存储级联组件中顺反设置，例如相邻启动子顺反设置。
产芽孢细菌是指在营养缺乏、干燥等特定的条件下，会在菌体内产生圆形或椭圆形的休眠体的细菌。具体的，产芽孢细菌包括芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)、芽孢盐杆菌属(Sporohalobacter)、脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)、芽孢肠状菌属(Sporotomaculum)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、芽孢乳酸菌属(Sporolaetobacilbs)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、类芽孢杆菌属(Paemibacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、硫化芽孢杆菌属(Sulfobacillus)和芽孢杆菌属(Bacillus)等多个不同属的细菌。而孢子也是指内生孢子，即产芽孢细菌所产生的芽孢。
在其中一些实施方式中，产芽孢细菌包括芽孢杆菌属的细菌，具体可以是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、蜂房芽孢杆菌(Bacillus alvei)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)、嗜酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)、好碱芽孢杆菌(Bacillusalkalicola)、产氮芽孢杆菌(Bacillus azotoformans)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)、环庚烷芽孢杆菌(Bacilluscycloheptanicus)、解硫胺素芽孢杆菌(Bacillus aneurinilyticus)、米氏芽孢杆菌(Bacillus migulanus)、深海芽孢杆菌(Bacillus abyssalis)、潮间带芽孢杆菌(Bacillusaestuarii)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)等其中的至少一种。
在其中一些实施方式中，产芽孢细菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)中的至少一种。
具体的，由于孢子(或称芽孢)是产芽孢细菌在营养条件极低、含水量低等条件下形成的休眠体，因而可以通过提供产芽孢细菌以特定的适于芽孢形成的环境而诱导产芽孢细菌形成孢子，例如，可以是通过控制养分、水分、氧气、pH或特定的促进芽孢形成的物质等其中至少一种条件下诱导产芽孢细菌形成孢子。
在其中一些实施方式中，诱导芽孢杆菌形成孢子的方式包括将产芽孢细菌在孢子化培养基培养。通过这种方式限制产芽孢细菌的营养代谢，促进孢子形成。
在其中一些实施方式中，孢子化培养基中含有金属离子。通过富含金属离子的孢子化培养基来限制产芽孢细菌的营养代谢以促进孢子的形成。具体的，金属离子可以是Mn2 +、Mg2+、Ca2+、Fe2+等其中至少一种金属离子。进一步的，Mn2+的浓度为0.05～0.2mg/ml，Mg2+的浓度为0.1～0.3mg/ml，Ca2+的浓度为0.05～0.2mg/ml，Fe2+的浓度为0.1～0.3mg/ml。
在其中一些实施方式中，孢子化培养基的配方包含少量营养物质，以维持芽孢杆菌营养细胞的一些代谢需要。具体的，营养物质可以是蛋白胨、牛肉膏提取物、酵母提取物等其中至少一种物质。进一步的，蛋白胨的浓度为2-5mg/ml，牛肉膏提取物的浓度为0.5～2mg/ml，酵母提取物的浓度为1～3mg/ml。
在其中一些实施方式中，在上述孢子化培养基中培养1～7天，例如，在孢子化培养基中培养至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天。通过孢子化培养基中一定时间的培养，促进产芽孢细菌的孢子形成，最终得到高占比的孢子。
在其中一些实施方式中，形成孢子后，还包括将未孢子化的营养细胞处理，例如通过溶菌酶进行处理。
为了进一步延长孢子的储存期限和/或增强其对特定环境胁迫下的抗性，可以通过特定的干燥剂进行包覆，例如可以是多孔干燥剂，多孔干燥剂具体包括但不限于活性炭、木薯粉、多孔淀粉等其中的至少一种。
在其中一些实施方式中，在干燥剂包覆前后，还可以将其包覆在胶体中以进一步增强抗性，胶体具体包括但不限于阿拉伯胶、明胶、黄原胶、骨胶等其中的至少一种。
在其中一些实施方式中，诱导产芽孢细菌形成孢子后，还包括将孢子负载于阿拉伯胶和多孔干燥剂中。
在其中一些实施方式中，诱导产芽孢细菌形成孢子后，还包括将孢子负载于阿拉伯胶和活性炭中。
在其中一些实施方式中，包覆的方法包括如下步骤，将孢子的分散液与多孔干燥剂混合，使其吸附到所述多孔干燥剂中，然后将其与胶体混合。
在其中一些实施方式中，包覆的方法包括如下步骤，将孢子的分散液与胶体或其溶液混合，然后投入多孔干燥剂吸附干燥。
在其中一些实施方式中，包覆的方法包括如下步骤，将孢子的分散液直接与胶体和多孔干燥剂混合。
在其中一些实施方式中，形成孢子后，还包括将孢子或其溶液或经包覆的孢子或其组合低温存储。
本申请的第二方面，提供DNA存储介质，该DNA存储介质包括产芽孢细菌转化体的孢子，该孢子采用前述的DNA数据存储方法获得。
本申请的第三方面，提供装置，该装置包括：
编码模块，用于将待存储的数据转化为数据基因；
存储模块，用于将数据基因插入到质粒，进而将质粒转入产芽孢细菌，并诱导产芽孢细菌形成孢子。
在一些实施方式中，存储模板用于实施第一方面所述的DNA数据存储方法。
在其中一些实施方式中，该装置还包括读取模块，用于在孢子萌发后提取核酸，测序，进一步将测序结果转化为待读取的数据。
在其中一些实施方式中，读取模块还包括通过特定的诱导剂进行选择性转录、通过特定的引物等进行选择性扩增、选择性测序等其中至少一种方式进行选择性读取。
本申请的第三方面，提供读取方法，该读取方法包括以下步骤：取前述的DNA存储介质，待孢子萌发且诱导数据基因表达后提取核酸，测序。
在其中一些实施方式中，待孢子萌发可以通过提供特定的适于孢子萌发的环境而使孢子结束休眠。例如，可以是通过控制养分、水分、氧气、pH或促进产芽孢细菌生长增殖的物质等其中至少一种条件来结束孢子的休眠使其萌发。
在其中一些实施方式中，还包括将测序结果转化为待读取的数据。
在其中一些实施方式中，还包括通过特定的诱导剂进行选择性转录、通过特定的引物等进行选择性扩增以及选择性测序等其中至少一种方式进行选择性读取。
在其中一些实施方式中，乳酸链球菌肽操纵子系统采用10～100μg/ml的乳酸链球菌肽进行选择性转录。具体的，可以是采用10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml的乳酸链球菌肽进行选择性转录。进一步，采用20～90μg/ml、30～80μg/ml、40～60μg/ml、45～55μg/ml的乳酸链球菌肽进行选择性转录。
在其中一些实施方式中，乳糖操纵子系统采用0.5～2mM的IPTG进行选择性转录。具体的，可以是采用0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM的IPTG进行选择性转录。进一步，采用0.5～1.5mM、0.8～1.2mM的IPTG进行选择性转录。
在其中一些实施方式中，木糖操纵子系统采用0.5～2mM的木糖进行选择性转录。具体的，可以是采用0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM的木糖进行选择性转录。进一步，采用0.5～1.5mM、0.8～1.2mM的木糖进行选择性转录。
在其中一些实施方式中，选择性转录的诱导时间为12～24h，进一步在16～20h。
本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
附图说明
图1是本申请的实施例中DNA数据存储方法和读取方法的示意图。
图2是本申请的实施例中pBASC-data和pBASC-sfGFP的构建结果。其中，a是pBASC的质粒图谱。b是pBASC-data和pBASC-sfGFP中存储级联装置BSC的结构。c是数据的编码方式。d是构建得到的pBASC的菌落PCR结果。e中1～3为枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的pBASC-data转化体的菌落PCR的结果，C为未转化的对照。f是凝结芽孢杆菌pBASC-sfGFP转化体的菌落PCR的结果，1～3为位点1～3的sfGFP，C为未转化的对照。
图3是本申请的实施例中从模板质粒中扩增对应片段的琼脂糖凝胶验证结果。
图4是本申请的实施例中诱导条件探索结果和长期稳定性实验结果。其中，a为转化体B.coagulans::pBASC-sfGFP1/2/3中不同浓度诱导剂以及最佳诱导浓度下不同诱导时间诱导不同位点的转录水平的热图，blk为对应的空白对照组。b为a中最佳诱导条件下的蛋白质印迹结果。c是采用a中最佳诱导条件下不同芽孢杆菌数据基因转化体中将不同数据插入到不同位点后这些数据的转录水平的热图，blk为对应的空白对照组。d～f从上到下为热胁迫、氧化胁迫和紫外胁迫条件下孢子存活水平的检测结果。
图5是本申请的实施例中不同时间孢子细胞形成的染色后镜下(1000×)观察结果。其中，包括Slide1～3三个重复，左侧孢子比例为三个重复的均值，每一个图像的左下角为ImageJ分析结果，横轴为绿色，代表染色孢子，纵轴为红色，代表染色营养细胞。
具体实施方式
以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。
下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
实施例1
参考图1，为DNA数据存储和读取过程中的流程简图，本实施例提供DNA数据存储方法中芽孢杆菌转化体的构建，具体如下：
1.数据基因的构建
选择以下三段数据作为本实施例需要存储的数据信息：
data1：“Southern University of Science and Technology,College ofEngineering,Department of Biomedical Engineering,Synthetic biology lab”
data2：“The core culture of SUSTech BME department is,Adventurous,Arduous,Amiable.”
data3：“The school motto of SUSTech is,Virtue,Truth,Advance.”
按照图2中c所示的4碱基编码方式转换为对应的DNA序列，例如以AAAC、ATAC、ACAC三种组合中的任一种来表示小写字母a，得到携带有上述三段数据的DNA序列作为数据基因的载荷(payload)，以此构建完成数据基因。
2.人工储存染色体的合成
表1.用于构建人工储存染色体的质粒
Figure BDA0003681374940000081
利用数据基因构建命名为人工储存染色体的穿梭质粒，该穿梭质粒主要依据表1中的pMSP3535和pJet 1.2作为主体框架构建，图谱参考图2的a，主要由七个部分构成：复制起点(Ori)、红霉素和卡那霉素抗性基因(ErmR和KanR)、乳糖、木糖和乳酸链球菌肽三个操纵子系统以及芽孢杆菌储存级联(Bacillus storage cassette，BSC)。其中，BSC的结构如图2的b所示，其中含有三个操纵子系统对应的启动子，三个启动子在BSC中采用顺反位设计，在各自对应的下游插入data1～3三个数据基因。而pBASC-sfGFP1～3分别在data1～3的对应位置插入sfGFP1～3。
使用表1中的质粒作为模板，利用表2中对应的引物对对应的DNA片段进行七次独立PCR扩增并进一步纯化。PCR产物通过1％琼脂糖凝胶验证，如图3所示，泳道1～7分别是NisRK(2303bp)、KanR(1397bp)、ErmR(967bp)、Ori(755bp)、LacI(1123bp)、XOR(1122bp)、BSC(909bp)，符合预期大小。然后通过E.Z.N.A.
Figure BDA0003681374940000082
凝胶提取试剂盒(Omega Bio-Tek)实现PCR产物的回收。
为实现高组装效率，上述DNA片段都含有与其相邻片段的30～40bp重叠区域。利用
Figure BDA0003681374940000083
HiFi DNA Assembly技术进行组装，1×NEBuilder HiFi DNA AssemblyMaster Mix和0.2pmols每DNA片段，在50℃下孵育8小时过夜。将产物转化DH5α细胞进行筛选，使用片段扩增引物通过菌落PCR鉴定正确的构建体，结果如图2中的d所示，泳道1～7分别为NisRK(2303bp)、KanR(1397bp)、ErmR(967bp)、Ori(755bp)、LacI(1123bp)、XOR(1122bp)、BSC(909bp)，与预期大小相对应，表示pBASC构建成功。
表3.质粒片段和对应的引物序列
Figure BDA0003681374940000091
在上述人工储存染色体中的设计中，包含选择性转录过程，该过程可以使用特定的诱导分子特异性地转录出所需的数据序列。具体而言，乳酸链球菌肽、IPTG和木糖可分别用于诱导data1、data2和data3的转录。三个操纵子诱导表达系统在质粒上顺反位设计的选择性转录在默认情况下具有调控作用，能够防止基因表达溢出而导致宿主细菌负担增加；而且在进行专一诱导的情况下可得到比未诱导更高的转录水平，有利于后期数据筛选以及读取。
3.芽孢杆菌的转化
将过夜培养的芽孢杆菌培养基转移到SPI培养基(柠檬酸钠0.1％、KH2PO4 0.6％、K2HPO4 1.4％、MgSO4·7H2O 0.02％，(NH4)2SO4 0.2％、0.5％葡萄糖、0.02％钙氨基酸、0.1％酵母抽提物)中，并在37℃、220rpm下生长，直到OD600达到1.0～1.3/ml。使用SPII培养基(向SPI溶液中添加1％v/v 50mM CaCl2溶液和1％v/v 250mM MgCl2溶液)将培养物稀释10倍，并在37℃下160rpm摇动120分钟，制备得到芽孢杆菌化学感受态细胞并-80℃条件下保存。
将步骤2中在DH5α细胞中构建得到的正确的构建体10～100ng与解冻的芽孢杆菌化学感受态细胞在冰上孵育10分钟，并在37℃下以220rpm培养180分钟。之后，将细菌溶液铺展在筛板上筛选，使用数据基因对应的片段扩增引物通过菌落PCR鉴定，得到携带有数据基因的芽孢杆菌底盘细胞。
其中，pBASC转化进枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌共三种菌株中；pBASC-sfGFP1/2/3只转化进凝结芽孢杆菌。菌落PCR鉴定结果如图2的e和f所示，从中可以看出，data1(544bp)、data2(356bp)和data3(496bp)在上述三个菌株中都成功表达，sfGFP1/2/3(1687bp)也在凝结芽孢杆菌中成功表达。
实施例2
1.不同诱导条件探索
培养若干转有sfGFP1/2/3的凝结芽孢杆菌转化体B.coagulans::pBASC-sfGFP1/2/3，分为l(低)、m(中)、h(高)和ctrl(对照)的四组(一式三份管)对应不同浓度的诱导剂培养条件。其中，对于乳链菌肽，浓度依次为10、50和100μg/mL；对于IPTG，浓度依次为0.5、1和2mM；对于木糖，浓度依次为0.5、1和2mM；ctrl组使用未转化的细胞作为空白对照。具体实验过程如下：
转化体B.coagulans::pBASC-sfGFP1/2/3在5ml LB(10μg/ml红霉素)中培养，37℃220rpm培养至OD600为0.6/ml，然后加入诱导剂，转移到20℃160rpm摇动培养箱中再培养20小时。随后，使用GoScript Reverse transcription system(Promega)进行mRNA的逆转录，并按照GoTaq qPCR Master Mix(Promega)进行qPCR。使用基于ΔΔCt的数据处理方法分析转录组水平的qPCR数据。
不同诱导剂浓度的qPCR结果如图4的a所示，从中可以看出，三者的最佳诱导剂浓度均为m(中)，因而最佳诱导剂浓度分别为50μg/ml乳链菌肽、1mM IPTG、1mM木糖。与未诱导组相比，使用这种浓度的诱导剂后，sfGFP组中基因表达水平上升明显(sfGFP1增加到10.1倍，sfGFP2增加到4.4倍，sfGFP3增加到10.6倍)。基于最佳的诱导剂浓度进一步探索不同的诱导处理时间，结果如图4的a所示，最佳诱导持续时间在16至20小时之间。由于sfGFP3在20小时时仍保持7.6倍的表达增加，与16小时时的10.6倍峰值增加相比略有下降，因而将后续实验中的诱导持续时间标准化为20小时。
最佳诱导条件下诱导后的培养物进行蛋白质印迹，结果如图4的b所示，从图中可以看出，所有三个sfGFP位点的未诱导培养物都几乎看不见条带，而诱导组均具有明显的大小约为28kDa的GFP条带。其中，sfGFP1表达最高，其次是sfGFP2和sfGFP3，与qPCR分析一致。结合qPCR和WB的结果可以看出，通过使用各种不同的诱导物，可以控制芽孢杆菌底盘细胞BSC克隆位点中特定的数据基因的转录。
2.不同芽孢杆菌诱导比较
利用实施例3中最佳诱导条件对转入有pBASC-data的三株不同芽孢杆菌的诱导效果进行比较，结果如图4的c所示，其中，各个菌株左侧的I1-3为分别诱导位点1、2、3，从图中可以看出，与对照组相比，枯草芽孢杆菌诱导后各个位点数据基因的表达水平的提升倍数基本上都是最低，而在蜡样芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌中，在位点2和3的数据基因上均表现出对诱导剂的高度响应性，但在位点1上的转录水平变化很小。因此，优选采用蜡样芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌作为DNA数据存储的底盘细胞。此外，蜡样芽孢杆菌的部分菌株产肠毒素，可能导致呕吐或胃肠炎等，而凝结芽孢杆菌被认为是一种益生菌，没有致病性状，考虑到安全性问题，在本申请实施例中蜡样芽孢杆菌是基于孢子的DNA数据存储的最佳底盘。
实施例3
孢子形成实验
使用富含金属离子的孢子化培养基培养芽孢杆菌以限制其营养代谢，促进凝结芽孢杆菌pBASC-data转化体形成孢子，采用孢子染色法，通过孢子细胞与营养细胞的比例来分析评估孢子形成。具体方法如下：
在孢子化培养基(组成为蛋白胨2g，牛肉膏提取物0.5g，Mn2+0.2g、Mg2+0.3g，Ca2+0.2g、Fe2+0.3g，水1L)中培养12h、24h、48h和168h后取菌液样本，固定在载玻片上，并用孔雀绿/藏红染料染色。其中，藏红染料容易被营养细胞吸收，而将其染成红色，孔雀绿染料可渗透到孢子壁，而将孢子细胞染成绿色。使用ImageJ软件中的Color Inspector 3D插件分析图像，并根据绿色像素与红色像素的比率计算孢子比例。
结果如图5所示，从图中可以看出，孢子比例增长与时间呈正相关，在第0～2天，每天孢子比例增加36～38％；但在第2天后，孢子比例增速下降，继续培养至第7天，孢子比例为86.5％。考虑到图片拍摄偏差和计算偏差，实际情况下，孢子比例可能在第7天接近100％，在第2天接近90％。由于大多数孢子形成发生在前两天内(延长培养后观察到的变化极小)，因此，认为48小时是将大多数芽孢杆菌底盘转化为孢子的最短时间，其速度足以为编码数据提供及时的保护。
为了得到足够的孢子溶液用于后续试验，使用孢子化培养基分别培养枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌pBASC-data转化体形成孢子，经历两天，后续使用溶菌酶处理未孢子化的营养细胞，低温存储，待后续试验。
实施例4
长期稳定性测试
1.热胁迫测试
取实施例3中48小时培养后得到的孢子溶液0.5ml两份，其中一份加入0.4ml 15％阿拉伯胶和0.1g活性炭粉，一份0.5ml PBS溶液作为对照，置于60℃烘箱中最长两周，在第0、2、7和14天取样。
2.氧化胁迫测试
取实施例3中48小时培养后得到的孢子溶液0.5ml两份，一份与0.4ml 15％阿拉伯胶和0.1g活性炭粉混合，一份与0.5ml PBS溶液混合，倒入六孔板中，随后加入不同浓度梯度的H2O2水溶液(0、2％、4％、6％、8％和10％)。六孔板用封口膜盖住并密封，室温下放置两天后取样。
3.紫外胁迫测试
取实施例3中48小时培养后得到的孢子溶液0.5ml两份，其中一份加入0.4ml 15％阿拉伯胶和0.1g活性炭粉，一份0.5ml PBS溶液作为对照。将其置于黑色不透明密闭盒内紫外线灯(10W，254nm)照射。在12h、24h、36h、48h和60h时取样。
上述三项测试中，取样完成后，从样品溶液中浸取10μl混合物，稀释至10-2、10-4、10-6和10-8。将稀释液和原始样品分别以10μl体积滴入LB板并风干，测量其中存活的细胞数。
4.数据准确性测试
上述三项测试后，参考图1中的流程，回收第14天热胁迫测试、10％双氧水测试和60h紫外线照射处理后的孢子，待孢子萌发后提取数据基因的转录数据RNA、扩增、测序，将测序结果与以原始编码序列进行比对，以评估存储的数据准确(稳定)性。
高温、氧化、紫外胁迫的测试结果如图4的d～f所示，从图中可以看出，在氧化胁迫条件下，对照组采用2％以上的H2O2处理后，三种芽孢杆菌均已没有存活的孢子。而在阿拉伯胶和木炭的保护下，孢子的耐受性更强，其中，即便在8％H2O2处理后，枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌组存活孢子也都仅减少了2-3个数量级。可见，采用阿拉伯胶和活性炭粉对孢子进行处理可以作为外部屏障提高孢子对于这些环境压力的抗性。在紫外光照条件下，对照组在12小时后被完全杀死，而用阿拉伯胶和木炭处理后，孢子活力增强，在照射36小时后只下降不到一个数量级，60小时后也仅仅下降不到四个数量级。所以，经过阿拉伯胶和木炭处理的芽孢杆菌底盘细胞可以承受长时间的紫外线压力。而在热胁迫条件下，芽孢杆菌的活力逐渐下降，从1010下降到102～103CFU/ml，表明孢子天然具有一定的耐高温性。然而，阿拉伯胶和活性碳粉的保护作用在60℃的环境下并没有体现明显效果，这可能是由于本研究中的样本体积较小，导致外部部分孢子与高温环境直接接触的比例更大。
根据研究结果，我们可以得出结论，使用阿拉伯胶和木炭来封装芽孢杆菌孢子可以增加孢子对氧化应激和紫外线照射的抗性。这些特性对于促进长期DNA数据存储至关重要。与以往通过加速老化测定法估计孢子保质期的研究对比，我们的芽孢杆菌底盘在室温下估计可保持内部DNA数据完整超过100年，在4℃下保持500多年。此外，存储的孢子具有大量拷贝，并且可以根据需求释放，从而有助于频繁读取数据的功能。
数据准确性测试结果如表4所示，从表中可以看出，热胁迫和氧化胁迫下，数据错误率不到1％，而紫外胁迫下，与原始编码序列的一致性(准确率)也在96％以上。对于编码方案的改进，实施例1中在设计编码方案时使用了两个或三个编码来表示每个字符，以提供纠错能力。然而，校正仅适用于单碱基替换，其中由于碱基缺失或连续碱基替换导致的错误可能需要另一种分析方式，表明检索到的数据信息的准确性可以在未来使用改进的编码系统进一步提高。
表4.数据准确性测试结果
Figure BDA0003681374940000131
从上述实施例中可以看到，本申请通过一种嵌入了储存有数据基因的人工染色体的芽孢杆菌底盘细胞来开发一种改进的长期储存方法。具体而言，通过四碱基编码系统将待存储的信息转化为碱基序列，这些序列被进一步整合到芽孢杆菌人工储存染色体(pBASC)中，作为一种合成的穿梭质粒，该芽孢杆菌人工储存染色体由三个功能诱导系统和两个抗生素抗性基因组成，该质粒具有起始位点，为多拷贝，因而可以保证将其转录进细菌后稳定地进行数据复制和存取。通过评估数据基因和GFP基因诱导后的转录水平，证明了质粒设计中的诱导阅读功能。此外，在高温、氧化条件和紫外线照射等恶劣环境压力下进行了孢子的活力测定，以此验证含有DNA数据的芽孢杆菌孢子的长期储存稳定性。而在处理后发芽孢子的数据检索测序结果则证明了该方法可以保持存储数据的高精度。
上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方科技大学
<120> DNA数据存储方法及其应用
<130> 1
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
actgcactat caacacactc tttcgttcca ctgagcgtc 39
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
actatcaaca cacggtaccg gcggtaatac ggttatccac 40
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgtattaccg ccggtaccgt gtgttgatag tgcagtatc 39
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
catagtatcg aagatctgaa gctgtcagta gtatacc 37
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cagcttcaga tcttcgatac tatgttatac gccaac 36
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gataacgcag gaaagaacat gcaagatgtt ggggcc 36
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gttctttcct gcgttatcgt gaaaccagta acgttatacg atgtc 45
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gtcatgaatt ccagagacgc tcactgcccg ctttccag 38
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gactggaaag cgggcagtga gcgtctctgg aattcatg 38
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
agacgcaaga cactgcggat gatccggtac cttattac 38
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atgtaataag gtaccggatc atccgcagtg tcttgcgtc 39
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccaaggattg agatacacgc tagcgctatg accgtctcgg 40
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gacggtcata gcgctagcgt gtatctcaat ccttggtata 40
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gagtgtgttg atagtgcagt ctttatccgc ctccatcc 38

Claims (10)

1.DNA数据存储方法，其特征在于，包括以下步骤：
将数据基因插入到质粒；
将所述质粒转入产芽孢细菌；
诱导所述产芽孢细菌形成孢子。
2.根据权利要求1所述的DNA数据存储方法，其特征在于，所述质粒包括至少一个操纵子系统，所述至少一个操纵子系统分别用于启动至少一个所述数据基因的转录；
优选地，所述质粒包括多个操纵子系统，所述多个操纵子系统分别用于启动多个所述数据基因的转录；
优选地，所述质粒为穿梭质粒。
3.根据权利要求2所述的DNA数据存储方法，其特征在于，所述操纵子系统选自乳酸链球菌肽操纵子系统、乳糖操纵子系统、木糖操纵子系统、阿拉伯糖操纵子系统、鼠李糖操纵子系统、四环素操纵子系统中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的DNA数据存储方法，其特征在于，所述质粒包括起始位点、筛选标记、至少一个所述操纵子系统的操纵基因和存储级联组件；
优选地，所述存储级联组件包括至少一个所述操纵子系统的启动子，所述至少一个所述数据基因插入到对应操纵子系统的所述启动子的下游；
优选地，所述筛选标记包括至少一个抗性基因。
5.根据权利要求1至4任一项所述的DNA数据存储方法，其特征在于，诱导所述产芽孢细菌形成孢子的方式包括将所述产芽孢细菌在孢子化培养基培养。
6.根据权利要求1至4任一项所述的DNA数据存储方法，其特征在于，所述产芽孢细菌为芽孢杆菌，所述芽孢杆菌选自枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌中的至少一种。
7.根据权利要求1至4任一项所述的DNA数据存储方法，其特征在于，诱导所述产芽孢细菌形成孢子后，还包括将所述孢子包覆于干燥剂中。
8.DNA存储介质，其特征在于，包括产芽孢细菌转化体的孢子，所述孢子采用权利要求1至7任一项所述的DNA数据存储方法获得。
9.装置，其特征在于，包括：
编码模块，所述编码模块用于将待存储的数据转化为数据基因；
存储模块，所述存储模块用于将所述数据基因插入到质粒，进而将所述质粒转入产芽孢细菌，并诱导所述产芽孢细菌形成孢子。
10.读取方法，其特征在于，包括以下步骤：取权利要求8所述的DNA存储介质，待孢子萌发且诱导数据基因表达后提取核酸，测序。
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