CN115181800A - 基因标志物在非小细胞肺癌预后效果预测中的应用、预测装置以及计算机可读取介质 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因标志物在非小细胞肺癌预后效果预测中的的应用、预测装置以及计算机可读取介质，属于医学分子生物学技术领域。通过对阿法替尼治疗患者进行NGS检测及获益时间随访分析，找到了可以用于EGFR阳性非小细胞肺癌患者阿法替尼治疗疗效预测的分子标志物：Mutation signature APOBEC，能够有效地区分出阿法替尼原发耐药患者，及时调整临床方案，从而使得患者能够更好的获益。
Description
技术领域
本发明涉及基因标志物在非小细胞肺癌预后效果预测中的的应用、预测装置以及计算机可读取介质，主要涉及一种用于EGFR阳性非小细胞肺癌阿法替尼治疗疗效预测的分子标志物，属于医学分子生物学技术领域。
背景技术
肺癌是全球发病率和致死率最高的癌种之一，其中非小细胞肺癌（NSCLC）为其主要的病理学亚型，占比约为80%-85%。EGFR基因是非小细胞肺癌中常见的可靶点基因，大约10-50%的患者携带EGFR基因激活突变。在中国NSCLC患者中EGFR基因突变频率更可高达35-50%，常见于女性，非吸烟及腺癌患者。在正常细胞中，EGFR受体和配体结合，激活下游一系列通路，促使细胞生长、增殖。通常情况下，EGFR功能是受到严密控制，行使完功能后则被关闭。然而，当EGFR发生突变，形成的受体不再需要其它的讯号，自己会不停地发出讯息，通路持续活化后影响细胞的增殖、分化、信号的传导、血管的形成、细胞凋亡的抑制等，最终导致癌症的发生。
2005年针对EGFR基因的第一款靶向药物吉非替尼在国内获批，而后基于IPASS研究，奠定了其一线治疗地位，拉开了肺癌靶向治疗的序幕。而后一系列靶向药物，如厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼等均获得了相关适应症。其中阿法替尼属于第二代EGFR-TKI，是第一个不可逆性ErbB家族阻滞剂，可抑制应用于表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶，阿法替尼能够不可逆性地阻断EGFR以及其他ErbB家族的其他相关成员。对于EGFR少见突变，如G719X, L861Q和S768I等，阿法替尼展示出比其他TKI更好的疗效。另外也有报道EGFR 20ins，EGFR-KDD，EGFR复合突变患者使用阿法替尼具有很好的临床获益。但不可避免地在使用阿法替尼一段时间后会出现耐药的情况。相应的耐药机制包括EGFR自身变异，其中以T790M为主，大概占了50%。其他的耐药机制包括下游或是旁路的激活，如PI3K-AKT通路激活，ERBB2扩增，MET扩增及KRAS基因突变等。相比于继发耐药患者，原发耐药患者通常在用药后的三个月内即发生进展，目前对于阿法替尼原发耐药相关的研究较少。只有清楚EGFR-TKI原发性耐药的分子机制，才能及时调整治疗方案，给患者更多的临床获益。
发明内容
本发明通过基因数据的筛选，找到了可以用于评估EGFR阳性非小细胞肺癌阿法替尼治疗疗效相关的分子标志物，利用标志物对患者的无进展生存时间（PFS）进行评估时，具有较好的区分效果。
用于检测TP53基因或者APOBEC特征性突变占比的试剂在用于制备阿法替尼治疗EGFR阳性非小细胞肺癌的耐药性评估试剂中的应用；所述的APOBEC特征性突变占比是指APOBEC特征性突变占全部体细胞单碱基突变的比例。
所述的APOBEC特征性突变是指COSMIC Mutation Signature中的Signature 2和Signature 13突变特征之和。
所述的耐药性评估是通过采用无进展生存时间（PFS）作为指标。
所述的应用中还包括判定APOBEC特征性突变占比与阈值比较的步骤。
所述的阈值是0.36-0.38。
一种用于评估阿法替尼治疗EGFR阳性非小细胞肺癌的耐药性的装置，包括：
测序模块，用于对样本进行测序，获得样本的体细胞基因突变信息；
分析模块，用于根据体细胞基因突变信息分析出TP53基因变异情况或者APOBEC特征性突变占比；所述的APOBEC特征性突变占比是指APOBEC特征性突变占全部体细胞单碱基突变的比例；
判定模块，根据TP53基因变异情况或者APOBEC特征性突变占比判定样本是否存在阿法替尼治疗EGFR阳性非小细胞肺癌的耐药；若TP53基因为变异型或者APOBEC特征性突变大于阈值的患者被判定为阿法替尼治疗疗效差。
所述的阈值为0.36-0.38。
一种计算机可读取介质，其记载有能够运行以下步骤的计算机程序：
对样本进行测序，获得样本的基因突变信息；
根据体细胞基因突变信息分析出TP53基因变异情况或者APOBEC特征性突变占比；所述的APOBEC特征性突变占比是指APOBEC特征性突变占全部体细胞单碱基突变的比例；
根据TP53基因变异情况或者APOBEC特征性突变占比判定样本是否存在阿法替尼治疗EGFR阳性非小细胞肺癌的耐药；若TP53基因为变异型或者APOBEC特征性突变大于阈值的患者被判定为阿法替尼治疗疗效差。
附图说明
图1：患者不同mutation signature占比情况；
图2：不同阈值下APOBEC占比对患者阿法替尼治疗PFS影响；
图3：APOBEC占比高vs低患者阿法替尼治疗PFS获益差异；
图4：TP53变异型与野生型患者阿法替尼治疗PFS获益差异。
具体实施方式
本发明的研究中对36例EGFR阳性使用阿法替尼的非小细胞肺癌患者基线组织样本进行世和一号®靶向panel测序，通过南京世和基因生物技术股份有限公司生物信息分析流程进行测序数据分析，并采用R包sigminer进行mutation signature分析。将30种signature按照生物学意义分成10组，其中APOBEC酶相关突变特征包括Signature 2和Signature 13，其主要特征在于C>G/T突变，与APOBEC酶活性有关。通过R软件分别筛选10组signature中能够显著区分阿法替尼治疗无进展生存期（PFS）的最佳阈值，满足P<0.05，仅有APOBEC存在满足条件的阈值。将人群变异频次≥5人的基因、临床特征及APOBEC突变特征结合阿法替尼治疗无进展生存期（PFS）进行分析，通过Log-rank进行统计检验筛选P<0.05的特征，并进一步通过False Discovery Rate方法进行多重校正，发现TP53突变型或APOBEC High的患者阿法替尼治疗疗效显著更差（校正P<0.05），其中APOBEC是新发现的阿法替尼治疗疗效预测潜在分子标志物。
本发明中对于TP53基因所提及的“基因变异”包括基因突变、融合以及拷贝数变化。
本发明中的APOBEC特征性突变占比是指样本中APOBEC家族相关特征突变在全部单核苷酸突变中的占比。APOBEC是载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽家族，比如APOBEC1、APOBEC3A 和 APOBEC3B等，它们能够特异催化基因组中的胞嘧啶—>尿嘧啶，可能参与人体内免疫反应与抗病毒反应。根据COSMIC Mutation signature V2版本对患者样本中单核苷酸突变特征进行分类成30种，将它们按照生物学意义分成10组，其中APOBEC酶相关突变特征是Signature 2和Signature 13突变特征之和，其主要特征在于C>G/T突变，与APOBEC酶活性有关。APOBEC突变特征阈值划分是基于本发明中患者阿法替尼治疗的无进展生存时间，筛选使得两组患者生存差异最显著（P值最小，HR最大时）的值，作为阈值，将患者分成APOBEC高(High)和APOBEC低(Low)两组。
获得APOBEC特征性突变为本领域已知技术，目前可以通过使用软件R3.6.3（https://cran.r-project.org/bin/windows/base/old/3.6.3/）版本对样本的三碱基单核苷酸突变模式进行mutation signature分析，涉及的R包有Maftools包（v2.12.0，https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/maftools.html）及Sigminer包（v2.1.4https://cran.r-project.org/web/packages/sigminer/index.html）。
临床患者基本信息如下：
对36例EGFR阳性的非小细胞肺癌患者进行了靶向panel检测，患者的分期均为IV期。中位年龄为61岁，年龄分布范围为33-83岁，其中小于等于65岁的患者数占比为75%（27例），大于65岁的患者占了25%（9例）。队列中的女性患者居多，61%（22例），男性比例为39%（14例）。患者中以肺腺癌为主31例（86%），还有一部分患者为肺鳞癌2例（6%），2例（6%）腺鳞混合癌及1例（3%）病理亚型未知。具体患者信息，见表1。
表1 分析队列样本临床信息
临床因素对EGFR阳性非小细胞肺癌患者阿法替尼治疗PFS的影响如下：
部分临床病理特征可能是肿瘤治疗疗效的潜在预测指标。本研究使用单因素Log-rank分析了这些可能的临床特征与患者阿法替尼治疗后PFS的关联。其中患者无进展生存期（PFS）定义为从患者服用阿法替尼开始至疾病出现进展或死亡或最后一次随访日期间的时间。如表2所示，临床特征包括性别、年龄和病理分型，可能都不是PFS的预测指标（P>0.05）。
表2：Log-rank筛选阿法替尼疗效相关临床因素
基因组特征对EGFR阳性非小细胞肺癌患者阿法替尼治疗PFS的影响如下：
本研究患者治疗前肿瘤组织样本使用世和基因的425基因panel进行二代测序基因检测，该基因panel全面覆盖重要癌症相关信号通路基因，具体基因列表见表3：
表3：425panel基因列表
DNA提取和测序文库制备过程如下：
使用QIAamp DNA FFPE组织提取试剂盒（Qiagen），通过从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本中提取基因组DNA。所有样本均通过病理医生证实其肿瘤含量至少为10％。分别使用Qubit3.0荧光定量仪和NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific）评估提取的DNA的浓度和质量。然后，使用Covaris M220超声系统将基因组DNA超声破碎成350bp片段，并用Agencourt AMPure XP beads（Beckman Coulter）进行纯化。使用KAPA Hyper PrepKit（KAPA Biosystems）制备测序文库。将带有不同分子标签的文库混合。使用上述的425个基因panel和IDT xGen Lockdown Reagents对混合文库进行靶向富集。富集后的文库采用Illumina p5（5'AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA 3'）和p7（5'CAA GCA GAA GAC GGC ATACGA GAT 3'）引物在KAPA Hifi Hot Start Ready Mix（KAPA Biosystems）中进行扩增，然后通过qPCR方法用KAPA Library Quantification kit（KAPA Biosystems）定量测序文库。最终文库采用Illumina Hiseq 4000平台进行测序，平均测序深度至少为250×。
测序结果分析如下：
测序数据经由过验证的南京世和基因生物技术股份有限公司生物信息分析流程进行分析，主要步骤如下所述。采用bck2fastq进行数据拆分，然后用Trimmomatic进行FASTQ文件质量过滤（QC）。删除低质量碱基（based phredscore低于15）或N碱基。使用Burrows-Wheeler Aligner（BWA-mem，v0.7.12; https://github.com/lh3/bwa/tree/master/bwakit）将所测序列比对到人类参考基因组hg19上，应用Picard去除PCR所导致的重复序列。使用Genome Analysis Toolkit（GATK 3.4.0）在插入缺失周围进行局部组装校正比对并重新校准碱基质量分数。VarScan2软件用于检测单核苷酸变异（SNV）和插入/缺失突变，参数如下：最小测序深度= 20，最小碱基质量= 25，最小变异等位基因频率（VAF）=0.03，最小变异支持读数= 3，正负两条链均测到变异，并且链偏倚不大于10%。在接下来的过滤步骤中，只有当VAF高于1％且至少有3个突变读数的COSMIC热点（recurrence> = 20）突变，或者至少5个变异支持读数的其他突变才会被读出。由ANNOVAR针对以下数据库注释：dbSNP（v138），1000Genome，ExAC，COSMIC（v70），ClinVAR和SIFT。如果突变在1000 GenomesProject或65000 exomes project（ExAC）中的人群频率>1%则被移除。然后，突变列表将通过内部收集的同一测序平台上的重复测序错误列表进行过滤，该列表来源于53个最小平均测序深度为700x的正常样本的测序结果总结。如果某变异（如≥3个突变读数且> 1%VAF）在>20％的正常样品中被检测到，则认为其可能是人为错误并被移除。在重复区域内发生的突变也将被除去。在接下来的过滤步骤中，仅当VAF高于2%且至少有3个突变读数的COSMIC突变，或者VAF高于3%且至少有5个突变读数的非COSMIC突变才会被读出。
对于CNV分析，我们将微滴数字聚合酶链反应（ddPCR）结果作为“金标准”，采用38个样本对我们的CNV程序进行综合试验验证。我们通过对同一批次中100个正常样品进行主成分分析，降低拷贝数数据中的系统噪音。对于拷贝数丢失，阈值为0.65，对于拷贝数增加，阈值为2.0。
使用R包sigminer对患者体细胞单碱基突变数据进行mutation signature分析，一共有30个不同signature特征，而后按照COSMIC V2 legacy signatures对得到的30个signature特征进行合并，最后得到10个不同的signature，包括Age, APOBEC, BRCA,Smoking, MMR deficiency, Ultraviolet, Immunoglobulin, POLE, Temozolomide和Others。APOBEC特征性突变占比包括signature 2 和signature 13占比之和。
数据分析结果如下：
患者无进展生存期（PFS）计算从患者服用阿法替尼开始至疾病出现进展或死亡或最后一次随访日期间的时间。采用Kaplan-Meier方法估计不同基因组的PFS，并使用Log-rank检验分析组间差异。
30种Mutation signature被合并成10种，各组signature占比情况如图1所示。选取其中占比较多的Age, APOBEC, MMR deficiency和Others四个signature特征通过R软件筛选用于区分患者阿法替尼疗效PFS的阈值，需要满足P<0.05。四个signature中，仅有APOBEC能找到相应的阈值，能够显著区分患者阿法替尼治疗PFS(P<0.05)，结果详见表4。APOBEC占比高低阈值的划分通过R软件分析确定当阈值为0.377时，P值最为显著，HR值最大（见图2），因此定义APOBEC≥0.377，为APOBEC High，反之则为APOBEC Low。APOBEC High与APOBEC Low的患者阿法替尼治疗PFS存在显著差异（mPFS: 2.8个月 vs 7.2个月; HR=3.59, 95%CI(1.37~9.36); P=0.005），见图3。尚未见有关APOBEC占比可能会导致阿法替尼原发耐药的研究，因此，APOBEC是本专利新发现的阿法替尼治疗疗效预测潜在分子标志物。
表4：不同阈值下signature占比对患者PFS影响
接着对患者的肿瘤体细胞变异进行分析，根据非小细胞肺癌患者的突变图谱分布情况，并进行了初步筛选，将体细胞变异≥5人的基因作为候选对象。而后通过Log-rank筛选出与EGFR阳性非小细胞肺癌阿法替尼治疗疗效相关的体细胞变异，体细胞突变的Log-rank筛选结果分布见表5。根据筛选结果可以看出，TP53基因变异的患者阿法替尼疗效显著较差（mPFS: 4.0个月 vs 8.3个月; HR=2.51, 95%CI(1.21~5.18); P=0.010），见图4。另有研究报道（PMID: 32272775）发现TP53突变型患者EGFR-TKIs（纳入药物包括吉非替尼、阿法替尼和厄洛替尼）疗效较野生型更差，两者结果趋势吻合。
表5： Log-rank筛选EGFR阳性非小细胞肺癌阿法替尼治疗疗效相关体细胞变异
为了进一步验证，本专利将基因变异频次≥5人（14%）的分子特征与相关临床特征单因素结果，进一步进行多重校正，采用False Discovery Rate方法。各特征因素P值经过FDR校正过后，显示APOBEC占比高及TP53基因变异仍然显著（P=0.035），具体结果见表6所示。
表6：临床及分子特征单因素P值校正结果
可以看出，通过上述方法我们发现了两种（TP53基因和Mutation signatureAPOBEC）可以用于预测EGFR阳性非小细胞肺癌阿法替尼治疗疗效的潜在分子标志物，这两种标志物均可以通过世和一号®大panel进行检测，能够对患者原发耐药进行评估，其中Mutation signature APOBEC是本专利首次发现并验证。
Claims (8)
1.用于检测APOBEC特征性突变占比的试剂在用于制备阿法替尼治疗EGFR阳性非小细胞肺癌的耐药性评估试剂中的应用；所述的APOBEC特征性突变占比是指APOBEC特征突变占全部体细胞单碱基突变的比例。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的APOBEC特征性突变是指COSMICMutation Signature中的Signature 2和Signature 13突变特征之和。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的耐药性评估是通过采用无进展生存时间作为指标。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用中还包括APOBEC特征性突变占比与阈值进行比较的步骤。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的阈值是0.36-0.38。
6.一种用于预测阿法替尼治疗EGFR阳性非小细胞肺癌的耐药性的装置，其特征在于，包括：
测序模块，用于对样本进行测序，获得样本的体细胞基因突变信息；
分析模块，用于根据体细胞基因突变信息分析出APOBEC特征性突变占比；所述的APOBEC特征性突变占比是指APOBEC特征性突变占全部体细胞单碱基突变的比例；
判定模块，根据APOBEC特征性突变占比判定样本是否存在阿法替尼治疗EGFR阳性非小细胞肺癌的耐药；若APOBEC特征性突变大于阈值的患者被判定为阿法替尼治疗疗效差。
7.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，所述的阈值为0.36-0.38。
8.一种计算机可读取介质，其特征在于，其记载有能够运行以下步骤的计算机程序：
对样本进行测序，获得样本的基因突变信息；
根据体细胞基因突变信息分析出APOBEC特征性突变占比；所述的APOBEC特征性突变占比是指APOBEC特征性突变占全部体细胞单碱基突变的比例；
根据APOBEC特征性突变占比判定样本是否存在阿法替尼治疗EGFR阳性非小细胞肺癌的耐药；若APOBEC特征性突变大于阈值的患者被判定为阿法替尼治疗疗效差。
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