CN115161388A - 一种基于细菌的CUT&Tag测序建库方法 - Google Patents

一种基于细菌的CUT&Tag测序建库方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于细菌的CUT&Tag测序建库方法，包括以下操作步骤：步骤S1，载体构建，将荧光基因克隆到中拷贝质粒中，设计酶切位点利用一步克隆法进行酶切，从而构建一个含有荧光基因、HIS标签、目的蛋白所对应基因序列的质粒载体，并将该质粒转化到受测菌株的感受态细胞；步骤S2，利用CUT&Tag技术起始样品处理；步骤S3，利用CUT&Tag技术试剂盒进行试验。本技术转座酶原位激活产生片段，分辨率高，背景信号低，信噪比高；步骤简单，省去了超声破碎和免疫共沉淀，节省了时间；将转座体产生的片段与测序接头整合，进行了pcr富集；程序高度灵敏，需要的起始材料量较少。

Description

一种基于细菌的CUT&Tag测序建库方法
技术领域
本发明涉及细菌基因检测技术领域，具体为一种基于细菌的CUT&Tag测序建库方法。
背景技术
目前研究中的大多数细菌，其本身的基因序列并没有被测通或者在测序后并没有对其序列进行注释，即便序列有注释，细菌内许多蛋白亦会被注释成假设蛋白；细菌上的质粒亦是近年来的研究的关注点之一，临床菌中含有很多质粒，质粒上的许多蛋白会被注释成假设蛋白，使得它们的功能并不清楚。有的假设蛋白会被注释成转录因子，其转录对象未知。同一个耐药基因在不同的临床耐药细菌中的表达量并不一致且相差较大，因此研究该耐药基因的转录调控，是研究临床耐药菌高耐药性机制的有效途径之一。临床上的许多细菌的耐药表型、耐药基因以及耐药机制并不能完全被人们所发现。近年来，产生耐药性的原因有很多，主要是取决于染色体编码机制，如外排泵的过表达和核糖体的保护。由于目前对细菌的染色体的基因序列或是质粒上的基因序列注释并不完善，许多蛋白会被注释成假设蛋白，再者，耐药基因的表达调控，或者是细菌本身携带有的外排泵调控仍处于一个探索研究的阶段，这使得人们在现有的分子机制水平上无法对这三者之间的关系有一个很好的解释。而对部分在注释上可能是转录因子的蛋白所可能调控的基因进行研究，这可能有助于人们去研究耐药基因或某些表型相关基因的被调控情况。
早在2007年，染色质免疫共沉淀（ChIP-seq）技术就作为新一代测序的早期应用之一被发表。ChIP是一种基于抗体的技术，主要是在活细胞上进行操作，可用来选择性地使特异性 DNA 结合蛋白及其 DNA 靶标富集，将目的片段纯化后进行检测，获得蛋白质与DNA相互作用的信息，常被用于检测某种特异蛋白或某种特异蛋白修饰在某个基因组区域的相对丰度。ChIP可用来研究某种特殊的蛋白-DNA 相互作用、多种蛋白-DNA 相互作用或全基因组或部分基因内的相互作用。但是ChIP-seq技术在实验操作中存在着实验步骤繁琐、实验周期长、实验所需起始细胞量大、可重复性差、对实验操作要求较高等问题。为了能够更好地获得数据，弗雷德哈钦森癌症研究中心的Henikoff博士早期在Nature Communication上发布了染色质靶向切割和标签化（CUT&Tag）技术，随后便在世界范围内进行了广泛的应用。
染色质靶向切割和标签化（CUT&Tag）技术是一种基于标记的表观基因组分析方法，其中特定的染色质蛋白被其特定的抗体原位识别，并且与pAG-Tn5转座酶结合。利用转座酶在目标蛋白结合的DNA附近进行切割并对切割下来的DNA片段进行标签化，再通过后续的二代测序可以快速鉴定蛋白质-DNA的相互作用。
目前，CUT&Tag技术主要应用于组蛋白类、转录因子类、全基因组范围内蛋白以及实验室模式生物（人、动物、植物、微生物样本），国内外暂无对CUT&Tag技术对细菌的研究报导。其中很大一个原因是在CUT&Tag技术中需要用到抗体孵育来使得带有目的DNA片段的特异性染色质附合物富集沉淀，而在该步骤中需要用到抗体，目前针对细菌中各个蛋白所生产的商业化抗体较少，由于成本问题，人们通常不会为了研究一个细菌而将其中所有蛋白质纯化出来再进行抗体制作，这就阻碍了该项技术在细菌中的普及应用。
发明内容
为了克服现有技术方案的不足，本发明提供一种基于细菌的CUT&Tag测序建库方法，能有效的解决背景技术提出的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种基于细菌的CUT&Tag测序建库方法，包括以下操作步骤：
步骤S1，载体构建，将荧光基因克隆到中拷贝质粒中，设计酶切位点利用一步克隆法进行酶切，从而构建一个含有荧光基因、HIS标签、目的蛋白所对应基因序列的质粒载体，并将该质粒转化到受测菌株的感受态细胞，具体包括以下工序：
DNA制备：用KOD酶与含有GFP荧光基因的模板进行PCR扩增，并进行胶回收处理，获得GFP荧光基因片段，同时，用KOD酶将设计好的含有HIS标签以及目的蛋白所对应基因序列的引物与相应的菌株进行PCR扩增，并进行胶回收处理，获得目的蛋白所对应基因，最后用TIANGEN质粒小提试剂盒对细菌进行质粒抽提；
重组反应：计算获取重组反应所需DNA量，于冰上配制一定组分的反应体系，反应体系成分包括线性化载体、插入片段、5×CEⅡBuffer、Exnase Ⅱ、ddH2O，接着使用移液器轻轻吸打混匀，短暂离心将反应液收集至管底，在50℃条件下反应50分钟，并降至4℃或立即置于冰上冷却处理；
重组产物转化：在冰上解冻克隆感受态细胞，取10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，在冰上静置30分钟，然后在42℃水浴中热激1分钟后，立即置于冰上冷却2~3分钟，接着加入900μLLB肉汤培养基，在37℃条件下以180rpm摇菌1小时，再以5000rpm离心处理5分钟，弃掉800μL上清，用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀，最后在37℃培养箱中倒置培养12~16小时；
重组产物鉴定：过夜培养后，重组反应转化平板上形成数百个单克隆；
步骤S2，利用CUT&Tag技术起始样品处理，具体包括以下工序：
诱导蛋白表达：调制菌悬液：挑单菌到装有4mL LB肉汤的试管中，并加入40μL 10%阿拉伯糖到已接种单菌的肉汤中，在37℃条件下以180 rpm摇床中摇4小时，使菌量达到1×108CFU/mL；
交联：从上述4mL菌液中吸取1mL到2.0EP管中，再在菌液中加入1%甲醛溶液，并放置于37℃在以180rpm摇床中摇10min进行交联，随后取出，加入125mM甘氨酸终止交联；
步骤S3，利用CUT&Tag技术试剂盒进行试验，具体包括以下工序：
Buffer溶液配制：按照说明配制相应的Buffer溶液，现配现用，Buffer溶液包括Binding Buffer溶液、Wash Buffer溶液、Antibody Buffer溶液、Dig-wash Buffer溶液和Dig-300 Buffer溶液；
ConA Beads处理：取一支8联管，每个样本加入100μL Binding Buffer溶液，使用移液器充分重悬ConA Beads，取出10μL ConA Beads至上一步的Binding Buffer溶液中，混合均匀并置于磁力架上，待溶液澄清后，弃尽上清，再将8联管从磁力架上取下，加入100μLBinding Buffer溶液，用移液器轻轻吹打混匀，接着将8联管置于磁力架上，待液体澄清后，弃尽上清，加入10μL Binding Buffer溶液重悬ConA Beads；
收集细菌：取上述菌液，室温下以5500 rpm离心处理5分钟弃上清，然后在室温条件下加入500μL Wash Buffer溶液重悬细菌，以5500rpm离心处理5分钟弃尽上清，接着每个样本加入100μL Wash Buffer溶液重悬细菌，再将100μL细菌转移至含有活化ConA Beads的pcr管中，上下颠倒混匀后，室温孵育10 分钟，期间颠倒混匀2~3次，最后瞬时离心收集反应液，将pcr管置于磁力架上，待溶液澄清后，弃尽上清；
结合一抗：每个样本加入50μL预冷的Antibody Buffer溶液重悬细菌-磁珠复合物，按一定免疫浓度向pcr管中加入抗体，上下颠倒混匀，接着瞬时离心收集液体于管底，将pcr管置于2~8℃的环境下静置过夜；
结合二抗：将上一步产物瞬时离心收集反应液，将pcr管置于磁力架上，待溶液澄清后，弃尽上清，再加入用Dig-wash Buffer溶液按照一定比例稀释好的二抗，每个样本50μL，上下颠倒数次，使抗体与细菌-磁珠复合物混合均匀，室温下旋转孵育30~60分钟，然后瞬时离心收集反应液，将pcr管置于磁力架上，待溶液澄清后，弃尽上清，接着向pcr管中加入200μL Dig-wash Buffer溶液，上下颠倒数次，确保Buffer溶液与细菌-磁珠复合物充分混合，再重复该步骤两次；
Hyperactive pA/G-Transposon结合：取2μL pA/G-Tnp加入98μL Dig-300 Buffer溶液中混合，终浓度为0.04μM，每个样本100μL，接着取含有产物的pcr管，瞬时离心收集反应液，将pcr管置于磁力架上，待溶液澄清后，弃尽上清，然后每个样本加入100μL稀释好的pA/G-Tnp转座子，上下颠倒数次，使转座子与细菌-磁珠复合物混合均匀，在室温下旋转孵育1 小时，瞬时离心，将pcr管置于磁力架上，待液体澄清后，弃尽上清，最后向pcr管中加入200μL Dig-300 Buffer溶液，上下颠倒数次，确保Buffer溶液与细菌-磁珠复合物充分混合均匀，再重复该步骤两次；
DNA片段化：取40μL Dig-300 Buffer溶液，加入10μL 5 × TTBL，混合均匀，然后取上述步骤的pcr管，瞬时离心收集反应液，将pcr管置于磁力架上，待液体澄清后，弃尽上清，接着每个样本加入50μL稀释好的TTBL，混合均匀，最后将pcr管置于PCR仪中在37℃的环境下孵育60分钟；
DNA提取：向片段化后的样本中加入5μL Proteinase K溶液、100 μL Buffer L/B溶液和20μL DNA Extract Beads溶液，充分涡旋混匀，在55℃的条件下孵育10分钟，其间颠倒混匀2~3次，瞬时离心，将pcr管置于磁力架上，静置2~3 分钟，移除上清，然后将上述样本取下磁力架，加入200μL Buffer WA溶液，充分涡旋混匀，瞬时离心收集反应液，将pcr管置于磁力架上，静置2分钟，弃尽上清，将上述样本取下磁力架，加入200μL Buffer WB溶液，充分涡旋混匀，瞬时离心收集反应液，将pcr管置于磁力架上，静置2分钟，弃尽上清，重复该步骤一次，接着开盖室温晾置5~10分钟，直至管内无液体残留和磁珠表面无反光，再将上述样本取下磁力架，加入22μL灭菌超纯水，用移液枪吹打混匀，室温洗脱5分钟，其间轻轻振荡2~3次，最后将pcr管置于磁力架上，待溶液澄清后吸取20μL上清至新的pcr管中，样本置于-30~ -15℃长期保存，避免反复冻融；
文库扩增：使用配套试剂盒构建DNA二代测序文库，对纯DNA进行接头连接以及PCR文库富集处理，使用Qubit 3.0荧光定量仪对纯化的文库进行定量，并使用Agilent 2100生物分析仪进行验证，再利用Illumina Hiseq-X平台对文库进行双端测序，最后保留通过Illumina质量过滤器的reads以进行序列分析。
进一步地，在步骤S1中，重组反应时，计算所需DNA按以下公式执行：
最适克隆载体使用量=[0.02×克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)；
最适插入片段使用量=[0.04×克隆载体碱基对数]ng(0.06pmol)。
进一步地，在步骤S3中，配制的Binding Buffer溶液、Wash Buffer溶液、AntibodyBuffer溶液、Dig-wash Buffer溶液和Dig-300 Buffer溶液，按单个样品计算的方式如下：
Binding Buffer溶液：取30μL 10 × Binding Buffer溶液，加ddH2O至300μL，混匀；
Wash Buffer溶液：取150μL 10 × Wash Buffer溶液，加入30μL 50 ×蛋白酶抑制剂，加入1,320μL ddH2O，混匀；
Antibody Buffer溶液：取50μL Antibody Buffer溶液，加入0.5μL 5% Digitonin溶液，混匀后置于冰上预冷；
Dig-wash Buffer溶液：取792μL上面配制的Wash Buffer溶液，加入8μL 5%Digitonin溶液，混匀；
Dig-300 Buffer溶液：取100μL 10 × Dig-300 Buffer溶液，加2μL 5%Digitonin溶液和20μL 50 ×蛋白酶抑制剂，加入878μL ddH2O，混匀。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）转座酶原位激活产生片段，分辨率高，背景信号低，信噪比高；
（2）步骤简单，省去了超声破碎和免疫共沉淀，节省了时间；
（3）将转座体产生的片段与测序接头整合，进行了pcr富集；
（4）程序高度灵敏，需要的起始材料量较少。
附图说明
图1为本发明整体操作步骤流程示意图；
图2为本发明步骤S1内部流程示意图；
图3为本发明步骤S2内部流程示意图；
图4为本发明步骤S3内部流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
具体实施例：
如图1-4所示，本发明提供了一种基于细菌的CUT&Tag测序建库方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
步骤S1，载体构建，将荧光基因克隆到中拷贝质粒中，设计酶切位点利用一步克隆法进行酶切，从而构建一个含有荧光基因、HIS标签、目的蛋白所对应基因序列的质粒载体，并将该质粒转化到受测菌株的感受态细胞，具体包括以下工序：
1.1 DNA制备
用KOD酶与含有GFP荧光基因的模板进行PCR扩增，并进行胶回收处理，获得GFP荧光基因片段，同时，用KOD酶将设计好的含有HIS标签以及目的蛋白所对应基因序列的引物与相应的菌株进行PCR扩增，并进行胶回收处理，获得目的蛋白所对应基因，最后用TIANGEN质粒小提试剂盒对细菌进行质粒抽提。
1.2 重组反应
计算获取重组反应所需DNA量，于冰上配制一定组分的反应体系，反应体系成分包括线性化载体、插入片段、5×CEⅡBuffer、Exnase Ⅱ、ddH2O，接着使用移液器轻轻吸打混匀，短暂离心将反应液收集至管底，在50℃条件下反应50分钟，并降至4℃或立即置于冰上冷却处理。
在重组反应时，一般利用公式计算所需DNA量，如下公式：
最适克隆载体使用量=[0.02×克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)；
最适插入片段使用量=[0.04×克隆载体碱基对数]ng(0.06pmol)。
为了确保加样的准确性，在配制重组反应体系前可将线性化载体与插入片段做适当稀释，各组分加样量不低于1μL。
于冰上配制一定组分的反应体系，组分如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
1.3 重组产物转化
在冰上解冻克隆感受态细胞，取10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，在冰上静置30分钟，然后在42℃水浴中热激1分钟后，立即置于冰上冷却2~3分钟，接着加入900μLLB肉汤培养基（不添加抗生素），在37℃条件下以180rpm摇菌1小时，再以5000rpm离心处理5分钟，弃掉800μL上清，用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀，最后在37℃培养箱中倒置培养12~16小时。
1.4 重组产物鉴定
过夜培养后，重组反应转化平板上形成数百个单克隆，而阴性对照反应转化平板上的克隆数应显少于前者。
步骤S2，利用CUT&Tag技术起始样品处理，具体包括以下工序：
2.1 诱导蛋白表达
调制菌悬液：挑单菌到装有4mL LB肉汤的试管中，并加入40μL 10%阿拉伯糖到已接种单菌的肉汤中，在37℃条件下以180 rpm摇床中摇4小时，使菌量达到1×108CFU/mL。
2.2 交联
从上述4mL菌液中吸取1mL到2.0EP管中，再在菌液中加入1%甲醛溶液，并放置于37℃在以180rpm摇床中摇10min进行交联，随后取出，加入125mM甘氨酸终止交联。
步骤S3，利用CUT&Tag技术试剂盒进行试验，具体包括以下工序：
3.1 Buffer溶液配制
按照说明配制相应的Buffer溶液，现配现用，Buffer溶液包括Binding Buffer溶液、Wash Buffer溶液、Antibody Buffer溶液、Dig-wash Buffer溶液和Dig-300 Buffer溶液，而配制Binding Buffer溶液、Wash Buffer溶液、Antibody Buffer溶液、Dig-washBuffer溶液和Dig-300 Buffer溶液按单个样品计算方式如下：
Binding Buffer溶液：取30μL 10 × Binding Buffer溶液，加ddH2O至300μL，混匀；
Wash Buffer溶液：取150μL 10 × Wash Buffer溶液，加入30μL 50 ×蛋白酶抑制剂，加入1,320μL ddH2O，混匀；
Antibody Buffer溶液：取50μL Antibody Buffer溶液，加入0.5μL 5% Digitonin溶液，混匀后置于冰上预冷；
Dig-wash Buffer溶液：取792μL上面配制的Wash Buffer溶液，加入8μL 5%Digitonin溶液，混匀（加入Digitonin后缓冲液不可长期保存，现配现用）；
Dig-300 Buffer溶液：取100μL 10 × Dig-300 Buffer溶液，加2μL 5%Digitonin溶液和20μL 50 ×蛋白酶抑制剂，加入878μL ddH2O，混匀。
首次使用Buffer WA和Buffer WB时，请按照瓶上标签加入指定量的无水乙醇，并进行标注。
3.2 ConA Beads处理
取一支8联管，每个样本加入100μL Binding Buffer溶液，使用移液器充分重悬ConA Beads，取出10μL ConA Beads至上一步的Binding Buffer溶液中，混合均匀并置于磁力架上，待溶液澄清后（约2分钟），弃尽上清，再将8联管从磁力架上取下，加入100μLBinding Buffer溶液，用移液器轻轻吹打混匀，接着将8联管置于磁力架上，待液体澄清后（约2分钟），弃尽上清，加入10μL Binding Buffer溶液重悬ConA Beads。
3.3 收集细菌
取上述菌液，室温下以5500 rpm离心处理5分钟弃上清，然后在室温条件下加入500μL Wash Buffer溶液重悬细菌，以5500rpm离心处理5分钟弃尽上清，接着每个样本加入100μL Wash Buffer溶液重悬细菌，再将100μL细菌转移至含有活化ConA Beads的pcr管中，上下颠倒混匀后，室温孵育10 分钟，期间颠倒混匀2~3次，最后瞬时离心收集反应液，将pcr管置于磁力架上，待溶液澄清后（约2分钟），弃尽上清。
3.4 结合一抗
每个样本加入50μL预冷的Antibody Buffer溶液重悬细菌-磁珠复合物，按一定免疫浓度向pcr管中加入抗体，上下颠倒混匀，接着瞬时离心收集液体于管底（切忌因离心时间过长，导致磁珠聚集在管底），将pcr管置于2~8℃的环境下静置过夜，常在4℃下过夜孵育。
3.5结合二抗
将上一步产物瞬时离心收集反应液，将pcr管置于磁力架上，待溶液澄清后（30秒~2分钟），弃尽上清，再加入稀释好的二抗（用Dig-wash Buffer溶液按照一定的比例稀释二抗，常规使用1：100比例稀释，每个样本50μL），上下颠倒数次，使抗体与细菌-磁珠复合物混合均匀，室温下旋转孵育30~60分钟，然后瞬时离心收集反应液，将pcr管置于磁力架上，待溶液澄清后（30秒~2分钟），弃尽上清，接着向pcr管中加入200μL Dig-wash Buffer溶液，上下颠倒数次，确保Buffer溶液与细菌-磁珠复合物充分混合，再重复该步骤两次，合计三次。
3.6 Hyperactive pA/G-Transposon结合
取2μL pA/G-Tnp加入98μL Dig-300 Buffer溶液中混合，终浓度为0.04μM，每个样本100μL，接着取含有产物的pcr管，瞬时离心收集反应液，将pcr管置于磁力架上，待溶液澄清后（30秒~2分钟），弃尽上清，然后每个样本加入100μL稀释好的pA/G-Tnp转座子，上下颠倒数次，使转座子与细菌-磁珠复合物混合均匀，在室温下旋转孵育1 小时，再瞬时离心，将pcr管置于磁力架上，待液体澄清后（30秒~2分钟），弃尽上清，最后向pcr管中加入200μLDig-300 Buffer溶液，上下颠倒数次，确保Buffer溶液与细菌-磁珠复合物充分混合均匀，再重复该步骤两次，合计三次。
3.7 DNA片段化
取40μL Dig-300 Buffer溶液，加入10μL 5 × TTBL，混合均匀，然后取上述步骤的pcr管，瞬时离心收集反应液，将pcr管置于磁力架上，待液体澄清后（30秒~2分钟），弃尽上清，接着每个样本加入50μL稀释好的TTBL，混合均匀，最后将pcr管置于PCR仪中在37℃的环境下孵育60分钟。
3.8 DNA提取
向片段化后的样本中加入5μL Proteinase K溶液、100 μL Buffer L/B溶液和20μL DNA Extract Beads溶液，充分涡旋混匀，在55℃的条件下孵育10分钟，其间颠倒混匀2~3次，瞬时离心，将pcr管置于磁力架上，静置2~3 分钟移除上清，然后将上述样本取下磁力架，加入200μL Buffer WA溶液（使用前请确认已加无水乙醇），充分涡旋混匀，瞬时离心收集反应液，将pcr管置于磁力架上，静置2分钟弃尽上清，将上述样本取下磁力架，加入200μLBuffer WB溶液（使用前请确认已加无水乙醇），充分涡旋混匀，瞬时离心收集反应液，将pcr管置于磁力架上，静置2分钟弃尽上清，重复该步骤一次，接着开盖室温晾置5~10分钟，直至管内无液体残留和磁珠表面无反光，再将上述样本取下磁力架，加入22μL灭菌超纯水，用移液枪吹打混匀，室温洗脱5分钟，其间轻轻振荡2~3次，最后将pcr管置于磁力架上，待溶液澄清后（约1分钟）吸取20μL上清至新的pcr管中，样本置于-30~-15℃长期保存，避免反复冻融。
3.9 文库扩增
使用配套试剂盒构建DNA二代测序文库，对纯DNA进行接头连接以及PCR文库富集处理，使用Qubit 3.0荧光定量仪对纯化的文库进行定量，并使用Agilent 2100生物分析仪进行验证，再利用Illumina Hiseq-X平台对文库进行双端测序，最后保留通过Illumina质量过滤器的reads以进行序列分析。
相比传统的ChIP-seq技术，CUT&Tag技术转座酶原位激活产生片段，分辨率高，背景信号低，信噪比高；步骤简单，省去了超声破碎和免疫共沉淀，节省了时间；将转座体产生的片段与测序接头整合，进行了pcr富集；程序高度灵敏，需要的起始材料量较少。由于CUT&Tag技术具有实验周期短、步骤简单、重复性好以及信噪比高的优点，人们可以利用CUT&Tag技术，选用事先构建好带有标签的蛋白质对单个甚至多个耐药基因的DNA进行抓取，然后进行建库并二代测序。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (3)

1.一种基于细菌的CUT&Tag测序建库方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
步骤S1，载体构建，将荧光基因克隆到中拷贝质粒中，设计酶切位点利用一步克隆法进行酶切，从而构建一个含有荧光基因、HIS标签、目的蛋白所对应基因序列的质粒载体，并将该质粒转化到受测菌株的感受态细胞，具体包括以下工序：
DNA制备：用KOD酶与含有GFP荧光基因的模板进行PCR扩增，并进行胶回收处理，获得GFP荧光基因片段，同时，用KOD酶将设计好的含有HIS标签以及目的蛋白所对应基因序列的引物与相应的菌株进行PCR扩增，并进行胶回收处理，获得目的蛋白所对应基因，最后用TIANGEN质粒小提试剂盒对细菌进行质粒抽提；
重组反应：计算获取重组反应所需DNA量，于冰上配制一定组分的反应体系，反应体系成分包括线性化载体、插入片段、5×CEⅡBuffer、ExnaseⅡ、ddH2O，接着使用移液器轻轻吸打混匀，短暂离心将反应液收集至管底，在50℃条件下反应50分钟，并降至4℃或立即置于冰上冷却处理；
重组产物转化：在冰上解冻克隆感受态细胞，取10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，在冰上静置30分钟，然后在42℃水浴中热激1分钟后，立即置于冰上冷却2～3分钟，接着加入900μLLB肉汤培养基，在37℃条件下以180rpm摇菌1小时，再以5000rpm离心处理5分钟，弃掉800μL上清，用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀，最后在37℃培养箱中倒置培养12～16小时；
重组产物鉴定：过夜培养后，重组反应转化平板上形成数百个单克隆；
步骤S2，利用CUT&Tag技术起始样品处理，具体包括以下工序：
诱导蛋白表达：调制菌悬液：挑单菌到装有4mL LB肉汤的试管中，并加入40μL 10％阿拉伯糖到已接种单菌的肉汤中，在37℃条件下以180rpm摇床中摇4小时，使菌量达到1×108CFU/mL；
交联：从上述4mL菌液中吸取1mL到2.0EP管中，再在菌液中加入1％甲醛溶液，并放置于37℃在以180rpm摇床中摇10min进行交联，随后取出，加入125mM甘氨酸终止交联；
步骤S3，利用CUT&Tag技术试剂盒进行试验，具体包括以下工序：
Buffer溶液配制：按照说明配制相应的Buffer溶液，现配现用，Buffer溶液包括Binding Buffer溶液、Wash Buffer溶液、Antibody Buffer溶液、Dig-wash Buffer溶液和Dig-300 Buffer溶液；
ConA Beads处理：取一支8联管，每个样本加入100μL Binding Buffer溶液，使用移液器充分重悬ConA Beads，取出10μL ConA Beads至上一步的Binding Buffer溶液中，混合均匀并置于磁力架上，待溶液澄清后，弃尽上清，再将8联管从磁力架上取下，加入100μLBinding Buffer溶液，用移液器轻轻吹打混匀，接着将8联管置于磁力架上，待液体澄清后，弃尽上清，加入10μL Binding Buffer溶液重悬ConA Beads；
收集细菌：取上述菌液，室温下以5500rpm离心处理5分钟弃上清，然后在室温条件下加入500μL Wash Buffer溶液重悬细菌，以5500rpm离心处理5分钟弃尽上清，接着每个样本加入100μL Wash Buffer溶液重悬细菌，再将100μL细菌转移至含有活化ConA Beads的pcr管中，上下颠倒混匀后，室温孵育10分钟，期间颠倒混匀2～3次，最后瞬时离心收集反应液，将pcr管置于磁力架上，待溶液澄清后，弃尽上清；
结合一抗：每个样本加入50μL预冷的Antibody Buffer溶液重悬细菌-磁珠复合物，按一定免疫浓度向pcr管中加入抗体，上下颠倒混匀，接着瞬时离心收集液体于管底，将pcr管置于2～8℃的环境下静置过夜；
结合二抗：将上一步产物瞬时离心收集反应液，将pcr管置于磁力架上，待溶液澄清后，弃尽上清，再加入用Dig-wash Buffer溶液按照一定比例稀释好的二抗，每个样本50μL，上下颠倒数次，使抗体与细菌-磁珠复合物混合均匀，室温下旋转孵育30～60分钟，然后瞬时离心收集反应液，将pcr管置于磁力架上，待溶液澄清后，弃尽上清，接着向pcr管中加入200μL Dig-wash Buffer溶液，上下颠倒数次，确保Buffer溶液与细菌-磁珠复合物充分混合，再重复该步骤两次；
Hyperactive pA/G-Transposon结合：取2μL pA/G-Tnp加入98μL Dig-300 Buffer溶液中混合，终浓度为0.04μM，每个样本100μL，接着取含有产物的pcr管，瞬时离心收集反应液，将pcr管置于磁力架上，待溶液澄清后，弃尽上清，然后每个样本加入100μL稀释好的pA/G-Tnp转座子，上下颠倒数次，使转座子与细菌-磁珠复合物混合均匀，在室温下旋转孵育1小时，瞬时离心，将pcr管置于磁力架上，待液体澄清后，弃尽上清，最后向pcr管中加入200μLDig-300 Buffer溶液，上下颠倒数次，确保Buffer溶液与细菌-磁珠复合物充分混合均匀，再重复该步骤两次；
DNA片段化：取40μL Dig-300 Buffer溶液，加入10μL 5×TTBL，混合均匀，然后取上述步骤的pcr管，瞬时离心收集反应液，将pcr管置于磁力架上，待液体澄清后，弃尽上清，接着每个样本加入50μL稀释好的TTBL，混合均匀，最后将pcr管置于PCR仪中在37℃的环境下孵育60分钟；
DNA提取：向片段化后的样本中加入5μL ProteinaseK溶液、100μL Buffer L/B溶液和20μL DNA Extract Beads溶液，充分涡旋混匀，在55℃的条件下孵育10分钟，其间颠倒混匀2～3次，瞬时离心，将pcr管置于磁力架上，静置2～3分钟，移除上清，然后将上述样本取下磁力架，加入200μL Buffer WA溶液，充分涡旋混匀，瞬时离心收集反应液，将pcr管置于磁力架上，静置2分钟，弃尽上清，将上述样本取下磁力架，加入200μL Buffer WB溶液，充分涡旋混匀，瞬时离心收集反应液，将pcr管置于磁力架上，静置2分钟，弃尽上清，重复该步骤一次，接着开盖室温晾置5～10分钟，直至管内无液体残留和磁珠表面无反光，再将上述样本取下磁力架，加入22μL灭菌超纯水，用移液枪吹打混匀，室温洗脱5分钟，其间轻轻振荡2～3次，最后将pcr管置于磁力架上，待溶液澄清后吸取20μL上清至新的pcr管中，样本置于-30～-15℃长期保存，避免反复冻融；
文库扩增：使用配套试剂盒构建DNA二代测序文库，对纯DNA进行接头连接以及PCR文库富集处理，使用Qubit 3.0荧光定量仪对纯化的文库进行定量，并使用Agilent 2100生物分析仪进行验证，再利用Illumina Hiseq-X平台对文库进行双端测序，最后保留通过Illumina质量过滤器的reads以进行序列分析。
2.根据权利要求1所述的一种基于细菌的CUT&Tag测序建库方法，其特征在于，在步骤S1中，重组反应时，计算所需DNA按以下公式执行：
最适克隆载体使用量＝[0.02×克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)；
最适插入片段使用量＝[0.04×克隆载体碱基对数]ng(0.06pmol)。
3.根据权利要求1所述的一种基于细菌的CUT&Tag测序建库方法，其特征在于，在步骤S3中，配制的Binding Buffer溶液、Wash Buffer溶液、Antibody Buffer溶液、Dig-washBuffer溶液和Dig-300 Buffer溶液，按单个样品计算的方式如下：
Binding Buffer溶液：取30μL 10×Binding Buffer溶液，加ddH2O至300μL，混匀；
Wash Buffer溶液：取150μL 10×Wash Buffer溶液，加入30μL 50×蛋白酶抑制剂，加入1,320μL ddH2O，混匀；
Antibody Buffer溶液：取50μL Antibody Buffer溶液，加入0.5μL 5％Digitonin溶液，混匀后置于冰上预冷；
Dig-wash Buffer溶液：取792μL上面配制的Wash Buffer溶液，加入8μL 5％Digitonin溶液，混匀；
Dig-300 Buffer溶液：取100μL 10×Dig-300 Buffer溶液，加2μL 5％Digitonin溶液和20μL 50×蛋白酶抑制剂，加入878μL ddH2O，混匀。
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CN117051078A (zh) * 2023-05-24 2023-11-14 上海近岸科技有限公司 甲醛重交联在CUT&Tag技术建库中的应用

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