CN115176029A - 分析物检测 - Google Patents

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保罗·阿克蒂
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Abstract

一种用于检测靶标分析物的载体分子，包含限定中央孔隙的分子框架和对靶标分析物具有特异性的结合部分。结合部分结合至框架并定位，使得靶标分析物在结合至结合部分时位于中央孔隙中。载体分子应用于样品中靶标分析物的检测和/或定量。

Description

分析物检测
技术领域
本发明涉及用于靶标分析物检测的载体分子、包含载体分子的组合物和试剂盒以及使用载体分子检测样品中靶标分析物的方法。更具体地，本发明涉及包含对所述靶标分析物具有特异性的结合部分所结合的分子框架的载体分子。
背景技术
疾病生物标志物的快速和廉价检测在现代保健中变得日益重要，其中不断增加的注意力集中在早期诊断。由于相关生物标志物通常仅以极低浓度存在，因此这提供了巨大技术挑战。理想地，诊断测定将能够检测小体积复杂临床样品中极少生物标志物的存在。当前金标准临床诊断测定通常基于整体平均免疫测定，如ELISA(酶联免疫吸附测定)。在这些中，结合部分，如抗体或抗体模拟物用于捕获样品中的相关生物标志物，并且通常，每个抗体-生物标志物相互作用促使较小的量达到积累的测定信号。然而，不再能够识别个体免疫相互作用，并且仅将它们自身显示为这种整体平均信号。有争议地，以单一实体分辨率，而不是通过整体平均技术检测生物标志物的能力为超低生物标志物浓度的检测提供了显著优势。
在近些年已发展的多种单分子方法中，其中跨纳米孔施加电压并将电压以随时间变化的电化学电流的形式脉冲的纳米孔用于检测单个蛋白的用途是有前景的方法。在本文中，移位通过纳米孔的单一蛋白在否则将稳定的离子电流中引起短暂调节。该方法已在一些单分子蛋白和DNA检测研究中使用。
然而，除了这些进步之外，仍存在显著困难。从复杂混合物检测特定分子是非常困难的，因为当纳米孔直径大于分子尺寸时，单一实体的移位速度通常较高，并因此移位仅导致产生弱信号和相应低的信噪比。此外，由不同蛋白所产生的信号通常非常类似并且难以区分。为了解决这些限制，已实施了多种策略，包括通过小心选择电解质和开发高带宽电子设备来减缓蛋白移位。另外，已研究了纳米孔的化学和生物学改性(修饰，modification)以及混合纳米孔的使用来提高灵敏性和选择性。最近，已利用大载体分子，包括纳米颗粒、抗体和长直链dsDNA分子来容纳受试者分子并借此提高质量，并因此降低受试者分子的移位速度。
尽管由于修饰和工程化系统的容易性，已成功使用了DNA基(DNA-based)载体并且提供了适合的载体系统，但是长直链DNA载体不是无限制的—它们倾向于形成结(knots)和扭结(kinks)，这些已知在纳米孔移位期间提供假阳性信号。此外，由于多个DNA分子通过纳米孔，基于移位取向和高堵塞率，已注意到信号中的显著变化。为了试图克服这些限制，近期的工作已将单分子荧光与纳米孔检测组合以实施单分子结合测定。尽管精巧，但是与不需要标记的简单电学读取系统相反，这种方法通过引入标记和复杂光学装置消除了纳米孔传感的关键优势。
发明内容
考虑到这些问题，已设计了本发明。
根据本发明的第一方面，提供了用于靶标分析物检测和/或定量的载体分子，所述载体分子包括：
分子框架，其限定中央孔隙；和
对靶标分析物具有特异性的结合部分，其中所述结合部分结合至所述框架并定位，使得靶标分析物在结合至所述结合部分时位于所述中央孔隙。
所述分子框架可以由核酸、蛋白、肽或其混合物形成。
因此，在一些实施方式中，所述分子框架包含核酸。所述核酸可以是DNA、RNA或核酸类似物或其混合物。
如本文所使用的，应理解“核酸类似物”表示DNA或RNA的结构类似物，其设计以杂交至互补核酸序列。核酸类似物可以在其磷酸酯主链、糖基和/或核碱基方面不同于DNA或RNA。核酸类似物的实例包括(但不限于)苏糖核酸、二醇核酸、吗啉代寡聚物、肽核酸(PNA)、锁核酸“LNA”、2'-O-甲基核酸、2'-氟代核酸、硫代磷酸酯和金属膦酸盐。
在一些实施方式中，由核酸部分或完全形成所述分子框架。换言之，所述分子框架可以是核酸框架。
在一些实施方式中，所述核酸是DNA。
可以通过DNA折纸(或者代替DNA或除DNA外，使用RNA或核酸类似物的等价方法)形成核酸框架。如本领域中已知的，DNA折纸是DNA纳米尺度折叠物，从而在纳米尺度产生非任意二维或三维形状。一般地，所述方法包括使用多个理性设计的“订书钉”DNA链使一个或多个长DNA“支架”链折叠成特定形状。设计每个订书钉，从而它杂交至支架的特定区域并因此通过碱基配对，支架链形成所期望的形状。本文以及(例如)通过Rothemund,Nature 440:297-302(2006)、Douglas等人,Nature 459:414-418(2009)和Dietz等人,Science 325:725-730(2009)描述了DNA折纸结构形成的方法。形成特定结构所要求的订书钉设计软件是可获得的，例如，caDNAno，它是由DNA产生折纸(origami)结构的开源软件。
因此，在一些实施方式中，所述核酸框架可以是DNA折纸结构。已显示DNA折纸结构显著抵抗由存在于生物流体中的DNA酶产生的降解。提高DNA折纸结构稳定性的方法，例如使用交联将是本领域技术人员已知的。因此，生物样品中DNA折纸结构的浓度和寿命提供了检测和/或定量靶标分析物的更可靠的方式。
可以由至少一个支架链和多个订书钉链形成所述分子框架。在一些实施方式中，所述支架链可以来源于噬菌体，如噬菌体M13，例如，M13mp18。
在一些实施方式中，由一个或多个肽和/或蛋白部分或完全形成所述分子框架。换言之，所述分子框架可以是肽或蛋白框架，或者核酸-肽复合框架。Ljubetic等人,Nat.Biotechnol.,35,1094-1101和Lapenta等人,Chem.Soc.Rev.47,3530-3542描述了产生蛋白折纸结构的方法。
如本文所使用的，术语“框架”将被理解为限定形状的连续结构。换言之，所述框架是具有穿孔的薄片材样或瓦片样结构。
与直链DNA载体相反，使用分子框架作为载体分子的优势在于直链载体可以形成扭结和结(当直链载体穿过纳米孔时导致产生假阳性信号)。结构载体分子，如本发明的分子框架减少或避免了这种问题。
因此，可以认为所述框架包含第一(例如，上)表面和第二相对(例如，下)表面。因此，可以将所述第一和第二表面两者描述为外表面。两个表面其中具有孔。因此，在一些实施方式中，所述框架不包含内(或内部)表面。
WO2012/061719描述了用于在靶向药物递送中使用的DNA折纸装置。DNA折纸装置能够将潜在生物学活性部分包埋(隔离，嵌合，多价螯合，sequester)在所述装置内部，借此在空间上防止它们与不适当的细胞群相互作用。所述DNA折纸装置可以是筒形的，例如，六边形管。
不同于WO2012/061719的DNA折纸装置，本发明的载体分子及其框架不能包埋分子(如生物活性分子)，从而阻止它们与其它分子或细胞的相互作用。
本发明的框架不是容器。换言之，所述框架不将分析物完全包围在所述框架内。不同于WO2012/061719的DNA折纸装置，本发明的载体分子结合通过薄框架限定的孔隙中的靶标分析物。因此，通过所述结合部分所结合并且位于所述框架的中央孔隙中的靶标分析物可以从所述孔隙伸出并延伸到所述框架的第一和/或第二表面以外。因此，所述框架不排除通过所述结合部分所结合并且位于所述框架的中央孔隙中的靶标分析物与环境或者其中的分子或细胞的相互作用。
在一些实施方式中，本发明所述的分子框架具有单一构象。换言之，不同于WO2012/061719的DNA折纸装置，可以的是所述分子框架不能明显改变形状，如在开放构象和闭合构象之间改变。这表示当通过所述结合部分结合时，靶标分析物的至少一部分始终暴露于周围环境，包括其中的任何分子或细胞。所述靶标分析物的至少一部分可以延伸至所述框架以外。因此，可以配置所述分子框架，从而当通过所述结合部分结合时，靶标分析物的至少一部分延伸至所述框架外。所述靶标分析物可以仅在一个维度延伸至所述框架外。例如，所述靶标分析物可以在第一和第二维度(例如，在所述框架的长度和高度方向上)包含在中央孔隙内，但是在第三维度(例如，在所述框架的厚度方向)上延伸至所述框架边界外。
所述分子框架可以具有任何适合的形状。例如，所述框架可以是长方形、正方形、圆形、椭圆形、三角形、梯形、菱形、五边形、六边形、八边形、风筝形或者不规则形状。所述框架可以包含3、4、5或更多个侧边(或“臂”)。所述框架的侧边可以全部具有相同长度(例如，在其中所述框架具有正方形或等边三角形形状的实施方式中)，或者所述侧边中的一些或全部可以具有不同长度(例如，在其中所述框架是长方形的实施方式中)。
在一些实施方式中，所述分子框架是长方形或正方形。不受理论束缚，据信长方形或正方形框架可以随着载体分子移位通过纳米孔而提高检测，因为长方形或正方形框架更好地能够与电场线对齐。
本发明的分子框架可以基本是2维的。本领域技术人员将理解在本领域中，“2维”(或“2D”)被理解为表示所述框架在其维度中的2个中明显大于第3维度(并因此使用2D几何形状描述更准确)，而不是表示所述框架是字面上的2维物体。因此，在一些实施方式中，所述分子框架不是管形的。
在一些实施方式中，所述框架具有长度、高度和厚度。相对于所述框架的长度和/或高度，所述框架的厚度可以较小。将理解如本文所使用的“厚度”是指在所述框架侧边上的单一点所测量的所述框架的尺寸。框架的厚度是从所述框架的第一(上)表面至第二相对(下)表面的距离。
所述框架的厚度可以不大于约50nm、不大于20nm、不大于15nm、不大于约10nm、不大于约8nm、不大于约6nm、不大于约4nm或不大于约3nm。
将理解当作为整体在分子框架背景中使用时，术语“长度”和“高度”表示所述框架的外部尺寸。例如，可以从所述框架外缘上的点至所述框架外缘上直接相对的点来测量长度。还将理解术语“长度”和“高度”表示所述框架在任何方向上的最大尺寸。
在一些实施方式中，所述框架的长度和/或高度与所述框架的厚度之比为至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1或者至少50:1。所述框架的长度和/或高度与所述框架的厚度之比可以为5:1至100:1、8:1至70:1、10:1至50:1或者15:1至30:1。
例如，所述框架的长度可以为至少30、至少50、至少70、至少80、至少90、至少100nm、至少150nm或至少200nm。
所述框架的高度可以为至少30、至少50、至少70、至少80、至少90、至少100nm、至少150nm或至少200nm。
在一些实施方式中(例如，在其中所述框架具有正方形形状的实施方式中)，所述框架的长度可以与所述框架的高度基本相同。
所述载体分子可以是纳米结构。所述框架的最大(外部)尺寸可以不大于1000nm、不大于800nm、不大于500nm、不大于300nm、不大于200nm、不大于100nm或者不大于50nm。
在一些实施方式中，所述分子框架是基本平面的(即基本平的)。
在其它实施方式中，所述分子框架是弯曲的。在这些实施方式中，所述框架可以具有第一凹表面和第二凸表面。所述框架可以弯曲至有限程度。例如，所述框架将不会弯曲至所述框架的相对边缘接触以形成圆柱形或管样结构的程度。
在一些实施方式中，框架的弯曲度使得所述框架的总深度不大于所述框架的高度和/或长度的50％、不大于30％、不大于20％、不大于10％或者不大于5％。将理解在这方面“深度”是指框架作为整体的总深度(即全局深度)，这与表示框架侧边上给定点的(局部)尺寸的框架厚度相反。在其中框架是弯曲的实施方式中，框架的深度可以大于或显著大于框架的点厚度。
所述框架的深度可以不大于200nm、不大于150nm、不大于100nm、不大于80nm、不大于60nm、不大于50nm、不大于40nm、不大于30nm、不大于20nm、不大于10nm、不大于6nm或者不大于5nm。
本发明人已发现分子框架(如核酸框架)特别适合于检测例如使用纳米移液器(nanopipette)而移位通过纳米孔的靶标分析物。这是因为孔隙或空腔在分子框架中心的存在致使随着分子框架移位通过纳米孔所产生的离子电流特征中峰的分裂，借此产生了双峰。出乎意料地，本发明人现已发现通过提供在中央孔隙中或其近端具有靶标分析物可以特异性结合的结合部分的分子框架，可以通过观察作为载体分子的特征的离子电流特征，使用纳米孔检测中央孔隙中分析物的存在或不存在。具体地，本发明人已发现由于靶标分析物部分填充孔隙，靶标分析物与可以位于所述分子框架的中央孔隙中或附近的结合部分的结合致使离子电流特征的峰从双峰(对于空位载体分子)向单峰(对于占位载体分子，即具有在中央孔隙中结合的靶标分析物)的改变。换言之，所述框架结构使得能够通过检测框架中孔隙的堵塞(占用，occlusion)来进行分析物检测。
借此，所观察到的移位离子电流特征和核酸框架内的孔隙几何形状之间的关系使得能够使用纳米孔检测小得多的分析物。
可以使用纳米孔将载体分子用于检测靶标分析物。因此，本发明的载体分子可以适合于将靶标分析物运载(即转运或移位)通过纳米孔。所述载体分子本身可以不是纳米孔。因此，将理解在使用时，所述载体分子可以是未结合的(除结合至靶标分析物(如果存在)外)。例如，所述载体分子可以游离存在于溶液中。
在一些实施方式中，配置所述载体分子，从而在不存在结合的靶标分析物的情况下，一旦移位通过纳米孔，则所述载体分子在离子电流特征中产生双峰。可以配置所述载体分子，从而当结合部分结合靶标分析物时，一旦所述载体分子移位通过纳米孔，则在离子电流特征中产生单峰。因此，可以配置所述载体分子，从而在使用时，靶标分析物与载体分子的结合将信号从双峰调节为单峰。这类信号调节是特别有利的，因为与例如依赖于检测信号峰宽变化来确定结合的分析物的存在相反，它提供了结合的分析物的明显证据。
不受理论束缚，据信一旦分析物结合，信号从双峰向单峰的改变可以是由载体分子的薄框架样结构(例如，基本2D结构)所造成的。据认为如果将管样结构(即3D结构)用作载体分子，则在载体分子移位通过纳米孔期间，可以检测不出内部孔隙的存在。随着载体分子厚度从例如基本2D增加至3D，则据信检测内部孔隙存在的能力将会失去。因此，薄分子框架(例如，基本2D的结构)的使用有利地使得能够在靶标分析物结合时容易地观察到信号变化。
有利地，载体分子的分子框架具有稳定且半刚性的结构。这克服了通常与长、直链DNA载体的使用有关的问题，如DNA以非直链或折叠布置形式通过所述孔，这可以使得更难以区分单个分析物。在一些实施方式中，所述分子框架是基本刚性的或不变形的。基本刚性的结构可以对改善纳米孔信号有益。
所述框架可以由一层或多层核酸、肽或蛋白形成。例如，所述框架可以由1、2、3、4或更多层核酸、肽或蛋白形成。
在一些实施方式中，所述框架由单层核酸、肽或蛋白形成。
所述框架可以完全或部分由双链核酸(例如，双链DNA)形成。例如，尽管大多数框架可以由双链核酸形成，但是所述框架还可以包含单链核酸部分。双链核酸对于向框架提供稳定性有益。
在一些实施方式中，所述框架的厚度对应于一个双链核酸螺旋的直径，例如，2-3nm。
在一些实施方式中，所述框架由两层核酸组成，例如，两层双链核酸。在这些实施方式中，所述框架可以具有约4nm至约8nm，或者约5nm至约7nm的厚度。
有利地，可以根据靶标分析物的尺寸调节分子框架的尺寸和/或其中的中央孔隙的尺寸。因此，中央孔隙的尺寸可以使其能够在其中接受分析物。具体地，可以选择孔隙的尺寸，从而一旦所述中央孔隙内的分析物结合(通过所述结合部分)，则载体分子的离子电流特征从双峰变化为单峰。
可以配置所述载体分子从而一旦结合至结合部分，则所述靶标分析物基本填充或堵塞所述孔隙。可以通过调节以下中的一种或多种实现通过结合的靶标分析物对孔隙的显著堵塞：分子框架的尺寸；中央孔隙的尺寸；和一个或多个结合部分的尺寸和/或位置。本领域技术人员将能够基于所关注的靶标分析物，选择载体分子的特性以实现通过靶标分析物对孔隙的显著堵塞。框架内靶标分析物的捕获是有利的，因为它确保更强的信号并且有助于避免缠结。
所述分子框架的尺寸还可以使其可以穿过纳米孔。在一些实施方式中，所述分子框架(或载体分子)的尺寸允许每次单一分子框架(或载体分子)通过纳米孔。
在一些实施方式中，所述中央孔隙可以具有至少10、至少20、至少30、至少50nm或至少100nm的长度。
所述中央孔隙可以具有至少10、至少20、至少30或至少50nm的高度。将理解在中央孔隙的背景中，“长度”和“高度”表示框架内部尺寸，即从框架内边缘上的点至框架内边缘上直接相对的点所测量的。所述中央孔隙可以具有作为所述孔隙的高度和长度的乘积的面积。
在一些实施方式中，配置所述载体分子，从而一旦结合至结合部分，所述靶标分析物占据所述中央孔隙面积的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一些实施方式中，当通过所述结合部分结合并且位于所述中央孔隙时，所述靶标分析物基本填充或堵塞所述孔隙。
可以相对于框架的各个侧边(即臂)的宽度限定中央孔隙的尺寸。将每个侧边的宽度定义为从侧边内边缘上的点(即孔隙近端)至相同侧边外边缘上相对的点(即孔隙远端)的距离。例如，在正方形框架中，所述中央孔隙可以是通过具有相等长度和高度的四个侧边所限定的正方形。所述孔隙的长度和高度可以与所述框架的每个侧边的宽度相同。因此，所述孔隙的高度/长度与每个侧边的宽度之比为1:1。
在另一个实例中，所述框架是长方形并且限定长方形孔隙。所述孔隙可以具有所述孔隙高度2倍的长度。所述孔隙的高度与每个侧边的宽度之比可以为1:1。因此，所述孔隙的长度与每个侧边的宽度之比可以为2:1。
因此，在一些实施方式中，所述中央孔隙的高度和/或长度：所述框架的一个(或者每个)侧边的宽度之比为0.5:1至5:1、1:1至3:1或者2:1至2.5:1。
在一些实施方式中，所述孔隙的表面积:所述框架的表面积之比为1:1至25:1、1:2至15:1、1:3至10:1或者1:5至1:8。
所述中央孔隙可以具有与所述分子框架相同的形状，或者它可以是不同的形状。在一些实施方式中，所述中央孔隙具有与框架相同的总体形状(例如，两者可以是长方形)，但是所述中央孔隙的相对尺寸可以不同于所述框架的那些，从而所述中央孔隙和所述框架是不对称的。
可以使用显微镜，例如，AFM确认核酸框架的尺寸。
如本领域中已知的，可以通过调节支架和订书钉链来实现所期望的框架和中央孔隙的尺寸。
所述结合部分可以包含能够选择性结合至所述靶标分析物的任何适合的分子。这些分子的实例包括适体(核酸或肽适体)、affimer、抗体(或其衍生物或片段，如域抗体、单链可变区片段、人源化抗体、双重特异性抗体、Fab和F(ab)2片段)、蛋白、分子印记聚合物(MIPs)和核酸-蛋白融合分子。
在一些实施方式中，所述结合部分包含适体(例如，DNA适体)。
在一些实施方式中，所述载体分子包含至少2个、至少3个或至少4个结合部分。在一些实施方式中，至少2个、至少3个或至少4个结合部分可以结合至单一框架。在这些实施方式中，将理解所述结合部分均将对相同靶标分析物具有特异性。
作为另外一种选择，所述载体分子可以包含单一结合部分。
所述结合部分结合至所述框架。可以配置所述结合部分(例如，尺寸和/或位置)，从而当结合至所述结合部分时，靶标分析物位于中央孔隙中。在一些实施方式中，可以配置所述结合部分从而当结合至结合部分时，所述靶标分析物基本填充(即堵塞)所述中央孔隙。
在一些实施方式中，所述结合部分位于所述中央孔隙中。
在一些实施方式中，所述结合部分位于所述中央孔隙近端(例如，相比于所述框架的外边缘，更接近于所述框架的内边缘)。
所述结合部分可以共价结合至所述分子框架，或者它可以例如通过静电相互作用或氢键作用非共价结合。
在一些实施方式中，所述结合部分通过锚定部分结合至所述分子框架。
在一些实施方式中，所述锚定部分由核酸，例如，DNA组成。所述锚定部分可以是核酸框架的延伸。例如，所述锚定部分可以构成形成核酸框架的支架或订书钉链的一部分。
所述锚定部分可以包含与形成所述结合部分的一部分的序列互补的单链核酸序列。因此，所述结合部分可以通过核酸(例如，DNA)杂交结合至所述核酸框架。
因此，在一些实施方式中，所述结合部分包含用于杂交至所述锚定部分的单链核酸序列。例如，可以修饰适体结合部分，从而它在其3'或5'末端包含单链DNA序列。
所述锚定部分的位置必须使得所述靶标分析物(当结合至所述结合部分时)定位在所述框架内部，即所述中央孔隙中。这使得一旦靶标分析物结合，离子峰特征从双峰变为单峰。在一些实施方式中，所述锚定部分位于所述分子框架的中央孔隙中。
类似地，所述结合部分可以具有选择以使得当靶标分析物结合至结合部分时，所述靶标分析物位于所述分子框架的中央孔隙中的长度。例如，所述结合部分可以具有适合于以靶标分析物基本堵塞所述框架的中央孔隙的这种方式结合靶标分析物的长度。另外或者作为另外一种选择，所述结合部分可以具有将所述靶标分析物定位在中央孔隙中的构造。例如，可以配置所述结合部分，从而当靶标分析物结合时，改变所述结合部分的折叠以使所述靶标分析物位于中央孔隙中。靶标分析物在中央孔隙中的定位使得当载体分子通过纳米孔时，能够通过所结合的靶标分析物的存在将所述载体分子的信号从双峰调节为单峰。
有利地，本发明所述的载体分子可以提供有条型码。这使得所述载体分子能够用于例如给定样品中多个不同靶标分析物的多路检测。
用于在多路系统中检测和/或定量靶标分析物的载体分子可以包括：
检测区，其包含包围中央孔隙的分子框架，和对所述靶标分析物具有特异性的结合部分，其中所述结合部分结合至所述框架并且定位，使得所述靶标分析物在结合至所述结合部分时位于所述中央孔隙中；和
连接至所述检测区的条型码区。
包含在检测区内的具有与之结合的结合部分的分子框架也可以被称为“检测单元”或者“检测框架”。
所述检测区可以包含单一检测框架，或者它可以包含多个检测框架，例如，两个、三个或更多个检测框架。
在一些实施方式中，所述检测区包含第一结合部分所结合的第一检测框架，和第二结合部分所结合的第二检测框架。所述第一和第二结合部分可以对不同靶标分析物特异，或者它们可以对相同靶标分析物特异。
所述条型码区可以包含至少一种纳米结构，例如，核酸、蛋白或肽纳米结构。在一些实施方式中，所述条型码区包含多种纳米结构，例如，2、3、4、5、6或更多种纳米结构。所述纳米结构可以串联布置。
所述纳米结构可以是分子瓦片，或者它可以是缺少结合部分(从而它不可以结合分析物)的分子框架。如本文所使用的，分子“瓦片”是指不包含中央孔隙的结构。换言之，所述瓦片是实体(实心，solid)或“填充”形状。
因此，所述条型码区可以包含分子瓦片，或者缺少结合部分的分子框架，或两者的混合物。所述条型码区的纳米结构可以被称为“标识符单元”。
如所述检测区的分子框架(即检测框架)一样，所述纳米结构中的一些或全部可以是基本平面或2D的。作为另外一种选择，所述纳米结构的一些或全部可以是弯曲的。所述纳米结构的一些或全部可以具有与所述检测框架类似的尺寸和几何形状。可以通过DNA或蛋白折纸形成所述纳米结构。
除检测框架之外，所述检测区还可以包含一个或多个纳米结构(例如，一个或多个分子瓦片和/或缺少结合部分的框架)。存在于所述检测区中的纳米结构可以与所述检测框架串联连接。存在于所述检测区中的纳米结构可以用于将所述检测框架彼此间隔开，和/或起到取向标志物的作用。
所述检测框架和纳米结构可以串联连接在一起以形成链或“带”。因此，可以认为所述检测框架和纳米结构构成了所述链或带的亚基。
所述链的亚基(即分子框架和瓦片)可以由单一支架链形成。
作为另外一种选择，所述链的亚基可以由各个支架链单独形成。然后，可以将所述各个亚基连接在一起。
可以通过至少一个接头部分将相邻的分子框架和瓦片(即亚基)连接在一起。在一些实施方式中，在相邻亚基之间提供了1至6个接头部分，例如，2、3、4或5个接头部分。
在一些实施方式中，所述接头部分包含核酸序列，例如，双链DNA或RNA。
每个亚基(即每个检测框架和纳米结构)可以包含单链核酸序列，其与相邻亚基上的单链核酸序列互补。然后，通过单链序列杂交，形成接头部分。形成接头的单链核酸序列可以从亚基边缘伸出。
所述接头部分可以为10至50、15至35或者20至30个碱基对长。
因此，在一些实施方式中，用于在多路系统中检测靶标分析物的载体分子可以包含多个，例如，2、3、4、5、6或更多个串联的纳米结构，其中所述纳米结构中的至少一个是用对靶标分析物特异的结合部分官能化的分子框架(例如，核酸框架)。
所述纳米结构使得能够识别载体分子，例如，通过它们的形状、尺寸和/或通过随着所述单元移位通过纳米孔所产生的信号。
将理解所述载体分子的分子框架(包括在不存在结合的分析物的情况下的检测框架和缺少结合部分的条型码区的框架)将随着它们移位通过纳米孔产生双峰。相反，所述条型码区的分子瓦片将随着它们移位通过纳米孔产生单峰。将通过框架和瓦片的尺寸确定峰的幅度和停留时间。照此，可以通过调节存在于载体分子中的核酸纳米结构的数目、尺寸和顺序来产生特征性离子电流特征。这使得能够通过其独特特征识别所述载体分子。
例如，载体分子可以包含4个串联连接的分子框架，其中所述系列的第一框架具有与之结合且位于所述框架的中央孔隙中的结合部分，而第二、第三和第四框架缺少结合部分。因此，所述系列的第一框架构成了检测区，并且所述第二、第三和第四框架构成了条型码区。所述系列中的第一框架将捕获存在于样品中的靶标分析物，并随着它移位通过纳米孔而产生单峰(sp)信号。中央孔隙中不能结合分析物的第二、第三和第四框架将随着它们移位通过所述纳米孔而产生双峰(dp)信号。因此，所述载体分子作为整体产生了以下信号：sp-dp-dp-dp。由于可以通过改变框架和中央孔隙的尺寸来改变峰的停留时间和幅度，因此可以调节所述框架的几何形状以提供作为给定载体分子的特征的独特“条型码”。具有不同条型码的不同载体分子可以用于通过在每个不同类型的载体分子中提供不同的结合部分来检测不同的靶标分析物，借此能够进行多路检测。
尽管以上实例描述了包含4个串联分子框架链的载体分子，其中所述框架在所述链末端具有与之结合的结合部分，但是将理解可以根据需要改变所述系列中核酸纳米结构的数目、类型和顺序。
根据本发明的第三方面，提供了组合物，其包含如本文所描述的载体分子。所述组合物可以包含溶液(例如，水溶液)中的载体分子。
本发明所述的载体分子在靶标分析物的检测和/或定量中获得使用。因此，本发明还提供了载体分子用于检测和/或定量样品中靶标分析物的存在的使用。所述载体分子可以如本文所描述。所述使用可以包括使所述载体分子移位通过纳米孔。通过单独的载体分子相对于具有结合的靶标分析物的载体分子所产生的信号差异使得能够确定分析物的存在和/或其浓度。
根据本发明的其它方面，提供了包含结合至靶标分析物的本文所定义的载体分子的复合物。
因此，所述复合物可以包含：
载体分子，其包含限定中央孔隙的分子框架，和对所述靶标分析物特异的结合部分，其中所述结合部分结合至所述框架；和
结合至所述结合部分并位于所述中央孔隙中的靶标分析物。
在一些实施方式中，如本文所描述的，所述载体分子用于在多路系统中检测靶标分析物。
在另一个方面，本发明提供了用于检测和/或定量样品中靶标分析物的系统，所述系统包括：
第一电解质储罐和第二电解质储罐，所述第一和第二储罐通过包含纳米孔的隔板分开；和
任选地，用于使分子从第一电解质储罐移位通过纳米孔到达第二电解质储罐的电极，
其中所述第一和第二电解质储罐中的至少一个包含如本文所描述的载体分子。
所述系统可以包含含有电解质溶液的室，其中所述室通过隔板分成第一和第二电解质储罐。
所述系统可以包含一对电极，即阳极和阴极。阳极可以浸没在第一和第二电解质储罐中的一个中，并且阴极可以浸没在第一和第二电解质储罐中的另一个中。
所述载体分子可以位于所述第一和第二电解质储罐的第一电解质储罐中，或者第二电解质储罐中，或两者中。所述载体分子可以游离地存在于电解质溶液中(即它们是未结合的)。
对于使用所述系统检测靶标分析物，可以将所述样品添加至第一和/或第二电解质储罐。将理解将所述样品添加至包含载体分子的储罐。因此，在一些实施方式中，所述系统还在所述第一和/或第二电解质储罐中包含样品。
所述纳米孔使得分子能够在所述第一和第二电解质储罐之间通过。样品中具有结合的靶标分析物(如果存在)的载体分子从储罐之一通过纳米孔向另一个储罐的移位可以受电极之间所施电压驱动或者受压力驱动。
所述隔板可以包含膜或由膜组成，如生物膜(例如，由脂质或磷脂双分子层、脂质体或聚合物薄膜形成)或者固态膜(例如，由二氧化硅、氮化硅、二氧化铪、石墨烯或氧化铝或它们的组合形成)。
所述纳米孔可以如本文所描述。
根据其它方面，本发明提供了用于检测和/或定量样品中靶标分析物的存在的方法，所述方法包括：
将载体分子与所述样品接触；和
检测载体分子-靶标分析物复合物的存在。
在所述方法中所使用的载体分子可以是如本文所描述的载体分子。
所述方法还可以包括将所述载体分子与样品温育足以使所述靶标分析物结合至所述载体分子的结合部分的时间，借此形成载体分子-靶标分析物复合物。
可以将所述载体分子与所述样品温育至少1、至少2、至少5、至少15、至少30、至少45或至少60分钟。
温育可以在10至40℃、12至37℃或者15到30℃的温度下进行。在一些实施方式中，在室温下，例如，19-22℃或者约20℃下进行温育。
可以通过任何适合的技术，如显微镜(例如，AFM)或者凝胶电泳检测载体分子-靶标分析物复合物的存在。
在一些实施方式中，通过电压驱动的所述复合物通过纳米孔的移位来检测所述载体分子-靶标分析物复合物。
与单独的载体分子(即在不存在靶标分析物的情况下)的特征相比，一旦移位，离子电流特征的变化可以指示载体分子-靶标分析物复合物的形成和因此的靶标分析物在样品中的存在。
所述离子电流特征的变化可以是峰形、峰幅度和/或停留时间的变化。例如，分析物与载体分子的结合可以引起峰幅度升高、停留时间减少和/或峰形从双峰向单峰的变化。
在一些实施方式中，检测载体分子-靶标分析物复合物的存在包括检测随着载体分子移位通过纳米孔的峰形、幅度和停留时间的变化。
理想地，所述纳米孔的尺寸使得每次允许单一载体分子通过所述孔。因此，将理解根据载体分子尺寸，本领域技术人员可以选择纳米孔的尺寸。
在一些实施方式中，所述纳米孔的直径可以为至少5、至少10、至少30、至少50、至少70、至少100或至少130nm。所述纳米孔的直径可以不大于200nm、不大于150nm或者不大于100nm。将理解纳米孔不必须是圆形的。照此，在这方面纳米孔的“直径”是指孔的平均尺度。尽管大孔径不适合于检测单一分析物或直链dsDNA载体，但是它们可以用于较大的结构，如DNA或蛋白折纸结构。此外，通过将纳米孔的尺寸调节至载体分子的尺寸，从而不可以检测未结合的靶标和非靶标分析物，存在较低的背景信号。因此，所产生的信号在后续分析期间需要较少过滤。另外，较大的纳米孔更易于可靠制造。
因此，通过设计包含分子框架的载体(所述分子框架具有其尺寸将靶标分析物容纳其中的中央孔隙)和通过选择尺寸允许每次单一载体分子从中通过的纳米孔，本发明提供了可以对于所期望的靶标分析物的检测进行调节的灵活系统。
所述纳米孔可以是固态纳米孔或生物学纳米孔。可以在由二氧化硅、氮化硅、二氧化铪、石墨烯、氧化铝或其组合所制备的膜中形成固态纳米孔。
所述纳米孔可以位于纳米移液器的尖端。在一些实施方式中，所述纳米移液器可以是玻璃纳米移液器。可以使用本文所描述的方法或者本领域技术人员将已知的其它方法制造纳米移液器。
如本领域中已知的，纳米移液器是可以用于检测和分析溶液中单分子的一类纳米孔。可以容易地制造具有高度控制的孔径的纳米移液器，从而使它们称为常规固态纳米孔的经济合算的替代。利用纳米移液器对单分子的检测和分析依赖于电阻脉冲传感。对此，用电解质填充所述纳米移液器并将尖端浸没在所述电解质中，并且在纳米移液器内部电极和外部电极之间施加电压，从而在尖端产生电场。该场驱动所关注的分子通过纳米移液器孔，从而产生可检测的脉冲。
本发明在保健应用，如诊断中获得应用。例如，可以在指示疾病或病况的分析物，例如，生物标志物或毒素的检测中使用本发明的载体分子和方法。
因此，在一些实施方式中，本发明提供了诊断受试者中疾病或病况的方法，所述方法包括检测和/或定量得自受试者的样品中靶标分析物(例如，生物标志物)的存在。
所述样品可以是液体。在一些实施方式中，所述样品是生物流体，如血液、血浆、血清、尿液、痰液、唾液或者疑似包含特定分析物的另一种流体。然而，将理解所述样品可以是其中可以检测靶标分析物的存在的任何类型的样品。例如，本发明可以用于确定食品或饮料样品、环境样品、水样或化学样品的纯度、质量和/或安全性。
所述受试者可以是哺乳动物，如小鼠、大鼠、猪、马、牛、山羊、兔或灵长类动物。在一些实施方式中，所述哺乳动物是人。
将理解本发明不局限于保健应用，而是还可以在要求检测分析物的任何领域中使用，如在食品生产、农业或相关领域中的环境分析、水质检测、质量控制。
所述靶标分析物可以是任何所关注的分析物。它可以是生物学分析物或化学分析物。例如，所述分析物可以是蛋白、肽、抗体、细胞因子、小分子(例如，药物分子)、毒素、核酸、多糖、脂质、激素或无机化合物。
在另一个方面，提供了用于检测靶标分析物的试剂盒，所述试剂盒包括：
根据本发明的第一方面的载体分子；和
使用说明书。
所述试剂盒还可以包括纳米孔。所述纳米移液器可以是如本文所描述的纳米孔。所述纳米孔可以是固态纳米孔。在一些实施方式中，在纳米移液器，例如，玻璃纳米移液器中提供纳米孔。
所述试剂盒还可以包含一种或多种其它部件，其选自：放大器；数字化器(digitator)；一个或多个电极；或者法拉第筒。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括用于分析所产生的离子电流特征的程序。这种程序可以在一个或多个电子处理器中提供，或者可以在可以包含以机器或电子处理器/计算装置可读取的形式储存信息的任何机构的计算机-可读存储媒介(例如，永久性存储媒介)中提供，所述机构无限制地包括：磁存储媒介(例如，软盘)；光存储媒介(例如，CD-ROM)；磁光存储媒介；只读存储器(ROM)；随机存取存储器(RAM)；可擦除编程存储器(例如，EPROM和EEPROM)；闪速存储器；或者用于存储这些信息/说明的电学或其它类型的媒介。
本发明的载体分子和方法可以进一步用于定量样品中靶标分析物的量。
在一些实施方式中，所述方法用于定量存在于样品中的靶标分析物的量。在这些实施方式中，所述方法可以包括：
使所述样品与已知浓度的载体分子接触；和
确定占位载体分子(即载体分子-靶标分析物复合物)与空位载体分子(即无结合的靶标分析物的载体分子)之比。
基于占位与空位载体分子之比以及添加至所述样品的载体分子的已知浓度，可以计算所述靶标分析物的浓度。
如以上所描述的，通过观察随着载体分子穿过纳米孔的离子电流特征，可以使用纳米孔检测所述核酸框架的中央孔隙中靶标分析物的存在或不存在。空位载体分子(即无结合至所述结合部分的靶标分析物)产生特征双峰。只要将中央孔隙尺寸适当调整至靶标分析物尺寸，则占位载体分子将产生单峰。然后，可以根据观察到的多个单独峰计算两个特征不同的峰的频率以获得分析物-浓度相关信号。
因此，在一些实施方式中，确定占位载体分子与空位载体分子之比包括：
对所述样品进行电压驱动的通过纳米孔的移位；和
测量随着所述载体分子移位通过所述纳米孔所产生的离子电流特征，
其中所述离子电流特征中单峰与双峰之比指示占位载体分子与空位载体分子之比。
例如，可以通过下列方式从定量分析中排除由于破碎或截短的载体分子所造成的假阳性：
破坏载体分子的结构；
对所述破坏的载体分子进行电压驱动的通过纳米孔的移位；
测量所述破坏的载体分子的离子电流特征；和
确定离子电流特征中峰的平均峰幅度和/或平均停留时间。
可以确定峰幅度和/或停留时间的阈值，其然后可以用于从后续定量分析中排除通过破坏的载体分子的移位所产生的单峰。
因此，离子电流特征的所有3个参数(峰形、峰幅度和停留时间)可以用于以更大的置信度定量检测靶标分析物。因此，本发明的载体分子是有利的，其中随着它们穿过纳米孔，由破坏的载体所产生的信号就停留时间、峰幅度和峰形而言与由完整载体所产生的那些显著不同，借此能够过滤出假阳性。
在本发明申请的范围内，明确预期可以单独或以任意组合采用在以上段落、权利要求和/或以下描述和附图中所描述的多个方面、实施方式、实施例和替代，并且具体地其各个特性。也就是说，可以以任何方式和/或组合并且与本发明的任何方面来合并所有实施方式和/或任何实施方式的特性，除非这些特性是不相容的。为了避免怀疑，如本文所使用的术语“可以”、“和/或”、“例如”、“如”和任何类似术语应理解为非限制性的，从而所描述的任何特性不需要存在。实际上，在不背离本发明的范围的情况下明确设想了任选的特性的任意组合，无论这些是否明确主张。本发明申请人因此保留了改变任何最初提交的权利要求或提交任何新的权利要求的权利，包括修改任何最初提交的权利要求以取决于和/或引入任何其它权利要求的任何特性的权利，尽管最初未以那种方式主张。
附图说明
现将参考附图通过举例说明来描述本发明的实施方式，其中：
图1a是具有不同几何组织的DNA纳米结构设计的示意图，其中ConA是实体瓦片，而ConB和ConC形成框架。所有3种结构显示出类似的外部尺寸，但是内部孔隙不同；
图1b显示了图1a所示的纳米结构的AFM显微照片；
图1c显示了图1a所示的纳米结构的离子电流特征；
图1d显示了各个事件的散点图，对于ConA、ConB和ConC，将峰幅度对停留时间作图，以95％置信椭圆覆盖。
图2显示了具有中央腔体的两种同心正方形纳米结构(ConB和ConC)的延迟时间和双峰(Dp)高度分析，其中表示了平均值；
图3显示了纳米结构ConA、B和C的单独的峰幅度和停留时间柱状图，其表示它们的平均值；
图4a是采用通过纳米移液器的移位作为传感机制的DNA纳米结构基生物传感概念的示意图；
图4b显示了空位和占位DNA折纸载体的设计和代表性AFM显微照片的示意图。框架DNA纳米结构的尺寸为约95×95nm，其中内部孔隙为35×35nm。所述结构包括伸出到内部孔隙外，帮助通过杂交并入DNA适体(钩形)的小核苷酸“锚”。所述DNA载体也包括取向标志物(在右下角显示为凹口(缺口，notch))；
图4c显示了DNA框架载体(9nM)和以约9nM浓度与靶标CRP温育的载体样品的峰幅度和停留时间柱状图；
图4d显示了由于CRP分子、CRP结合的适体分子、载体分子和CRP结合的载体分子的移位所造成的离子电流特征。在y轴上比例尺表示20pA，并且在x轴上为1ms；
图5a显示了(i)空位载体和(ii)与10×过量的CRP(90nM)温育的载体的离子电流峰的散点图。将落在95％置信椭圆内的事件作为圆形作图，并且将其它作为三角形作图。仅认为落在95％置信椭圆内的事件是双峰。对单峰实施相同分析。将既不类似双峰也不类似单峰的离子电流事件显示为实心三角形，并且从分析中排除；
图5b显示了记录约2分钟的破碎的载体的离子电流迹线；
图5c显示了对于破碎的载体峰幅度相对于停留时间的散点图，以95％置信椭圆覆盖；
图6a显示了对于不同的CRP浓度所观察到的离子电流特征的代表性选择。出于说明的目的，将来自具有更长迹线的各个峰的峰迹线连在一起以除去无事件的区域；
图6b显示了对于与不同浓度的CRP温育的载体(9nM)的一系列移位事件，峰幅度相对于停留时间作图的图。将从定量分析丢弃的未分类事件表示为三角形。将图与95％置信椭圆重叠；
图6c是归一化的单峰计数的图，即单峰vs总分类的峰之比相对于CRP浓度。将数据用郎格缪尔等温线(实线)拟合，并且显示了11±2nM的Kd。短划线表示拟合的置信边界。误差线表示使用3种不同的纳米移液器在不同天实施的移位实验的标准偏差；
图7a显示了对于使用1:10浓度的非特异性适体和CRP的对照实验所观察到的停留时间和峰幅度的柱状图。对照实验显示峰幅度和停留时间的平均值为69±5pA和0.3±0.13ms，其类似于表示结合至随机适体序列的阴性CRP的空载体；
图7b显示了对于使用非特异性靶标蛋白、90nM的MupB和9nM载体浓度的对照实验所观察到的停留时间和峰幅度的柱状图。样品的各个峰幅度和停留时间柱状图显示了60±7pA和0.25±0.1ms的平均值，这也类似于表示阴性非特异性靶标结合的空载体；
图7c是散点图分析，其显示了离子电流事件的分类。未检测到占位载体，证明所述传感方法的高特异性；
图8a显示了在5％的血浆中具有空位载体的移位实验的峰幅度和停留时间的柱状图的代表性离子电流迹线；
图8b显示了在5％的血浆中具有对于不同浓度的CRP，与CRP温育的载体的移位实验的峰幅度和停留时间柱状图的代表性离子电流迹线；
图8c显示了单峰相对于各自在血浆中的CRP浓度的比例的图。如曲线所示，数据符合朗格缪尔拟合。
图9显示了对于在血浆中经受4种不同浓度的CRP(0nM、3mM、9nM和36nM)的载体(9nM)的峰幅度相对于停留时间的散点图。对于0nM，未观察到单峰，并且将双峰聚类用于定义空位载体的95％置信区间。类似地，从最高CRP浓度数据产生单峰的95％置信椭圆；
图10a是包含用于多路检测的条型码的载体分子的示意图；
图10b是用于连接多路载体分子的亚基的接头策略的示意图。这些线代表单链DNA并且当它们与另一条线平行时，这表示两者之间的碱基配对；和
图11显示了实例带的原子力显微镜图像；包括：a)由实体瓦片和大腔体框架样亚基所形成的二联体(duplet)；b)由实体和小腔体框架样亚基所形成的二联体；和a)由大腔体框架样、实体和小腔体框架样亚基所形成的三联体。
具体实施方式
实施例
材料和方法
DNA折纸设计
使用9073bp、8515bp和6307bp的定制单链DNA(ssDNA)支架设计了3个同心正方形折纸，然而从来自Tillibit(Garching,Germany)的7249bp m13mp18 ssDNA设计了在本项目中用作载体的DNA纳米结构。以下提供了定制支架的程序。用于各个纳米结构设计的所有短订书钉链购自IDT(Coralville,IA,USA)。
使用caDNAno软件设计所有DNA折纸纳米结构。对于折纸折叠，将ssDNA支架与十倍摩尔过量的订书钉链的混合物在含有10nM TrisAc(pH 7.4)、10mM MgAc和1mM EDTA(SigmaAldrich,USA)的折叠缓冲液中加热至95℃，然后以1℃/分钟的降低速率冷却至室温。然后，通过Sephacryl S400(GE healthcare,UK)尺寸排阻柱，通过除去过量订书钉纯化折叠结构并洗脱到相同折叠缓冲液中。
在第二热退火步骤(加热至35℃，随后以0.5℃每分钟降低至室温)中，在纯化步骤之前在存在订书钉的情况下，或者作为另外一种选择，在纯化步骤之后立即，将含有具有5'(适体1)和3'(适体2)胺连接的修饰的末端序列的适体序列引入载体设计。任一种方式致使产生了插入适体的准确折叠的框架DNA折纸载体。
特异性hCRP适体1：
NH2-AAGCCTTTATTTCAACGGCAGGAAGACAAACACGATGGGGGGGTATGATTTGATGTGGTTGTTGCATGATCGTGGTCTGTGGTGCTGT(SEQ ID NO.1)
特异性hCRP适体2：
CGAAGGGGATTCGAGGGGTGATTGCGTGCTCCATTTGGTGTTTTTTTTTTTTGCAAGGATAAAAATTT-NH2(SEQ ID NO.2)
非特异性随机适体：
NH2-CTGAACAAGAAAAATAGCAGAACTTACGAGCCAGGGGAAACAGTAAGGCCTAATTAGGTAAAGGAGTAAGTGCTCGAACGCTTCAGA(SEQ ID NO.3)
SPR研究
通过来自Metrohm Autolab B.V(Utrecht,The Netherlands)的ESPRIT SPR仪进行适体-蛋白结合研究。为此，通过EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺)NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)偶联化学，将连接胺基的末端修饰的适体锚定在用C11PEG6COOH的自组装单分子层(SAM)官能化的金SPR表面上。通过在丙酮中超声处理两次，每次10分钟来清洁来自XanTec bioanalytics的金SPR表面，然后将其浸没在含有5％乙酸的乙醇1mM SAM溶液中并使其在室温静置48小时。在温育后，用100％乙醇漂洗表面，用氮气快速干燥并固定在SPR系统上。为了将DNA适体连接至金表面，用50mM EDC和200mM NHS在100mM MES缓冲液中的溶液，在pH5.5激活COOH-封端的SAM表面约15min。用MES缓冲液清洗表面，随后与5μM DNA适体在10mM乙酸钠缓冲液中，在pH5.5温育30分钟。通过将所述表面暴露于100mM乙醇胺的水溶液约10min，使任何剩余的激活的COOH位点淬灭。然后，用结合缓冲液(10mM TrisAc、10mMMgAc、2mM CaCl2和1mM EDTA的水溶液)清洗表面，然后用不同浓度的人CRP进行激发。作为共振角变化测量结合。
同心正方形折纸的产生
将修饰的噬粒(具有m13区的质粒)用于产生具有不同长度的3个支架以产生具有类似外部尺寸，但是不同腔体尺寸的DNA折纸。从来源于λ噬菌体DNA的两个不同的片段以及pBluescript II SK(+)噬粒(PBS)，将3种DNA折纸(同心正方形(Con)A、B和C)所需的支架连接在一起。PBS(+)是含有噬菌体复制起点(f1 ori)和抗生素抗性基因的质粒，其允许通过辅助噬菌体的有义链挽救(sense strand rescue)。通过将作为来自λ噬菌体的两个不同的片段所获得的6.1kb序列插入2.9kb噬粒，产生了DNA折纸ConA所需的9kb常规支架。选择缺少蛋白编码区的这两个片段(约1.8kb和4.2kb)以消除噬菌体生长和下游过程中的任何干扰。
使用适当引物，分别从λ噬菌体DNA和PBS质粒PCR扩增了称为f1、f2和f3的组成支架的这3种片段。设计在扩增程序中所使用的引物以引入侧接f2的限制性位点EcoRI和NspI，和侧接f3的NcoI和NspI。然后，用各个酶限制性水解这两个片段以形成相容性悬突，然后连接以获得一个长片段(f23)。然后，使用HiFi DNA组装克隆(NEB,UK)将片段f1与片段f23组合，从而产生了双链环形f123 dsDNA。
随后，在感受态大肠杆菌(E.coli)细胞中化学转化环形dsDNA(f123)以生产常规支架。使用它们的抗生素抗性基因选择具有f123质粒的转化细胞并通过miniprep回收，从而与辅助质粒(m13cp细胞)共转化以产生ssDNA f123。最终的ssDNA f123产物具有9073bp并且构成了用于最大DNA构建体ConA的支架。
通过作为模板的双链f123的PCR扩增产生了两种较小的DNA构建体ConB和ConC的支架。如前所述，设计引物以引入产物ConB的限制性消化位点KasI和产物ConC的BmtI。如上所述，后续限制和连接，以及随后与辅助质粒的类似的共转化规程分别对Con B和C产生了8515bp和6307bp的ssDNA支架。首先，在5ml培养物中产生支架，随后通过按比例放大至1升培养物收获大规模支架。通过从噬菌体分离细菌以及后续的酚氯仿DNA提取，收获培养物。
纳米移液器的制造和离子电流测量
使用Sutter instrument的P-2000型激光拉伸仪(laser puller)，从内径0.5mm的玻璃毛细管(QF100-50-7.5,World precision Instruments,UK)制造具有约100nm孔径的纳米移液器。拉伸规程包括使用参数HEAT 575FIL 3VEL 35DEL 145PULL 75和HEA T900FIL 2VEL 15DEL 128PULL 150的两条不同的线。所述规程显示出高度一致的玻璃纳米移液器，在不同天拉伸移液管时，标准偏差小于±12nm。将Ag/AgCl丝(0.25mm直径,SigmaAldrich,UK)作为工作电极插入纳米移液器。
对于移位实验，将具有工作电极的纳米移液器充满含有最终浓度500pM的DNA折纸和(在适用情况下)分析物的移位缓冲液(具有10mM TrisAc、10mM MgAc、2mM CaCl2和1mMEDTA的0.1M KCl)。Mg是维持DNA折纸稳定性所需的，以及Ca，匹配用于选择用作结合部分的DNA适体的缓冲条件。将接地反电极浸没在0.1M KCl溶液中，从而接通电路。在向纳米移液器内部的工作电极应用负电势时，来自纳米移液器内部的DNA折纸移位出来并进入电解质溶液，从而致使离子电流的调节。使用Axon instruments-膜片箝制系统(Moleculardevices,USA)采集离子电流数据。使用Axopatch 700b放大器记录测量，并以100kHz和20kHz的低通过滤采集数据。通过常规MATLAB脚本(由Joshua Edel教授提供，ImperialCollege,London,UK)进行原始数据分析并且使用Pro FIT(QuanSoft,Switzerland)进行了进一步数据分析。
AFM
将DNA折纸样品在室温下在新切割的云母片上沉积10-15分钟，并且装满含有10mMTrisAc(pH 7.4)和10mM MgAc、1mM EDTA的扫描缓冲液。对于观察对载体的蛋白结合，类似于纳米移液器移位实验，在扫描缓冲液中包括2mM CaCl2。使用Bruker DimensionFastscan(Santa Barbara,CA,USA)，以含有Si尖头的Fastscan D Si3N4悬臂，以轻敲模式在液体中对DNA折纸样品成像。以20kHz(256×256像素)的扫描速率获得图像。
实施例1：同心正方形
假设如果设计DNA折纸以包括所关注的分析物可以特异性结合至其中的中心腔体，则可以通过观察特征移位离子电流峰，使用纳米孔由所述折纸检测分析物的存在或不存在。可以根据观察到的大量单独峰计算两个特征不同的峰的频率以获得分析物-浓度相关信号。
为了获得对DNA折纸中腔体设计参数的进一步理解，我们设计了具有相同外部尺寸，但具有不同腔体尺寸的3种不同的DNA纳米结构。3种DNA纳米结构类似于一组3个同心正方形并且对于实体纳米结构(100nm长×85nm高)称为ConA，对于具有相同外部尺寸，但含有30nm长×12nm高和65nm长×35nm高的中央腔体的纳米结构，分别称为ConB和ConC，如图1a所示。
所述同心正方形纳米结构均设计以根据所建立的DNA折纸原理折叠。3种瓦片均由相同DNA制成，即通过支架的简单缩短并省略适当的订书钉的相同组的DNA寡核苷酸订书钉和DNA支架，以产生具有不同尺寸的腔体。例如，用于组装ConB的支架DNA与用于组装ConA的那种支架DNA相同，但是除去折叠成中心部分的部分。这确保在改变腔体尺寸时，所述结构尽可能在DNA折纸之间保持相同，从而我们可以将离子电流特征与腔体体积直接关联。
通过原子力显微镜(AFM)对折叠的DNA纳米结构成像以确认成功组装。图1b显示了代表性AFM图像，并且可以看出如所预期，形成了全部3种结构。据发现ConA为107×86nm，并且ConB和ConC具有107×86nm的类似外部尺寸，并且腔体分别为29×11nm和65×38nm。
实施了各个同心正方形样品通过约100nm孔径的玻璃纳米移液器的纳米孔移位研究。通过激光器拉伸制造了纳米移液器并且显示在0.1M KCl中86±10MΩ的电阻。通过将500pM浓度的样品溶液加载到纳米移液器中并记录离子电流，同时在纳米孔间施加-350mV的恒定电压来实施同心正方形移位。
图1c显示了移位通过纳米孔的各个纳米结构的代表性离子电流特征。当将腔体引入纳米结构中时，所观察到的峰结构从单峰(无腔体存在)变化为双峰(存在腔体)，其中双峰变得更明显，腔尺寸增加(ConC的双峰高度为37pA vs ConB的14pA，图2)。对于每个纳米结构，至少100个离子电流峰的更详细的定量分析显示对于不同纳米结构，平均峰幅度和停留时间差异显著(图3)。
ConC(大腔体)显著更缓慢地移位通过纳米孔(停留时间＝0.31±0.14ms)并且当与ConB相比时(小腔体；停留时间＝0.22±0.06ms和峰值幅度＝97±13pA)，产生了较小的离子电流升高(峰幅度＝86±19pA)。相反，ConA(无腔体)纳米结构产生了最大的离子电流升高(峰值度＝121±23pA)，以及最短的停留时间(0.15±0.01ms)。当综合时，这些参数允许我们识别不同的群(图1d)。
实施例2：生物传感中作为移位载体的DNA纳米结构
移位离子电流峰特征与这些DNA纳米结构内腔体几何形状的关系提供了检测小得多的分子存在的唯一机会。如果将对所关注的分子特异的结合部分置于DNA纳米结构空腔内，则靶标分析物与结合部分的结合部分填充了空腔，其进而致使特征转变为离子电流特征(图4a)。
为了研究这种现象并且作为原理验证，我们显示了C-反应蛋白(CRP)的定量检测，它是确立的炎症生物标志物。在健康成年人中，中值CRP浓度为0.8mg/L，并且其血液浓度由于炎症反应超过1mg/mL(8μM)。CRP作为五聚物存在，其分子量为约125kDa并且尺寸为约11nm。我们设计了具有中央腔体的DNA纳米结构，所述中央腔体对于CRP分子足够大以进行配合，同时足够小，从而CRP在腔体中的存在将造成移位离子电流可测量的差异。如通过使用同心正方形的研究所报告的(实施例1)，设计了具有35长×35nm宽的中央腔体的纳米结构以提供稳健的双峰特征(图4b)。
在所述中央腔体内引入内部锚定柱，从而可以通过DNA杂交将特异性捕获部分置于空腔内部(图4b)。为了能够进行选择性CRP检测，我们从文献中选择了两种良好表征的CRP DNA适体(适体1和适体2)作为潜在捕获部分。我们注意到尽管本文所使用的DNA适体序列与发表的那些相同，但是对于本发明申请，适体必须分别在它们的5'和3'末端延伸，从而它们可以杂交到腔体内。为了确保DNA适体仍以预期发挥作用，我们通过表面等离子共振(SPR)确认CRP结合至延伸的适体。如所期望的，两种DNA适体继续结合CRP。适体1显示出比适体2更快速的结合动力学，并因此将其选择用于生物传感器概念的详细验证。
在DNA折纸的一个角落还包括了凹口以起到极性标志物的作用以识别AFM图像中折纸的取向(图4b)。将完整的DNA纳米结构和适体组装体称为载体。
通过凝胶阻滞测定研究了载体环境内DNA适体的表现(即DNA纳米结构内杂交的适体，图4b)。将9nM载体溶液与逐渐升高的浓度的CRP(9、18、27、36nM)在移位缓冲液中(0.1MKCl，含有10mM MgAc、2mM CaCl2和10mM TrisAc和1mM EDTA)在室温下一起温育30分钟。凝胶显示载体条带的浓度依赖性改变，其证明了CRP与载体的成功结合。在如上所述的类似缓冲条件下，通过AFM进一步确认了结合至载体(9nM)的CRP(36nM)，其中在结合至适体的腔体中清楚地观察到了CPR，它与嵌入的极性标志物相反。
为了在单分子纳米孔传感中利用DNA纳米结构载体，占位和空位载体需要具有与载体内CRP的存在相关的独特指纹(由离子电流峰的停留时间、幅度和形状组成)。如上实施了使用玻璃纳米移液器的载体(浓度500pM)的纳米孔移位研究。超过100个移位峰的定量分析显示出65±6pA的峰值幅度和0.29±0.1ms的停留时间(图4c，上部)，其与含有腔体的类似尺寸的DNA纳米结构的上述观察结果相当。
类似地，为了分析CRP占位载体，我们为了具有占位和空位载体的混合群，使用了CRP的等摩尔溶液和9nM的载体。将溶液在室温下在移位缓冲液中温育30min并在500pM浓度下进行纳米移液器移位，其产生了离子电流的单峰和双峰混合群。两类峰的峰幅度和停留时间的分析显示出双极性分布。双峰具有62±4pA的平均峰幅度和0.33±0.03ms的停留时间(图4c，底部；n>100)。相反，超过50个单峰的分析显示出分别为0.15±0.05ms和90±9pA的平均停留时间和峰幅度，其证实了由于CRP结合所造成的两个量的显著改变(图4c，下部)。我们注意到较低的峰幅度和更长的停留时间非常类似于对于空位载体所观察到的那些。
与显示当中央腔体填充时，峰形从双峰变为单峰的同心正方形研究结果结合，我们推测单峰事件对应于占位载体，即具有结合至特异性适体的CRP的载体。此外，双峰占所观察事件总数的约30％。这与基于得自SPR实验的Kd所预期的占位载体的百分比一致，其表明如所期望的，所述百分比是浓度相关的。
然而，为了使用这种方法进行高灵敏度生物传感，需要对不同离子电流事件进行分类的可靠方式。图5a(i)显示了对于空位载体移位所观察到的离子电流峰的峰幅度相对于停留时间的散点图。将类似于双峰形状的所有事件显示为空心圆形和空心倒置三角形。实心三角形代表了无法分类的事件。为了消除异常值并确保稳健分类，如果所测量的峰幅度和停留时间在图中所示的95％置信椭圆内，则仅将离子电流事件分类为表示空位载体的真实双峰(通过空心圆形表示)。通过空心倒置三角形表示在该边界以外的峰并且其将不会被认为是代表空位载体的事件。
类似地，图5a(ii)显示了对于与预期导致大多数载体占位的10倍过量的CRP温育的载体移位所观察到的离子电流事件的峰幅度相对于停留时间的散点图。将类似于双峰形状的所有事件显示为空心圆形和空心倒置三角形。将单峰显示为实心圆形和空心三角形。将所有其它事件显示为实心三角形，其表明它们不可以分类。如上所示，为了确保单峰的稳健分类以表示CRP占位载体，将95％置信椭圆(表示为浅灰色(左手)椭圆)用作进出过滤器(in-out filter)。仅属于该95％置信区域的单峰被认为是由CRP占位载体(通过实心圆形表示)的移位所产生的，所有其它单峰被认为是无法分类的(通过空心三角形表示)。为了分类双峰并借此建立表示空位载体的事件数，显示了来自示图(i)的置信椭圆(作为深灰色(右侧)椭圆)，并且目前仅属于该区域的双峰事件被认为代表空位载体(空心圆形)，同时排除了该区域以外的那些(空心倒置三角形)。
目前，这使得能够将所观察到的离子电流峰分类为3类，表示空位载体的双峰，表示CRP占位载体的单峰，和既不是双峰也不是单峰的未分类峰。这种多参数分类允许以稳健方式丢弃模糊的移位事件，例如，由破碎载体所产生的事件。这些事件将可能类似于单峰，并因此代表假阳性。为了说明这种情况，在移位前通过在10mM CaCl2中温育30min以用Ca2+置换成分Mg2+来故意破坏所述DNA纳米结构。AFM显微照片显示所述载体已显著降解。在移位实验期间，仅记录了极少事件，并且峰幅度vs停留时间的散点图显示所记录的峰均不在相关置信椭圆(图5b和c)中，从而证实了分类方法的稳健性。照此，通过以上所讨论的分类程序，通过过滤单峰有效限制了样品中来自破碎或截短载体的假阳性计数。我们注意到移位缓冲液中Ca2+的低浓度不显著影响载体。即使将载体在移位缓冲液中温育4小时之后，通过以上分类方法仅少数(约10％)移位事件将分类为CRP占位载体。
重要地，由于与CRP直径(11nm)相比，纳米移液器孔(100nm)的大尺寸，单独的CRP的移位不导致可检测的离子电流特征并因此不可以通过我们的纳米移液器传感器检测(图4d)。类似地，溶液中任何其它分子也将不导致任何信号，借此既不造成噪音，也不造成假阴性或阳性。
实施例3：定量单分子生物传感
为了证实使用具有特异性DNA适体的载体移位的定量传感以及对通过3参数法分类的单一各个载体分子计数的概念(峰停留时间、幅度和形状)，我们分析了不同CRP浓度下一定范围的移位实验的离子电流。
图6a显示了不同CRP浓度范围的一系列代表性离子电流峰。对于每个浓度，如以上所述分类所观察到的离子电流事件。当单峰或双峰不满足过滤标准时，将它们标记为“未分类的”并且不考虑浓度分析(图6b)。这种未分类的峰代表了2分钟迹线中事件总数的9-36％。
图6c显示了对于3nM至90nM的不同的CRP浓度，归一化的单峰计数，即分类的单峰相对于分类峰总数。如所期望的，归一化的单峰计数随着CRP浓度升高而升高。使用解离常数Kd作为唯一拟合参数，通过郎格缪尔等温线拟合数据，并且作为实线显示结果。得自拟合的Kd为11±2nM。
为了研究我们的传感系统的特异性并且具体地载体对CRP靶标的特异性，选择随机DNA序列以起到非特异性适体的作用，并且对于9nM的载体浓度和90nM的CRP浓度(即图6中报道的最高浓度)测量了移位离子电流。图7显示了离子电流事件的分析。发现了平均值分别为69±5pA和0.3±13ms的峰幅度和停留时间的单一分布，这与对于空位载体所测量的值一致。散点图清楚地显示仅识别了双峰，并且无单峰，从而证实了非特异性适体不导致产生任何检测信号。
此外，对CRP特异性载体(浓度9nM)进行90nM具有与CRP类似尺寸的对照蛋白(MupB)，并且图7显示了离子电流分析结果。类似于非特异性适体，观察到停留时间和峰幅度(平均值为0.25±0.1ms和60±7pA)的单一分布，这与空位载体的那些一致。散点图清楚地显示未识别单峰(n>50)，从而证实无MupB结合至CRP载体。
在2分钟采样窗口内，在约5μl样品中实现了低至3nM CRP的使用3参数分类(幅度、停留时间和离子电流特征)的定量检测。
重要地，实施了类似的研究，但是在载体中引入了不同的CRP特异性适体(适体2)。获得了与具有CRP适体1的载体形式非常类似的结果，从而证实了生物传感方法的稳健性。
对于在临床诊断学中的应用，重要的是还可以在复杂生物流体中进行分析物，如CRP的定量检测。为了证实使用这些流体的这种传感系统的表现，用在0.1M KCl中稀释的5％人血浆溶液填充纳米移液器，并且用在3nM至36nM的范围内的所期望的CRP浓度加标(spike)。类似于缓冲液中的情况，无CRP的5％血浆中的载体产生了离子电流双峰事件，但是具有稍低的停留时间0.26±0.06ms和峰幅度55±6pA(图8a，n>50)。相反，据发现对于占位载体，在5％血浆(峰幅度0.12±0.04ms且停留时间98±1pA，n>30，图8b)和缓冲液(0.15±0.05ms和90±9pA)中实验之间的峰特征，即在加标CRP的5％血浆中所观察到的单峰一致。
以与缓冲液中相同的方式，在具有5％血浆的移位实验期间所观察到的不同的离子电流事件可以分为单峰、双峰和未分类峰。图9显示了对于所有CRP浓度的峰幅度相对于停留时间的散点图，其中以与缓冲液实验中相同的方式表示分别选择为代表CRP占位和空位载体的单峰和双峰。
图8c显示了作为CRP浓度的函数的归一化单峰计数，即单峰vs总分类的峰之比。类似于缓冲液中的结果，归一化的单峰计数随CRP浓度而升高并且符合类似的行为。估计检测限为9nM(与纯缓冲液中的3nM相比)。我们注意到对于血浆样品中多种CRP浓度所观察到的未分类事件数目(9至25％)类似于纯缓冲液中所观察到的那些。
实施例4：载体多路检测和标识条型码
为了多路实施生物传感技术，我们可以通过将多个DNA纳米结构连接在一起形成“带”或聚合物。这些带可以含有两种功能元件；1)分析物检测区和2)条型码区。
分析物检测区包含采取已描述的载体分子的形式的结构，其包含核酸框架和结合部分。空的或空位框架在离子电流信号中产生双峰，然而结合的分析物的存在产生单峰。
条型码区用于识别所述带，并且正是该区域能够检测单一样品中的多个分析物。条型码区利用了在离子电流特征和纳米结构几何形状之间所识别的关系，例如，实体瓦片结构产生单峰，而框架样结构产生双峰。这种情况更精细的实施包括框架腔体尺寸的改变以提供额外的信号。条型码区可以包括以特定顺序连接在一起的两个或更多个亚基以提供独特的离子电流指纹。这些布置是固有模块化的，并因此提供了灵活且经济的方法。
图10a显示了多路带状结构10的实施方式。使用实体核酸瓦片14和核酸框架16的具体组合产生了身份条型码区12。实体-框架-实体的布置将提供单峰-双峰-单峰的离子电流指纹。
将条型码区12连接至包含含有第一适体A1的第一检测框架20和含有第二适体A2的第二检测框架22的检测区18。在所示实施方式中，第二适体A2对不同于第一适体A1的分析物特异，尽管将理解在替代实施方式中，所述适体可以是相同的。3个其它核酸框架16、24分别缺少结合部分，其构成检测区18。然而，将理解该方法是固有模块化的并且可以以任何方式重新布置纳米结构亚基以出于所期望的目的，提供独特的条型码/分析物带。
通过间臂26将图10a所示的带结构10的框架和瓦片连接在一起。
可以通过伸出的DNA接头的相互作用实现DNA纳米结构亚基一起与带的连接。图10b显示了其可以如何实施的实例，但是将理解可以以一些不同方式实现使用DNA接头对邻近结构的连接。通过位于这些接头末端的特异性DNA序列的互补碱基配对决定了这些相互作用的特异性以及因此哪个亚基与哪个结合。用于指明这些相互作用的DNA序列是可变且可调节的。这使得能够设计接合的特异性和调节相互作用的强度(即整个DNA配对的熔融温度)。这种相互作用强度也是通过改变亚基间的DNA接头数目可调节的(例如，在一些实施方式中，可以为1至6)。
结论
我们已证实了使用对所关注的靶标分析物具有选择性且敏感的核酸框架，具体地DNA折纸纳米结构的替代载体分子方法。通过使用DNA折纸对移位离子电流的确定结构特性，我们使用框架DNA纳米结构结合玻璃纳米移液器作为可以检测和定量单一分析物分子的生物传感平台。我们表明通过折叠通常作为对于纳米孔实验所选的载体的长直链DNA，可以克服多种阻碍。DNA折纸载体的特异性离子电流特征不仅去除了由于结和折叠所造成的假阳性事件，而且还消除了使用修饰的长直链DNA链相对于其移位方向所遇到的“尾至头”和“头至尾”事件。这意味着我们的载体显示出可以通过特异性离子电流特征，而不是对于直链DNA所产生的多种离子电流导电事件来进一步验证的类似的峰幅度和停留时间移位数据。
此外，本发明的载体的空间可寻址性有助于DNA纳米结构中结合部分，如适体在可以影响离子电流的特定位置的并入。
另外，除峰幅度和停留时间差异外，离子电流特征相对于靶标分析物(CRP)位置的变化提供了对靶标捕获的目视指示(双峰向单峰)。通过这种3因素技术，我们可以以低浓度、高特异性地定量检测单一分析物分子。重要地，实验证明了载体以如简单的KCl缓冲液中所示的类似的灵敏性和信噪比检测复杂血浆样品中靶标分析物的能力。
核酸框架载体的另一个优势在于可以使用显微镜技术使靶标捕获现象。此外，可以对于多路检测容易地修饰载体分子，从而使得能够同时检测不同靶标分子。
序列表
<110> 利兹大学（University of Leeds）
<120> 分析物检测
<130> P294731WO
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 适体
<400> 1
aagcctttat ttcaacggca ggaagacaaa cacgatgggg gggtatgatt tgatgtggtt 60
gttgcatgat cgtggtctgt ggtgctgt 88
<210> 2
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 适体
<400> 2
cgaaggggat tcgaggggtg attgcgtgct ccatttggtg tttttttttt ttgcaaggat 60
aaaaattt 68
<210> 3
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 适体
<400> 3
ctgaacaaga aaaatagcag aacttacgag ccaggggaaa cagtaaggcc taattaggta 60
aaggagtaag tgctcgaacg cttcaga 87

Claims (35)

1.一种用于检测和/或定量靶标分析物的载体分子，所述载体分子包含：
分子框架，所述分子框架限定中央孔隙；和
对所述靶标分析物具有特异性的结合部分，其中所述结合部分结合至所述框架并定位，使得所述靶标分析物在结合至所述结合部分时位于所述中央孔隙。
2.根据权利要求1所述的载体分子，其中所述载体分子用于将所述靶标分析物运载通过纳米孔。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的载体分子，其中所述分子框架由核酸、蛋白、肽或它们的混合物形成。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的载体分子，其中所述分子框架部分或完全由DNA形成。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的载体分子，其中所述分子框架由DNA折纸或蛋白折纸形成。
6.根据前述权利要求中任一项所述的载体分子，其中所述分子框架是长方形、正方形、圆形、椭圆形、三角形、梯形、菱形、五边形、六边形、八边形、风筝形或者不规则形状。
7.根据前述权利要求中任一项所述的载体分子，其中所述分子框架具有不大于约20nm的厚度。
8.根据前述权利要求中任一项所述的载体分子，其中所述分子框架是基本2维的。
9.根据前述权利要求中任一项所述的载体分子，其中所述分子框架具有单一构象。
10.根据前述权利要求中任一项所述的载体分子，其中所述分子框架是基本刚性的。
11.根据前述权利要求中任一项所述的载体分子，其中所述中央孔隙的尺寸设定为使得能够在其中接受所述靶标分析物。
12.根据前述权利要求中任一项所述的载体分子，其中所述载体分子配置为：
在不存在结合的靶标分析物的情况下，一旦所述载体分子移位通过纳米孔，则所述载体分子在离子电流特征中产生双峰；且
当所述结合部分结合所述靶标分析物并且所述靶标分析物位于所述载体分子的所述中央孔隙中时，一旦所述载体分子移位通过纳米孔，则在所述离子电流特征中产生单峰。
13.根据前述权利要求中任一项所述的载体分子，其中所述载体分子配置为所述靶标分析物在结合至所述结合部分时，基本填充或堵塞所述孔隙。
14.根据前述权利要求中任一项所述的载体分子，其中所述分子框架配置为靶标分析物的至少一部分在由所述结合部分结合时，延伸至所述框架外。
15.根据前述权利要求中任一项所述的载体分子，其中所述结合部分包括适体、affimer、抗体(或其衍生物或片段)、分子印记聚合物(MIP)或核酸-蛋白融合分子。
16.根据前述权利要求中任一项所述的载体分子，其中所述结合部分经由锚定部分结合至所述框架。
17.一种用于在多路系统中检测和/或定量靶标分析物的载体分子，包含：
检测区，包含至少一个检测框架和对所述靶标分析物具有特异性的结合部分，所述检测框架是限定中央孔隙的分子框架，其中所述结合部分结合至所述框架并且定位，使得所述靶标分析物在结合至所述结合部分时位于所述中央孔隙中；和
连接至所述检测区的条型码区，其中所述条型码区包含至少一个纳米结构，其中所述纳米结构是分子瓦片或缺少结合部分的分子框架。
18.根据权利要求17所述的载体分子，其中所述载体分子根据权利要求2至16中任一项所定义。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的载体分子，其中所述条型码区包含串联布置的多个纳米结构。
20.一种组合物，包含处于溶液中的根据权利要求1至19中任一项所述的载体分子。
21.根据权利要求1至19中任一项所述的载体分子用于检测和/或定量样品中靶标分析物的存在的用途，所述用途包括使所述载体分子移位通过纳米孔。
22.一种复合物，包含结合至靶标分析物的根据权利要求1至19中任一项所述的载体分子。
23.一种用于检测和/或定量样品中靶标分析物的存在的方法，所述方法包括：
使根据权利要求1至19中任一项所述的载体分子与所述样品接触；和
检测载体分子-靶标分析物复合物的存在。
24.根据权利要求23所述的方法，其中经由电压驱动的复合物移位通过纳米孔来进行载体分子-靶标分析物复合物存在的检测。
25.根据权利要求24所述的方法，其中相对于单独的载体分子的离子电流特征变化指示所述样品中所述靶标分析物的存在。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述离子电流特征变化是峰形、峰幅度和/或停留时间的变化。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中峰形从双峰向单峰的变化指示所述样品中所述靶标分析物的存在。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的方法，其中所述纳米孔的尺寸设定为允许每次通过单一载体分子。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的方法，其中所述纳米孔位于纳米移液器的尖端。
30.根据权利要求23至29中任一项所述的方法，其中所述方法用于定量所述样品中存在的靶标分析物的量，所述方法还包括：
使所述样品与已知浓度的载体分子接触；和
确定占位载体分子(即，载体分子-靶标分析物复合物)与空位载体分子(即，无结合的靶标分析物的载体分子)之比。
31.根据权利要求30所述的方法，其中确定占位载体分子与空位载体分子之比包括：
对所述样品进行电压驱动的移位通过纳米孔；和
测量随着所述载体分子移位通过所述纳米孔所产生的离子电流特征，
其中所述离子电流特征中单峰与双峰之比指示占位载体分子与空位载体分子之比。
32.一种用于检测和/或定量样品中靶标分析物的系统，所述系统包括：
第一电解质储罐和第二电解质储罐，第一储罐和第二储罐由包含纳米孔的隔板分开；和
任选地，用于使分子从所述第一电解质储罐移位通过所述纳米孔到达所述第二电解质储罐的电极，
其中所述第一电解质储罐和第二电解质储罐中的至少一个包含根据权利要求1至19中任一项所述的载体分子。
33.根据权利要求32所述的系统，其中所述隔板包含膜或由膜组成，任选地其中所述膜是生物膜或固态膜。
34.一种用于检测靶标分析物的试剂盒，所述试剂盒包含：
根据权利要求1至19中任一项所述的载体分子；和
使用说明书。
35.根据权利要求34所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含纳米孔，任选地其中所述纳米孔包含在纳米移液器内。
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