CN115175666B - {4,6-二氨基-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}氨基甲酸甲酯的纳米制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及{4,6‑二氨基‑2‑[5‑氟‑1‑(2‑氟苄基)‑1H‑吡唑并[3,4‑b]吡啶‑3‑基]嘧啶‑5‑基}氨基甲酸甲酯(维利西呱(Vericiguat)，式(I)化合物)的稳定纳米混悬剂、制备稳定纳米混悬剂的方法、包含式(I)化合物的纳米颗粒，以及由纳米混悬剂制成的以固体形式的药物组合物。

Description

{4,6-二氨基-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡 啶-3-基]嘧啶-5-基}氨基甲酸甲酯的纳米制剂
本发明涉及{4,6-二氨基-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}氨基甲酸甲酯(维利西呱(Vericiguat)，式(I)化合物)的稳定纳米混悬剂、制备稳定纳米混悬剂的方法、包含式(I)化合物的纳米颗粒，以及由纳米混悬剂制成的以固体形式的药物组合物。
在过去的几十年中，来自药物发现的水溶性差的候选药物的数量急剧增加。将它们制成有效剂型存在各种挑战。
从WO 2011/147809已知的式(I)的{4,6-二氨基-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}氨基甲酸甲酯
(维利西呱)，
是这些活性药物成分(API)中的一种，其具有影响生物利用度的有限溶解行为。WO2011/147809 A1提及了固体和液体制剂，包括用于口服给药的混悬剂。WO 2011/147809 A1没有解决式(I)化合物的有限溶解行为的问题，也没有任何增加其溶解的措施。此外，WO2011/147809没有公开式(I)化合物的晶型。
WO 2013/076168 A1尤其涉及制备式(I)化合物的方法和用于该方法的中间体。WO2013/076168 A1还涉及呈变型I的晶型的式(I)化合物和以式(I)化合物的二-二甲基亚砜溶剂合物形式的式(I)的结晶物质化合物。式(I)化合物的二-二甲基亚砜溶剂合物在获得高纯度的呈变型I的晶型的式(I)化合物的方法中用作中间体。WO 2013/076168 A1还提及了式(I)化合物在呈变型I的晶型中的稳定性，其在微粉化过程中被保存，这意味着不发生转化和重结晶。WO 2013/076168 A1没有解决式(I)化合物的有限溶解行为的问题，也没有任何增加其溶解的措施。
出版物Follmann等人(2017)涉及发现式(I)化合物用于治疗心力衰竭。Follmann等人描述了制备呈变型I的晶型的式(I)化合物的方法步骤，包括如WO 2013/076168 A1的实施例13中所述的最终步骤使用式(I)化合物的二-二甲基亚砜溶剂合物作为中间体。该方法产生高度纯化的干燥形式的呈变型I的晶型的式(I)化合物。
在本申请的首次申请日之后公布的WO 2020/126983 A1涉及例如具有改进的特性的呈变型I的晶型的式(I)化合物的活性化合物产物，例如关于活性化合物产品的可分离性、活性化合物产品在分离和干燥后的排出能力以及活性化合物产品的可输送性、筛分性和微粉化性。这些改进的特性允许在技术规模上运行制备方法。据说改进的微粉化是可测量的，例如通过更容易地将活性化合物产品进料到气流研磨机中。其还提及在WO 2020/126983 A1的上下文中，微粉化例如通过在气流研磨机中粉碎来进行。气流研磨机进行干磨。气流研磨机适用于将颗粒研磨至微米范围。气流研磨机中的研磨作用是由多个空气或蒸汽喷射流驱动的颗粒之间的高速碰撞产生的。干磨不适合生产纳米颗粒。WO 2020/126983 A1没有解决式(I)化合物的有限溶解行为问题，也没有任何增加其溶解的措施。
WO 2020/014504 A1涉及sGC刺激剂(包括维利西呱)用于治疗线粒体疾病的用途。WO 2020/014504 A1还涉及sGC刺激剂的一般制剂，尤其提到稳定剂和纳米颗粒。然而，WO2020/014504 A1没有提供任何关于维利西呱的稳定纳米制剂或如何制备它们的具体教导，除了可以使用常规溶解和混合程序制备制剂的一般性陈述。
CN 108721296 A涉及维利西呱用于治疗高原病的用途。在实施例1中，CN108721296 A描述了固体维利西呱的某些组合物，但没有公开维利西呱的晶型或纳米制剂。
{4,6-二氨基-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}氨基甲酸甲酯(维利西呱，式(I)化合物)的设想的临床剂量范围为2.5-15mg，每天一次，取决于目标适应症。开发了一种标准的速释片剂。随着剂量的增加，观察到标准速释制剂(如片剂)的生物利用度降低和积极的食物效应，表现为生物利用度随着食物摄入的增加而增加。
食物可以通过多种机制影响药物产品的药代动力学，例如胃排空延迟、胆汁流动刺激、胃肠道(GI)pH的变化、管腔代谢的改变或药物与食物本身的相互作用。药物吸收过程会受到许多因素的影响，包括卡路里含量(低热量膳食与高热量膳食)、营养成分(蛋白质、富含碳水化合物或高脂肪膳食)、体积、膳食本身的温度以及液体摄入量。食物也会增加流向肝脏的血流量(内脏血流量)；因此，结果发生的首次通过提取的变化可能会导致进食和禁食状态之间的生物利用度差异。
药物纳米颗粒或纳米晶体的制备是制备具有有限溶解行为的此类药物的一种方法，因为药物晶体的尺寸减小会增加比表面积，这可以提高此类药物的溶解速度，进而提高其生物利用度。此外，超细颗粒往往表现出更高的饱和溶解度，这也提高了溶解速度。
在本发明的含义内，足够的溶解速度被定义为在吸收位点的通过时间内可以溶解足够的预期剂量范围的药物颗粒的能力。相反，如果溶解速度太慢以至于所有药物颗粒在通过吸收部位的过程中无法溶解，则药物具有有限的溶解速度(Butler,Dressman,2010)。
有几种生产药物纳米颗粒的方法，例如湿法珠磨(在纳米混悬剂制备的上下文中也称为纳米研磨)、均质化、液体抗溶剂沉淀、熔融乳化、使用超临界流体的沉淀、蒸发沉淀和微乳液。
研磨过程中的粒径通常取决于(i)工艺设备参数，包括比能量输入和应力强度；(ii)药物颗粒的机械和物理化学性质；以及(iii)研磨混悬剂的物理稳定性，即在各种稳定剂存在下减轻聚集和/或奥斯特瓦尔德熟化。“应力强度(SI)”是根据Kwade等人(1996年)定义的，如
其中SI＝应力强度；SIb＝珠子的应力强度；db＝研磨珠的直径[m]；ρb＝研磨珠的密度；ρ＝流体密度[kg/m3]；vd＝搅拌盘的圆周速度[m/s]。
“奥斯特瓦尔德熟化”描述了溶液中的较小颗粒溶解并沉积在较大颗粒上以通过使表面积与面积比最小化来达到更热力学稳定状态的现象，从而促进较大颗粒的形成。制备具有所需粒径和足够储存稳定性的药物纳米混悬剂需要湿法珠磨(或纳米研磨)方法，如下文所定义和实施例1至3中所述。选择最佳稳定剂配方是一项费力且需要资源的任务，然而，这是一个重要的，可能会产生严重后果的事件。配制不当的药物纳米混悬剂可能会在研磨/储存过程中发生聚集、奥斯特瓦尔德熟化、颗粒快速沉降和结块形成，这将导致相应混悬剂的后续加工过程中出现各种问题以及最终制剂的产品性能不佳，例如出乎意料的缓慢的溶解速度。
根据Kwade等人(1996)的研究，对于固定的比能量输入，存在最佳的应力强度，从而获得最佳产品。随着比能量输入的增加，从而增加产品细度，最佳应力强度降低。由于比能量与应力强度和应力频率的乘积成正比，因此粉碎结果也可以与应力频率和应力强度相关。随着应力强度的增加，达到一定产品细度所需的应力频率降低。
在研磨和储存过程中潜在的粒径增加或颗粒生长会导致与药物纳米颗粒相关的高表面积损失，这会降低纳米研磨过程预期的显著收益。
为了利用它们的特定性质，始终需要稳定溶液中的纳米颗粒。随着时间的推移，必须避免聚集、生长或融合。由于它们的高比表面积，纳米颗粒总是处于“高能量状态”，因此本质上不是稳定的。因此，必须采取特定措施来稳定纳米颗粒混悬剂。
通过湿法珠磨生产的药物纳米混悬剂的稳定性可以通过各种赋形剂来实现，取决于潜在的稳定机制，这是无法预料的。现有技术中的数据表明，湿法珠磨已被有效地用于制备多种水溶性差的的药物的纳米混悬剂，并且可以使用各种聚合物和/或表面活性剂来确保纳米混悬剂具有足够的物理稳定性。有趣的是，只有少数纳米混悬剂达到了低于100nm的最终药物粒径。因此，药物纳米技术文献中关于通过湿法珠磨制备药物纳米颗粒的文献存在巨大差距。
正如Li等人(2016)的综述中所述，通过湿法珠磨(纳米研磨)制备药物纳米颗粒是一种众所周知的成熟技术，适用于口服和其他形式的给药。根据Li等人(2016)的研究，湿法珠磨后接各种干燥工艺已成为一种成熟的且经过验证的制剂方法，特别是对于提高水溶性差的的药物的生物利用度。据说湿磨混悬剂(纳米混悬剂)的物理稳定性引起了很多关注，但仍然缺乏对该过程的基本了解。表面活性剂的选择及其最佳浓度对于物理不稳定性至关重要，并且是一项费力且需要资源的任务。仍然缺少为给定药物选择合适稳定剂的第一种基于原理的预测方法。得出的结论是，物理化学药物性质(分子量、熔点、logP、溶解度和密度)与稳定纳米混悬剂形成之间不存在相关性。聚合物或表面活性剂等稳定剂浓度不足可能无法防止药物纳米颗粒聚集，而其过量(特别是表面活性剂浓度高于临界胶束浓度(CMC)时)被认为会加速奥斯特瓦尔德熟化。研磨时的固态变化可能会影响生物利用度和进一步的制备。此外，从一个研磨机到另一个的桥接可能是至关重要的。
Kumar等人(2008)指出了确定合适的稳定剂和工艺参数的影响和重要性，例如均质循环次数对粒径的影响，以及成分混合顺序对纳米混悬剂物理特性的影响。George&Gosh(2013)分析了作为药物特性的函数的稳定机制，并得出结论，使用介质研磨方法优化纳米混悬剂是一个复杂的过程，因为它涉及许多影响纳米混悬剂产品特性的因素。
根据Desai(2012)的研究，设计用于口服给药的纳米混悬剂的主要挑战是在储存期间和口服给药后在胃肠道中保持纳米混悬剂的胶体稳定性和粒径，并将纳米混悬剂转化为可口且对患者友好的口服制剂。
Choi&Han和Jermain(2018)等人的出版物提供了用于难溶于水的药物的纳米晶体技术的最近更新。正如Jermain等人(2018)所总结的，纳米颗粒比微粒更不稳定，因为与减小颗粒尺寸相关的额外吉布斯自由能贡献，主要是由于表面能增加。解决这种额外贡献是配制药物纳米颗粒的关键，因为它们往往会聚集以使它们的总能量最小化(VanEerdenbrugh等人，2008)。正如Jermain等人(2018)所述，热力学稳定可用作稳定药物纳米颗粒的方法，该方法使用表面活性剂或嵌段共聚物来实现颗粒稳定性。为了达到最大效果，这两种方法经常结合使用(Lee等人，2008)。仔细选择稳定剂的用量与选择稳定剂的类型同样重要。例如，稳定的一个障碍是奥斯特瓦尔德熟化，如上所述。太少的稳定剂会导致纳米颗粒的聚集，而太多的稳定剂会促进奥斯特瓦尔德熟化(Merisko-Liversidge等人，2003)。
已知有几种基于纳米制剂的上市产品，通过湿法珠磨制备(表格根据“Nanomedicinein Health and Disease”一书进行了修改(Hunter，2011)：
如上所述，对于每个单独的化合物仍有待解决的关于纳米制剂的常见技术问题包括：
a)稳定剂的选择
b)机械加工：工艺参数(如研磨机的选择、比能量输入和应力强度、研磨持续时间、尖端速度)、研磨珠的材料、研磨珠的尺寸、研磨珠的体积填充和药物的物理化学性质的影响。
c)进一步加工：在纳米混悬剂干燥时，基于纳米尺寸的有益效果损失的风险，例如由于结块或奥斯特瓦尔德熟化或进一步加工至最终剂型储存，并在吸收部位重新悬浮。
鉴于现有技术，本发明的一个目的是解决由于维利西呱的有限溶解行为，临床前和临床研究中的生物利用度可能随着更高剂量而降低的问题。
本发明的该目的通过提供根据本发明的式(I)化合物的稳定纳米混悬剂、制备稳定纳米混悬剂的方法、包含式(I)化合物的纳米颗粒、以及由纳米混悬剂制成的以固体形式的药物组合物来解决，通过这种方法，受到低溶解速度限制的生物利用度通常可以增加，并且预计可以避免食物效应。
根据一个实施方案，本发明提供了式(I)化合物维利西呱的稳定纳米混悬剂。对于维利西呱，之前没有描述过稳定的纳米制剂。
本发明的一个实施方案是一种稳定纳米混悬剂，其包含分散剂中的呈变型I的晶型的式(I)化合物的纳米颗粒和一种或多种稳定剂，其中一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂在混悬剂中的溶解度极限，其中所述纳米颗粒的平均粒径(以d50表示)为500nm或更小。
在本发明的含义内，式(I)化合物是{4,6-二氨基-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}氨基甲酸甲酯
在本发明的含义内，“呈变型I的晶型的式(I)化合物”应理解为表示式(I)化合物的变型，其在WO 2013/076168中定义为晶体变型I；例如通过参考在5.9、6.9和22.7处或在5.9、6.9、16.2、16.5、24.1、22.7和24.7处具有定义的2θ角的峰值最大值的X射线衍射图；或通过在1707、1633和1475cm-1处或在1707、1633、1566、1475、1255和1223cm-1处具有定义的谱带最大值的IR光谱；或借助257℃的熔点。
在本发明的含义内，“药物纳米颗粒”或“呈变型I的晶型的式(I)化合物的纳米颗粒”被定义为活性药物成分(API)或呈变型I的晶型的式(I)化合物的颗粒，以d50表示的粒径分别为500nm或更小，或400nm或更小，或300nm或更小，或250nm或更小，或200nm或更小，或150nm或更小，或100nm或更小。
在本发明的含义内，粒径分布以d值表示。d值可以被认为是球体的直径，当颗粒以质量递增的方式排列时，它将样品的质量分成指定的百分比。例如，d10是样品质量的10％由直径小于该值的颗粒组成的直径。d50是样品质量的50％小于和样品质量的50％大于的颗粒的直径。d90是样品质量的90％小于和样品质量的10％大于的颗粒的直径。药物纳米颗粒尺寸的测量可以例如通过动态光散射(DLS)，使用Zetasizer Nano-ZS(来自MalvernPanalytical)或静态光散射(SLS)，使用Mastersizer 3000(来自Malvern Panalytical)进行。
在本发明的含义内，“稳定纳米混悬剂”定义为在分散剂中包含呈变型I的晶型的式(I)化合物的纳米颗粒和一种或多种稳定剂的纳米混悬剂，其中所述纳米颗粒的平均粒径(以d50表示)为500nm或更小、或300nm或更小、或250nm或更小、或200nm或更小、或150nm或更小、或100nm或更小，其中平均粒径(以d50表示)在至少40℃的温度下保存至少1周时保持在500nm或更小，或300nm或更小，或250nm或更小或200nm或更小，或150nm或更小或100nm或更小。
在本发明的含义内，“稳定纳米混悬剂”进一步定义为包含呈变型I的晶型的式(I)化合物的纳米颗粒和一种或多种稳定剂的纳米混悬剂，其比例为8:1至1:1w/w，所述纳米颗粒的平均粒径(以d50表示)为500nm或更小，其中所述纳米颗粒的粒径(用DLS或用SLS测量)在40℃保存一周或多周时保持在500nm或更小。颗粒生长的长期测量显示在实施例2b和图2中。
在本发明的含义内，“稳定剂”定义为改善研磨性能、引起表面润湿和表面稳定化并导致纳米混悬剂物理稳定性的物质及其组合。
本公开的主题是稳定纳米混悬剂，其中一种或多种稳定剂选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物、十二烷基硫酸钠(SDS)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、d-α生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(维生素E-TPGS)、聚山梨醇酯、羟丙基纤维素(HPC)、聚氧乙烯-35蓖麻油、聚氧乙烯15羟基硬脂酸酯、脱氧胆酸钠及其组合。
本公开的主题是稳定纳米混悬剂，其中一种或多种稳定剂选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物(例如PVP VA 64)、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物(例如Poloxamer188)、十二烷基硫酸钠(SDS)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、d-α生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(维生素E-TPGS)、聚山梨醇酯羟丙基纤维素(HPC)、聚氧乙烯-35蓖麻油(Cremophor/>)、聚乙二醇15羟基硬脂酸酯(Solutol HS/>)、脱氧胆酸钠及其组合。
本公开的主题是稳定纳米混悬剂，其中一种或多种稳定剂选自十二烷基硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮K10至K50、羟丙基甲基纤维素、维生素ETPGS、聚山梨醇酯20-80及其组合。
本发明的一个实施方案是根据本发明的稳定纳米混悬剂，其中所述一种或多种稳定剂选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)结合十二烷基硫酸钠(SDS)、乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物、十二烷基硫酸钠(SDS)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚山梨醇酯、羟丙基纤维素(HPC)、聚氧乙烯-35蓖麻油、聚氧乙烯15羟基硬脂酸酯、脱氧胆酸钠及其组合。
本发明的一个实施方案是根据本发明的稳定纳米混悬剂，其中所述一种或多种稳定剂选自十二烷基硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮K10至K50结合十二烷基硫酸钠(SDS)、羟丙基甲基纤维素、聚山梨醇酯20-80及其组合。
根据本发明的一个实施方案，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)选自PVP K10至K50。根据本发明的另一个实施方案，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)选自PVP K12至K30。根据本发明的另一个实施方案，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)选自PVP K12、PVP K17和PVP K30。根据本发明的一个实施方案，乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物是PVP VA 64。根据本发明的一个实施方案，环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物是Poloxamer 188。根据本发明的一个实施方案，聚山梨醇酯选自聚山梨醇酯20-80。根据本发明的一个实施方案，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯80。
根据本发明的一个实施方案，包含在根据本发明的纳米颗粒中的一种或多种稳定剂是SDS和PVP K12的组合。根据本发明的一个实施方案，包含在根据本发明的纳米颗粒中的一种或多种稳定剂是SDS和PVP K17的组合。根据本发明的一个实施方案，包含在根据本发明的纳米颗粒中的一种或多种稳定剂是SDS和Poloxamer 188的组合。
本发明的一个实施方案是根据本发明的稳定纳米混悬剂，其中一种或多种稳定剂是十二烷基硫酸钠。本发明的一个实施方案是根据本发明的稳定纳米混悬剂，其中一种或多种稳定剂是聚山梨醇酯20-80。本发明的一个实施方案是根据本发明的稳定纳米混悬剂，其中一种或多种稳定剂是聚山梨醇酯80。
在本发明的含义内，一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂在混悬剂中的溶解度极限。对于使用本发明的纳米混悬剂制备的药物组合物，一种或多种稳定剂的最大浓度进一步受到每日可接受摄入量(ADI)的限制，如果这种ADI是针对相应的稳定剂定义的。根据欧洲食品安全局的定义，ADI是对食品或饮用水中一种物质在一生中每天可以食用且不会对健康造成明显风险的估计量。通常以每千克体重的该物质的毫克数表示，适用于食品添加剂、农药残留、兽药等化学物质。
在本发明的含义内，“分散剂”定义为式(I)化合物不溶于其中的极性液体。实例包括但不限于水；醇例如伯醇、仲醇和叔醇，包括乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、叔丁醇；以及多元醇，包括甘油。根据本发明的一个实施方案，使用水作为分散剂。
本发明的一个实施方案是一种稳定纳米混悬剂，其包含分散剂中的呈变型I的晶型的式(I)化合物的纳米颗粒和一种或多种稳定剂，其中一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂在混悬剂中的溶解度极限，其中所述纳米颗粒的平均粒径(以d50表示)为400nm或更小。
本发明的一个实施方案是一种稳定纳米混悬剂，其包含分散剂中的呈变型I的晶型的式(I)化合物的纳米颗粒和一种或多种稳定剂，其中一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂在混悬剂中的溶解度极限，其中所述纳米颗粒的平均粒径(以d50表示)为300nm或更小。
本发明的一个实施方案是一种稳定纳米混悬剂，其包含分散剂中的呈变型I的晶型的式(I)化合物的纳米颗粒和一种或多种稳定剂，其中一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂在混悬剂中的溶解度极限，其中所述纳米颗粒的平均粒径(以d50表示)为250nm或更小。
本发明的一个实施方案是一种稳定纳米混悬剂，其包含分散剂中的呈变型I的晶型的式(I)化合物的纳米颗粒和一种或多种稳定剂，其中一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂在混悬剂中的溶解度极限，其中所述纳米颗粒的平均粒径(以d50表示)为200nm或更小。
本发明的一个实施方案是一种稳定纳米混悬剂，其包含分散剂中的呈变型I的晶型的式(I)化合物的纳米颗粒和一种或多种稳定剂，其中一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂在混悬剂中的溶解度极限，其中所述纳米颗粒的平均粒径(以d50表示)为150nm或更小。
本发明的一个实施方案是一种稳定纳米混悬剂，其包含分散剂中的呈变型I的晶型的式(I)化合物的纳米颗粒和一种或多种稳定剂，其中一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂在混悬剂中的溶解度极限，其中所述纳米颗粒的平均粒径(以d50表示)为100nm或更小。
本发明的一个实施方案是一种稳定纳米混悬剂，其包含分散剂中的呈变型I的晶型的式(I)化合物的纳米颗粒和一种或多种稳定剂，其中一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂在混悬剂中的溶解度极限，其中所述纳米颗粒的平均粒径(以d50表示)为500nm或更小，且其中式(I)化合物：一种或多种稳定剂的比例为16:1至1:2w/w。
在使用两种稳定剂的组合并且这两种稳定剂是表面活性剂和聚合物(例如SDS加聚乙烯吡咯烷酮或SDS加环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物)的情况下，化合物(I):聚合物的比例为16:1至1:2w/w或8:1至2:1w/w，表面活性剂浓度为0.1-0.2％w/v。
本发明的一个实施方案是本发明的稳定纳米混悬剂，其中以d50表示的平均粒径在至少40℃的温度下保存至少一周时保持在300nm或更小。
本发明的一个实施方案是根据本发明的稳定纳米混悬剂，其中一种或多种稳定剂以式(I)化合物：稳定剂为8:1至2:1w/w的比例使用。
根据本发明的一个实施方案，包含以8:1至1:1w/w比例的呈变型I的晶型的式(I)化合物的纳米颗粒和一种或多种稳定剂的稳定纳米混悬剂的平均粒径(以d50表示并且用DLS或SLS测量)，在40℃下保存至少一周时保持在300nm或更小。
根据本发明的一个实施方案，包含以8:1至1:1w/w比例的呈变型I的晶型的式(I)化合物的纳米颗粒和一种或多种稳定剂的稳定纳米混悬剂的平均粒径(以d50表示并且用DLS或SLS测量)，在40℃下保存至少两周时保持在300nm或更小。
根据本发明的一个实施方案，包含以8:1至1:1w/w比例的呈变型I的晶型的式(I)化合物的纳米颗粒和一种或多种稳定剂的稳定纳米混悬剂的平均粒径(以d50表示并且用DLS或SLS测量)，在40℃下保存至少四周时保持在300nm或更小。
根据本发明的一个实施方案，包含以8:1至1:1w/w比例的呈变型I的晶型的式(I)化合物的纳米颗粒和一种或多种稳定剂的稳定纳米混悬剂的平均粒径(以d50表示并且用DLS或SLS测量)，在40℃下保存至少八周时保持在300nm或更小。
根据本发明的一个实施方案，包含以8:1至1:1w/w比例的呈变型I的晶型的式(I)化合物的纳米颗粒和一种或多种稳定剂的稳定纳米混悬剂的平均粒径(以d50表示并且用DLS或SLS测量)，在40℃下保存至少十三周时保持在300nm或更小。
本发明的一个实施方案是一种稳定纳米混悬剂，其包含分散剂中的呈变型I的晶型的式(I)的{4,6-二氨基-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}氨基甲酸甲酯纳米颗粒，
其特征在于该化合物的X射线衍射图在5.9、6.9、22.7处显示出2θ角的峰值最大值，以及一种或多种稳定剂，其中所述一种或多种稳定剂选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)结合十二烷基硫酸钠(SDS)、乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物、十二烷基硫酸钠(SDS)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚山梨醇酯、羟丙基纤维素(HPC)、聚氧乙烯-35蓖麻油、聚氧乙烯15羟基硬脂酸酯、脱氧胆酸钠及其组合，一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂在混悬剂中的溶解度极限，分散剂选自水、伯醇、仲醇和叔醇，以及多元醇，纳米颗粒的平均粒径(以d50表示)为500nm或更小，并且平均粒径(以d50表示)在至少40℃的温度下保存至少一周时保持在500nm或更小。
本发明的一个实施方案是根据本发明的稳定纳米混悬剂，其中所述一种或多种稳定剂选自十二烷基硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮K10至K50结合十二烷基硫酸钠(SDS)、羟丙基甲基纤维素、聚山梨醇酯20-80及其组合。
本发明的一个实施方案是一种稳定纳米混悬剂，其包含分散剂中的呈变型I的晶型的式(I)的{4,6-二氨基-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}氨基甲酸甲酯的纳米颗粒，其特征在于该化合物的X射线衍射图在5.9、6.9、22.7处显示出2θ角的峰值最大值，以及一种或多种稳定剂，其中一种或多种稳定剂选自十二烷基硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮K10至K50与十二烷基硫酸钠(SDS)结合羟丙基甲基纤维素、聚山梨醇酯20-80及其组合，一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂在混悬剂中的溶解度极限，分散剂选自水、伯醇、仲醇和叔醇，以及多元醇,纳米颗粒的平均粒径(以d50表示)为500nm或更小，并且平均粒径(以d50表示)在至少40℃的温度下保存至少一周时保持在500nm或更小。
本发明的一个实施方案是根据本发明的稳定纳米混悬剂，其中式(I)化合物：一种或多种稳定剂的比例为16:1至1:2w/w。本发明的一个实施方案是根据本发明的稳定纳米混悬剂，其中式(I)化合物：一种或多种稳定剂的比例为8:1至2:1w/w。在使用两种稳定剂的组合并且这两种稳定剂是表面活性剂和聚合物(例如SDS加聚乙烯吡咯烷酮或SDS加环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物)的情况下，化合物(I)：聚合物的比例为16:1至1:2w/w或8:1至2:1w/w，表面活性剂的浓度为0.1-0.2％w/v。
本发明的一个实施方案是一种稳定纳米混悬剂，其包含分散剂中的呈变型I的晶型的式(I)的{4,6-二氨基-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}氨基甲酸甲酯的纳米颗粒，其特征在于该化合物的X射线衍射图在5.9、6.9、22.7处显示出2θ角的峰值最大值，以及一种或多种稳定剂，其中一种或多种稳定剂选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)结合十二烷基硫酸钠(SDS)、乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物、十二烷基硫酸钠(SDS)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚山梨醇酯、羟丙基纤维素(HPC)、聚氧乙烯-35蓖麻油、聚氧乙烯15羟基硬脂酸酯、脱氧胆酸钠及其组合，一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂在混悬剂中的溶解度极限，分散剂选自水、伯醇、仲醇和叔醇以及多元醇，纳米颗粒的平均粒径(以d50表示)为500nm或更小，并且平均粒径(以d50表示)在至少40℃的温度下保存至少一周时保持在500nm或更小，并且其中式(I)化合物:一种或多种稳定剂的比例为16:1至1:2w/w。
本发明的一个实施方案是一种稳定纳米混悬剂，其包含分散剂中的呈变型I的晶型的式(I)的{4,6-二氨基-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}氨基甲酸甲酯的纳米颗粒，其特征在于该化合物的X射线衍射图在5.9、6.9、22.7处显示出2θ角的峰值最大值，以及一种或多种稳定剂，其中一种或多种稳定剂选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)与十二烷基硫酸钠(SDS)的组合，或环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物与SDS的组合，一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂在混悬剂中的溶解度极限，分散剂选自水、伯醇、仲醇和叔醇以及多元醇，纳米颗粒的平均粒径(以d50表示)为500nm或更小，并且平均粒径(以d50表示)在至少40℃的温度下保存至少一周时保持在500nm或更小，并且其中式(I)化合物:一种或多种稳定剂的比例为16:1至1:2w/w或8:1至2:1w/w，SDS的浓度为0.1-0.2％w/v。
本发明的一个实施方案是根据本发明的稳定纳米混悬剂，其中纳米颗粒的平均粒径(以d50表示)为500nm或更小、或300nm或更小、或250nm或更小、或200nm或更小、或150nm或更小、或100nm或更小。
本发明的一个实施方案是根据本发明的稳定纳米混悬剂，其中纳米颗粒的平均粒径(以d50表示)为300nm或更小。
本发明的一个实施方案是根据本发明的稳定纳米混悬剂，其中以d50表示的平均粒径在至少40℃的温度下保存至少一周时保持在300nm或更小。
本发明的一个实施方案是一种稳定纳米混悬剂，其包含分散剂中的呈变型I的晶型的式(I)的{4,6-二氨基-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}氨基甲酸甲酯的纳米颗粒，其特征在于该化合物的X射线衍射图在5.9、6.9、22.7处显示出2θ角的峰值最大值，以及一种或多种稳定剂，其中一种或多种稳定剂选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)结合十二烷基硫酸钠(SDS)、乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物、十二烷基硫酸钠(SDS)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚山梨醇酯、羟丙基纤维素(HPC)、聚氧乙烯-35蓖麻油、聚氧乙烯15羟基硬脂酸酯、脱氧胆酸钠及其组合，一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂在混悬剂中的溶解度极限，分散剂选自水、伯醇、仲醇和叔醇以及多元醇，纳米颗粒的平均粒径(以d50表示)为500nm或更小，并且以d50表示的平均粒径在至少40℃的温度下保存至少一周、或至少两周、或至少四周、或至少八周、或至少十三周时保持在500nm或更小、或300nm或更小、或250nm或更小、或200nm或更小、或150nm或更小、或100nm或更小。
为了获得根据本发明的稳定纳米混悬剂，必须确定特定的稳定剂和稳定剂的组合(图1)。这项任务高度依赖于特定的化合物。图2显示了本发明的纳米混悬剂的长期稳定性，这是它们按原样使用和加工成其他药物形式如颗粒剂和片剂的先决条件。与现有技术中关于高于CMC的稳定剂浓度促进奥斯特瓦尔德熟化的教导相反，出人意料地发现稳定纳米混悬剂可以用至少比CMC高4倍的SDS稳定剂浓度获得(图3，API:SDS＝2:1)。如图4所示，微粉化维利西呱经过纳米研磨后的粒径明显小于仅微粉化维利西呱的粒径。
为了获得稳定纳米混悬剂，除了稳定剂的选择和浓度之外，还必须仔细选择湿法珠磨的参数。
本发明的一个实施方案是一种制备根据本发明的稳定纳米混悬剂的方法，其包括以下步骤：
a.将呈变型I的晶型的式(I)化合物悬浮在根据本发明的分散剂和一种或多种稳定剂中，其中一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂的溶解度极限；
b.湿法珠磨步骤a中产生的混悬剂，比能量输入为10,000kJ/kg或更高，应力强度为0.004·10-3Nm至1·10-3Nm。
本发明的一个实施方案是根据本发明任一实施方案的制备稳定纳米混悬剂的方法，其中分散剂选自水、伯醇、仲醇和叔醇以及多元醇。
本发明的一个实施方案是根据本发明任一实施方案的制备稳定纳米混悬剂的方法，其中一种或多种稳定剂选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)结合十二烷基硫酸钠(SDS)、乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物、十二烷基硫酸钠(SDS)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚山梨醇酯、羟丙基纤维素(HPC)、聚氧乙烯-35蓖麻油、聚氧乙烯15羟基硬脂酸酯、脱氧胆酸钠及其组合。
本发明的一个实施方案是根据本发明任一实施方案的制备稳定纳米混悬剂的方法，其中一种或多种稳定剂选自十二烷基硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮K10至K50结合十二烷基硫酸钠(SDS)、羟丙基甲基纤维素、聚山梨醇酯20-80及其组合。
本发明的一个实施方案是一种制备根据本发明的稳定纳米混悬剂的方法，其包括以下步骤：
a.将呈变型I的晶型的式(I)化合物悬浮在分散剂和一种或多种稳定剂中，所述分散剂选自水、伯醇、仲醇和叔醇以及多元醇，所述稳定剂选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)结合十二烷基硫酸钠(SDS)、乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物、十二烷基硫酸钠(SDS)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚山梨醇酯、羟丙基纤维素(HPC)、聚氧乙烯-35蓖麻油、聚氧乙烯15羟基硬脂酸盐、脱氧胆酸钠及其组合，其中一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂在混悬剂中的溶解度极限；
b.湿法珠磨步骤a中产生的混悬剂，比能量输入为10,000kJ/kg或更高，应力强度为0.004·10-3Nm至1·10-3Nm。
在本发明的含义内，“湿法珠磨”与“湿法球磨”同义使用，也与“湿法研磨”同义使用。可通过调整球/珠的直径来调整容量和细度。
优化包括研磨珠尺寸、研磨珠材料、尖端速度、研磨持续时间和研磨珠体积填充的研磨参数以获得根据本发明的纳米制剂。
在本发明的含义内，术语“研磨(milling)”与术语“研磨(grinding)”同义使用。
为了获得根据本发明的纳米制剂，需要足够的比能量输入和应力强度。如果能在足够稳定的情况下达到所需的粒径，则比能量输入和/或应力强度就足够了。如果粒径太高，则比能量输入和/或应力强度和/或稳定性都不够。
在本发明的含义内，比能量输入定义为与产品质量相关的净能量输入。
在本发明的含义内，应力强度是根据Kwade等人(1996)定义的。根据Kwade的说法，对于固定的比能量输入，存在最佳应力强度，从而获得最好的产品。随着比能量输入的增加并且从而增加产品细度，最佳应力强度降低。对于恒定的比能量输入，应力强度决定了产品的细度。
在本发明的含义内，“湿法珠磨”或“纳米研磨”定义为通过湿法介质研磨(纳米研磨)制备药物纳米颗粒。如本领域技术人员所知的，研磨珠用于“湿法珠磨”或“纳米研磨”。纳米研磨背后的基本原理是通过将测量为d90的粒径减小到800nm以下来增加API的表面积与体积比，通常在百至数百nm范围内，测量为d50。这种将药物颗粒转化为纳米晶体的过程允许与水发生更大的相互作用，从而提高溶解速率。一般而言，较小的颗粒溶解得更快。
根据本发明的一个实施方案，混悬剂的湿法珠磨在尺寸为0.05-0.8mm的研磨珠存在下进行。根据本发明的实施方案，研磨珠由选自陶瓷、玻璃、聚合物和钢的材料制成。在本发明的含义内，陶瓷的实例包括钇稳定的氧化锆、铈稳定的氧化锆和硅酸锆，例如烧结或熔合。玻璃的实例包括掺杂有氧化锆的玻璃。聚合物的实例包括聚苯乙烯。根据本发明的一个实施方案，研磨珠由钇稳定的氧化锆制成。根据本发明的一个实施方案，研磨珠的体积填充率(volumetric filling)为40-85％v/v。根据本发明的一个实施方案，研磨珠的体积填充率为50-85％v/v。根据本发明的一个实施方案，研磨珠的体积填充率为60-85％v/v。根据本发明的一个实施方案，研磨珠的体积填充率为60-80％v/v。
本发明的一个实施方案是根据本发明任一实施方案的制备稳定纳米混悬剂的方法，其中步骤b.在尺寸为0.05-0.8mm的研磨珠存在下进行。
本发明的一个实施方案是根据本发明任一实施方案的制备稳定纳米混悬剂的方法，其中步骤b.在由选自陶瓷、玻璃、聚合物和钢的材料制成的研磨珠存在下进行。
本发明的一个实施方案是根据本发明任一实施方案的制备稳定纳米混悬剂的方法，其中步骤b.中珠子的体积填充率为50-85％v/v。
10,000kJ/kg或更高的比能量输入和0.004·10-3Nm至1·10-3Nm的应力强度与例如尖端速度和研磨的持续时间相关。
根据本发明的一个实施方案，如果比能量输入为10,000kJ/kg或更高且应力强度为0.004·10-3Nm至1·10-3Nm，尖端速度的实例为8-15m/s或12-15m/s，研磨持续时间为10min至12h。根据本发明的一个实施方案，如果比能量输入为10,000kJ/kg或更高且应力强度为0.004·10-3Nm至1·10-3Nm，尖端速度的实例为8-15m/s，研磨持续时间为30min至8h。根据本发明的一个实施方案，如果比能量输入为10000kJ/kg或更高且应力强度为0.004·10-3Nm至1·10-3Nm，尖端速度的实例为8-15m/s，研磨持续时间为30min至6h。根据本发明的一个实施方案，如果比能量输入为10,000kJ/kg或更高且应力强度为0.004·10-3Nm至1·10-3Nm，尖端速度的实例为8-15m/s或12-15m/s，研磨持续时间为30min至2h。
根据本发明的一个实施方案，研磨珠由钇稳定的氧化锆制成，研磨珠的尺寸为0.05-0.6mm，研磨珠的体积填充率为60-80％，尖端速度为12-15m/s，研磨持续时间为60分钟。
本发明的一个实施方案是根据本发明任一实施方案的制备稳定纳米混悬剂的方法，其中步骤b.在具有0.05-0.8mm尺寸的研磨珠存在下进行，该研磨珠由选自陶瓷、玻璃、聚合物和钢的材料制成，并且其中步骤b.中研磨珠的体积填充率为50-85％v/v。
本发明的一个实施方案涉及在湿法珠纳米研磨之前的另一步骤，执行该步骤以破坏粗颗粒并改善后续纳米研磨步骤的结果。粗颗粒可能会被例如微粉化或使用尺寸为1-2mm的珠子的湿法珠磨破坏。
本发明的一个实施方案是制备根据本发明任一实施方案的稳定纳米混悬剂的方法，其中在步骤a.中，将呈变型I的晶型的式(I)化合物在第一步中微粉化，然后将其悬浮在分散剂和一种或多种稳定剂中。
本发明的一个实施方案是制备根据本发明任一实施方案的稳定纳米混悬剂的方法，其中在步骤a.中，在第一个湿法珠磨步骤中在尺寸为1-2mm的研磨珠存在下研磨呈变型I的晶型的式(I)化合物，然后将其悬浮在分散剂和一种或多种稳定剂中。
本发明的一个实施方案是制备根据本发明任一实施方案的稳定纳米混悬剂的方法，其包含以下步骤：
a.在第一步中将呈变型I的晶型的式(I)化合物微粉化，然后将其悬浮在选自水、伯醇、仲醇和叔醇以及多元醇的分散剂和一种或多种选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)结合十二烷基硫酸钠(SDS)、乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物、十二烷基硫酸钠(SDS)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚山梨醇酯、羟丙基纤维素(HPC)、聚氧乙烯-35蓖麻油、聚氧乙烯15羟基硬脂酸酯、脱氧胆酸钠及其组合的稳定剂中，其中一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂在混悬剂中的溶解度极限；
b.湿法珠磨步骤a中产生的混悬剂，比能量输入为10,000kJ/kg或更高，应力强度为0.004·10-3Nm至1·10-3Nm，其中使用的研磨珠的尺寸为0.05-0.8mm。
本发明的一个实施方案是根据本发明任一实施方案的制备稳定纳米混悬剂的方法，其包含以下步骤：
a.在第一个湿法珠磨步骤中，在尺寸为1-2mm的研磨珠存在下研磨呈变型I的晶型的式(I)化合物，然后将其悬浮在选自水、伯醇、仲醇和叔醇以及多元醇的分散剂和一种或多种选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)结合十二烷基硫酸钠(SDS)、乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物、十二烷基硫酸钠(SDS)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚山梨醇酯、羟丙基纤维素(HPC)、聚氧乙烯-35蓖麻油、聚氧乙烯15羟基硬脂酸酯、脱氧胆酸钠及其组合的稳定剂中，其中一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂在混悬剂中的溶解度极限；
b.湿法珠磨步骤a中产生的混悬剂，比能量输入为10,000kJ/kg或更高，应力强度为0.004·10-3Nm至1·10-3Nm，其中使用的研磨珠的尺寸为0.05-0.8mm。
本发明的一个实施方案是一种制备根据本发明的稳定纳米混悬剂的方法，其包含以下步骤：
a.将呈变型I的晶型的式(I)化合物悬浮在根据本发明的分散剂和一种或多种稳定剂中，其中一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂在混悬剂中的溶解度极限；
b.湿法珠磨步骤a中产生的混悬剂，比能量输入为15,000kJ/kg或更高、或20,000kJ/kg或更高、或25,000kJ/kg或更高，应力强度为0.004·10-3Nm至1·10-3Nm。
本发明的一个实施方案是一种制备本发明的稳定纳米混悬剂的方法，其包含以下步骤：
a.将呈变型I的晶型的式(I)化合物悬浮在选自水、伯醇、仲醇和叔醇以及多元醇的分散剂和一种或多种选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)结合十二烷基硫酸钠(SDS)、乙烯基吡咯烷酮醋酸乙烯酯共聚物、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物、十二烷基硫酸钠(SDS)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚山梨醇酯、羟丙基纤维素(HPC)、聚氧乙烯-35蓖麻油、聚氧乙烯15组合羟基硬脂酸盐、脱氧胆酸钠及其组合的稳定剂中，其中一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂在悬浮液中的溶解度极限；
b.湿法珠磨步骤a中产生的混悬剂，比能量输入为10,000kJ/kg或更高，或15,000kJ/kg或更高，或20,000kJ/kg或更高，或25,000kJ/kg或更高，应力强度为0.004·10-3Nm至1·10-3Nm，其中使用的研磨珠的尺寸为0.05-0.8mm。
众所周知，降低API的粒径可能会导致溶解速度增加，因此会导致更高的生物利用度，并可能影响食物效应的程度。然而，用于减小粒径的工艺的选择、工艺设备参数的选择，即制备稳定纳米混悬剂和稳定纳米颗粒，以及药物纳米混悬剂的最佳稳定剂的选择具有挑战性并且相对于现有技术是非显而易见的。
比能量输入的上限与研磨过程引起的式(I)化合物的非晶化程度有关。应避免完全非晶化，因为在那种情况下式(I)化合物的晶体结构完全丧失并且重结晶以不受控制的方式发生。如图5a至c所示，出人意料的是，在湿法珠纳米研磨过程中，呈变型I的晶型的式(I)化合物没有发生非晶化。
研磨机的选择对于生产纳米颗粒是决定性的。纳米研磨必须作为湿法珠磨进行，例如在行星式研磨机或搅拌介质研磨机中。相比之下，气流研磨机——使用的另一种类型的研磨机，例如用于微粉化——进行干磨。气流研磨机适用于将颗粒研磨至微米范围。气流研磨机中的研磨作用是由多个空气或蒸汽喷射流驱动的颗粒之间的高速碰撞产生的。干磨不适合生产纳米颗粒。
本公开的主题是包含呈变型I的晶型的式(I)化合物的颗粒和一种或多种稳定剂，式(I)化合物：一种或多种稳定剂的比例为16:1至1:2w/w，其中所述颗粒以干燥形式的平均粒径(以d50表示)为500nm或更小。
本发明的一个实施方案是干燥的纳米颗粒，其包含呈变型I的晶型的式(I)化合物和一种或多种稳定剂，式(I)化合物:一种或多种稳定剂的比例为16:1至1:2w/w，其中纳米颗粒的平均粒径(以d50表示)为500nm或更小。
本发明的一个实施方案是干燥的纳米颗粒，其包含呈变型I的晶型的式(I)化合物和两种稳定剂PVP和SDS的组合，式(I)的化合物：PVP的比例为16:1至1:2w/w，SDS的浓度为0.1-0.2％w/v，其中纳米颗粒的平均粒径(以d50表示)为500nm或更小。
本发明的一个实施方案是干燥的纳米颗粒，其包含呈变型I的晶型的式(I)化合物和两种稳定剂的环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物和SDS组合，式(I)化合物：环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物的比例为16:1至1:2w/w，SDS的浓度为0.1-0.2％w/v，其中纳米颗粒的平均粒径(以d50表示)为500nm或更小的平均粒径。
在本发明的含义内，术语“干燥的”或“以干燥形式的”，例如在术语“干燥的纳米制剂”或“以干燥形式的(纳米)颗粒”或“干燥形式的以d50表示的平均粒径为500nm或更小的(纳米)颗粒”定义为根据本发明的纳米混悬剂，其已通过干燥步骤转变为固态。干燥的纳米制剂或纳米颗粒仍含有一种或多种稳定剂，但不再含有分散剂。通过进行干燥步骤除去分散剂。
本公开的主题是用本发明的以干燥形式的纳米混悬剂制成的固体形式的药物组合物，其通过制药工艺制备，任选地包括造粒，并且包括压制和包衣。
本公开的主题是用本发明的以干燥形式的纳米混悬剂制成的固体形式的药物组合物，其通过制药工艺制备，包括造粒、压制和包衣。
根据本发明的一个实施方案，根据本发明的纳米混悬剂的干燥可以通过喷雾干燥或通过流化床造粒的伴随造粒来进行。
固体剂型的生产可以通过湿法造粒工艺(高剪切造粒或流化床造粒)进行。高剪切造粒是湿法造粒的成型工艺。使用混合工具和切碎机将粘合剂液体送入密闭容器中的粉末颗粒中。通过由此产生的液体和固体桥形成致密颗粒。流化床造粒也是一种湿法造粒工艺，包括将粘合剂液体添加到原始颗粒中以形成聚集颗粒。当粘合剂液体从顶部喷淋时，颗粒从底部流化。
根据本发明的一个实施方案，顶部喷淋造粒用于流化床造粒。
压片优选用最初生产的颗粒进行。然后可以是固体剂型的包衣。
在湿法造粒中，活性化合物产品悬浮在造粒液体中。使用的造粒液体含有溶剂、亲水性粘合剂和润湿剂。亲水性粘合剂分散在造粒流体中或优选溶解在其中。可用于造粒液体的溶剂包括有机溶剂，例如乙醇或丙酮或水或其混合物。优选使用水作为溶剂。所使用的亲水性粘合剂是药学上可接受的亲水性添加剂，优选溶解在造粒流体溶剂中的那些。此处优选使用亲水性聚合物，如羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基纤维素(HPC)、低取代羟丙基纤维素(L-HPC)、羟丙基纤维素LF、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物(例如VA64、BASF)、明胶、瓜尔豆胶、部分水解淀粉、藻酸盐或黄原胶。特别优选使用羟丙基甲基纤维素(HPMC)作为亲水性粘合剂。亲水性粘合剂以1％至12％(基于药物剂型的总质量)，优选1％至6％的浓度存在。使用的润湿剂是药学上可接受的化合物，如十二烷基硫酸钠、聚山梨醇酯、聚乙二醇(15)-羟基硬脂酸酯或聚乙二醇十六烷基醚。
湿法造粒的预混物含有其他药学上可接受的添加剂，例如填充剂、粘合剂和崩解促进剂(崩解剂)。填充剂和粘合剂例如是纤维素粉末、微晶纤维素、硅化微晶纤维素、羟丙基纤维素、乳糖一水合物、甘露醇、麦芽糖醇、山梨糖醇和木糖醇，优选微晶纤维素或甘露糖醇或微晶纤维素和甘露醇/乳糖一水合物的混合物。崩解促进剂(崩解剂)例如是羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素、交联聚维酮(交联聚乙烯吡咯烷酮)、低取代羟丙基纤维素(L-HPC)、羧甲基淀粉钠、马铃薯淀粉乙醇酸钠、部分水解淀粉、小麦淀粉、玉米淀粉、大米淀粉和马铃薯淀粉。
随后将获得的颗粒转化为固体剂型。添加的药学上可接受的添加剂例如是润滑剂、助流剂、流动调节剂和崩解促进剂(崩解剂)。润滑剂、助流剂、流量调节剂例如是富马酸、硬脂酸、硬脂富马酸钠、硬脂酸镁、更高分子量的脂肪醇、淀粉(小麦、大米、玉米或马铃薯淀粉)、滑石粉、高分散性(胶体)二氧化硅和甘油二硬脂酸酯。崩解促进剂(崩解剂)例如是羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素(croscarmellose)(交联羧甲基纤维素(crosslinkedcarboxymethylcellulose))、交联聚维酮(交联聚乙烯吡咯烷酮)、低取代羟丙基纤维素(L-HPC)、羧甲基淀粉钠、部分水解淀粉、小麦淀粉、玉米淀粉、大米淀粉和马铃薯淀粉。
在进一步的步骤中，在本领域技术人员熟悉的常规条件下任选地对固体剂型进行包衣。包衣通过加入包衣剂和成膜剂如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(例如羟丙基甲基纤维素5cP或15cP)、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物(例如VA64、BASF)、虫胶、甘油三乙酸酯、柠檬酸三乙酯、作为抗粘附剂的滑石粉和/或着色剂/颜料如二氧化钛、氧化铁、靛蓝或合适的有色涂料。
本发明的一个实施方案包括固体剂型，其含有呈纳米颗粒形式的式(I)化合物的活性化合物产物，并且还含有微晶纤维素、乳糖一水合物、羟丙基甲基纤维素3cP和/或5cP、十二烷基硫酸钠或聚山梨醇酯20、交联羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁、滑石粉、氧化铁和二氧化钛。纳米颗粒仍含有一种或多种稳定剂，但通过干燥除去分散剂。
本发明的另一个实施方案包括含有式(I)化合物的活性化合物产物的固体剂型，其通过根据本发明的纳米颗粒形成方法生产，其中固体剂型含有1.25至20mg的式(I)化合物的活性化合物产物/固体剂型。其他实施方案包括固体剂型，其含有1.25mg、2.5mg、5.0mg、7.5mg、10mg、12.5mg、15mg、17.5mg或20mg通过根据本发明的方法生产的式(I)化合物的活性化合物产物/固体剂型。
本发明的一个实施方案是包含呈变型I的晶型的式(I)的{4,6-二氨基-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}氨基甲酸甲酯化合物的干燥纳米颗粒，其特征在于该化合物的X射线衍射图在5.9、6.9、22.7处显示出2θ角的峰值最大值，以及一种或多种稳定剂，比例为式(I)化合物：一种或多种稳定剂为16:1至1:2w/w，其中干燥的纳米颗粒的平均粒径(以d50表示)为500nm或更小。
本发明的一个实施方案是呈固体形式的药物组合物，其包含呈变型I的晶型的式(I)的{4,6-二氨基-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}氨基甲酸甲酯的干燥纳米颗粒，其特征在于该化合物的X射线衍射图在5.9、6.9、22.7处显示出2θ角的峰值最大值，以及一种或多种根据本发明的纳米颗粒制成的平均粒径(以d50表示)为500nm或更小的稳定剂。
本发明的一个实施方案是根据本发明的药物组合物，其中固体形式选自颗粒剂和片剂。
本发明的一个实施方案是根据本发明的干燥纳米颗粒或药物组合物，其中干燥纳米颗粒或药物组合物不含分散剂。
除了在水/生物相关介质中的溶解度外，纳米制剂中的稳定剂还必须满足其他重要特性。它们需要确保纳米混悬剂的短期稳定性，以防止(重新)聚集。这种性质对于纳米制剂工艺是不可避免的，并且是在研磨工艺中生产纳米颗粒的基本要求。此外，稳定剂需要确保纳米混悬剂的长期稳定性。一旦产生了纳米混悬剂，这种混悬剂必须在一个明显的时间跨度内保持稳定，直到可以进行干燥。在那段时间内必须通过适当选择稳定剂来抑制重新聚集、晶体生长(奥斯特瓦尔德熟化)和沉淀。此外，必须确保在干燥材料复原后仍存在纳米尺寸的颗粒。在喷雾干燥过程中，纳米混悬剂几乎瞬间转变为固体颗粒。这种相变暗示了活性化合物的纳米颗粒发生变化的可能性，包括在聚合物中的熔化、聚集或溶解。通过确定合适的喷雾干燥参数和合适的赋形剂，必须确保活性化合物的颗粒在干燥材料溶解后保持为分离的纳米颗粒。
另一个障碍和挑战是将含有{4,6-二氨基-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}氨基甲酸甲酯(维利西呱，式(I)化合物)的纳米混悬液进一步加工为颗粒剂和片剂作为最终剂型。潜在的粒径增加或颗粒生长也可能发生在后续加工过程中，例如造粒和压缩，并可能导致与药物纳米颗粒相关的高表面积损失，从而降低纳米研磨过程的显著益处。
如图6-11所示，根据本发明的稳定纳米混悬剂和由它们制成的干燥药物形式导致药物释放增加。在纳米混悬剂以及由它们制成的颗粒剂和片剂中观察到了这种情况。不仅在0.01N HCl中观察到药物释放增加，而且在生物等效介质(FeSSIF)中也观察到药物释放增加。仅含有微粉化(图12a)的式(I)化合物的颗粒的共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)照片清楚地显示代表式(I)荧光化合物的光斑。相比之下，如图12b所示，微粉化和纳米研磨的式(I)化合物的CLSM照片清楚地显示了没有光斑的更光滑的表面。这些图片清楚地表明在微粉化和纳米研磨后保留的纳米颗粒。
最后，必须确保纳米颗粒在由纳米混悬剂制成的固体制剂中被保留，并且纳米颗粒在重新悬浮时仍然存在于吸收部位。如表7和8中所示，纳米尺寸的颗粒在通过干燥纳米混悬剂获得的干燥材料重构后仍然存在，这取决于所使用的赋形剂/稳定剂的性质和用量。
可以将纳米混悬剂转换为固态并同时保持干燥纳米混悬剂的优异生物利用度的事实是相对于现有技术的出人意料的效果。
本发明的一个实施方案是包含在根据本发明的分散剂中的呈变型I的晶型的式(I)化合物和一种或多种稳定剂的稳定纳米混悬剂，其用于治疗和/或预防心力衰竭、慢性心力衰竭恶化、射血分数降低的慢性心力衰竭恶化、射血分数保留的慢性心力衰竭恶化、心绞痛、高血压、肺动脉高血压、缺血、血管疾病、认知障碍、肾衰竭、血栓栓塞性疾病、纤维化疾病和动脉硬化。
本发明的一个实施方案是包含在根据本发明的分散剂中的呈变型I的晶型的式(I)化合物和一种或多种稳定剂的干燥纳米颗粒，其用于治疗和/或预防心力衰竭、慢性心力衰竭恶化、射血分数降低的慢性心力衰竭恶化、射血分数保留的慢性心力衰竭恶化、心绞痛、高血压、肺动脉高血压、缺血、血管疾病、认知障碍、肾衰竭、血栓栓塞性疾病、纤维化疾病和动脉硬化。
本发明的一个实施方案是包含在根据本发明的分散剂中的呈变型I的晶型的式(I)化合物和一种或多种稳定剂的呈固体形式的药物组合物，其用于治疗和/或预防心力衰竭、恶化的慢性心力衰竭、恶化的射血分数降低的慢性心力衰竭、恶化的射血分数保留的慢性心力衰竭、心绞痛、高血压、肺动脉高压、缺血、血管疾病、认知障碍、肾衰竭、血栓栓塞性疾病、纤维化疾病和动脉硬化。
本发明的一个实施方案是用于治疗和/或预防人或动物心力衰竭、恶化的慢性心力衰竭、恶化的射血分数降低的慢性心力衰竭、恶化的射血分数保留的慢性心力衰竭、心绞痛、高血压、肺动脉高压、缺血、血管疾病、认知障碍、肾衰竭、血栓栓塞性疾病、纤维化疾病和动脉硬化的方法，其通过给予有效量的以固体形式的药物组合物，该药物组合物由包含在根据本发明的分散剂中呈变型I的晶型的式(I)化合物和一种或多种稳定剂的纳米混悬剂制成。
与仅具有式(I)化合物的微粉化材料的甲基纤维素悬浮液相比，在大鼠研究中显示了这种纳米混悬剂的改善的生物利用度。混悬剂即使在流化床造粒机中干燥后，纳米级对提高生物利用度的影响仍然可以保持，这是一个非常敏感的生产步骤，容易发生API颗粒聚集或奥斯特瓦尔德熟化，因此有失去纳米颗粒益处的风险。使用颗粒剂和迷你片剂在大鼠中进行了相对生物利用度的研究。如实施例5、表3、实施例6、表5-7和图6-11所示，与微粉化起始材料相比，用于加工的具有纳米级起始材料的制剂在体外和体内产生更高的生物利用度。
由于式(I)化合物(维利西呱)的溶解限制行为，临床前和临床研究中的生物利用度随着剂量的增加而降低。使用纳米制剂，受溶解速度限制的生物利用度通常可以增加，并且可以避免食物效应。
所示数据相较于现有技术出人意料，因为无法预期使用SDS作为稳定剂开发稳定的纳米混悬剂。此外，出人意料的是，稳定剂的选择是通过湿法珠磨生产纳米颗粒的关键工艺参数。使用SDS代替维生素E TPGS作为稳定剂的优越性表现在研磨后较小的粒径和没有非晶化，这两者均导致较小的纳米颗粒作为增加生物利用度的重要参数，这相较于现有技术也出人意料。
实验中使用的化合物(I)：SDS的比例为2:1。化合物(I)的含量为2％，因此SDS的含量为1％。SDS的临界胶束浓度(CMC)为0.23％或8.2mM。因此，实验中使用的SDS浓度是其CMC的4倍以上。因此，为了实现根据本发明的稳定纳米制剂所使用的表面活性剂(例如SDS)的浓度明显高于临界胶束浓度(CMC)。如现有技术中所述，明显高于CMC的表面活性剂浓度被认为会加速奥斯特瓦尔德熟化。因此出人意料的是，在本发明中，没有观察到奥斯特瓦尔德熟化。
在API/SDS浓度范围为8:1至2:1w/w的情况下，用十二烷基硫酸钠(SDS)对纳米颗粒进行物理稳定。出人意料的是，与以SDS作为稳定剂的类似生产的纳米颗粒相比，从现有技术已知的用维生素E TPGS稳定的纳米颗粒在较高的粒径和较差的生物利用度方面显示出较差的结果，如图1和实施例5、表3、实施例6、表4-6和图10所示。
在第一步中，对稳定剂的广泛筛选表明，并非文献中描述的所有赋形剂都适合生产这种化合物的纳米混悬剂。人血清白蛋白、鸡蛋卵磷脂、醋酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素(HPMC-AS)或油酸钠会产生颗粒过大或聚集现象的不良产品。
根据本发明的稳定纳米混悬剂和纳米颗粒的有益效果是增加式(I)化合物的生物利用度。
实施例
缩写词
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湿法珠磨设备
方法A：行星式磨
实施例1的大部分筛选实验是在Pulverisette 5型行星式珠磨机(PBM)中进行的。对于样品制备，将微粉化的式(I)化合物预分散在聚合物表面活性剂水溶液中并转移到填充有研磨珠的研磨室(PET 23ml)。溶液中所含的水用作分散剂。使用来自Sigmund Lindner(德国)的堆积密度为3.9kg/l的氧化锆(钇稳定)作为研磨介质(0.4-0.6mm)。研磨珠填充水平为研磨室体积的60％。注意不要在研磨室中留下任何空气夹杂物，因为这会对研磨过程产生负面影响。研磨时间为90分钟，每分钟400转。每次研磨操作可以将四个研磨室送入PBM。因此，在研磨介质分离后，每个研磨过程可产生约40-45g混悬液。
方法B：搅拌介质磨
为了生产更高量的纳米混悬液(例如用于动物试验)，使用picoliq(HosokawaAlpine)或Netzsch Labstar搅拌介质磨。
通过在研磨室体积为19ml的Hosokawa Picoliq型搅拌介质研磨机中湿法研磨微粉化的式(I)化合物来制备药物纳米混悬剂。用搅拌器进行研磨。转速为10000rpm。研磨介质与PBM中的相同，包括使用水作为分散剂。研磨介质填充水平为研磨室体积的80％。研磨机以批处理模式运行。研磨13.6g悬浮液。整个系统由低温恒温器冷却，因此研磨期间在研磨室出口处测得最高为29℃。
或者，药物纳米混悬剂通过在研磨室体积为120ml的Netzsch LabStar型搅拌介质研磨机中湿法研磨微粉化的式(I)化合物来制备。用盘式搅拌器进行研磨。转速为2770rpm。研磨介质与PBM中的相同。研磨介质填充水平为研磨室体积的80％。研磨机以循环模式运行。进料容器共装1L，研磨600g悬浮液，相当于约500ml。整个系统由低温恒温器冷却，因此在研磨室出口处测得最高为23℃。
在搅拌介质研磨机中通过湿法珠磨制备纳米颗粒的比能量需求至少为10,000kJ/kg。应力强度(根据Kwade等人，1996年)为0.004·10-3Nm至1·10-3Nm。
实施例1
纳米混悬剂的筛选实验
将呈变型I的晶型的{4,6-二氨基-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}氨基甲酸甲酯在根据实施例1-3的湿法珠磨工艺中将其研磨至纳米级的粒径(研磨后的d50<200nm)。
图1显示了在行星式研磨机中应用湿法珠磨工艺后的筛选实验结果。根据WO2013/076168的实施例13，方法E制备呈变型I的晶型的式(I)化合物。在纳米研磨之前，将呈变型I的晶型的式(I)化合物微粉化。对于筛选实验，测试了许多不同的制剂。对于这些实验，研磨的持续时间为60分钟。所使用的研磨珠的材料为ZrO2，研磨珠的尺寸为0.5mm(0.4-0.6mm)。
在第一步中，对稳定剂的广泛筛选表明，并非文献中描述的所有赋形剂都适合生产这种化合物的纳米混悬剂。结果发现，十二烷基硫酸钠(SDS)和维生素E TPGS作为单一稳定剂以及两种稳定剂如表面活性剂和聚合物(例如SDS+聚乙烯吡咯烷酮K17(PVP K17))的组合显示出最佳效果。E PO、鸡蛋卵磷脂、聚乙酸乙烯酯(PVA)、油酸钠和人血清白蛋白(HSA)因各种原因不适用于纳米研磨。人血清白蛋白、鸡蛋卵磷脂、醋酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素(HPMC-AS)或油酸钠会导致产生颗粒过大或聚集现象的不良产品。
化合物(I)：一种或多种稳定剂的比例为16:1至1:2w/w或8:1至2:1w/w。在使用两种稳定剂如表面活性剂和聚合物(例如SDS加聚乙烯吡咯烷酮或SDS加环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物)的组合的情况下，化合物(I)：聚合物的比例为16:1至1:2w/w或8:1至2:1w/w，表面活性剂浓度为0.1-0.2％w/v。
同时，引入新API质量的呈变型I的晶型的式(I)化合物，其根据WO2020126983(在本申请的首次申请日之后公开)合成，并微粉化。因此，以这种新的API质量重复筛选，结果可以重现(图1b)。
因为SDS也用于进一步的造粒过程，所以它是进一步研究的首选稳定剂。然而，PVPVA 64、d-α生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(维生素E TPGS)、EL、PVP K30和羟丙基纤维素(HPC)也用于Picoliq研磨机中的进一步研究。
实施例2
纳米混悬剂的稳定性测试
a)研磨后的直接粒径和经过至少7天后的粒径
这些实验的目的是评估纳米混悬剂在至少7天内的稳定性。进一步评估了研磨是否会引起颗粒分解。对于纳米研磨，应用以下参数：微粉化化合物(I)：稳定剂＝2:1，混悬剂中化合物(I)的含量为2％，研磨珠材料为钇稳定的ZrO2，研磨珠尺寸为0.4-0.6mm，持续研磨时间为60分钟，Picoliq研磨机。
表1：研磨后直接和在环境条件下保存7天后通过动态光散射(DLS)测量纳米研磨的维利西呱(Picoliq研磨机)的粒径测量结果(以d95计)
结果表明，尽管大多数分散体是稳定的，但颗粒尺寸存在一些小的差异。然而，HPC制剂显示在环境温度下7天后d95显著增加。
b)超过13周的颗粒生长长期测量
在高温下测量在实施例1的筛选中获得的不同纳米颗粒的稳定性长达13周。研磨条件如下：化合物(I)：稳定剂＝8：1；研磨珠的体积填充率为60％；研磨珠材料为ZrO2，研磨珠尺寸为0.4-0.6mm；研磨持续时间为60分钟；研磨机：行星式研磨机，在40℃和75％rh下保存。通过动态光散射(DLS)测量纳米混悬剂的粒径分布。DLS使用Zetasizer Nano-ZS(来自Malvern Analytical)以合适的浓度(例如0.2mg/mL，用软化水稀释)进行。作为回应，获得Dn(50)和多分散指数(PDI)。结果如图2所示。
实施例3
按比例扩大纳米混悬剂的制备
纳米混悬剂开发的下一步是按比例扩大。为此，至少必须解决两个问题：
在第一步中，式(I)化合物维利西呱在纳米混悬剂中的浓度必须从2％增加到20％。这主要是为了减少干燥工作和处理时间。2％的悬浮液太稀，不适合流化床造粒。这些实验是在行星式研磨机中进行的。
在图3中显示了行星式研磨机中这些实验的结果。“LD粒径”表示通过静态光散射(SLS)测量的粒径。在实验过程中，很明显，由于凝胶化，SDS的浓度不可能高于5％。因此，对于纳米混悬剂中更高浓度的式(I)化合物，必须改变式(I)化合物：稳定剂的比例以有利于更高的API份额。粒径测量表明，在不显著增加粒径的情况下，纳米混悬剂中式(I)化合物的更高浓度是可能的，最高可达20％。相反，随着式(I)化合物浓度的增加和化合物(I)：稳定剂的比例增加，d90值甚至略有下降。
实验表明增加化合物(I)的浓度是可能的。但是，应当考虑从较低浓度的稳定剂开始。(见上文，实施例3)
在第二步中，该方法必须转移到更大的研磨机中才能生产更多的产品。为此，该工艺被转移到尺寸为120ml的Netzsch Labstar研磨机中。生产了60g纳米混悬剂，用于在流化床造粒(FBG)中进一步加工。该实验是使用Netzsch研磨机以批处理模式完成的。本实验的结果如图4所示。
中值粒径为120nm。通过流化床造粒进一步处理混悬剂。
实施例4
在Picoliq研磨机中湿法珠磨后的呈变型I的晶型的化合物(I)
为了分析用于生产纳米混悬剂的湿法珠磨工艺中使用的呈微粉化的变型I的晶型的化合物(I)是否在湿式珠磨过程中发生非晶化，在Picoliq研磨机中在不同的条件下通过湿法珠磨生产三种纳米混悬剂，如表2所示：
表2：
这三种纳米混悬剂的XRPD分析显示在图5a至5c中。XRPD分析表明，在湿法珠磨过程中，即使在高机械应力(例如长研磨持续时间和高转速)下，呈变型I的晶型也得以保存，如混悬剂3所示。
实施例5
将纳米混悬剂进一步加工成颗粒剂和片剂
使用湿法造粒技术(流化床造粒)来改进所使用的预混物。将活性化合物悬浮在造粒液体中并喷雾在预混物上以使活性化合物均匀分布在所得颗粒中。
直至最终片剂配方的工艺步骤
研究粒径对{4,6-二氨基-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}氨基甲酸甲酯(维利西呱，化合物(I))生物利用度的影响，使用含有先微粉化后纳米研磨的原料药(drug substance)的混悬剂和含有仅微粉化的原料药的混悬剂制备了几种制剂。这些混悬剂的组成将在下一段中概述。在本发明的上下文中，例如通过在螺旋气流研磨机或流化床对置气流研磨机中粉碎来进行微粉化。
第一步—用微粉化药物制备混悬剂：为了将微粉化原料药掺入混悬液中，将粘合剂羟丙基甲基纤维素(HPMC 5Cp)和润湿剂十二烷基硫酸钠(SDS)溶解在水中。获得澄清溶液后，将微粉化{4,6-二氨基-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}氨基甲酸甲酯(维利西呱，化合物(I))悬浮在该粘合剂溶液中并均匀分布(对照表3，“混悬剂”)。
第二步—使用含有微粉化药物的混悬剂制备颗粒剂：为了产生颗粒剂，使用流化床造粒技术将所得混悬剂喷雾到填料纤维素微晶(Avicel PH 101)和乳糖一水合物以及一部分崩解剂交联羧甲基纤维素钠(AcDiSol)的预混物上。将颗粒剂干燥并过筛(筛孔尺寸0.8mm)(对照表3，“颗粒剂”)。
第三步—基于含有微粉化原料药的颗粒剂制备片剂：将所得颗粒剂与崩解剂交联羧甲基纤维素钠的第二部分和润滑剂硬脂酸镁分两步进行后混合。将一部分这种即用型混合物压制成片剂(直径为9mm的圆形)或迷你片剂(直径为1.2mm)(对照表3，“片剂”)。
使用这3步程序，生产了两个不同批次的剂量不同的片剂(对照表3，批次2和4)。
对于使用微粉化加纳米研磨的原材料，实施了一种类似的方法。
第一步—用微粉化加纳米研磨的原材料制备混悬剂：为了将用十二烷基硫酸钠(SDS)物理稳定的微粉化加纳米研磨的化合物(I)掺入颗粒中，取微粉化加纳米研磨的化合物(I)和十二烷基硫酸钠(SDS)的水性混悬剂并与羟丙基甲基纤维素(HPMC 5cP)在水中的水溶液以下表3中给出的相对量混合。在所用的水量中，30％用于制备纳米颗粒，70％用于制备粘合剂水溶液(HPMC 5cP)(对照表3，“混悬剂”)。
第二步—使用微粉化加纳米研磨的原料药的混悬剂制备颗粒剂：使用流化床造粒技术将所得混悬剂喷雾到填料纤维素微晶和乳糖一水合物以及一部分崩解剂交联羧甲基纤维素钠(AcDiSol)的预混物上。将颗粒剂(预混和)干燥并过筛(筛孔尺寸0.8mm)(对照表3，“颗粒剂”)。颗粒剂含有干燥形式的纳米颗粒。在干燥步骤中除去分散剂(此处：水)。
第三步—基于含有微粉化加纳米研磨的原料药的颗粒剂制备片剂：将所得颗粒剂与崩解剂交联羧甲基纤维素钠(AcDiSol)的第二部分和润滑剂硬脂酸镁分两步进行后混合。将一部分这种即用型混合物压制成片剂(直径为9mm的圆形)。对于在大鼠体内给药片剂的研究(实施例6b)，将迷你片剂压缩(直径为1.2毫米)(对照表3，“片剂”)。片剂含有干燥形式的纳米颗粒，不再含有分散剂(此处：水)。
使用此3步程序，使用微粉化和纳米研磨的化合物(I)制备了两个不同批次的片剂，仅在剂量强度上有所不同(对照表3，批次1和3)。
表3：含有使用微粉化和纳米研磨的原料药的化合物(I)(维利西呱)的片剂的组成(mg/片，直径9mm)
第3批和第4批生产的颗粒(15mg剂量强度)通过流式(flow through)实验(n＝2±SD(每个细胞1mg API，2ml/min流速))在小型流通池(flow through cell)溶解装置(USPConvention 2011,Revision Bulletin,Official February 1,2012,General Chapter<711>Dissolution)中在三种不同介质(磷酸盐缓冲液pH 6.8、FaSSIF和FeSSIF)中进行表征。结果总结在图6和图7中。
图6和图7清楚地表明，相较于仅微粉化(是研究批次中的唯一差异)的化合物(I)(维利西呱)(根据表3的组合物)制成的颗粒剂，使用微粉化加纳米研磨的化合物(I)(维利西呱)制成的颗粒剂的药物释放增加。微粉化加纳米研磨的化合物(I)(维利西呱)的这种优势与所测试的介质无关。
此外，所有4个生产批次的片剂(对照表3)使用USP II桨式装置(USP Convention2011,Revision Bulletin,Official Feb 1,2012,711Dissolution)与900mL 0.01N HCl以75rpm混合，通过药物溶解行为进行表征。给出了图8中10mg剂量和图9中15mg剂量的比较。
相较于微粉化原料药的两个批次，微粉化加纳米研磨的化合物(I)维利西呱的两个片剂批次中溶解药物的百分比更高，与所研究的剂量强度无关。
此外，将15mg含有微粉化加纳米研磨或仅微粉化的化合物(I)(维利西呱)的片剂(含有根据表4的组合物)使用USP II桨式装置(USP Convention 2011,RevisionBulletin,Official Feb 1,2012,711Dissolution)与500mL FeSSIF以75rpm混合，通过药物溶解行为进行表征。溶解数据如图11所示。数据清楚地表明，相较于仅微粉化的化合物(I)(维利西呱)(是研究批次中的唯一差异)，使用微粉化加纳米研磨的化合物(I)(维利西呱)的药物释放增加。
表4：含有使用微粉化和微粉化加纳米研磨的原料药的化合物(I)(维利西呱)的片剂的组成(mg/片，直径9mm)
实施例6
体内实验
a)纳米混悬剂
根据德国动物保护法，所有体内研究均在插入导管的雄性Wistar大鼠(n＝3)中进行。以不同的剂型(混悬剂、颗粒剂、迷你片剂)给予三种剂量：0.3、1.0和3.0mg/kg(对于颗粒剂：最高剂量为2.1mg/kg)，将治疗剂量范围包括起来。溶液和混悬剂的应用体积为5mL/kg。在给药后48小时内收集血浆样品并通过LC-MS/MS进行分析。使用标准PK软件从血浆浓度-时间曲线估计药代动力学参数。相对生物利用度比较了通过相同给药途径以标准化剂量施用的两种不同制剂，并计算为从不同研究组获得的AUC比率。
作为比较，试验化合物(化合物(I))以含有化合物(I)的溶液口服给药，其不可能在体内沉淀(100％PEG或PEG/EtOH/水(40/10/50，V/V/V))。作为崩解标准片剂的替代物，给予含有0.5％甲基纤维素溶液的混悬剂，其中化合物以微粉化材料悬浮。以下两种纳米混悬剂在不同剂量强度下进行测试：
a)SDS稳定的纳米混悬剂
a.0.6mg/mL微粉化加纳米研磨化合物(I)+0.3mg/mL SDS溶液
b.1mg/mL微粉化加纳米研磨化合物(I)+0.5mg/mL SDS溶液
c.6mg/mL微粉化加纳米研磨化合物(I)+3mg/mL SDS溶液
b)维生素E TPGS稳定的纳米混悬剂
a.0.6mg/mL微粉化加纳米研磨化合物(I)+0.3mg/mL维生素ETPGS溶液
b.1mg/mL微粉化加纳米研磨化合物(I)+0.5mg/mL维生素E TPGS溶液
c.6mg/mL微粉化加纳米研磨化合物(I)+3mg/mL维生素E TPGS溶液
在动物研究之后，检查所施用的纳米悬浮剂的粒径以验证没有发生粒径的关键变化。纳米混悬剂的生物利用度见表5。
表5：纳米混悬剂的生物利用度
b)颗粒剂和片剂
基于微米混悬剂或纳米混悬剂的颗粒剂(通过流化床造粒，使用微粉化或微粉化加纳米研磨形式的化合物(I)制备)以小胶囊形式给药(由于填充体积有限，剂量：0.3和2.1mg/kg，组成见表3)。由上述颗粒剂制成的迷你片剂(直径＝1.2mm)也以小胶囊形式给药。0.3mg/kg的剂量对应1片15mg颗粒剂的成分比例，而3mg/kg的剂量对应于10片。
将上述基于式(I)化合物的纳米混悬剂的颗粒剂与基于式(I)化合物的微米混悬剂的颗粒剂以及与式(I)化合物作为PEG溶液进行体内比较。观察到剂量比例。结果如表5和表6以及图10所示。
表6：颗粒剂的生物利用度
表7：片剂的生物利用度
在较低剂量(0.3mg/kg)下，微米和纳米制剂具有可比性。在更高的剂量(2.1或3mg/kg)下，纳米制剂更优，如AUC和Cmax的增加所示。对于每种制剂类型，即混悬剂、颗粒剂和片剂，都显示了含有微粉化加纳米研磨化合物(I)的制剂优于含有仅微粉化化合物(I)的制剂。
实施例7
纳米混悬剂稳定性及干燥后重构的筛选实验
为了分析通过干燥纳米悬浮剂获得的干燥材料重构后是否仍然存在纳米尺寸颗粒，进行了以下筛选实验。不同的活性成分/稳定剂组合在Pulverisette 5型行星式珠磨机(PBM)中进行纳米研磨，如方法A中所述，存在偏差，使用5ml小瓶，研磨时间为60分钟，每分钟400转。
研磨后直接测量粒径分布。为了测量悬浮稳定性，将纳米混悬剂在无压力(无搅拌)的室温条件下在40℃下储存7天。
为了测量干燥和重构后纳米颗粒的稳定性，纳米混悬剂在40℃的干燥室中研磨14-18小时后直接干燥。将水添加到干燥的薄膜上，并用磁力搅拌器搅拌最多5分钟。测量粒径分布。
这些测试是在干燥过程中使用HPC或PVP K30和SDS作为稳定剂，乳糖作为基质形成剂的不同组合进行的。结果如表7和表8所示。
表7：5％维利西呱与PVP K30/SDS/乳糖
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表8：5％维利西呱与HPC/SDS/乳糖
附图说明
图1a显示了使用式(I)化合物制备的纳米混悬剂在行星式研磨机中使用不同的稳定剂进行湿法珠磨(实施例1)后的筛选实验结果。
图1b显示了使用根据WO2020126983(其公开于本申请的首次申请日之后)合成的式(I)化合物制备的纳米混悬剂在行星式研磨机中使用不同的稳定剂进行湿法珠磨(实施例1)后的筛选实验结果。
图2显示了在实施例1的筛选中获得的不同纳米颗粒的长期稳定性，在高温下测量长达13周。研磨条件如下：化合物(I)：稳定剂的比例＝5：1；研磨珠的体积填充率为50％；研磨珠尺寸为0.3-0.4mm；研磨持续时间为90min；研磨机：行星式研磨机，在40℃下储存。粒径以Dn(50)和多分散指数(PDI)的形式给出。
图3显示了在行星式研磨机中研磨的不同浓度的微粉化和纳米研磨化合物(I)和化合物(I)：稳定剂的比例的粒径分布。API＝化合物(I)(实施例3，按比例扩大)。
图4显示了化合物(I)(维利西呱)纳米研磨后的粒径分布(相对于总质量，20％API悬浮)。数据以体积分数Q3的形式给出(体积百分比，体积％，Q3表示颗粒是三维测量的，X％表示小于指定尺寸的颗粒的百分比)。两条曲线的维利西呱材料均已微粉化且未进行超声处理。左曲线：在Netzsch研磨机中使用3.3％SDS纳米研磨90分钟。右曲线：没有经过纳米研磨。
图5a显示了针对实施例4的混悬剂1测量的XRPD。下图显示了作为参考的呈变型I的晶型的化合物(I)的XRPD，上图显示了化合物(I)在表2中显示的混悬剂1的条件下湿法珠磨后的XRPD。比较显示了在湿法珠磨过程中没有发生非晶化。
图5b显示了针对实施例4的悬浮液2测量的XRPD。下图显示了作为参考的呈变型I的晶型的化合物(I)的XRPD，上图显示了化合物(I)在表2中显示的混悬剂2的条件下湿法珠磨后的XRPD。比较显示了在湿法珠磨过程中没有发生非晶化。
图5c显示了针对实施例4的悬浮液3测量的XRPD。下图显示了作为参考的呈变型I的晶型的化合物(I)的XRPD，上图显示了化合物(I)在表2中显示的混悬剂3的条件下湿法珠磨后的XRPD。比较显示了在湿法珠磨过程中没有发生非晶化。
图6显示了作为颗粒剂的化合物(I)(维利西呱)在使用三种不同介质的流通池中释放的量。图7显示了作为颗粒剂的化合物(I)(维利西呱)在使用三种不同介质的流通池中测量的释放的累积量。图6和图7都清楚地表明，相较于微粉化的化合物(I)(维利西呱)，使用纳米研磨的化合物(I)(维利西呱)(是研究批次中的唯一差异)增加了药物释放。纳米研磨化合物(I)(维利西呱)的这种优势与所测试的介质无关。
图8显示了含有化合物(I)(维利西呱)的片剂的药物溶解速度数据，剂量强度为10mg，其中分别掺入了微粉化或纳米研磨的原料药。在0.01NHCl中测量药物溶解速度(n＝6的平均值)。
图9显示了含有化合物(I)(维利西呱)的片剂的药物溶解速度数据，剂量强度为15mg，其中分别掺入了微粉化或纳米研磨的原料药。在0.01NHCl中测量药物溶解速度(n＝6的平均值)。
图10显示了从含有化合物(I)的不同剂型(溶液剂、混悬剂、颗粒剂、迷你片剂)获得的所有体内结果的概览。对于颗粒剂，低剂量：0.3mg/kg，中剂量：1mg/kg(仅溶液剂)，高剂量：2.1mg/kg，对于溶液剂、混悬剂(使用两种不同粒径：含有微晶材料的甲基纤维素混悬剂和含有纳米级化合物(I)的悬浮液)和迷你片剂(由微粉化或微粉化加纳米研磨的化合物(I)制成)为3mg/kg。
图11显示了含有15mg化合物(I)的微粉化或微粉化加纳米研磨形式的片芯(无包衣)的溶解数据。溶解曲线是在存在非吸收条件的生物相关介质(FeSSIF)中测量的。“非吸收条件”是指将少于片剂中所含剂量的三倍量溶解在释放介质中。这导致更高的辨别力。从曲线上看，含有纳米研磨化合物(I)的制剂明显优于含有微粉化化合物(I)的制剂，化合物(I)的粒径是两种片芯的唯一区别。
图12a和图12b分别显示了含有微粉化(图12a,#WU-000704-01)和纳米研磨(图12b,#WU-000704-02)的式(I)的化合物的颗粒的共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)照片。在405nm处引发荧光，在420-500nm处测量发射，增益(gain)550，物镜HC PL APO CS2 63x/1.40OIL。图12a清楚地显示了代表仅微粉化的荧光的式(I)化合物的光点。在图12b中，代表荧光的式(I)化合物清楚地显示了没有光斑的更光滑的表面。
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Claims (13)

1.稳定纳米混悬剂，其包含分散剂中的呈变型I的晶型的式(I)的{4,6-二氨基-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}氨基甲酸甲酯纳米颗粒
其特征在于该化合物的X射线衍射图在5.9、6.9、22.7处显示出2θ角的峰值最大值，以及一种或多种稳定剂，其中所述的稳定纳米混悬剂通过下述步骤制备：
a.将呈变型I的晶型的式(I)化合物悬浮在一种分散剂和一种或多种稳定剂中；
b.湿法珠磨步骤a中产生的混悬剂，比能量输入为10,000kJ/kg或更高，应力强度为0.004·10-3Nm至1·10-3Nm，其中使用的研磨珠的尺寸为0.05-0.8mm，
其中所述一种或多种稳定剂选自十二烷基硫酸钠、维生素E TPGS、聚乙烯吡咯烷酮K10至K30结合十二烷基硫酸钠(SDS)、羟丙基甲基纤维素、聚山梨醇酯20-80及其组合
所述一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂在混悬剂中的溶解度极限，
所述分散剂选自水、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、叔丁醇和甘油，
式(I)化合物和一种或多种稳定剂的比例是16:1至1:2w/w，
所述纳米颗粒以d50表示的平均粒径为500nm或更小，并且
以d50表示的平均粒径在至少40℃的温度下储存至少一周时保持在500nm或更小。
2.根据权利要求1所述的稳定纳米混悬剂，其中纳米颗粒以d50表示的平均粒径为300nm或更小。
3.根据权利要求1或2所述的稳定纳米混悬剂，其中以d50表示的平均粒径在至少40℃的温度下储存至少一周时保持在300nm或更小。
4.制备根据权利要求1至3中任一项所述的稳定纳米混悬剂的方法，其包括以下步骤：
a.将呈变型I的晶型的式(I)化合物悬浮在选自水、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、叔丁醇和甘油的一种分散剂和根据权利要求1所述的一种或多种稳定剂中，其中一种或多种稳定剂的最大浓度是稳定剂在混悬剂中的溶解度极限；
b.湿法珠磨步骤a中产生的混悬剂，比能量输入为10,000kJ/kg或更高，应力强度为0.004·10-3Nm至1·10-3Nm，其中使用的研磨珠的尺寸为0.05-0.8mm。
5.根据权利要求4所述的方法，其中在步骤a.中，将呈变型I的晶型的式(I)化合物在第一步中微粉化，然后将其悬浮在一种分散剂和一种或多种稳定剂中。
6.根据权利要求4所述的方法，在步骤a.之前，在尺寸为1-2mm的研磨珠存在下研磨呈变型I的晶型的式(I)化合物，然后将其悬浮在一种分散剂和一种或多种稳定剂中。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中研磨珠由选自陶瓷、玻璃、聚合物和钢的一种材料制成。
8.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中研磨珠的体积填充率为50-85％v/v。
9.根据权利要求7所述的方法，其中研磨珠的体积填充率为50-85％v/v。
10.干燥纳米颗粒，其包含呈变型I的晶型的式(I)的{4,6-二氨基-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}氨基甲酸甲酯，其特征在于该化合物的X射线衍射图在5.9、6.9、22.7处显示出2θ角的峰值最大值，以及一种或多种稳定剂，式(I)化合物：一种或多种稳定剂的比例为16:1至1:2w/w，其中干燥纳米颗粒以d50表示的平均粒径为500nm或更小，所述一种或多种稳定剂如权利要求1中所定义，所述干燥纳米颗粒通过干燥权利要求1的稳定纳米混悬剂制备。
11.以固体形式的药物组合物，其包含呈变型I的晶型的式(I)的{4,6-二氨基-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}氨基甲酸甲酯的干燥纳米颗粒，其特征在于该化合物的X射线衍射图在5.9、6.9、22.7处显示出2θ角的峰值最大值，以及一种或多种稳定剂，其由权利要求10的纳米颗粒制成，其以d50表示的平均粒径为500nm或更小的。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中固体形式选自颗粒剂和片剂。
13.根据权利要求10所述的干燥纳米颗粒或根据权利要求11或12所述的药物组合物，其中干燥纳米颗粒或药物组合物不含分散剂。
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