CN115177581A - 一种用于免疫治疗的可注射水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于免疫治疗的可注射水凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115177581A
CN115177581A CN202210510863.8A CN202210510863A CN115177581A CN 115177581 A CN115177581 A CN 115177581A CN 202210510863 A CN202210510863 A CN 202210510863A CN 115177581 A CN115177581 A CN 115177581A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hydrogel
ipbisog
immunotherapy
tumor
inosine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210510863.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115177581B (zh
Inventor
赵行
祁佳佳
刘江
罗小波
陈谦明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan University
Original Assignee
Sichuan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan University filed Critical Sichuan University
Priority to CN202210510863.8A priority Critical patent/CN115177581B/zh
Publication of CN115177581A publication Critical patent/CN115177581A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115177581B publication Critical patent/CN115177581B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7076—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0024—Solid, semi-solid or solidifying implants, which are implanted or injected in body tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于免疫治疗的可注射水凝胶及其制备方法和应用，属于水凝胶领域。本发明以化学键合的方式构建的超分子可注射水凝胶克服了传统物理包覆型水凝胶递送系统易造成突释的缺点，对肌苷和aPDL1具有优良的缓释效果，该水凝胶具有全身免疫调节作用，可以明显增强PD‑L1抗体的肿瘤免疫治疗效果。与此同时，该水凝胶还具有优异生物相容性，毒副作用小。本发明提供的可注射水凝胶在制备免疫治疗药物和生物材料中具有广阔的应用前景。

Description

一种用于免疫治疗的可注射水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于水凝胶领域，具体涉及一种用于免疫治疗的可注射水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗，特别是程序性凋亡蛋白1(简称PD-1)封闭治疗，因其显著的临床疗效已经成为目前的研究前沿。PD-L1抗体(简称aPDL1)是一种免疫检查点抑制剂，可以通过与肿瘤细胞表面高表达的PD-L1受体特异性结合来阻断肿瘤免疫抑制信号通路PD-1/PD-L1。PDL1抗体在临床应用中对多种癌症有很好的免疫治疗效果，如非小细胞肺癌、头颈癌和黑色素瘤。但是，PD-L1抗体在应用上还存在一定的局限性，例如治疗效果不理想，总有效率低于40％，并且会产生全身性副作用。
公开号为CN113559269A的中国专利申请公开了一种抗肿瘤的药物组合物，所述抗肿瘤的药物组合物包括肌苷或其衍生物，化疗药物和/或靶向治疗药物，免疫检查点抑制剂，例如anti-PD-1、anti-PD-L1抗体/抑制剂。该申请发现将肌苷或其衍生物与其他各肿瘤治疗方式进行联用，能够进一步增强抗肿瘤治疗疗效或逆转肿瘤治疗耐药，还可以减轻由其他各肿瘤治疗方式带来的毒副作用。另外，有研究发现，肌苷可以在体内增强PD-L1及CTLA-4免疫检查点封闭治疗的疗效，其主要机制有以下两个方面：①肌苷的核糖亚基可通过戊糖磷酸途径(PPP)、糖酵解和Krebs循环途径代谢，可以在葡萄糖缺乏的条件下作为替代能源促进CD8+T细胞增殖和功能；②微生物来源的肌苷可以通过激活腺苷2A受体(A2AR)促进T细胞Th1型分化及CD8+T细胞活化来增强肿瘤免疫治疗。
但是，由于肌苷的体内半衰期较短(约15h)，为了达到理想的治疗效果，需要高频率与大剂量的通过系统给药的方式给予肌苷以及PD-L1抗体，从而导致患者依从性较差。此外，全身应用PD-L1抗体易导致PD-L1抗体与正常组织的脱靶结合，可能诱发剧烈的免疫相关副作用，严重影响患者生存质量。
近年来，水凝胶由于其良好的生物相容性和药物封装作用在药物递送系统中获得了广泛的关注。在天然核碱基中，鸟苷及其衍生物因其在适当条件下具有自互补的氢键包括Hoogsteen氢键以及Watson-Crick氢键和芳香族表面的π-π堆叠相互作用而受到关注。申请号为201810452768.0的中国专利申请公开了有一种自愈性可注射超分子水凝胶，该超分子水凝胶是按照以下方法制得的：分别称取一定质量的鸟苷和芳基硼酸化合物，将其加入到盐水或碱水溶液中，加热至沸腾使其完全溶解，自然冷却，即得。该超分子水凝胶具有良好的自愈性、粘弹性、可注射性、和使用安全性，在离子皮肤、凝胶电解液领域具有良好的应用前景。但是，一方面，该申请仅仅公开了该超分子水凝胶作为离子皮肤、凝胶电解液的用途，并未公开该水凝胶作为免疫治疗药物的递送系统；另一方面，即使以该超分子水凝胶作为载体来包载药物用于免疫治疗，其在体内也易造成药物的突释，导致免疫治疗效果不佳。
因此，开发一种免疫治疗效果优异、同时能减少免疫相关副作用的新型药物具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于免疫治疗的可注射水凝胶及其制备方法和应用，该可注射水凝胶同时具有优异的免疫治疗效果和低免疫相关副作用。
本发明提供了一种可注射水凝胶，它是将肌苷、1，4-苯基硼酸及鸟苷在水性溶剂中加热溶解后冷却得到的；其中，鸟苷的质量浓度为0.0002％-2％。
进一步地，所述鸟苷为异鸟苷。
进一步地，所述水性溶剂为水或缓冲溶液，所述缓冲溶液优选为PBS缓冲液；
和/或，所述鸟苷的质量浓度为1.4％；
和/或，所述肌苷、1，4-苯基硼酸及鸟苷的摩尔比为1：(0.5-2)：(0.5-2)，优选为1:1:1。
本发明还提供了一种用于免疫治疗的水凝胶，它是以上述的可注射水凝胶和免疫治疗剂为原料制得的。
进一步地，所述免疫治疗剂为免疫检查点抑制剂；所述免疫检查点抑制剂优选为PD-1抗体或PD-L1抗体。
进一步地，所述免疫治疗剂与肌苷的质量比为(6-7)：1，优选为6.7：1。
本发明还提供了一种制备上述用于免疫治疗的水凝胶的方法，所述方法包括以下步骤：在可注射水凝胶中加入免疫治疗剂的水性溶液，即得。
本发明还提供了上述用于免疫治疗的水凝胶在制备免疫治疗药物或生物材料中的用途。
进一步地，所述免疫治疗为肿瘤免疫治疗。
进一步地，所述肿瘤为非小细胞肺癌、头颈癌、黑色素瘤。
本发明以化学键合的方式构建了一种新型超分子可注射水凝胶，该水凝胶克服了传统物理包覆型水凝胶递送系统易造成突释的缺点，对肌苷和aPDL1具有优良的缓释效果，该水凝胶具有全身免疫调节作用，可以明显增强PD-L1抗体的肿瘤免疫治疗效果。
该水凝胶具有优异生物相容性，毒副作用小。
该水凝胶还具有优异的可注射性和自愈性。
本发明提供的可注射水凝胶在制备免疫治疗药物和生物材料(例如植入材料)中具有广阔的应用前景。
本发明提供的制备上述超分子水凝胶的方法简单，安全无毒，适合扩大化生产。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：IPBisoG水凝胶的稳定性及结构表征。A)1.4％wtIPBisoG水凝胶的形成及其稳定性；B)inosine、isoG及IPBisoG的1H NMR图谱；C)PBA、PBisoG及IPBisoG的11B NMR图谱；D)IPBisoG的圆二色谱图；E)IPBisoG水凝胶的PXRD图；F)IPBisoG水凝胶变温小角X射线散射图；G)IPBisoG水凝胶的成胶原理示意图；H)IPBisoG水凝胶SEM图；I)IPBisoG水凝胶AFM图。
图2：IPBisoG水凝胶可注射性及体内外缓释性能。A)IPBisoG水凝胶流变学应变扫描图；B)IPBisoG水凝胶自修复扫描图；C)IPBisoG水凝胶黏度扫描图；D)IPBisoG水凝胶注射实验；E)IPBisoG水凝胶良好的书写能力；F)水凝胶中肌苷及aPDL1的释放随时间的变化图；G)不同处理组肿瘤组织中肌苷含量变化；H)不同处理组血液中肌苷含量变化；I)不同处理组Cy5-aPDL1活体荧光成像图；J)60h时不同处理组Cy5-aPDL1荧光强度对比柱状图，(*)P<0.05。
图3：IPBisoG水凝胶的生物相容性。A)IPBisoG水凝胶体内降解图；B)IPBisoG水凝胶注射后小鼠注射部位皮肤及心、肝、脾、肺、肾HE染色；C)不同浓度IPBisoG水凝胶溶血实验直观图；D)不同浓度IPBisoG水凝胶溶血率。
图4：IPBisoG水凝胶体内免疫治疗疗效。A)IPBisoG水凝胶治疗B16F10移植瘤治疗分组及治疗周期；B)不同处理组肿瘤生长曲线；C)不同时间点各处理组B16F10移植瘤活体荧光成像图；D)实验终点各处理组肿瘤体积柱状图；E)实验终点各处理组小鼠肿瘤直观图；F)不同处理组小鼠体重变化图；肿瘤生长曲线结果分析采用重复测量的方差分析，以Mean±SEM表示；(*)P<0.05；(**)P<0.01；(***)P<0.001。
图5：IPBisoG水凝胶体内免疫治疗机制验证。A)B16F10模型中不同处理组肿瘤组织中CD8+T细胞表达IHC图；B)B16F10模型中不同处理组肿瘤组织浸润淋巴细胞中IFN-γ+CD8+T细胞流式图；C)B16F10模型中不同处理组脾脏组织浸润淋巴细胞中IFN-γ+CD8+T细胞流式图；结果分析采用单因素的方差分析，以Mean±SEM表示；(*)P<0.05；(**)P<0.01；(***)P<0.001。图6：IPBisoG水凝胶增强全身免疫系统验证:A)IPBisoG水凝胶治疗B16F10双侧移植瘤治疗分组及治疗周期示意图；B)不同时间点各处理组B16F10双侧移植瘤活体荧光成像图；C)不同处理组小鼠右侧B16F10移植瘤生长曲线；D)不同处理组小鼠左侧B16F10移植瘤生长曲线；E)各处理组实验终点肿瘤体积柱状图；F)各处理组小鼠生存曲线；G)各处理组小鼠体重变化图；肿瘤生长曲线结果采用重复测量方差分析统计分析，小鼠生存曲线结果采用对数秩检验统计分析；以Mean±SEM表示；(*)P<0.05；(**)P<0.01；(***)P<0.001。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
肌苷，又称inosine，结构为：
Figure BDA0003639429780000041
1，4-苯基硼酸，又称PBA，结构为：
Figure BDA0003639429780000042
异鸟苷，又称isoG，结构为：
Figure BDA0003639429780000043
PD-L1抗体，又称aPDL1，是一种免疫检查点抑制剂。
以下实施例和实验例采用的PBS缓冲液的pH范围为7.35～7.45。
实施例1、制备IPBisoG水凝胶
将等摩尔的肌苷、1，4-苯基硼酸及异鸟苷在PBS缓冲液中混匀(其中，异鸟苷的质量浓度为1.4％)，加热至100℃充分溶解后，冷却至室温，形成1.4％wt的IPBisoG水凝胶。
实施例2、制备包载了aPDL1的IPBisoG水凝胶
等摩尔的肌苷、1，4-苯基硼酸及异鸟苷在PBS缓冲液中混匀(其中，异鸟苷的质量浓度为1.4％)，加热至100℃充分溶解后，冷却至室温，向该混合溶液中加入含有aPDL1的PBS溶液，控制aPDL1与肌苷的质量比为6.7：1，静置，形成包载了aPDL1的1.4％wt的IPBisoG水凝胶。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、IPBisoG水凝胶的结构表征
1.实验方法
在室温下将实施例1制备IPBisoG水凝胶后的小瓶倒置，若未观察到样品流动，即可确认水凝胶形成。
取实施例1制得的IPBisoG水凝胶分别进行1H NMR表征，11B NMR表征，圆二色谱(CD)表征，粉末X射线衍射分析(PXRD)，变温小角X射线散射，原子力显微镜(AFM)表征，扫描电子显微镜(SEM)表征。以inosine、isoG、PBA为对照。
2.实验结果
如图1A所示，IPBisoG可自组装形成超分子水凝胶，并在3个月后仍保持稳定。
图1B-G显示了IPBisoG水凝胶基本的成胶原理。扫描电镜和原子力显微镜显示出该水凝胶的三维多孔网络是由包含众多纳米纤维的树枝状或网状结构组成的光滑成员状结构形成的(图1H-I)，这些孔状结构为PD-L1抗体的包封提供了物理空间。
实验例2、IPBisoG水凝胶的可注射性及体内外缓释性能
1.实验方法
可注射性是保证水凝胶生物医学应用的重要特性。可注射性便于临床使用，并可以达到微创，减少侵入性，同时可以减少系统给药的相关不良反应。为评估IPBisoG水凝胶的的可注射性，使用流变测试评估其自愈能力。具体测试方法如下：在震荡模式下，选用型号为PP50的转子，平板规格50mm。首先制备1.4％wt的IPBisoG水凝胶，加热至溶液状态，用移液枪吸取1.5mL凝胶溶液置于预热至65℃流变仪平行板上，下降椎板PP50至间隙距离为0.5mm，刮除多余样品，并沿平行板周围滴加硅油，边缘密封以防止蒸发，降温至25℃进行测试(参数设置：①应变扫描：角频率10rad/s，剪切应变0.1％-100％；②黏度扫描：剪切速率0.1-100/s；③自修复扫描：角频率10rad/s，剪切应变0.1％-100％-0.1％)。
良好的缓释潜能是水凝胶应用于肿瘤局部免疫治疗、减少全身免疫治疗相关不良反应的重要性能之一。故使用HPLC及ELISA实验评估IPBisoG水凝胶的体外缓释潜能；HPLC-MS及活体荧光成像实验评估IPBisoG水凝胶的体内缓释潜能。具体测试方法如下：
(1)首先制备了1.4％wt的IPBisoG水凝胶，取3mL分别置于3个玻璃小瓶中，每个小瓶1mL，即设置三个平行样品；在水凝胶上方各加入2mL的PBS，室温静置。在不同时间点(0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h)取20μL缓释液，然后再加入同等体积的PBS补足体积。用HPLC检测不同时间点的缓释液中肌苷和isoG的含量及变化(参数设置：①流动相水：甲醇＝90：10；②柱温25℃；③进样体积20μL；④流速0.8mL/min；⑤检测波长248nm)。接下来制备了包载aPDL1的1.4％wt的IPBisoG水凝胶，取3mL分别置于3个玻璃小瓶中，每个小瓶1mL，即设置三个平行样品；在水凝胶上方各加入2mL的PBS，室温静置。在不同时间点(0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h)取20μL缓释液，然后再加入同等体积的PBS补足体积。用ELISA检测不同时间点的缓释液中aPDL1的含量及变化。
(2)收集状态良好、处于对数生长期内的B16F10细胞，细胞经无血清DMEM培养基洗涤3次后重悬、计数，调整细胞密度为1×106个/mL，使用1mL注射器在小鼠右侧肋部皮下接种100μL细胞悬液，构建B16F10细胞移植瘤模型。小鼠B16F10细胞移植瘤模型构建成功后将实验动物随机分为两组，每组60只；制备1.4％wt的IPBisoG水凝胶，用胰岛素针给予实验动物瘤周注射50μLIPBisoG水凝胶；对照组实验动物瘤周注射50μL含与IPBisoG水凝胶相等质量肌苷的PBS溶液。在特定时间点处死实验动物，采用HPLC-MS检测小鼠体内重要脏器(心、肝、脾、肺、肾)、血液及肿瘤组织中肌苷的含量及变化(参数设置：①流动相-0.1％甲酸水：乙腈＝98：2 0.01；0.1％甲酸水：乙腈＝95：5 1.00；0.1％甲酸水：乙腈＝90：10 1.50；0.1％甲酸水：乙腈＝90：10 2.60；②柱温35℃；③进样体积20μL)。
(3)小鼠B16F10细胞移植瘤模型构建成功后随机分为两组，每组5只；制备1.4％wt的IPBisoG水凝胶，并往水凝胶中包封Cy5标记的aPDL1；用胰岛素针给予实验动物瘤周注射50μL包封了Cy5标记aPDL1的IPBisoG水凝胶；对照组实验动物瘤周注射50μL含相等质量Cy5标记aPDL1抗体的PBS溶液。在特定时间点，采用小动物活体荧光成像仪检测并分析小鼠体内荧光信号强度变化(参数设置：相机温度-70℃；载物台高度10mm；视野D；曝光时间自动；激发波长650nm；发射波长680nm)。
2.实验结果
图2A-B表明当应变达到时，IPBisoG可由凝胶变为溶液，同时在交替应变变化中，其模量可回复初始值。除此之外，该水凝胶显示了良好的剪切稀化性能(图2C)。图2D-E说明在体外进行可注射实验时，水凝胶在针管内成胶，通过针头注射剪切稀化为液体后具有可书写性。同时，注射入小瓶内水凝胶则可立即成胶。以上结果证实，IPBisoG水凝胶具有良好的可注射性和快速的自愈性，在被剪切后可以快速且完全恢复其原始模量。
图2F显示本发明水凝胶在体外对肌苷及aPDL1具有良好的缓释潜能；图2G-J显示了本发明水凝胶可以实现肌苷及aPDL1在肿瘤部位的长存留时间，具有良好的体内缓释潜能。
上述实验结果表明，本发明的IPBisoG水凝胶具有良好的可注射性和快速的自愈性，在被剪切后可以快速且完全恢复其原始模量。包载了aPDL1的IPBisoG水凝胶在体外和体内均对肌苷及aPDL1具有良好的缓释性能，有利于在体内发挥优异的免疫治疗效果。
实验例3、IPBisoG水凝胶的生物相容性
1.实验方法
为评估IPBisoG水凝胶应用于肿瘤免疫治疗的生物相容性，采用体内降解实验及体外溶血实验检测了IPBisoG水凝胶的生物相容性。具体测试方法如下：
(1)首先制备1.4％wt的IPBisoG水凝胶，用胰岛素针注射100μLIPBisoG水凝胶于6-8周龄的BABL/c雌性小鼠背部皮下，PBS作为对照。在特定时间点(0h、24h、48h、72h、96h)观察小鼠背部皮下凝胶的存留情况并拍摄照片，评价其降解情况。同时安乐处死实验动物，取小鼠注射部位的皮肤及重要脏器(心、肝、脾、肺、肾)，固定、包埋、4um切片，HE染色进行组织病理学分析。
(2)取BABL/c小鼠眼眶血，将眼眶血加入含有肝素钠的抗凝真空采血管中，上下摇晃，充分混匀；加入预冷的PBS后重复离心，制备5％压积红细胞；随后与等体积的不同浓度IPBisoG水凝胶共孵育(PBS及0.1％Triton-100分别做阴性及阳性对照)，吸取上清，酶标仪检测上清562nm处吸光度(OD)值，计算溶血率。
2.实验结果
体内降解实验显示IPBisoG水凝胶在体内的降解时间约为96h(图3A)，且对重要脏器没有明显的毒性(图3B)。
同时体外溶血实验证明IPBisoG水凝胶未引发明显的溶血现象(图3C-D)。
上述实验结果说明本发明的IPBisoG水凝胶应用于肿瘤免疫治疗具有良好的生物相容性，毒副作用小。
实验例4、IPBisoG水凝胶在体内促进肿瘤免疫治疗的疗效
1.实验方法
为进一步确定IPBisoG水凝胶在体内的生物学应用，建立了小鼠黑色素瘤B16F10移植瘤模型。具体测试方法如下：
(1)收集状态良好、处于对数生长期内的B16F10细胞，细胞经无血清DMEM培养基洗涤3次后重悬，计数，调整细胞密度为1×106个/mL，使用1mL胰岛素针在小鼠右侧肋部皮下接种100μL细胞悬液，构建B16F10细胞移植瘤模型。接种B16F10细胞6天后肉眼可见肿瘤结节，可以扪及皮下肿块，将小鼠随机分组(n＝10只/组)，包括PBS组(50μL/只)、aPDL1组(50μL，100ug/只)、IPBisoG水凝胶组(1.4％wt，50μL/只)、inosine+aPDL1组(50μL，肌苷及aPDL1给药量与IPBisoG水凝胶组及aPDL1组保持一致)、IPBisoG+aPDL1组(即注射包载了aPDL1的1.4％wt的IPBisoG水凝胶，50μL/只，aPDL1给药量同aPDL1组保持一致，肌苷给药量同IPBisoG水凝胶组保持一致)，此时测量各组肿瘤体积，并通过瘤周注射的方式给予各组相应的治疗，每3天1次。动物伦理标准规范内，在特定时间点用数显游标卡尺测量肿瘤体积，并进行动物体重的称量，同时观察记录动物的毛发、行为等变化。计算肿瘤体积(V)：V＝π/6×最大径×(垂直最大径的最小径)2。当动物达到伦理安乐死标准(肿瘤体积达到1500mm3；肿瘤最大径达到20mm；肿瘤坏死部位直径达到10mm；小鼠体重下降超过初始体重的20％)时，终止实验，收取肿瘤及重要脏器用于后续实验。
(2)在特定时间点(第8、11、14、17天)进行小动物活体荧光实验，实验12h前动物禁食，但不禁水；动物使用异氟烷吸入麻醉镇静后，使用胰岛素针将100μL D-荧光素钾盐(D-luciferin,Potassium salt，D-luc，30mg/mL)注入小鼠腹腔，10min后采用小动物活体荧光成像仪检测动物体内生物发光信号。
2.实验结果
如图4C所示，在整个实验过程中，各个治疗组的肿瘤发光信号均比PBS对照组减弱，其中IPBisoG+aPDL1组发光信号最弱。与活体荧光成像结果一致，各处理组肿瘤生长曲线如图4B所示，与PBS对照组相比，各治疗组的肿瘤生长均受到不同程度的抑制，aPDL1组、IPBisoG组、inosine+aPDL1组及IPBisoG+aPDL组的肿瘤抑制率分别为41.06％、61.46％、70.46％及84.59％，其中IPBisoG+aPDL1组肿瘤生长抑制作用最为明显(图4B)。各治疗组小鼠实验终点肿瘤直观图结果与肿瘤生长曲线一致(图4E)。
为进一步说明IPBisoG水凝胶对肿瘤免疫微环境的具体影响，首先采用IHC实验对各处理组B16F10肿瘤组织中CD8+T细胞的浸润情况进行了初步探究，结果如图5A所示，在B16F10肿瘤组织中，相较于PBS对照组，经不同药物处理后，肿瘤组织中浸润的CD8+T细胞均有不同程度的升高，其中IPBisoG+aPDL1组升高最为明显。接下来对B16F10肿瘤组织浸润淋巴细胞中的CD8+IFN-γ+T细胞进行了流式分析，结果如图5B所示：PBS组、aPDL1组、IPBisoG组、inosine+aPDL1组及IPBisoG+aPDL1组CD8+IFN-γ+T细胞的比例分别为1.09％、1.57％、1.06％、1.47％及2.52％，其中相较于PBS组，IPBisoG+aPDL1组CD8+IFN-γ+T细胞比例升高最为显著。同样对各处理组实验终点时脾脏组织淋巴细胞中的CD8+IFN-γ+T细胞进行了流式分析，结果如图5C所示：PBS组、aPDL1组、IPBisoG组、inosine+aPDL1组及IPBisoG+aPDL1组CD8+IFN-γ+T细胞的比例分别为1.34％、1.14％、1.93％、2.03％及2.52％，其中相较于aPDL1组，IPBisoG+aPDL1组CD8+IFN-γ+T细胞比例升高最为显著。
为了进一步说明IPBisoG水凝胶对全身免疫反应的影响，接下来建立了B16F10细胞双侧移植瘤模型。以PBS组作为对照，予以IPBisoG+aPDL1组小鼠右侧肿瘤瘤周注射包载了aPDL1的1.4％wt的IPBisoG水凝胶(50μL，aPDL1给药量为100μg/只)，左侧肿瘤不做任何处理(图6A)。与PBS组相比，IPBisoG+aPDL1组双侧肿瘤的体内发光信号均有不同程度减弱(图6B)。双侧肿瘤生长曲线也显示出与活体荧光成像一致的结果；如图6C-D所示，与PBS对照组相比，IPBisoG+aPDL1组的右侧肿瘤生长明显受到抑制，抑制率约为75.06％；同时，IPBisoG+aPDL1组左侧肿瘤相较于PBS组，其生长也受了明显抑制，抑制率约为54.82％。同时对两个处理组动物的生存时间也进行了分析，如图6F所示，PBS组小鼠的中位数生存时间为19天，而IPBisoG+aPDL1组的中位数生存时间延长至29天。
上述实验结果表明，本发明的IPBisoG水凝胶可以明显增强PD-L1抗体免疫治疗的疗效，且这种免疫增强作用主要是依赖增强CD8+T细胞的增殖与功能实现的。同时，IPBisoG水凝胶具有全身免疫调节作用，能够增强全身免疫治疗疗效。
综上，本发明提供了一种用于免疫治疗的可注射水凝胶及其制备方法和应用。本发明以化学键合的方式构建的超分子可注射水凝胶克服了传统物理包覆型水凝胶递送系统易造成突释的缺点，对肌苷和aPDL1具有优良的缓释效果，该水凝胶具有全身免疫调节作用，可以明显增强PD-L1抗体的肿瘤免疫治疗效果。与此同时，该水凝胶还具有优异生物相容性，毒副作用小。本发明提供的可注射水凝胶在制备免疫治疗药物和生物材料中具有广阔的应用前景。

Claims (10)

1.一种可注射水凝胶，其特征在于：它是将肌苷、1，4-苯基硼酸及鸟苷在水性溶剂中加热溶解后冷却得到的；其中，鸟苷的质量浓度为0.0002％-2％。
2.根据权利要求1所述的可注射水凝胶，其特征在于：所述鸟苷为异鸟苷。
3.根据权利要求1所述的可注射水凝胶，其特征在于：所述水性溶剂为水或缓冲溶液，所述缓冲溶液优选为PBS缓冲液；
和/或，所述鸟苷的质量浓度为1.4％；
和/或，所述肌苷、1，4-苯基硼酸及鸟苷的摩尔比为1：(0.5-2)：(0.5-2)，优选为1:1:1。
4.一种用于免疫治疗的水凝胶，其特征在于：它是以权利要求1-3任一项所述的可注射水凝胶和免疫治疗剂为原料制得的。
5.根据权利要求4所述的水凝胶，其特征在于：所述免疫治疗剂为免疫检查点抑制剂；所述免疫检查点抑制剂优选为PD-1抗体或PD-L1抗体。
6.根据权利要求4或5所述的水凝胶，其特征在于：所述免疫治疗剂与肌苷的质量比为(6-7)：1，优选为6.7：1。
7.一种制备权利要求4-6任一项所述用于免疫治疗的水凝胶的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：在可注射水凝胶中加入免疫治疗剂的水性溶液，即得。
8.权利要求4-6任一项所述用于免疫治疗的水凝胶在制备免疫治疗药物或生物材料中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述免疫治疗为肿瘤免疫治疗。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述肿瘤为非小细胞肺癌、头颈癌、黑色素瘤。
CN202210510863.8A 2022-05-11 2022-05-11 一种用于免疫治疗的可注射水凝胶及其制备方法和应用 Active CN115177581B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210510863.8A CN115177581B (zh) 2022-05-11 2022-05-11 一种用于免疫治疗的可注射水凝胶及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210510863.8A CN115177581B (zh) 2022-05-11 2022-05-11 一种用于免疫治疗的可注射水凝胶及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115177581A true CN115177581A (zh) 2022-10-14
CN115177581B CN115177581B (zh) 2023-08-04

Family

ID=83512909

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210510863.8A Active CN115177581B (zh) 2022-05-11 2022-05-11 一种用于免疫治疗的可注射水凝胶及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115177581B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106000363A (zh) * 2016-06-23 2016-10-12 大连医科大学 一种苯硼酸亲水硅胶材料的制备方法
CN107189011A (zh) * 2016-12-21 2017-09-22 哈尔滨师范大学 中空分子印迹聚合物、固相萃取柱及其制备方法和应用
CN109180963A (zh) * 2018-08-15 2019-01-11 四川大学 一种自修复超分子水凝胶及其制备方法和用途
CN111804246A (zh) * 2020-02-17 2020-10-23 河南工业大学 一种超分子低共熔溶剂凝胶及其制备方法与应用
CN113304325A (zh) * 2020-02-27 2021-08-27 四川大学 一种集可注射与抗菌于一体的双功能水凝胶及其制备方法和用途
CN114224824A (zh) * 2021-12-17 2022-03-25 四川大学 一种可用于亲脂性药物递送的超分子水凝胶及其制备方法和用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106000363A (zh) * 2016-06-23 2016-10-12 大连医科大学 一种苯硼酸亲水硅胶材料的制备方法
CN107189011A (zh) * 2016-12-21 2017-09-22 哈尔滨师范大学 中空分子印迹聚合物、固相萃取柱及其制备方法和应用
CN109180963A (zh) * 2018-08-15 2019-01-11 四川大学 一种自修复超分子水凝胶及其制备方法和用途
CN111804246A (zh) * 2020-02-17 2020-10-23 河南工业大学 一种超分子低共熔溶剂凝胶及其制备方法与应用
CN113304325A (zh) * 2020-02-27 2021-08-27 四川大学 一种集可注射与抗菌于一体的双功能水凝胶及其制备方法和用途
CN114224824A (zh) * 2021-12-17 2022-03-25 四川大学 一种可用于亲脂性药物递送的超分子水凝胶及其制备方法和用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN115177581B (zh) 2023-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Shao et al. Biomimetic diselenide‐bridged mesoporous organosilica nanoparticles as an X‐ray‐responsive biodegradable carrier for chemo‐immunotherapy
Liu et al. Photothermal-triggered immunogenic nanotherapeutics for optimizing osteosarcoma therapy by synergizing innate and adaptive immunity
CN109045303B (zh) 一种中药-磁纳米簇化学免疫药物递送系统及其制备方法
JPH11514650A (ja) 治療用シスプラチン（ｃｄｄｐ）のための改良された方法及び組成物
Wu et al. A Bi 2 S 3-embedded gellan gum hydrogel for localized tumor photothermal/antiangiogenic therapy
Ke et al. Bifunctional fusion membrane‐based hydrogel enhances antitumor potency of autologous cancer vaccines by activating dendritic cells
JP2008506757A5 (zh)
Tang et al. Extracellular Vesicles‐Derived Hybrid Nanoplatforms for Amplified CD47 Blockade‐Based Cancer Immunotherapy
Das et al. Preparation of a size selective nanocomposite through temperature assisted co-assembly of gelatin and pluronic F127 for passive targeting of doxorubicin
MX2011007532A (es) Estructuras porosas con cinetica de biodegradacion modificada.
CN114224824B (zh) 一种可用于亲脂性药物递送的超分子水凝胶及其制备方法和用途
Jiang et al. Sono‐Driven STING Activation using Semiconducting Polymeric Nanoagonists for Precision Sono‐Immunotherapy of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma
CN114010799B (zh) 一种光热协同化疗的靶向可降解纳米药物载体及其制备方法
Zhao et al. Epigenetic reprogramming of carrier free photodynamic modulator to activate tumor immunotherapy by EZH2 inhibition
Liu et al. Thermosensitive selenium hydrogel boosts antitumor immune response for hepatocellular carcinoma chemoradiotherapy
Zhang et al. An Intelligent Vascular Disrupting Dendritic Nanodevice Incorporating Copper Sulfide Nanoparticles for Immune Modulation‐Mediated Combination Tumor Therapy
WO2023246336A1 (zh) 一种仿生可注射多肽水凝胶的制备及应用
CN115177581B (zh) 一种用于免疫治疗的可注射水凝胶及其制备方法和应用
CN113332241A (zh) 一种小胶束纳米药物及其制备方法与应用
Zheng et al. Labeling Assembly of Hydrophilic Methionine into Nanoparticle for Mild‐Heat Mediated Immunometabolic Therapy
Depani et al. Preparation and evaluation of chitosan based thermoreversible gels for intraperitoneal delivery of 5-fluorouracil (5-FU)
JP5150084B2 (ja) 高水溶性ｐ−ボロノフェニルアラニン含有組成物
Zhang et al. Multifunctional Cu x S-and DOX-loaded AuNR@ mSiO 2 platform for combined melanoma therapy with inspired antitumor immunity
Li et al. Hypoglycemic effect of insulin-loaded hydrogel-nanogel composite on streptozotocin-induced diabetic rats
CN109276541B (zh) 一种可调节药物释放的脂质体组合物及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant