CN115192605B9 - 二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及四氧化三钴的应用，提供一种二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒的应用，包括二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒在制备延缓衰老和/或提高抗衰老能力的产品中的应用以及二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒在制备增强抗热应激能力的产品中的应用。该二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒能够诱导线粒体DNA与细胞核DNA的含量比例不平衡，并能够激活线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt），从而调节线粒体稳态，以达到延缓衰老、抗衰老的功效，在制备抗衰老药物和/或抗衰老保健品中具有很大的开发前景。
Description
技术领域
本发明涉及四氧化三钴的应用，具体涉及一种二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒在制备延缓衰老和/或提高抗衰老能力的产品中的应用以及二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒在制备增强抗热应激能力的产品中的应用。
背景技术
我国已开始进入老龄化社会，且老龄化程度持续加剧，衰老是导致糖尿病、癌症、心血管疾病和神经退行性疾病的主要危险因素之一。随着全球人口老龄化的出现，多种老年退行性疾病以及随之产生的巨大的医疗费用已成为越来越严重的社会问题。保持老年人群健康状态是减轻人口老龄化带来的社会负担和经济负担的关键环节。因此，研发简便易行，经济有效，安全性高并适宜推广的抗衰老药物或保健食品，不仅对衰老相关疾病的治疗有重要帮助，而且对解决人口老年化问题也有巨大意义。
在抗衰老的研究过程中，生物学家意识到，单独的延长寿命并不能减轻老龄化所带来的沉重的社会经济负担，只有延长健康寿命才具有现实意义。因此，如何降低衰老相关疾病，提高老年人晚年生存质量，延长健康寿命成为衰老研究的热点所在。目前，健康寿命并无严格的指标衡量，一般认为衰老干预手段能够在延长寿命的同时，提高机体的应激能力，改善衰老相关性行为能力和生理功能的退化，即可延长健康寿命。目前为止，最普遍的抗衰老方式是使用抗衰老营养品或药物，然而现有技术中的抗衰老营养品和抗衰老药品的抗衰老效果还有待提高。
Co3O4纳米颗粒是一种性能良好的过渡金属氧化物催化材料，其物理性能和化学性能都非常优异，它具有资源丰富、储能效率高、催化活性好、环境友好等特性，具有巨大的研究与应用潜力，可广泛应用在电池、电容器、磁性材料、催化剂、气体传感器、着色剂、压敏陶瓷材料等领域。近年来，其被发现具有抗菌、抗癌和抗糖尿病的特性而被逐渐应用于生物医学领域。它们具有多种优点，例如易于制造、低毒性、可接受的生物利用度和多种酶样活性。但是，目前关于Co3O4纳米材料在衰老调控中的作用还未见报道。
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）是一种常见的、自由生活的小型土壤线虫。秀丽隐杆线虫成体长1-1.5mm，体宽约70μm，全身透明，以细菌为食，全身共有959个细胞。秀丽隐杆线虫生命周期短暂，能够多次重复寿命实验，并且其与寿命相关的遗传和环境背景较清晰，遗传操作灵活，且其生命周期过程都精准有致，和人类衰老进程大体是一致的，均包括出生期、发育期、成熟期和衰老期等几个过程。随着线虫的衰老，其机体会发生一系列生理、生化水平变化。机体的生理、生化指标，被称为“衰老生物标记”，可以预测线虫的寿命。因此，秀丽隐杆线虫可以作为研究药物抗衰老活性抗衰老分子机制的模型动物。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的Co3O4纳米材料在衰老调控中的作用还未见报道、以及抗衰老营养品和抗衰老药品的缓解衰老的效果还有待提高的问题，提供一种二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒在制备延缓衰老和/或提高抗衰老能力的产品中的应用以及二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒在制备增强抗热应激能力的产品中的应用，二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒具有良好的抗衰老效果，在制备抗衰老药物和/或提高抗衰老能力的产品中具有很大的开发前景。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒在制备延缓衰老和/或提高抗衰老能力的产品中的应用。
优选地，所述延缓衰老和/或提高抗衰老能力包括提高运动能力、降低脂褐素累积量的能力和调节细胞线粒体稳态的能力。
进一步优选地，所述运动能力为肢体运动能力和/或咽部运动能力。
优选地，所述调节细胞线粒体稳态的能力为降低细胞内线粒体DNA与细胞核DNA的转录水平比值的能力和/或激活细胞内线粒体未折叠蛋白反应通路的能力。
优选地，所述产品选自药品、保健品和食品中的至少一种。
进一步优选地，相对于1g的所述产品，所述二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒的添加量为0.005-5μg。
优选地，所述二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒的粒径为100-400nm。
优选地，在所述二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒中，所述二巯基丁二酸的修饰量为20-35（质量）%。
本发明第二方面提供一种二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒在制备增强抗热应激能力的产品中的应用。
优选地，所述产品选自药品、保健品和食品中的至少一种。
进一步优选地，相对于1g的所述产品，所述二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒的添加量为0.005-5μg。
优选地，所述二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒的粒径为100-400nm。
优选地，在所述二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒中，所述二巯基丁二酸的修饰量为20-35（质量）%。
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
（1）二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒具有良好的生物安全性，不良反应和毒副反应弱，且能够显著提高生物体的运动能力，使得中老年生物体的肢体运动能力、咽部运动（进食）能力、头部摆动能力增加，延缓生物体衰老过程中运动能力的衰退；还能够降低生物体内脂褐素累积量，进一步延缓生物体的衰老程度；同时也能够诱导线粒体DNA与细胞核DNA的含量比例不平衡并激活线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt），调节线粒体的代谢稳态，具有良好的抗衰老效果，能够有效延长使用者的寿命，且能够有效应用于制备延缓衰老和/或抗衰老能力的产品中。研究表明，使用该产品后，生物体的寿命能够延长39%以上。
（2）二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒能够增强生物体的热激能力，延长生物体在高温应激环境中的运动能力。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1为实施例1、对比例1-1和对比例1-2中秀丽隐杆线虫体存活率统计图；
图2为实施例1、对比例1-1、对比例1-2中秀丽隐杆线虫的电子显微镜图以及秀丽隐杆线虫的体长统计图，其中，A为秀丽隐杆线虫的电子显微镜图，B为秀丽隐杆线虫的体长统计图；
图3为实施例2和对比例2中秀丽隐杆线虫体存活率统计图；
图4为实施例2和对比例2中秀丽隐杆线虫体存活率曲线图，结果以Mean±SEM表示，与空白组对比，n.s.表示没有显著性差异，*P<0.05为显著性差异，**P<0.01为非常显著性差异，***P<0.001为极其显著性差异；
图5为实施例2和对比例2中秀丽隐杆线虫的咽部运动统计图，结果以Mean±SEM表示，与空白组对比，n.s.表示没有显著性差异，*P<0.05为显著性差异，**P<0.01为非常显著性差异；
图6为实施例3、对比例3-1和对比例3-2中秀丽隐杆线虫的咽部运动统计图，其中，A为对比例3-2中线虫的不同咽部运动能力的线虫数量统计图，B为对比例3-1中线虫的不同咽部运动能力的线虫数量统计图，C为实施例3、对比例3-1和对比例3-2中秀丽隐杆线虫在不同阶段的咽部运动能力统计图，结果以Mean±SEM表示，与空白组对比，n.s.表示没有显著性差异，*P<0.05为显著性差异，**P<0.01为非常显著性差异，***P<0.001为极其显著性差异；
图7为实施例3、对比例3-1和对比例3-2中秀丽隐杆线虫在不同阶段的身体摆动能力统计图，结果以Mean±SEM表示，与空白组对比，n.s.表示没有显著性差异，*P<0.05为显著性差异，**P<0.01为非常显著性差异，***P<0.001为极其显著性差异；
图8为实施例3、对比例3-1和对比例3-2中脂褐素的累积电镜图及荧光强度统计图，结果以Mean±SEM表示，与空白组对比，n.s.表示没有显著性差异，*P<0.05为显著性差异，**P<0.01为非常显著性差异，其中，A为对比例3-2中脂褐素的累积电镜图，B为对比例3-1中脂褐素的累积电镜图，C为实施例3中脂褐素的累积电镜图，D为脂褐素的荧光强度统计图；
图9为实施例3、对比例3-1和对比例3-2中秀丽隐杆线虫在35℃生活后的身体弯曲次数统计图，A为秀丽隐杆线虫的成虫一天的身体弯曲次数统计图，B为秀丽隐杆线虫的成虫七天的身体弯曲次数统计图，结果以Mean±SEM表示，与空白组对比，n.s.表示没有显著性差异，*P<0.05为显著性差异，**P<0.01为非常显著性差异；
图10为实施例3、对比例3-1和对比例3-2中秀丽隐杆线虫在35℃生活后的头部摆动次数统计图，A为秀丽隐杆线虫的成虫一天的头部摆动次数统计图，B为秀丽隐杆线虫的成虫七天的头部摆动次数统计图，结果以Mean±SEM表示，与空白组对比，n.s.表示没有显著性差异，*P<0.05为显著性差异，**P<0.01为非常显著性差异；
图11为实施例3和对比例3-2中成年第1天和第7天mtDNA/nDNA比率的倍数变化图，a为对比例3-2中线虫的nd-1与act-3的转录水平比值，b为实施例3中线虫的nd-1与act-3的转录水平比值；
图12为实施例3、对比例3-1和对比例3-2中二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒对激活线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt）通路报告基因Phsp-6::GFP的表达的影响，A为激光共聚焦图结果，B为荧光定量结果；
图13为实施例4、对比例4-1和对比例4-2中atfs-1和ubl-5干扰后，二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒对线虫的线粒体未折叠蛋白反应UPRmt报告基因Phsp-6::GFP的表达的影响的荧光定量结果；
图14为实施例4、对比例4-1、对比例4-2和对比例4-3中atfs-1和ubl-5干扰后线虫的存活曲线和咽部运动能力图，其中，A为存活曲线，B为咽部运动能力图。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
如前所述，本发明第一方面提供一种二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒在制备延缓衰老和/或抗衰老的产品中的应用。
所述延缓衰老和/或抗衰老的产品可以是延长生物体寿命的产品，也可以是改善生物体咽部运动能力、身体弯曲能力、头部摆动能力等方面运动能力的产品，或者是降低生物体内脂褐素累积量的产品，或者是调节细胞线粒体代谢稳定的产品。
本发明给二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒提供了一种新的用途，且发明人研究发现，二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒具有良好的生物安全性，不良反应和毒副反应弱，且能够显著提高生物体的运动能力，使得中老年生物体的肢体运动能力、咽部运动（进食）能力、头部摆动能力增加，延缓生物体衰老过程中运动能力的衰退；还能够降低生物体内脂褐素累积量，进一步延缓生物体的衰老程度；同时也能够诱导线粒体DNA与细胞核DNA的含量比例不平衡并激活线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt），调节线粒体稳态，具有良好的抗衰老效果，能够有效延长使用者的寿命，且能够有效应用于制备延缓衰老和/或抗衰老能力的产品中。研究表明，使用该产品后，生物的寿命能够延长39%以上。
具体地，该二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴可以通过商购得到，也可以通过现有技术中公开的制备方法制备得到。作为本发明的一个具体实施方式，所述二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴的制备方法包括：如下步骤：
S1、在酸性条件下，将四氧化三钴分散液和二巯基丁二酸-有机溶剂溶液进行混合反应，经固液分离、洗涤后得到反应产物；
S2、将所述反应产物和水混合，调节pH至9以上后分散形成混合溶液；
S3、将所述混合溶液调节至中性，经提纯、固液分离后得到所述二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒。
所述四氧化三钴和所述二巯基丁二酸可以以任意比混合。为了能够进一步提高二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒的产率。优选地，所述四氧化三钴和所述二巯基丁二酸的质量比为1:3-5，具体可以为1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值。
为了能够进一步提高四氧化三钴和二巯基丁二酸的反应效果，优选地，在步骤S1中，所述酸性条件的pH为2-3，具体可以是2、2.2、2.4、2.6、2.8、3，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值。所述酸性条件可以由酸或酸式盐提供，如盐酸、硫酸等。优选地，所述酸性条件由盐酸提供。酸的浓度没有特殊的限定，只需要将溶液的pH调节至上述pH即可。
为了能够进一步提高四氧化三钴和二巯基丁二酸的反应效果，优选地，在步骤S1中，所述混合反应包括：将四氧化三钴分散液和二巯基丁二酸-有机溶剂溶液在搅拌的条件下混合然后进行超声反应和搅拌反应。
在本发明中，对搅拌速率和搅拌时间没有特殊要求，只需要能将四氧化三钴分散液和二巯基丁二酸-有机溶剂溶液混合均匀即可。作为本发明的一个具体实施方式，所述搅拌的条件包括：转速为500-2000rpm。
优选地，所述超声反应的条件包括：功率为50-200W，时间为1-3h；所述搅拌反应的条件包括：转速为1000-3000rpm，时间为4-6h。在上述条件下进行反应，能够更进一步提高四氧化三钴和二巯基丁二酸的反应效果。
根据本发明，在步骤S1中，所述四氧化三钴分散液为四氧化三钴-水分散液。所述四氧化三钴和所述水的质量比没有特殊限定，只需要能够形成分散液即可。二巯基丁二酸和有机溶剂溶的混合质量比没有特殊限定，只需要能够形成溶液即可。示例性的，所述四氧化三钴和所述水的质量比为0.01-0.04:100，二巯基丁二酸和有机溶剂溶的混合质量比为0.03-0.05:1。
所述有机溶剂可以为任意一种能够与二巯基丁二酸互溶的有机溶剂。优选地，在步骤S1中，所述有机溶剂选自二甲基亚砜、乙醇和乙二醇的至少一种，进一步优选为二甲基亚砜。
优选地，在步骤S2中，将所述反应产物和水混合，调节pH至9-10以上后分散形成混合溶液。在该条件下能够有效控制产生的纳米颗粒的粒径。
调节pH可以用常用的碱或碱式盐调节。优选地，采用氢氧化钠和/或氢氧化钾调节pH。
所述分散可以采用任意可行的方式分散，如超声、震荡或搅拌等。为了能够进一步提高分散效果，优选地，在步骤S2中，所述分散的方式为超声分散。所述超声分散的条件没有特殊限定，只需要能够形成混合溶液即可。
根据本发明，优选地，在步骤S3中，所述提纯的方式为透析提纯。
优选地，在步骤S3中，所述固液分离的方式为滤膜分离。所述滤膜为0.22μm滤膜。
优选地，所述延缓衰老和/或提高抗衰老能力包括提高运动能力、降低脂褐素累积量的能力和调节细胞线粒体稳态的能力。进一步优选地，所述运动能力为肢体运动能力和/或咽部运动能力，所述调节细胞线粒体稳态的能力为降低细胞内线粒体DNA与细胞核DNA的转录水平比值的能力和/或激活细胞内线粒体未折叠蛋白反应通路的能力。
根据本发明，优选地，所述运动能力为肢体运动能力和/或吞咽能力。
优选地，所述产品选自药品、保健品和食品中的至少一种。所述药品或保健品的剂型为口服液、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂或丸剂，上述各种剂型的药物或保健品均可以按照本领域常规方法制备，也可以包含药学上或保健品上可接受的载体。
为了能够进一步提高二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒的作用效率，优选地，相对于1g的所述产品，所述二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒的添加量为0.005-5μg，具体可以为0.005μg、0.01μg、0.025μg、0.05μg、0.075μg、0.1μg、0.25μg、0.5μg、0.75μg、1μg、2.5μg、5μg，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值。在该添加量的情况下，二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒具有较高的吸收效率，且产品能够最大程度地发挥其缓解衰老的效果。
优选地，所述二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒的粒径为100-400nm，具体可以为100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值。发明人研究过程中发现，将二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒的粒径控制在上述范围能够进一步提高生物体对纳米颗粒的吸收，从而进一步提高其延缓衰老的作用。
在所述二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒中，所述二巯基丁二酸的修饰量可以为10-50（质量）%。为了能够进一步提高其延缓衰老的效果，优选地，在所述二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒中，所述二巯基丁二酸的含量为20-35（质量）%，具体可以是20（质量）%、22.5（质量）%、25（质量）%、27.5（质量）%、30（质量）%、32.5（质量）%、35（质量）%，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值。从更进一步提高其延缓衰老的效果来考虑，在所述二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒中，所述二巯基丁二酸的含量进一步优选为25-30（质量）%。
本发明第二方面提供一种二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒在制备增强抗热应激能力的产品中的应用。
具体地，该二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒可以通过购买得到，也可以通过上述记载的制备方法制备得到。增强抗热应激能力的产品可以是增强生物体抵抗外界热胁迫能力（即抗热应激能力）的产品，对于生物体的外界热胁迫指的是以高于生物体生长适应的温度范围最高点，对生物体产生代谢、生长发育胁迫的现象，例如，线虫的外界热胁迫温度可以采用32-40℃。
具体地，该制剂可以选自药品、保健品和食品中的至少一种。所述药品或保健品的剂型为口服液、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂或丸剂，上述各种剂型的药物或保健品均可以按照本领域常规方法制备，也可以包含药学上或保健品上可接受的载体。
发明人研究发现，将二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒用于制备提高动物抗逆能力制剂，不仅能够给二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒提供一种新的用途，而且二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒能够增强生物体对外界的急性热胁迫的抵抗作用，延长生物体在急性热胁迫环境中的运动能力。
优选地，相对于1g的所述产品，所述二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒的添加量为0.005-5μg，具体可以为0.005μg、0.01μg、0.025μg、0.05μg、0.075μg、0.1μg、0.25μg、0.5μg、0.75μg、1μg、2.5μg、5μg，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值。在该添加量的情况下，产品能够发挥更好的抗热应激能力，且具有较高的利用率。
在所述二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒中，所述二巯基丁二酸的修饰量可以为10-50（质量）%。为了能够进一步增强食用者的抗热应激能力，优选地，在所述二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒中，所述二巯基丁二酸的含量为20-35（质量）%，具体可以是20（质量）%、22.5（质量）%、25（质量）%、27.5（质量）%、30（质量）%、32.5（质量）%、35（质量）%，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值。从更进一步增强食用者的抗热应激能力来考虑，在所述二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒中，所述二巯基丁二酸的含量进一步优选为25-30（质量）%。
优选地，所述二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒的粒径为100-400nm。发明人研究过程中发现，将二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒的粒径控制在上述范围能够进一步提高动物对该药物的吸收效果，进而能够进一步增强动物的抗热应激能力。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例和对比例中，秀丽线虫来源：野生型N2线虫获自Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota)；SJ4100 (zcIs13 [HSP-6::GFP])，获自Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota)，该SJ4100在线粒体中特异性表达HSP-6::GFP的蠕虫用于UPRmt的体内监测。
大肠杆菌OP50的培养条件：振荡培养箱，220rpm，37℃培养。野生型秀丽隐杆线虫的培养条件：恒温恒湿培养箱，20℃，湿度45%-55%。
电子显微镜购于日本Nikon公司，发光检测仪购自Promega公司，线粒体功能测定系统Seahorse XF96购自美国Seahorse Bioscience公司，超净工作台购自苏州金净设备科技有限公司。
二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒购于南京东纳纳米有限公司，产品编号为Mag1200/2200，粒径为200nm；CoCl2购于Sigma-Aldricha公司；q-PCR引物由上海生工生物有限公司制备得到，具体引物为文献：The NAD+/Sirtuin Pathway Modulates Longevity through Activation of Mitochondrial UPR and FOXO Signaling，Laurent Mouchiroud，et al，Cell，Volume 154，Issue 2，18 July 2013，Pages 430-441中公开的引物序列；FUDR购自上海阿拉丁试剂有限公司，产品编号为50-91-9；Juglone购自北京源叶生物有限公司，产品编号为481-39-0。具有靶向atfs-1的siRNA的PL4440质粒克隆的OP50细菌菌种以及具有靶向ubl-5的siRNA的PL4440质粒克隆的OP50细菌菌种均购自上海禾生物科技有限公司。其余化学试剂和原料均为常规的市售品。
秀丽隐杆线虫的同步化：
将生长状态良好的成虫（约1000条）收集到离心管里，加1mL M9缓冲液洗去多余的大肠杆菌OP50；离心管内保留上清液750μL，加入50μL 1M KOH溶液和200μL 5质量%次氯酸钠溶液，在涡旋振荡器上振荡3min，一边振荡一边在体视显微镜下检测，若虫体断裂则尽快用M9缓冲液清洗3-5遍，清洗后用微型离心机离心，去掉多余的溶液并留下卵，再加500μL M9缓冲液放在20℃摇床，虫卵在16h孵化成同步化的L1幼虫。
秀丽隐杆线虫寿命实验的前期准备：线虫培养平板（NGM培养基平板）。
配置NGM培养板：NaCl 3g、琼脂17g、蛋白胨2.5g，加双蒸水至1000mL，PH调至6.0，灭菌。55℃水浴平衡15分钟，防止温度过低，培养基凝固。
制作培养平板：
制作过程在超净工作台中操作。培养皿、磁力搅拌器、手套、所需添加的物质紫外灭菌后，首先将装有培养基的锥形瓶放在磁力搅拌器上搅拌，转速以不产生气泡为标准。然后用酒精棉球把手套擦干净，拆开培养板包装和瓶口封口膜（手套不要触碰瓶口）。依次加入25mL KH2PO4溶液（1M）、1mL CaCl2溶液（1M）、1mL MgSO4溶液（1M），然后在搅拌过程中，沿着瓶壁缓慢滴加1mL胆固醇溶液（5mg/mL），使其充分与瓶内溶液混匀，使得溶液表面无可见的油滴。将培养基倒在9cm直径的培养皿上，尽量使培养基中无可见气泡。倒板后，培养皿室温静止放置一天，培养基凝固后待用。
将10mg二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒（DMSA-Co3O4NPs）和1mL水混合，配置成DMSA-Co3O4NPs母液。
将10mg CoCl2和1mL水混合，配置成CoCl2溶液。
实施例1
将一定体积DMSA-Co3O4NPs母液加入到OP50大肠杆菌菌液中混匀，并均匀涂到含80μM的2'-脱氧-5-氟尿苷（FUDR）的NGM平板上，配置成浓度为5μg/mL的DMSA-Co3O4NPs线虫培养平板，然后将同步化的L1生长发育期野生型线虫株（50-100条线虫）转移到DMSA-Co3O4NPs线虫培养平板上在20℃条件下培养3天。
对比例1-1
将一定体积CoCl2溶液加入到OP50大肠杆菌菌液中混匀，并均匀涂到含80μM的FUDR的NGM平板上，配置成浓度为5μg/mL的CoCl2线虫培养平板，然后将同步化的L1生长发育期野生型线虫株（50-100条线虫）转移到5μg/mL CoCl2线虫培养平板上在20℃条件下培养3天。
对比例1-2
将OP50大肠杆菌菌液均匀涂到含80μM的FUDR的NGM平板上，配置成空白线虫培养平板，然后将同步化的L1生长发育期野生型线虫株（50-100条线虫）转移到空白线虫培养平板上在20℃条件下培养3天。
DMSA-Co
3
O
4
NPs的生物安全性研究
使用电子显微镜隔天统计实施例1、对比例1-1和对比例1-2线虫死亡数目并对线虫拍照（参见图2中A），计算出存活率（参见图1），结果显示，线虫培养3天后，空白对照组（对比例2）和CoCl2处理组（对比例1）的线虫几乎均处于存活状态，实验组（实施例1）的线虫也几乎均处于存活状态。表明DMSA-Co3O4NPs不影响秀丽线虫正常的生存率，其具有良好的生物安全性。
用Image J软件分析并统计实施例1、对比例1和对比例2中的线虫体长，汇总数据，用Graph Pad软件绘制结果（参见图2中B）。结果显示，线虫培养3天后，空白对照组的线虫体长大概是1400-1500μm，CoCl2处理组的线虫体长也大概是1400μm，DMSA-Co3O4NPs处理组大概是1500μm。表明DMSA-Co3O4NPs不影响秀丽线虫的体长，其具有良好的生物安全性。
实施例2
将不同体积DMSA-Co3O4NPs母液分别加入到OP50大肠杆菌菌液中混匀，然后均匀涂到琼脂糖（NGM）培养板上，配置成浓度为0.005-5μg/mL的DMSA-Co3O4NPs线虫培养平板，然后将同步化的L1生长发育期野生型线虫株转移到DMSA-Co3O4NPs线虫培养平板上在20℃条件下进行培养，每组约30-50条线虫，待培养线虫2天后，线虫生长至L4期时，加入FUDR，使平板FUDR终度达到80μM，20℃条件下继续培养线虫。
对比例2
将OP50大肠杆菌菌液均匀涂到NGM平板上，配置成空白对照组线虫培养平板，然后将同步化的L1生长发育期野生型线虫株（30-50条线虫）转移到空白对照组线虫培养平板上在20℃条件下进行培养，待培养线虫2天后，线虫生长至L4期时，加入FUDR，使平板FUDR终度达到80μM，20℃条件下继续培养线虫。
寿命的研究
使用电子显微镜隔天统计实施例2和对比例2中线虫死亡数目，将死亡的线虫移出培养皿。统计成虫第一天的存活率（参见图3）并用Graph Pad绘制整个生长周期生存曲线，计算显著性差异(Log-rank test)，其结果图4所示，对数据进行统计，平均寿命统计如表1所示。由图4可知，0.005-5μg/mL的DMSA-Co3O4NPs处理（实施例2）与空白对照理（对比例2）L1幼虫三天后的秀丽隐杆线虫体存活率之间没有显著性差异，基本为100%存活，说明0.005-5μg/mL的DMSA-Co3O4NPs对线虫不具有急性毒性，DMSA-Co3O4NPs在0.005-5μg/mL浓度范围具有良好的安全性。由表1可知，空白对照组线虫的平均寿命大概是12.2天，在0.005-5μg/mL DMSA-Co3O4NPs处理组中，我们注意到与空白对照组相比，其平均寿命显著提高，其平均寿命达到17-19天，表明DMSA-Co3O4NPs能延长线虫的寿命。
表1
吞咽能力的研究一
统计实施例2和对比例2中线虫的吞咽次数，咽部小球的来回伸缩一次定义为一次咽部运动，观察日期持续。从L4期（定义为Adult day 0）开始到成虫期第7天（Adult day 7），统计一次线虫的咽泵频率（咽部运动速率），统计结果如图5所示，在成虫第7天时，空白对照组平均次数62.4次/30s，0.005μg/mL DMSA-Co3O4NPs处理组平均次数90.3次/30s；0.05μg/mL DMSA-Co3O4NPs处理组平均次数86.1次/30s，0.5μg/mL DMSA-Co3O4NPs处理组平均次数84.7次/30s，5μg/mL DMSA-Co3O4NPs处理组平均次数87.9次/30s，相比于空白对照组，0.005μg/mL-5μg/mL的DMSA-Co3O4NPs处理组的线虫咽部运动速率有显著提升。以上说明：DMSA-Co3O4NPs在0.005μg/mL-5μg/mL浓度条件范围时喂养线虫后，秀丽隐杆线虫具有较高的吞咽频率，其活性得到显著提高，此时具有更好的抗衰老效果。
实施例3
将DMSA-Co3O4NPs母液加入到OP50突变型大肠杆菌菌液中混匀，并均匀涂到含80μM的FUDR的NGM平板上，配置成浓度为0.05μg/mL的DMSA-Co3O4NPs线虫培养平板，然后将同步化的L4生长发育期野生型线虫株（30-50条）转移到DMSA-Co3O4NPs线虫培养平板上在20℃条件下进行培养。
对比例3-1
将CoCl2溶液加入到OP50突变型大肠杆菌菌液中混匀，并均匀涂到含80μM的FUDR的NGM平板上，配置成浓度为0.05μg/mL的CoCl2对照组线虫培养平板，然后将同步化的L4生长发育期野生型线虫株（30-50条）转移到CoCl2对照组线虫培养平板上在20℃条件下进行培养。
对比例3-2
将与实施例3以及对比例3-1等量的空白OP50突变型大肠杆菌菌液均匀涂到含80μM的FUDR的NGM平板上，配置成空白对照组线虫培养平板，然后将同步化的L4生长发育期野生型线虫株（30-50条）转移到空白对照组线虫培养平板上在20℃条件下进行培养。
吞咽能力的研究二
线虫的咽动是进食的体现，随着年龄增长会逐渐减慢。咽动次数降低表明进食频率减弱。统计实施例3、对比例3-1和对比例3-2中线虫吞咽次数，咽部小球的来回伸缩一次定义为一次咽部运动，观察日期持续。从L4期（定义为Adult day 0）开始到成虫期第12天（Adult day 12），每隔一天统计一次线虫的咽部运动频率（咽泵频率），其统计结果如图6中A和B所示。由图可知，从Adult day 0开始，每天观察并录像线虫的咽部运动情况。发现从成虫第6天开始，空白对照组野生型线虫的咽部运动速率随着线虫的衰老逐渐下降，而DMSA-Co3O4NPs处理组线虫的咽部运动速率的下降较空白对照组延迟。通常情况下，根据秀丽线虫的咽部运动速率可将其分为三组：小于6/分钟（无伸缩运动），6-147/分钟（缓慢伸缩运动），大于147/分钟（快速伸缩运动）。对于未处理的线虫，随着线虫的衰老，咽部快速伸缩的线虫数不断减少，慢速伸缩的线虫数不断增多，两条速率变化曲线相交于成虫期第7天（参见图6中A）；而DMSA-Co3O4NPs处理组中的咽部快速伸缩的线虫数以较低速率下降，慢速伸缩组中线虫数以较低速率增加，两条速率变化曲线相交于成虫期第9天之间（参见图6中B）。从结果可以看出：DMSA-Co3O4NPs可以延缓线虫衰老导致的咽部运动速率的下降。
由图6中C可知，在成虫第3天时，空白对照组平均次数99.4次/30s，DMSA-Co3O4NPs处理组平均次数104.1次/30s；CoCl2对照组平均次数98.1次/30s，在成虫第6天时，空白对照组平均次数79次/30s，DMSA-Co3O4NPs处理组平均次数106.7次/30s；CoCl2对照组平均次数22.8次/30s，在成虫第12天时，空白对照组平均次数18.7次/30s，DMSA-Co3O4NPs处理组平均次数44.5次/30s；CoCl2对照组平均次数13.2次/30s，结果显示，与空白对照组和CoCl2对照组相比，DMSA-Co3O4NPs处理组显著提高中老年（成虫第6天到第12天的）秀丽隐杆线虫正常生命体征吞咽频率。
运动能力的研究
秀丽隐杆线虫的运动与其肌肉组织强度相关，通过对线虫身体摆动能力的检测，可以反映材料对线虫运动能力及身体机能的影响。分别收集实施例3、对比例3-1和对比例3-2中成虫第3天、第6天和第12天的秀丽隐杆线虫，统计线虫的身体弯曲次数，线虫向前爬行一个波长的距离记为一次身体弯曲；用Graph Pad计算显著性差异(Two-way ANOVA ,Sidak multiple comparisons test)，误差棒标识的是平均数标准误差(SEM)，结果如图7所示。由图7可知，在成虫第3天时，空白对照组很容易检测到身体的弯曲运动，为4.4次/30s；CoCl2对照组为6.9次/30s；DMSA-Co3O4NPs处理组为5.7次/30s，其相对空白对照组无显著性差异，DMSA-Co3O4NPs处理组总体上提升线虫身体摆动速率，DMSA-Co3O4NPs处理组和CoCl2处理组的线虫身体摆动速率无明显差别。在成虫第6天时，空白对照组很容易检测到身体的弯曲运动，为4.3次/30s；CoCl2对照组为4.4次/30s；DMSA-Co3O4NPs处理组为4.1次/30s，其相对空白对照组及CoCl2处理组的线虫身体摆动速率无显著性差异；随着线虫衰老的进程，在成虫第12天时的空白对照组老年线虫较年轻线虫（成虫第3天和第6天）的身体的弯曲速率下降，为1.9次/30s；而CoCl2对照组为1.9次/30s；DMSA-Co3O4NPs处理组为4.1次/30s，其相对两个对照组均有显著性差异，DMSA-Co3O4NPs处理组总体上提升线虫身体摆动速率。以上结果表明，DMSA-Co3O4NPs显著提高老年（成虫第12天的）秀丽隐杆线虫的身体运动能力。
脂褐素累积的研究
随着衰老的过程，线虫肠道内会逐渐积累一种名为脂褐素的物质，高度被氧化而交联聚集，不会被蛋白酶或溶酶体降解，被视为衰老的“标志染料”。脂褐素在各种衰老细胞中均存在，脂褐素能自发荧光，因此很容易在荧光显微镜下观查。脂褐质是一种不可降解的溶酶体内物质，是秀丽隐杆线虫生理年龄的有用生物标志之一，其积累强度与线虫的年龄相关。收集实施例3、对比例3-1、对比例3-2中成虫第7天的线虫并转移到30μL的0.4M叠氮化钠溶液中麻痹固定，置于2质量%琼脂糖垫片上，待大部分虫体僵直后，小心盖上盖玻片，用激光共聚焦显微镜拍摄线虫体内的脂褐素累积情况（激发光：365nm，发射光：420nm），每个处理组随机选择10条左右线虫拍摄。然后用Image J软件统计各个实验组线虫的体内脂褐素的平均荧光强度。数据结果以Mean±SEM表示，并采用graphpad软件进行One-way ANOVAY统计分析。激光共聚焦显微镜图如图8中A、B和C所示，统计结果如图8中D所示。如图8所示，在成虫第7天时，在空白对照组和CoCl2对照组中，在线虫的肠道中观察到许多发光的脂褐素；DMSA-Co3O4NPs处理组的脂褐素荧光强度远弱于空白对照组和CoCl2对照组，定量分析数据也同样证明了该发现，空白对照组荧光强度值为154.3%，CoCl2对照组的脂褐素荧光强度值为143.8%，DMSA-Co3O4NPs处理组的脂褐素荧光强度值为122.9%，和空白对照组相比下降了20%，和CoCl2对照组相比下降了15%。
以上结果表明，相比于CoCl2，DMSA-Co3O4NPs能够显著延缓衰老相关的脂褐素积累。
抗热应激能力的研究
温度是影响机体衰老的重要因素之一，高温环境会导致细胞内生物大分子的结构被破坏，功能受损，从而诱导加速的衰老进程。因此提高对热应激压力的耐受性可以延缓衰老症状。分别收集实施例3、对比例3-1和对比例3-2中成虫期第1天和第7天的秀丽隐杆线虫，置于35℃培养箱中3小时，然后转移到空白NGM固态培养基上在20℃恢复1小时。对线虫的身体弯曲频率和头部摆动频率进行记录。线虫向前爬行一个波长的距离记为一次身体弯曲；，线虫头部从一侧摆到另一侧再摆回来记为一次头部摆动；统计数据，用Graph Pad计算显著性差异 (Two-way ANOVA ,Sidak multiple comparisons test)，误差棒标识的是平均数标准误差（SEM），统计结果如图9和图10所示。
由图9可知，在成虫第1天的空白对照组中，线虫身体弯曲速率为0.62次/20s，而DMSA-Co3O4NPs处理组的身体弯曲速率是空白对照组的线虫的身体弯曲速率的6.07倍，是CoCl2对照组弯曲速率的6.12倍；随着年龄增加，线虫在高温胁迫下线虫的身体弯曲能力下降，在成虫第7天的空白对照组中，线虫身体弯曲速率为0.19次/20s，而DMSA-Co3O4NPs处理组的身体弯曲速率是空白对照组的线虫的身体弯曲速率的3.2倍，是CoCl2对照组弯曲速率的2.9倍。
由图10可知，在成虫第1天的空白对照组中，线虫头部摆动速率为2.33次/20s，而DMSA-Co3O4NPs处理组的头部摆动速率是空白对照组的线虫的身体弯曲速率的3.97倍，是CoCl2对照组弯曲速率的3.60倍；随着年龄增加，线虫在高温胁迫下的头部摆动能力下降，在成虫第7天的空白对照组中，线虫头部摆动速率为0.98次/20s，而DMSA-Co3O4NPs处理组的身体弯曲速率是空白对照组的线虫的身体弯曲速率的5.25倍，是CoCl2对照组弯曲速率的3.21倍。
以上数据说明二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒能够增强秀丽线虫在高温胁迫下的肌肉运动，提高高温胁迫下线虫的运动行为能力。
细胞内nd-1（线粒体DNA）与act-3（细胞核DNA）的转录水平的研究
个体衰老的进程中，抗氧化防御系统作用减弱，线粒体内自由基不能有效地清除而积累，从而导致线粒体的氧化性损伤和线粒体mDNA突变的累积。根据“衰老线粒体学说”，人体内体细胞mDNA含量的增加与衰老及伴随的老年衰退性疾病有密切关系。收集实施例3、对比例3-2中成虫第1天和第7天的线虫（每组500-1000条），
使用TRIZOL（Invitrogen）从收裂解秀丽隐杆线虫并根据mRNA提取说明书加入三氯甲烷和异丙醇提取总mRNA，使用RQ1 RNase-Free DNase (Promega #M6101) 擦除DNA。使用M-MLV逆转录酶 (Invitrogen #28025013) 合成cDNA。使用SYBR Green Supermix和引物通过实时PCR测定基因表达水平。nd-1与act-3的相对内参基因的表达值的比率可以代表线粒体DNA和细胞核DNA含量的比值，结果如图11所示。
从图11可知，在成虫第1天时，相比空白对照组（a），DMSA-Co3O4NPs处理后的线虫（b）的nd-1（线粒体DNA）与act-3（细胞核DNA）的转录水平比值下降了56%；在成虫第7天时，DMSA-Co3O4NPs处理后的线虫的nd-1（mDNA）与act-3（nDNA）的转录水平比值下降了68%；以上结果表明DMSA-Co3O4NPs可以下调成虫第1天和第7天的线粒体DNA含量。
线粒体未折叠蛋白反应通路的研究一
线粒体和细胞核的DNA含量比例不平衡可以激活线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt）通路。UPRmt可随后转移并激活核转录反应并诱导FOXO转录因子HSP-6触发抗氧化保护程序并恢复线粒体代谢稳态，这是一种保守的长寿机制。分别收集实施例3、对比例3-1和对比例3-2中成虫第7天的线虫并转移到30μL的0.4M叠氮化钠溶液中麻痹固定，置于2质量%琼脂糖垫片上，待大部分虫体僵直后，小心盖上盖玻片，用激光共聚焦显微镜拍摄线虫体内的脂褐素累积情况（激发光：488nm，发射光：512nm），每个处理组随机选择10条左右线虫拍摄。用Image J软件统计线虫的体内HSP-6::GFP的平均荧光强度。数据结果以Mean±SEM表示，并采用graphpad软件进行One-way ANOVAY统计分析，统计结果如图12所示。
从图12中A和B可知，相比空白对照组和CoCl2对照组，DMSA-Co3O4NPs处理后的线虫的hsp-6的蛋白表达水平明显提升，以空白对照组的hsp-6平均荧光强度值为100%计，CoCl2对照组的hsp-6平均荧光强度值为127.6%，DMSA-Co3O4NPs处理后的hsp-6平均荧光强度值为160%，其相对CoCl2对照组提升了约25%。结果表明DMSA-Co3O4NPs诱导了线粒体未折叠蛋白反应通路的激活。
实施例4
将OP50菌种转移到含有100μg/mL羧苄青霉素的LB培养基中220rpm 37℃摇菌过夜。然后配置含有羧苄青霉素（25μg/mL）、异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG，1mM）和2'-脱氧-5-氟尿苷（FUDR，80μM）的NGM培养平板，将OP50和DMSA-Co3O4NPs混匀后在NGM板和上涂匀，制备出终浓度为0.05μM DMSA-Co3O4NPs的NGM培养平板。将在L4阶段将大约35-50条同步线虫放在上述NGM培养平板上，然后在成虫第一天收集线虫。
对比例4-1
参照实施例4方法，制备出仅含有携带空载体L4440的OP50细菌的空白平板。在L4阶段将大约35-50条同步线虫放在上述空白平板上，然后在成虫第一天收集线虫。
对比例4-2
将含有靶向ubl-5的siRNA的PL4440质粒克隆的OP50细菌菌种和含有靶向atfs-1的siRNA的PL4440质粒克隆的OP50细菌菌种分别转移到含有100μg/mL羧苄青霉素的LB培养基中220rpm 37℃摇菌过夜。然后配置含有羧苄青霉素（25μg/mL）、异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG，1mM）和2'-脱氧-5-氟尿苷（FUDR，80μM）的NGM培养平板，将两种OP50和DMSA-Co3O4NPs混匀后在NGM板和上涂匀，制备出含有ubl-5 siRNA和终浓度为0.05μM DMSA-Co3O4NPs的NGM培养平板以及含有atf-1 siRNA和终浓度为0.05μM DMSA-Co3O4NPs的NGM培养平板。将在L4阶段将大约35-50条同步线虫放在上述NGM培养平板上，然后在成虫第一天收集线虫。
对比例4-3
参照对比例4-2方法，制备出仅含有携带靶向atfs-1的siRNA的PL4440质粒克隆的OP50细菌菌种的空白NGM平板和仅含有携带靶向ubl-5的siRNA的PL4440质粒克隆的OP50细菌菌种的空白NGM平板。将在L4阶段将大约35-50条同步线虫放在上述NGM平板上，然后在成虫第一天收集线虫。
线粒体未折叠蛋白反应通路的研究二
泛素样蛋白5（ubl-5）和激活转录因子-1（atfs-1）是两个重要的UPRmt调节分子，分别激活线粒体伴侣和控制线粒体转录。对野生型的线虫进行了对atfs-1和ubl-5两个基因的RNAi实验。具有靶向atfs-1的siRNA的PL4440质粒克隆的OP50细菌菌种以及具有靶向ubl-5的siRNA的PL4440质粒克隆的OP50细菌菌种均购自上海禾生物科技有限公司。参照线粒体未折叠蛋白反应通路的研究一中所示方法检测实施例4、对比例4-1、对比例4-2和对比例4-3中hsp-6的表达情况（参见图13）。
如图13显示，对于携带空白L4440载体的大肠杆菌制备的培养平板，DMSA-Co3O4NPs处理组的线虫（实施例4）相对没有DMSA-Co3O4NPs处理的线虫（对比例4-1），UPRmt通路标记分子hsp-6显著提升；siRNA干扰掉UPRmt通路的关键分子atfs-1或ubl-5后，DMSA-Co3O4NPs处理组的线虫（对比例4-2）相对于没有DMSA-Co3O4NPs处理的线虫（对比例4-3）hsp-6的表达没有明显差别。以上结果表明DMSA-Co3O4NPs可以有效激活UPRmt通路。
线粒体未折叠蛋白反应通路的研究三
参照寿命的研究中所示方法，使用电子显微镜隔天统计实施例4、对比例4-1、对比例4-2和对比例4-3中线虫死亡数目，将死亡的线虫移出培养皿，直到所有线虫死亡。汇总数据，用Graph Pad绘制生存曲线，其结果如图14所示，统计结果如表2所示；参照吞咽能力的研究一的检验咽部运动的方法，隔天检测实施例4、对比例4-1、对比例4-2和对比例4-3中线虫的咽部运动速率（参见图14）。
如图14中A和B显示：对于携带空白L4440载体的大肠杆菌制备的培养平板，DMSA-Co3O4NPs处理组的线虫（实施例4）相对没有DMSA-Co3O4NPs处理的线虫（对比例4-1）寿命更长、咽部运动能力更强；siRNA干扰掉UPRmt通路的关键分子atfs-1或ubl-5后，DMSA-Co3O4NPs处理组的线虫（对比例4-2）相对于没有DMSA-Co3O4NPs处理的线虫（对比例4-3）寿命延长和运动能力增加的作用消失。寿命定量结果如表2所示，以上结果表明UPRmt通路的激活是DMSA-Co3O4NPs抗衰老的主要途径。
表2
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒在制备延缓衰老和/或提高抗衰老能力的药品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述延缓衰老和/或提高抗衰老能力包括提高运动能力、降低脂褐素累积量的能力和调节细胞线粒体稳态的能力。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述运动能力为肢体运动能力和/或咽部运动能力。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述调节细胞线粒体稳态的能力为降低细胞内线粒体DNA与细胞核DNA的转录水平比值的能力和/或激活细胞内线粒体未折叠蛋白反应通路的能力。
5.二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒在制备增强抗热应激能力的药品中的应用。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于，相对于1g的所述药品，所述二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒的添加量为0.005-5μg。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于，所述二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒的粒径为100-400nm。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于，在所述二巯基丁二酸修饰的四氧化三钴纳米颗粒中，所述二巯基丁二酸的修饰量为20-35质量%。
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