CN115177718A

CN115177718A - 花鲈干扰素IFN-γ及其受体抗病毒组合物和应用

Info

Publication number: CN115177718A
Application number: CN202210580029.6A
Authority: CN
Inventors: 邱丽华; 闫路路; 郭杰匀; 王鹏飞; 赵超; 张博
Original assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Current assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority date: 2022-05-25
Filing date: 2022-05-25
Publication date: 2022-10-14
Anticipated expiration: 2042-05-25
Also published as: CN115177718B

Abstract

本发明公开了包含花鲈干扰素IFN‑γ及其受体的抗病毒组合物和应用。所述抗病毒组合物包含花鲈干扰素IFN‑γ和花鲈II型干扰素受体，所述花鲈II型干扰素受体为CRFB6、CRFB13和CRFB17中的一种或两种以上组合。所述应用为包含花鲈干扰素IFN‑γ及其受体的抗病毒组合物在制备水产动物抗病毒药物中的应用；或包含花鲈干扰素IFN‑γ及其受体的抗病毒组合物在制备增强水产动物抗病毒免疫力的药物中的应用。所述抗病毒组合物可显著降低感染花鲈幼鱼后花鲈脾脏、肝脏和头肾组织中LBUSV病毒的拷贝数，同时可降低感染花鲈后花鲈头肾细胞和动脉球细胞系中LBUSV病毒的拷贝数，不仅能增强花鲈对病毒的拮抗能力，也能提高其他水产动物对病毒的拮抗能力。

Description

花鲈干扰素IFN-γ及其受体抗病毒组合物和应用

技术领域

本发明涉及干扰素及其受体的应用，具体涉及包含花鲈干扰素IFN-γ及其受体的抗病毒组合物及应用。

技术背景

花鲈(Lateolabrax maculatus)又名海鲈，属广温、广盐性鱼类，具有较好的营养价值和养殖价值，是中国沿海地区的重要养殖鱼类之一。随着海水鱼养殖业的蓬勃发展，养殖面积和密度的增大，往往伴随着鱼病的发生。花鲈养殖过程中疾病尤其是病毒病暴发增多，严重影响花鲈养殖业的发展。要解决产业问题，基础研究尤为重要，其中鱼类病毒致病机理和花鲈免疫机制的研究备受关注。

干扰素(Interferons，IFNs)是一类具有抗病毒活性的II类α-螺旋细胞因子，是机体的免疫细胞受到IFN诱生剂刺激后所产生的一类糖蛋白。IFN并不直接发挥免疫作用，而是通过与靶细胞表面受体相结合，介导该细胞产生多种细胞因子，包括各种趋化因子和转录调节因子等，从而间接发挥抗病毒作用，是脊椎动物免疫系统的重要组成部分。迄今为止，根据其受体和信号通路在哺乳动物和鸟类中的功能，已报道了三种类型的IFN，即I型、II型和III型。其中，I型和III型 IFN是特异性的先天抗病毒细胞因子，它们的主要区别在于组织分布和靶细胞的不同。相比之下，II型IFN是一种关键的免疫调节因子，在病毒和细菌感染时可调控机体先天免疫和适应性免疫系统。目前，在哺乳动物中只发现了一种类型的 II型IFN，为IFN-gamma(IFN-γ)，由单拷贝基因编码，基因组结构包含4个外显子和3个内含子。与哺乳动物不同，硬骨鱼类中II型IFN含两个成员，即IFN-γ 和IFN-γ相关因子(IFN-γrelated molecule，IFN-γrel)。分析发现IFN-γ和IFN-γrel 在基因结构上具有保守性，两者均有4个外显子和3个内含子组成。IFN-γ具有保守的IFN-γ序列特征，其C-末端具有核定位信号(NLS)基序，NLS进化保守，从低等脊椎动物至高等脊椎动物中都存在，对鱼类和哺乳动物的IFN-γ功能至关重要。

IFN-γ被IFN-γ受体(IFN-γRs)特异性识别后结合，形成受体-配体复合物，然后促进JAK-STAT信号通路蛋白磷酸化修饰而激活，并诱导IFN刺激基因(ISGs) 表达。哺乳动物中，II型IFN的受体由两条配体结合链(IFN-γR1/IFNGR1)和两条信号传导链(IFN-γR2/IFNGR2)组成，两者均属于II型细胞因子受体家族成员，在鱼类中被称为鱼类细胞因子受体家族B(CRFB)。其中IFN-γR1直接与二聚体化的IFN-γ结合，IFN-γR2则辅助参与信号的传导。在哺乳动物中，只有一个IFN-γR1。在硬骨鱼类中IFN-γR1基因根据系统发育和共线性分析被复制为两个拷贝，分别命名为CRFB13/IFNGR1-2和CRFB17/IFNGR1-1。已在斑马鱼、草鱼、虹鳟和达布利氏鲟中鉴定出鱼类IFN-γR2(CRFB6)。目前，有关硬骨鱼类II型IFN配体-受体复合物的模型仍不清楚，只有物种特异性配体-受体的结合，如金鱼IFN-γ和IFN-γrel在体外可以分别与CRFB13和CRFB17结合，而当受体交换结合后未检测到活性。但是，在斑马鱼中，CRFB17对IFN-γ和IFN-γrel的功能和信号传导有显著影响，同时IFN-γ也需要CRFB13传递信号。在花鲈中， II型IFN及其受体的互作方式和功能还不清楚。对花鲈II型干扰素免疫系统的研究有助于提高花鲈病毒性疾病的预防与控制。

发明内容

本发明的目的之一，是在于提供包含花鲈干扰素IFN-γ及其受体的抗病毒组合物。

具体地，包含花鲈干扰素IFN-γ及其受体的抗病毒组合物，包含花鲈干扰素 IFN-γ和花鲈II型干扰素受体，所述花鲈II型干扰素受体为CRFB6、CRFB13 和CRFB17中的一种或两种以上组合。

优选地，所述包含花鲈干扰素IFN-γ及其受体的抗病毒组合物包含花鲈干扰素IFN-γ和CRFB6；IFN-γ、CRFB6和CRFB13；IFN-γ、CRFB6、CRFB13和 CRFB17。

更优选地，所述包含花鲈干扰素IFN-γ及其受体的抗病毒组合物包含花鲈干扰素IFN-γ、CRFB6、CRFB13和CRFB17。

本发明的目的之二，是提供包含花鲈干扰素IFN-γ及其受体的抗病毒组合物的应用。具体地，该包含花鲈干扰素IFN-γ及其受体的抗病毒组合物在制备水产动物抗病毒药物中的应用；该包含花鲈干扰素IFN-γ及其受体的抗病毒组合物在制备增强水产动物抗病毒免疫力的药物中的应用。

所述病毒为大口黑鲈溃疡综合征病毒(Largemouth bass ulcer syndromevirus， LBUSV)。

本发明的优点在于：

1.本发明提供的包含花鲈干扰素IFN-γ及其受体的抗LBUSV病毒组合物，可显著降低感染花鲈幼鱼后花鲈脾脏、肝脏和头肾组织中LBUSV病毒的拷贝数，同时可降低感染花鲈后花鲈头肾细胞和动脉球细胞系中LBUSV病毒的拷贝数。对下游抗病毒基因(Mx、IRF1、ISG15)诱导均有较好的效果，其中以 IFN-γ+CRFB6+CRFB13+CRFB17构成的组合对下游抗病毒基因(Mx、IRF1、 ISG15)诱导效果最好，对病毒感染胖头鱥肌肉细胞(FHM)的病毒拷贝数最低。

2.本发明提供的包含花鲈干扰素IFN-γ及其受体的抗病毒组合物不仅能增强花鲈对病毒的拮抗能力，也能提高其他水产动物对病毒的拮抗能力。

附图说明

图1是LmIFN-γ和LmCRFBs在不同组织中的表达分析。不同字母间表示各组之间有显著性差异(P<0.05)。

图2-1是LBUSV病毒感染下LmIFN-γ和LmCRFBs的时空表达(*P<0.05； **P<0.01)。

图2-2是LBUSV病毒感染LMK细胞和LMAB细胞系下LmIFN-γ和 LmCRFBs的时空表达。等体积PBS作为对照组(*P<0.05；**P<0.01)。

图3-1是LmIFN-γ蛋白纯化的SDS-PAGE分析及蛋白免疫印迹。

图3-2是LmCRFBs蛋白纯化的SDS-PAGE分析及蛋白免疫印迹。

M：Marker；A，泳道1：LmCRFB13；泳道2：LmCRFB6；泳道3：LmCRFB17； B，泳道1：LmCRFB6；泳道2：LmCRFB13；泳道3：LmCRFB17。

图3-3是LmIFN-γ-GST菌体破碎后的SDS-PAGE分析及蛋白免疫印迹。

M：Marker；泳道1：沉淀；泳道2：上清。

图4-1是活体注射LmIFN-γ-His重组蛋白后ISGs基因表达变化。图A，B， C分别表示肝脏、脾脏和头肾。注射等体积PBS作为对照组(*P<0.05；**P<0.01)。

图4-2是重组蛋白LmIFN-γ-His孵育花鲈头LmK细胞和LMAB细胞系后 ISGs和STAT1基因表达情况。对照组为等体积PBS(*P<0.05；**P<0.01)。

图4-3是重组蛋白LmIFN-γ-His对LBUSV病毒增殖的影响。图A，B和C 分别表示肝脏、脾脏和头肾(P*<0.05；**P<0.01)。

图5-1是LmIFN-γ与LmCRFBs蛋白的体外相互作用。

Pull-down实验：磁珠上的LmIFN-γ-GST重组蛋白分别与LmCRFBs-His和 His蛋白结合，经变性洗脱后，蛋白复合物被解离出来，分别用His抗体和GST 抗体进行WesternBlotting验证洗脱混合物中是否有目的蛋白。

泳道1：LmCRFB13-His；泳道2：LmCRFB6-His；泳道3：LmCRFB17-His；泳道4：His-tag。

图5-2是LmIFN-γ真核表达质粒与不同受体组合转染。IFN表达质粒与 pcDNA3.1空载体共转染作为对照(*P<0.05；**P<0.01)。

图5-3是FHM细胞中pcDNA3.1-LmIFN-γ的抗病毒测定。IFN表达质粒与 pcDNA3.1空载体共转染作为对照(*P<0.05；**P<0.01)。

图6是LmIFN-γ与其他物种的IFN-γ氨基酸多重序列比对。其中，大方框表示IFN-γ特征序列，核定位序列用大方框表示。

图7是LmCRFB6与其他物种CRFB6氨基酸多重序列比对。

图8是LmCRFB13与其他物种CRFB13氨基酸多重序列比对。

图9是LmCRFB17与其他物种CRFB17氨基酸多重序列比对。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

花鲈II型干扰素受体基因CRFB6、CRFB13和CRFB17的cDNA，可以通过如下方法制备获得：

根据已构建的花鲈cDNA文库中II型干扰素IFN-γ和细胞因子家族B (CRFBs)的EST序列，在对目的基因的EST序列进行验证后，设计PCR引物，结合基因克隆技术分别得到花鲈IFN-γ、CRFB6、CRFB13和CRFB17基因的开放阅读框(ORF)序列。花鲈IFN-γ基因OFR全长594bp，编码187个氨基酸，预测花鲈IFN-γ编码蛋白分子量为22.31KD。CRFB6基因OFR全长864bp，编码287个氨基酸，预测花鲈CRFB6编码蛋白分子量为32.38KD。花鲈CRFB13 基因ORF长1248bp，编码415个氨基酸，预测花鲈CRFB13编码蛋白分子量为 46.19KD。花鲈CRFB17基因OFR全长1209bp，编码402个氨基酸，预测花鲈 CRFB17编码蛋白分子量为44.70KD。

以下是LmIFN-γ(其中Lm指花鲈)的cDNA及氨基酸序列。起始密码子和终止密码子用方框圈出，加粗字体表示预测的信号肽，预测的N糖基化位点画波浪线表示，预测的C-末端区域NLS基序用单线表示。

以下是LmCRFB6的cDNA及氨基酸序列。起始密码子和终止密码子用方框圈出，单线表示预测的信号肽，跨膜区氨基酸序列用方框圈出，预测Y用圆圈出。

以下是LmCRFB13的cDNA及氨基酸序列。起始密码子和终止密码子用方框圈出，单线表示预测的信号肽，跨膜区氨基酸序列用方框圈出，预测Y用圆圈出。

以下是LmCRFB17的cDNA及氨基酸序列。起始密码子和终止密码子用方框圈出，单线表示预测的信号肽，跨膜区氨基酸序列用方框圈出，预测Y用圆圈出。

1.组织总RNA的提取和cDNA模板制备

1.1总RNA的提取

所用花鲈，体质量为30±5g，体长10±5cm，实验前在温度27±1℃，盐度2.3‰的500L塑料桶中暂养。每天更换2/3的养殖水，花鲈暂养一周用于后续实验。随机选取3尾健康花鲈，使用50mg/mL的MS222麻醉2min，分别取鳃、脑、肝脏、肌肉、心脏、脾脏、头肾、胃、皮肤、肠、血细胞、眼和鱼鳍组织并立即放入液氮中暂存，随后使用Trizol试剂按照说明书提取各个组织的总 RNA。对提取的总RNA进行浓度、纯度及完整性检测，检测合格后冻存于-80℃ 冰箱中待用。

1.2 cDNA模板制备

使用PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa，Japan)，根据说明书要求，取1μg总RNA在反转录酶的作用下42℃反应1h合成cDNA 模板。

2.花鲈II型干扰素IFN-γ及受体CRFBs的cDNA序列的克隆

2.1 ORF序列的验证

在花鲈转录组数据库中，根据基因注释信息获得IFN-γ、CRFB6、CRFB13 和CRFB17的拼接序列，根据拼接序列设计特异性引物，引物序列见下表，扩增大小分别为594bp，864bp，1248bp，1209bp。

以上述合成的cDNA作为模板，以特异性引物进行PCR扩增，反应体系为： cDNA模板1μL,10nmol/L的上下游引物各1μL，10mmol/L dNTP 2μL，10x Extaq buffer 2.5μL，超纯水17μL，共25μL。PCR反应条件为：95℃变性3min； 95℃高温变性30s，58℃低温退火30s，72℃延伸1min 30s，共35个循环；72℃ 延伸5min；4℃保温。所扩增的PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测合格后，从凝胶中纯化回收目的片段的PCR产物。然后将纯化的PCR产物连接到 pMD18-T载体中，后转化到大肠杆菌感受态细胞DH-5α中，根据蓝白斑筛选挑取阳性克隆单菌株，在37℃220rpm的细胞培养箱中，摇4h进行扩大培养，提质粒DNA，用通用引物M13进行测序。

2.3花鲈IFN-γrel和受体CRFBs的生物信息学分析

用Blast(https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行同源性分析，结果显示， IFN-γ基因与日本花鲈、欧洲鲈鱼、褐菖鲉、牙鲆、点带石斑鱼和鰤鱼等IFN-γ 基因有高度同源性，揭示该基因是IFN-γ基因。在花鲈LmIFN-γC-末端存在一个IFN-γ家族的特征序列([I/V]-QX-[K/Q]-A-X2-E[L/F]-X2-[I/V])以及有一个 NLS基序。CRFB6基因与东星斑、鞍带石斑鱼、大口黑鲈、克氏镖鲈和鳜鱼等 CRFB6基因有高度同源性，揭示该基因是CRFB6基因。CRFB13基因与鳜鱼、白梭吻鲈、河鲈、荫平鲉、钻嘴鱼和东星斑等CRFB13有高度同源性，揭示该基因是CRFB13基因。CRFB17基因与鳜鱼、剑鱼、荫平鲉、眼斑双锯鱼、射水鱼和钻嘴鱼等CRFB17基因有高度同源性，揭示该基因是CRFB17基因。

经SignalIP预测LmIFN-γ蛋白N端前23个氨基酸 (MKVVTAKAVVCLCLWLTVCQVRG)为信号肽。功能域预测该蛋白含有两个 N-糖基化位点(Asn31和Ans91)，在170-194区域氨基酸为B-Box结构域，在 135-149区域氨基酸为CH结构域，由4个主要α-螺旋组成。经SignalIP预测LmCRFB6蛋白N端前16个氨基酸(MLFFVLWFHAAGQVLS)为信号肽。胞外域序列包含213个氨基酸，23个氨基酸的跨膜区序列，51个氨基酸的胞内域序列。功能域预测该蛋白1-99区域氨基酸和114-202区域氨基酸是FN3蛋白超家族结构域。经Signal预测LmCRFB13蛋白N端前25个氨基 (MDPGGGFPPVVLLLSALLLLLRASA)为信号肽。前27-261区域有235个氨基酸为胞内域序列，中间262-284区域有23个氨基酸是跨膜区序列，后285-415 区域有131个氨基酸为胞外域序列。功能域预测该蛋白132-202区域氨基酸是 FN3蛋白超家族结构域。经Signal预测LmCRFB17蛋白N端前19个氨基 (MLLEGAFTALLLLVCGVPA)为信号肽。前28-230区域有203个氨基酸为胞内域序列，中间1-253区域有23个氨基酸的跨膜区序列，后254-402区域有149 个氨基酸是胞外域序列。功能域预测该蛋白22-102区域氨基酸是FN3蛋白超家族结构域。

LmIFN-γ与其他物种的IFN-γ氨基酸多重序列比对，见图6。其中红框表示 IFN-γ特征序列，核定位序列用黑框表示。

LmCRFB6与其他物种CRFB6氨基酸多重序列比对，见图7。LmCRFB13 与其他物种CRFB13氨基酸多重序列比对，见图8。LmCRFB17与其他物种 CRFB17氨基酸多重序列比对，见图9。

3.qPCR检测花鲈IFN-γ和受体CRFBs在花鲈不同组织中的分布

分别取花鲈鳃、脑、肝脏、肌肉、心脏、脾脏、头肾、胃、皮肤、肠、血细胞、眼和鱼鳍组织的RNA。使用PrimeScript^TMRT Master Mix试剂盒(TaKaRa， Japan)，根据说明书要求，取500ng RNA与反转录酶混合液5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)2μL，加水补齐至10μL。反应过程为37℃15min， 85℃5s，稀释10倍后作为模板使用。

实时荧光定量PCR使用引物IFN-γ-qF和IFN-γ-qR扩增IFN-γ基因； CRFB6-qF和CRFB6-qR扩增CRFB6基因；使用引物CRFB13-qF和CRFB13-qR 扩增CRFB13基因；使用引物CRFB17-qF和CRFB17-qR扩增CRFB17基因，引物序列见下表。扩增内参基因RPL19作为内参，以上述合成的cDNA作为模板。反应总体系为12.5μL，含有6.25μL的2×SYBR Green proTaq Hs premix(艾科瑞)，2μL cDNA模板，0.5μL 10μmol/L的正向和反向引物，以及3.25μL去离子水。qPCR反应条件为95℃预变性30s；94℃变性5s，60℃退火30s，72℃ 延伸30s，共计40个循环。溶解曲线分析为65-95℃，以确保每个单一产物的扩增。通过2-ΔΔCt方法分析花鲈IFN-γ、CRFB6，CRFB13和CRFB17的相对表达水平。结果见图1，可见在被检测的组织中均有表达。其中，IFN-γ在鳃中表达量最高，其次是肝脏和脾脏；CRFB6在鳃中表达量最高，其次是胃和头肾； CRFB13在头肾中表达量最高，其次是脾脏和肝；CRFB17在鳃中表达量最高，其次是胃和眼。

4.qPCR检测花鲈IFN-γ和受体CRFBs mRNA在病毒感染下的表达分析

通过向花鲈腹腔注射病毒并在体外用病毒感染花鲈头肾原代细胞(LMK，免疫组织细胞)和花鲈动脉球细胞系(LMAB，非免疫组织细胞)，分别检测 LmIFN-γ(其中Lm指花鲈)和LmCRFBs在体内和体外病毒感染后的表达变化。体内实验：向体质量为30±5g健康花鲈腹腔分别注射800μL LBUSV(3.0×08 copies/μL)病毒和Poly I:C(1mg/mL)，对照组注射等量PBS，注射后，分别在 0h，6h，12h，24h，48h，72h时间点取头肾、脾脏、肝脏组织，速冻于液氮中。体外实验，LMK细胞和LMAB细胞系分别接种于6孔板，培养过夜后，用 LBUSV病毒感染后分别在0h，12h，24h，48h收集细胞，对照组每孔加入等量PBS，RNA抽提方法和逆转录方法如前所述。同时选用RPL19作为内参基因，内参基因引物见前述。定量体系以及反应程序见前所述。结果见图2-1，图2-2。

花鲈幼鱼在LBUSV病毒和Poly I:C的刺激下，LmIFN-γ和受体(LmCRFB6、LmCRFB13和LmCRFB17)基因在肝脏、脾脏和头肾组织中表达量显著上调，但表达模式存在差异。其中在肝脏中，LmIFN-γ在病毒感染后6h时表达显著上调，1d时显著持续升高；在脾脏和头肾中，LmIFN-γ在病毒感染后12h表达显著上调。在Poly I:C刺激下，LmIFN-γ在肝脏、脾脏和头肾组织中表达量显著上调。病毒感染花鲈LMK细胞和LMAB细胞系后，LmIFN-γ在12h表达量显著上调。

在病毒和Poly I:C刺激后，受体LmCRFB6、LmCRFB13和LmCRFB17在肝脏、脾脏和头肾组织中表达量显著上调。在LmMK细胞中，在病毒感染后12 h，与对照组相比LmCRFB6、LmCRFB13和LmCRFB17基因表达水平均显著上调；在LMAB细胞系中，在病毒感染后12h，与对照组相比LmCRFB13和 LmCRFB17基因表达水平均显著上调，LmCRFB6为正常水平。

5.花鲈IFN-γ及其受体CRFB6、CRFB13和CRFB17重组蛋白的制备

以cDNA作为模板，利用PCR扩增IFN-γ的全部ORF及其受体CRFB6、 CRFB13和CRFB17胞外域，引物前加有酶切位点，PCR引物分别为：

PCR反应条件为95℃3min，94℃30s，60℃，30s，72℃，50s，共30个循环。将LmIFN-γ，LmCRFB6，LmCRFB13和LmCRFB17 PCR产物克隆到pET21a 载体质粒中构成重组质粒pET21a-LmIFN-γ(其中Lm指花鲈)，pET21a-LmCRFB6， pET21a-LmCRFB13和pET21a-LmCRFB17。再将LmIFN-γPCR产物克隆到 pGEX-4T载体质粒中，构成重组质粒pGEX-LmIFN-γ。将重组质粒 pET21a-LmIFN-γ，pET21a-LmCRFB6，pET21a-LmCRFB13，pET21a-LmCRFB17和pGEX-LmIFN-γ转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。将五种大肠杆菌BL21 细胞在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中进行扩大培养。当大肠杆菌 BL21细胞溶液的OD600达到0.6-0.8之间时，将异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)以终浓度为0.6mol/L加入LB培养基中，在37℃，220rpm下诱导表达12h。根据His-binding Purification Kit说明书(北京康为世纪)，通过Ni-NTA 亲和层析纯化LmIFN-γ-His，LmCRFB6-His，LmCRFB13-His和LmCRFB17-His 重组蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot对纯化蛋白进行验证，大约分别在28 KD，35KD，30KD和27KD出现一条较粗的条带。四个蛋白的大小均和重组蛋白理论值接近(图3-1，3-2)，使用改良的BCA蛋白测定试剂盒(TaKaRa) 检测LmIFN-γ-His，LmCRFB6-His，LmCRFB13-His和LmCRFB17-His重组蛋白的浓度后，将纯化的重组蛋白储存在-80℃超低温冰箱中备用。根据BeyoGold^TM GST-tag Purification Resin说明书(碧云天)，通过GST琼脂糖纯化树脂纯化 LmIFN-γ-GST重组蛋白，于47KDa左右处有明显条带(图3-3)。

5.LmIFN-γ-His蛋白的免疫功能研究

5.1 LmIFN-γ-His蛋白诱导ISGs的表达

通过向花鲈腹腔注射LmIFN-γ重组蛋白并在体外用重组蛋白孵育LMK细胞和LMAB细胞系，分别分析ISGs在体内和体外诱导后的表达变化。体内实验：向实验花鲈注射LmIFN-γ-His重组蛋白(2μg/g)，分别在6h、12h、24h、48h、 72h取花鲈的肝脏、头肾和脾脏组织。每个时间组取三条鱼，以减少个体差异。体内实验：向6孔板中加入终浓度2μg/mL的LmIFN-γ进行诱导处理，对照组加入等体积的PBS作为对照，所有实验设置3个平行，于28℃中培养。孵育6h、 12h、24h和48h后取样，提取组织和细胞的总RNA，通过qRT-PCR检测ISGs和STAT1基因表达。结果显示：在体内和体外，LmIFN-γ-His重组蛋白均可激活下游ISGs和STAT1基因的表达(图4-1，4-2)。ISGs和STAT1基因引物如下：

5.2 LmFN-γ-His重组蛋白抗LBSUV免疫保护效果分析

在花鲈体内攻毒6h前向花鲈腹腔注射LmIFN-γ-His重组蛋白，来进一步确定LmIFN-γ-His重组蛋白对花鲈的免疫保护作用。腹腔注射LmIFN-γ-His重组蛋白(2μg/g)，对照组注射等量PBS，注射6h后，分别在腹腔注射200μL LBUSV (3.0×105copies/μL)病毒，分别在攻毒后0h、12h、1d、2d、3d、5d取花鲈的头肾、脾脏和肝脏组织，用于检测LBUSV的拷贝数。每个时间组取三条鱼，以减少个体差异(图4-3)。

引物：

LBUSV F：TGGAACGAGTACACCATGCC

LBUSV R：GACCCTAGCTCCTGCTTGAC

6.LmIFN-γ与受体的互作和转录调控分析

6.1 LmIFN-γ与受体的互作

为了验证LmIFN-γ是否能在体外与LmCRFB6，LmCRFB13，LmCRFB17 的胞外域结合，本实验将LmIFN-γ-GST蛋白与三个受体LmCRFB6-His， LmCRFB13-His和LmCRFB17-His分别进行Pull-down实验。将100μL LmIFN-γ-GST蛋白加到100μL平衡后的GST bead中。4℃在侧摆摇床缓慢摇动 1-2h。13000g，1min，离心弃上清。PBS洗涤三次。向各2mL离心管中加入100μL LmCRFB6-His，LmCRFB13-His和LmCRFB17-His蛋白，吹打重悬。His 标签蛋白做为对照。4℃在侧摆摇床缓慢摇动过夜。13000g，1min，弃上清。 PBS洗涤三次。向Beads中直接加蛋白上样缓冲液，煮沸，跑SDS-PAGE胶。结果显示，在LmCRFB6-His，LmCRFB13-His和LmCRFB17-His融合蛋白的实验组均可以检测到目的蛋白LmIFN-γ-GST，但在His组中没有检测到目的蛋白条带，表明目的蛋白LmIFN-γ-GST和LmCRFB6-His，LmCRFB13-His和LmCRFB17-His三个受体胞外域均可以在体外直接结合(图5-1)。

6.2 LmIFN-γ优先受体的使用

目前，在鱼类II型IFN系统中配体-受体之间关系仍未知，其中哪几个受体复合物优先与IFN-γ结合，需要进一步研究。IFN参与受体下游信号通路 JAK-STAT通路在不同鱼类中相对保守，因此用鱼类的FHM细胞系来检测花鲈 II型IFNd的受体使用情况。分别将LmIFN-γ、LmCRFB17、LmCRFB13和 LmCRFB6的ORF克隆到pCDNA3.1-Myc-His(-)载体上，然后分别将 pcDNA3.1-LmIFN-γ配体与不同受体组合一起共转染进FHM细胞，空载体pCDNA3.1-Myc-His(-)作为空白组，LmIFN-γ+空载作为对照组，所有实验设置 3个平行。转染48h后收集细胞。结果显示，LmIFN-γ与受体LmCRFB6、 LmCRFB6+LmCRFB13和LmCRFB6+LmCRFB13+LmCRFB17组合可同时诱导 FHM细胞中ISGs基因的表达(图5-2)。

以cDNA作为模板，利用PCR扩增IFN-γ及其受体CRFB6，CRFB13和 CRFB17的全部ORF，引物前加有酶切位点，PCR引物分别为：

FHM细胞中ISGs基因表达相关荧光定量PCR引物为：

6.3 LmIFN-γ与受体的不同组合在抗病毒中的应用

将pcDNA3.1-LmIFN-γ真核表达质粒与不同受体组合共转染FHM细胞。将 FHM细胞接种于12孔板，培养过夜后，分别将pcDNA3.1-LmIFN-γ表达质粒与不同受体共转染48h后，用LBUSV病毒感染72h后进行病毒拷贝数检测，空载体pCDNA3.1-Myc-His(-)+等体积PBS作为空白组，LmIFN-γ+空载+等体积 PBS作为对照组，所有实验设置3个平行。结果显示，LmIFN-γ与LmCRFB6、 LmCRFB6+LmCRFB13、LmCRFB13+LmCRFB17和 LmCRFB6+LmCRFB13+LmCRFB17组合转染的细胞中LBUSV的病毒拷贝数显著降低(图5-3)，其中LmIFN-γ+LmCRFB17+LmCRFB13+LmCRFB6组合抑制病毒复制的效果最佳，表明LmIFN-γ优先与LmCRFB17+LmCRFB13+LmCRFB6 组合进行信号传递。

序列表

<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所

<120> 花鲈干扰素IFN-γ及其受体抗病毒组合物和应用

<160> 66

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 594

<212> DNA

<213> 花鲈(Lateorax maculatus)

<400> 1

atgaaggttg tcacggcgaa ggcggtggtc tgtctgtgcc tgtggttgac tgtatgtcag 60

gtcagaggct cctacatcac agggaagatg aacaaaacca tccataacct cctgcagcac 120

tatagattaa caactcaaga gaaatatgac gggaagctcg tcttctccag agaaccagtg 180

gttggcaaaa tggaggcaaa gatggtgtac atgggtggcg ttctggagac gtatgaaaag 240

ctgattgccc agatgttgaa gcagctgccc aacccgactt tccagacagc ggccaccccc 300

gccgccggca ccgccagtga tgctgaggcg ggcggagatg tcaggacggg cctgagctac 360

atcctgaaga acatccagtt gctgaagaca agctattaca aagagcatga gggtcttctg 420

cagcgactgc atgctctcaa tcacatcaag acggataacg ctgtgaccca gaggaaagca 480

ttgtcggagc tgctgtggat ttacgaggag gcaagctcac tgcctaacat cgcaaagcag 540

aggaggcgcc ggcgccggca ggccctgagg gccaaaagtc acctgagagc ctga 594

<210> 2

<211> 197

<212> PRT

<213> 花鲈(Lateorax maculatus)

<400> 2

Met Lys Val Val Thr Ala Lys Ala Val Val Cys Leu Cys Leu Trp Leu

1 5 10 15

Thr Val Cys Gln Val Arg Gly Ser Tyr Ile Thr Gly Lys Met Asn Lys

20 25 30

Thr Ile His Asn Leu Leu Gln His Tyr Arg Leu Thr Thr Gln Glu Lys

35 40 45

Tyr Asp Gly Lys Leu Val Phe Ser Arg Glu Pro Val Val Gly Lys Met

50 55 60

Glu Ala Lys Met Val Tyr Met Gly Gly Val Leu Glu Thr Tyr Glu Lys

65 70 75 80

Leu Ile Ala Gln Met Leu Lys Gln Leu Pro Asn Pro Thr Phe Gln Thr

85 90 95

Ala Ala Thr Pro Ala Ala Gly Thr Ala Ser Asp Ala Glu Ala Gly Gly

100 105 110

Asp Val Arg Thr Gly Leu Ser Tyr Ile Leu Lys Asn Ile Gln Leu Leu

115 120 125

Lys Thr Ser Tyr Tyr Lys Glu His Glu Gly Leu Leu Gln Arg Leu His

130 135 140

Ala Leu Asn His Ile Lys Thr Asp Asn Ala Val Thr Gln Arg Lys Ala

145 150 155 160

Leu Ser Glu Leu Leu Trp Ile Tyr Glu Glu Ala Ser Ser Leu Pro Asn

165 170 175

Ile Ala Lys Gln Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gln Ala Leu Arg Ala Lys

180 185 190

Ser His Leu Arg Ala

195

<210> 3

<211> 864

<212> DNA/RNA

<213> 花鲈(Lateorax maculatus)

<400> 3

atgcttttct ttgtgttatg gtttcacgct gccggccaag tactctctga ggtgccacca 60

gctccgccgc agaacgtcca tgttaataac tggctactga catggactcc taccatggag 120

gagggagatg tcacccacac agttcagtac cgcagctttg actccagtga ctgggaggat 180

gtaccagcct gcgtccacat atccttaaac acctgtgatg tctcttcaac aaaagctaag 240

ggcgaacatg gctgtgttat gctgcatgtg caagcagaga gacgtgggct gacctcgaga 300

ccagtcaaag cctgtagcag acatggtgac gcctgtactc ctgaactcag tctgactgcg 360

aggcccggct ccctgaccgt agatttgagt aggaaccaca gtctggcttt ggaacatggg 420

gaccatgcaa aacacagggt ttactatggc aaggaaggag agctcctgca gaagtacaaa 480

gatgctgtct cttctgtgac aatcccagag ctggaggagg gccagcgtta ctgtgccaaa 540

gtgcagtata cttacttcaa taaacccatt ggtctggcca gctgtaccca gtgtgaggtc 600

atccctgact caagaaatga cccaaaacaa acagagatta tagtagctgt ggtggttgtc 660

gtagtcctga tcctcctgat accagtgata gcatacatcc tcatcttcca gcgagagaga 720

atcaaacatt ggctgcgacc tccatacgag atcccactca acattttgcc tgaaccattt 780

tctgagcatc gcaatcccat ttacagcagc agccccacca gggaggagtg tgatgtcatt 840

tccttcattt ccccggagaa gtga 864

<210> 4

<211> 287

<212> PRT

<213> 花鲈(Lateorax maculatus)

<400> 4

Met Leu Phe Phe Val Leu Trp Phe His Ala Ala Gly Gln Val Leu Ser

1 5 10 15

Glu Val Pro Pro Ala Pro Pro Gln Asn Val His Val Asn Asn Trp Leu

20 25 30

Leu Thr Trp Thr Pro Thr Met Glu Glu Gly Asp Val Thr His Thr Val

35 40 45

Gln Tyr Arg Ser Phe Asp Ser Ser Asp Trp Glu Asp Val Pro Ala Cys

50 55 60

Val His Ile Ser Leu Asn Thr Cys Asp Val Ser Ser Thr Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gly Glu His Gly Cys Val Met Leu His Val Gln Ala Glu Arg Arg Gly

85 90 95

Leu Thr Ser Arg Pro Val Lys Ala Cys Ser Arg His Gly Asp Ala Cys

100 105 110

Thr Pro Glu Leu Ser Leu Thr Ala Arg Pro Gly Ser Leu Thr Val Asp

115 120 125

Leu Ser Arg Asn His Ser Leu Ala Leu Glu His Gly Asp His Ala Lys

130 135 140

His Arg Val Tyr Tyr Gly Lys Glu Gly Glu Leu Leu Gln Lys Tyr Lys

145 150 155 160

Asp Ala Val Ser Ser Val Thr Ile Pro Glu Leu Glu Glu Gly Gln Arg

165 170 175

Tyr Cys Ala Lys Val Gln Tyr Thr Tyr Phe Asn Lys Pro Ile Gly Leu

180 185 190

Ala Ser Cys Thr Gln Cys Glu Val Ile Pro Asp Ser Arg Asn Asp Pro

195 200 205

Lys Gln Thr Glu Ile Ile Val Ala Val Val Val Val Val Val Leu Ile

210 215 220

Leu Leu Ile Pro Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ile Phe Gln Arg Glu Arg

225 230 235 240

Ile Lys His Trp Leu Arg Pro Pro Tyr Glu Ile Pro Leu Asn Ile Leu

245 250 255

Pro Glu Pro Phe Ser Glu His Arg Asn Pro Ile Tyr Ser Ser Ser Pro

260 265 270

Thr Arg Glu Glu Cys Asp Val Ile Ser Phe Ile Ser Pro Glu Lys

275 280 285

<210> 5

<211> 1248

<212> DNA/RNA

<213> 花鲈(Lateorax maculatus)

<400> 5

atggatcccg ggggtggatt tcctcctgtc gtcctgcttc tctccgcgct gctgctgctg 60

ctgcgagcct ctgcgggtta cgtggagccg ccgaccagcg taaccctgga ctgcaggaat 120

ctgcacaacg ttctggagtg gagttacaat caactctcaa cgcctgggct aaagttcaaa 180

gttgatataa aatcactttc aagttctcct agtgagattt ggattaactc ttcaacaagt 240

cttcaagctg atttgtcgtc tttctcggat ccaaaaaatg aataccttat ttgtgtaatg 300

gctgtgattg gacaaaatga gtctgcgtgt gtccctcagg ggggattcag ttacagctac 360

ttcaaggatg ctgccacaaa tcggacatgt tttttggact tcccaccagt taacgtcact 420

gccctccagg acgacaatgt gctgttacgc ttcacgcatc cctggttgtt gtaccaccaa 480

caacgacccg acggtccaaa tccgaaacag aagaagaaga atagccgtgg cgcaaagatc 540

agacaagagc tacctatgtt taattacgac gtcgtaatca tcggccagaa ggagcgacac 600

caacgattgg actgtgagga gagtgtgtgt gaggagaagc ttccagtgga tgctgcacag 660

gagaaacact gtgtgaaggt caagggggag ctgctgaaaa tggcagttag aggcacagaa 720

gagtactgcg ccatgtcatc accaatgaag ccatcaccaa gtaaaaaagc aaaccaaaat 780

aacgcctaca tctacattgt tgtcagcgtg ttggtcgtga ttgcagttgc ttttgtcctc 840

ttcatggtgt accaaaagat gaccaaaccc tcaacttctt taccgaactc catgaggttc 900

acggatcgac tgaagcagtg gaccatggga gtggttcaag agcaggtctc aaagccagaa 960

gtggagccta cctcaccaac attgctactg ccagaagaga aagaatccat acttattgtc 1020

tctgcctctg agcccgaact ccgtctgtgt atcggggtgt cggccgagga tgagggtgtg 1080

agtgatgtcg ggccggtagg gaatgatgaa gggccatgtt acatgccagg tagagagttg 1140

gatgaagatg aaacactatg ccccgttgag cacccctctg aatatgagaa acgtcaggtg 1200

ttggttgata tagcaccaga tgaacagact gagggctacc gtggctga 1248

<210> 7

<211> 415

<212> PRT

<213> 花鲈(Lateorax maculatus)

<400> 7

Met Asp Pro Gly Gly Gly Phe Pro Pro Val Val Leu Leu Leu Ser Ala

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Arg Ala Ser Ala Gly Tyr Val Glu Pro Pro Thr

20 25 30

Ser Val Thr Leu Asp Cys Arg Asn Leu His Asn Val Leu Glu Trp Ser

35 40 45

Tyr Asn Gln Leu Ser Thr Pro Gly Leu Lys Phe Lys Val Asp Ile Lys

50 55 60

Ser Leu Ser Ser Ser Pro Ser Glu Ile Trp Ile Asn Ser Ser Thr Ser

65 70 75 80

Leu Gln Ala Asp Leu Ser Ser Phe Ser Asp Pro Lys Asn Glu Tyr Leu

85 90 95

Ile Cys Val Met Ala Val Ile Gly Gln Asn Glu Ser Ala Cys Val Pro

100 105 110

Gln Gly Gly Phe Ser Tyr Ser Tyr Phe Lys Asp Ala Ala Thr Asn Arg

115 120 125

Thr Cys Phe Leu Asp Phe Pro Pro Val Asn Val Thr Ala Leu Gln Asp

130 135 140

Asp Asn Val Leu Leu Arg Phe Thr His Pro Trp Leu Leu Tyr His Gln

145 150 155 160

Gln Arg Pro Asp Gly Pro Asn Pro Lys Gln Lys Lys Lys Asn Ser Arg

165 170 175

Gly Ala Lys Ile Arg Gln Glu Leu Pro Met Phe Asn Tyr Asp Val Val

180 185 190

Ile Ile Gly Gln Lys Glu Arg His Gln Arg Leu Asp Cys Glu Glu Ser

195 200 205

Val Cys Glu Glu Lys Leu Pro Val Asp Ala Ala Gln Glu Lys His Cys

210 215 220

Val Lys Val Lys Gly Glu Leu Leu Lys Met Ala Val Arg Gly Thr Glu

225 230 235 240

Glu Tyr Cys Ala Met Ser Ser Pro Met Lys Pro Ser Pro Ser Lys Lys

245 250 255

Ala Asn Gln Asn Asn Ala Tyr Ile Tyr Ile Val Val Ser Val Leu Val

260 265 270

Val Ile Ala Val Ala Phe Val Leu Phe Met Val Tyr Gln Lys Met Thr

275 280 285

Lys Pro Ser Thr Ser Leu Pro Asn Ser Met Arg Phe Thr Asp Arg Leu

290 295 300

Lys Gln Trp Thr Met Gly Val Val Gln Glu Gln Val Ser Lys Pro Glu

305 310 315 320

Val Glu Pro Thr Ser Pro Thr Leu Leu Leu Pro Glu Glu Lys Glu Ser

325 330 335

Ile Leu Ile Val Ser Ala Ser Glu Pro Glu Leu Arg Leu Cys Ile Gly

340 345 350

Val Ser Ala Glu Asp Glu Gly Val Ser Asp Val Gly Pro Val Gly Asn

355 360 365

Asp Glu Gly Pro Cys Tyr Met Pro Gly Arg Glu Leu Asp Glu Asp Glu

370 375 380

Thr Leu Cys Pro Val Glu His Pro Ser Glu Tyr Glu Lys Arg Gln Val

385 390 395 400

Leu Val Asp Ile Ala Pro Asp Glu Gln Thr Glu Gly Tyr Arg Gly

405 410 415

<210> 7

<211> 1209

<212> DNA/RNA

<213> 花鲈(Lateorax maculatus)

<400> 7

atgctgctgg aaggtgcgtt cactgccctg ctcctcctgg tctgtggagt tcctgctgtg 60

attgttctgc ctccatcgaa catgaccgtg agctgccaaa atctcaaagt catcgtcagc 120

tggcagtaca gcaaagacca accacaaacc agcttcaggg tagacgtgca aagttctgct 180

gggaattatg tgaatgaaac cacagaccat cagcttgatc tgagccactt cttctgggta 240

tctgaagagc gctacatggc cctccatgag gtgactgtag cagccataca gggaggccac 300

cagtctgaac aaataaagtc taaaacattc gcctttaaca gtttaaagac ggctgatata 360

aaatgtgaat tagatttccc tcctgtacaa ctgaaggtgg attcggaggc cacagtgagt 420

ttcaaaaatc ccttccactt ctacagagaa ctggagcagg ctatcaagcc ggaagaagcc 480

acctttgcat acactgtctc ttcaggtgat aaacattttt attggcagtg cacaaagaaa 540

cagaaaatct gcaaacttga catcacattt cctgagaatg tggagaagtg cgtcacactg 600

aaaggacatt tgtatgatgg gattgaagtc ggcagcatag tgttcagaga gacgggcagg 660

atctgtgcaa atgaatcaac tgacgtccat tcgatagtcc ttataacact gctggtcatc 720

actgtgttag taatcagcgt ggcagcttta accatctggc agaccaaggc ctatatattg 780

aaggaaccca taccaaaccc tctgaagcca cctaaaccgg gaaaaaacaa ctcgaattac 840

tatactgtgc ccaacacagt catcagtcct gttacggtca ccaagccctg caagagccct 900

tcagtcagct ccgaggaggg gagcctctgc gacagctgcg tcagatctga ttcccagaac 960

aacgacaggt tgtactacgg gagaggactt tcagagagca gcaaccagag gctggaagct 1020

gtggggttga tatcagaggg acacgggaca gatgacgact ctgcagacga ctcggagaaa 1080

acagtgtctg tttggatcga tatggaggag gaggagcagt tggaggaggg ggtgtcaccc 1140

tatgactccc cgcagatgct ggacatgggc aacggagaca tggtcaaggg ttacagtcag 1200

atgtcttga 1209

<210> 8

<211> 402

<212> PRT

<213> 花鲈(Lateorax maculatus)

<400> 8

Met Leu Leu Glu Gly Ala Phe Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Cys Gly

1 5 10 15

Val Pro Ala Val Ile Val Leu Pro Pro Ser Asn Met Thr Val Ser Cys

20 25 30

Gln Asn Leu Lys Val Ile Val Ser Trp Gln Tyr Ser Lys Asp Gln Pro

35 40 45

Gln Thr Ser Phe Arg Val Asp Val Gln Ser Ser Ala Gly Asn Tyr Val

50 55 60

Asn Glu Thr Thr Asp His Gln Leu Asp Leu Ser His Phe Phe Trp Val

65 70 75 80

Ser Glu Glu Arg Tyr Met Ala Leu His Glu Val Thr Val Ala Ala Ile

85 90 95

Gln Gly Gly His Gln Ser Glu Gln Ile Lys Ser Lys Thr Phe Ala Phe

100 105 110

Asn Ser Leu Lys Thr Ala Asp Ile Lys Cys Glu Leu Asp Phe Pro Pro

115 120 125

Val Gln Leu Lys Val Asp Ser Glu Ala Thr Val Ser Phe Lys Asn Pro

130 135 140

Phe His Phe Tyr Arg Glu Leu Glu Gln Ala Ile Lys Pro Glu Glu Ala

145 150 155 160

Thr Phe Ala Tyr Thr Val Ser Ser Gly Asp Lys His Phe Tyr Trp Gln

165 170 175

Cys Thr Lys Lys Gln Lys Ile Cys Lys Leu Asp Ile Thr Phe Pro Glu

180 185 190

Asn Val Glu Lys Cys Val Thr Leu Lys Gly His Leu Tyr Asp Gly Ile

195 200 205

Glu Val Gly Ser Ile Val Phe Arg Glu Thr Gly Arg Ile Cys Ala Asn

210 215 220

Glu Ser Thr Asp Val His Ser Ile Val Leu Ile Thr Leu Leu Val Ile

225 230 235 240

Thr Val Leu Val Ile Ser Val Ala Ala Leu Thr Ile Trp Gln Thr Lys

245 250 255

Ala Tyr Ile Leu Lys Glu Pro Ile Pro Asn Pro Leu Lys Pro Pro Lys

260 265 270

Pro Gly Lys Asn Asn Ser Asn Tyr Tyr Thr Val Pro Asn Thr Val Ile

275 280 285

Ser Pro Val Thr Val Thr Lys Pro Cys Lys Ser Pro Ser Val Ser Ser

290 295 300

Glu Glu Gly Ser Leu Cys Asp Ser Cys Val Arg Ser Asp Ser Gln Asn

305 310 315 320

Asn Asp Arg Leu Tyr Tyr Gly Arg Gly Leu Ser Glu Ser Ser Asn Gln

325 330 335

Arg Leu Glu Ala Val Gly Leu Ile Ser Glu Gly His Gly Thr Asp Asp

340 345 350

Asp Ser Ala Asp Asp Ser Glu Lys Thr Val Ser Val Trp Ile Asp Met

355 360 365

Glu Glu Glu Glu Gln Leu Glu Glu Gly Val Ser Pro Tyr Asp Ser Pro

370 375 380

Gln Met Leu Asp Met Gly Asn Gly Asp Met Val Lys Gly Tyr Ser Gln

385 390 395 400

Met Ser

<210> 9

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgaaggttg tcacggcg 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcaggctctc aggtgacttt 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgcttttct ttgtgttatg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcacttctcc ggggaaatga 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggatcccg ggggtggatt tc 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tcagccacgg tagccctcag t 21

<210> 15

<211> 17

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgctgctgg aaggtgc 17

<210> 16

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tcaagacatc tgactgtaac cc 22

<210> 17

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cgctgtgacc cagaggaa 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgctttgcga tgttaggc 18

<210> 21

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atggtgacgc ctgtactcc 19

<210> 20

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aaagccagac tgtggttcct a 21

<210> 21

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttacgcttca cgcatccc 18

<210> 22

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cgccacggct attcttctt 19

<210> 23

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tggagttcct gctgtgattg 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gaagctggtt tgtggttggt 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cgagaccaat gagatcgcca 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

aacttctcag gcatacgggc 20

<210> 27

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ccggaattct cctacatcac aggg 24

<210> 28

<211> 26

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cccaagcttg gctctcaggt gacttt 26

<210> 29

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ccggaattcg aggtgccacc agctccgccg 30

<210> 30

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

cccaagctta atctctgttt gtttt 25

<210> 31

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cgagctccaa aagatgacca aaccctcaac 30

<210> 32

<211> 36

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

aaggaaaaaa gcggccgcgc cacggtagcc ctcagt 36

<210> 33

<211> 32

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ccggaattcc agaccaaggc ctatatattg aa 32

<210> 34

<211> 28

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cccaagctta gacatctgac tgtaaccc 28

<210> 35

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

taatacgact cactataggg 20

<210> 36

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gctagttatt gctcagcgg 19

<210> 37

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

catctccggt ctgaactggg 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

cactgtttga acaggcacgc 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gtatcagcag atgcgggaca 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

ggccctgaag tttcgtctga 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

tgaaacggca aatgaagcgg 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

tcgtggagtt tggggaatcg 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

tgagcagctg cggaatctac 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

taacagggcc agtgcacatt 20

<210> 45

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

tatgtgctca actcttggct ggtc 24

<210> 46

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

ccacgatggg cttgacttct cc 22

<210> 47

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

tggaacgagt acaccatgcc 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

gaccctagct cctgcttgac 20

<210> 49

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

ccggaattct cctacatcac aggg 24

<210> 50

<211> 26

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

ccgctcgagg gctctcaggt gacttt 26

<210> 51

<211> 27

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

ccgctcgaga tgaaggttgt cacggcg 27

<210> 52

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

ggggtaccgg ctctcaggtg acttt 25

<210> 53

<211> 28

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

gctctagaat gcttttcttt gtgttatg 28

<210> 54

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

ggggtaccct tctccgggga aatga 25

<210> 55

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

ccgctcgaga tggatcccgg gggtg 25

<210> 56

<211> 26

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

ggggtaccgc cacggtagcc ctcagt 26

<210> 57

<211> 26

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

ccgctcgaga tgctgctgga aggtgc 26

<210> 58

<211> 27

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

ggggtaccag acatctgact gtaaccc 27

<210> 59

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

atctggtgga taagggaac 19

<210> 60

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

catcctctgt taatgtggc 19

<210> 61

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

taatgccaca gtcggtgaa 19

<210> 62

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

aggtccagtg ttagtgatga gc 22

<210> 63

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

gcaaagcgag ggttacgac 19

<210> 64

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

ctgccattac taacgatgct gac 23

<210> 65

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

cggtatccat gagaccacct 20

<210> 66

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

cttctgcatc ctgtcagcaa 20

Claims

1.包含花鲈干扰素IFN-γ及其受体的抗病毒组合物，其特征是，包含花鲈干扰素IFN-γ和花鲈II型干扰素受体，所述花鲈II型干扰素受体为CRFB6、CRFB13和CRFB17中的一种或两种以上组合。

2.根据权利要求1所述的包含花鲈干扰素IFN-γ及其受体的抗病毒组合物，其特征是，包含花鲈干扰素IFN-γ和CRFB6。

3.根据权利要求1所述的包含花鲈干扰素IFN-γ及其受体的抗病毒组合物，其特征是，包含花鲈干扰素IFN-γ、CRFB6和CRFB13。

4.根据权利要求1所述的包含花鲈干扰素IFN-γ及其受体的抗病毒组合物，其特征是，包含花鲈干扰素IFN-γ、CRFB6、CRFB13和CRFB17。

5.权利要求1-4任一项所述包含花鲈干扰素IFN-γ及其受体的抗病毒组合物在制备水产动物抗病毒药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征是，所述病毒为大口黑鲈溃疡综合征病毒。

7.权利要求1-3任一项所述包含花鲈干扰素IFN-γ及其受体的抗病毒组合物在制备增强水产动物抗病毒免疫力的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征是，所述病毒为大口黑鲈溃疡综合征病毒。