CN115161199A - 一种细胞培养3d打印支架及细胞培养方法 - Google Patents

一种细胞培养3d打印支架及细胞培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细胞培养3D打印支架及细胞培养方法，其特征在于：包括3D打印一体成型的支架本体，支架本体上设有多组细胞培养孔，所述细胞培养孔的两端分别与支架本体的外壁相连通；细胞培养方法为：①用数字化3D打印机一体打印成型，得到预成型支架本体；②对预成型支架本体进行清理、干燥；③对预成型支架本体进行灭菌处理，得到成型支架本体；④将成型支架本放入培养皿、培养板或培养瓶内，用滴管在成型支架本体上滴入需扩增细胞和培养基，使培养基充分浸没成型支架本体；⑤将装有成型支架本体及细胞的培养皿、培养板或培养瓶放入二氧化碳培养箱内进行培养并定期更换培养基；⑥待细胞培养好后进行收集。本发明提高了细胞培养效率及质量。

Description

一种细胞培养3D打印支架及细胞培养方法
技术领域
本发明涉及一种细胞培养领域，尤其涉及一种细胞培养3D打印支架及细胞培养方法。
背景技术
目前国际上细胞培养基本是在2D状态下进行，如培养瓶、培养皿等，支持细胞在二维平面上生长。为了增加细胞的活性，国外高端品牌提供进行生物活性材料包被涂层的培养皿，都是采用2D培养，而2D培养无法模拟人体微环境，使得细胞的生物学特性无法充分表达，导致细胞功能性受到很大局限。国内外许多学者认为传统的2D贴壁细胞培养法虽简便易行，但贴壁培养法提供的平面生长环境与细胞在生物体内生长的微环境大相径庭，且改变了细胞生长的原始形态，使得细胞的生物学特性无法充分表达。
发明内容
本发明目的是提供一种细胞培养3D打印支架及细胞培养方法，通过使用该支架及方法，给予了细胞培养更好的环境，有效激发细胞的生物活性，提高培养效率及培养效果，使培养出的细胞生物学特性表达更加充分。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种细胞培养3D打印支架，包括支架本体，所述支架本体为3D打印一体成型结构，所述支架本体上设有多组细胞培养孔，所述细胞培养孔的两端分别与所述支架本体的外壁相连通。
上述技术方案中，所述支架本体的外壁上设有凸块及凹槽，所述凸块能够卡设于相邻所述支架本体的凹槽内。
上述技术方案中，所述支架本体的外壁上分别设有两组凸块及两组凹槽，两组所述凸块分别设置于所述支架本体相邻的两侧壁上，两组所述凹槽分别设置于所述支架本体相邻的另外两侧壁上，且每组所述凹槽设置于一组所述凸块的相对侧。
上述技术方案中，所述支架本体的长度为5毫米～80毫米，所述支架本体的宽度为5毫米～80毫米，所述支架本体的高度为3毫米～30毫米；所述细菌培养孔的孔径为100微米～800微米，所述支架本体的孔隙率为50％～90％。
上述技术方案中，所述支架本体上设有涂层，所述涂层设置于所述本体外壁以及所述细胞培养孔的内壁上。
上述技术方案中，所述涂层为胶原蛋白、甲基丙烯酸酯化胶原、多聚-D-赖氨酸、丝素蛋白、细胞纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、明胶、甲基丙烯酸酯化明胶中的一种或多种。
上述技术方案中，所述支架本体采用金属材料或非金属材料，所述金属材料为钛、钛合金、钽金属、不锈钢、钴基合金中的一种或多种；所述非金属材料为聚乙二醇及其聚合物、聚乙二醇二丙烯酸酯、胶原蛋白、甲基丙烯酸酯化胶原、明胶、甲基丙烯酸酯化明胶、氧化铝、氧化锆、聚醚醚酮、羟基磷灰石、磷酸三钙、硅酸盐纳米黏土中的一种或多种。
为达到上述目的，本发明采用了一种细胞培养3D打印支架的细胞培养方法，其步骤为：
①用数字化3D打印机将设计的数字化支架模型一体打印成型，得到预成型支架本体；
②对预成型支架本体进行清理、干燥；
③对步骤②中的预成型支架本体进行灭菌处理，得到成型支架本体；
④将成型支架本放入培养皿、培养板或培养瓶内，用滴管在成型支架本体上滴入需扩增细胞和培养基，使培养基充分浸没成型支架本体；
⑤将装有成型支架本体及细胞的培养皿、培养板或培养瓶放入二氧化碳培养箱内进行培养并定期更换培养基；
⑥待细胞培养达到使用目的后进行冲洗，将细胞进行收集。
上述技术方案中，在将预成型支架本体灭菌之前，将预成型本体支架浸没于涂层材料的溶液内，静置4小时～24小时后，将预成型本体支架取出，将其进行烘干，完成涂层涂覆，涂层涂覆完成之后，再进行步骤③的灭菌处理。
上述技术方案中，待细胞培养达到使用目的后，对成型支架本体或具有涂层的成型支架本体先加入特异性酶，使得涂层或成型支架本体被特异性酶进行酶解，涂层或成型支架本体被酶解后细胞自然脱落，然后再进行冲洗，将细胞进行收集。
上述技术方案中，在步骤⑤中，一组成型支架本体上的细胞培养完成之后，在需要对细胞进行传代培养时，取全新的成型支架本体，将全新的成型支架本体的边缘与已培养细胞的成型支架本体进行拼接，经过凸块与凹槽进行拼接，并使全新的成型支架本体浸没于培养基内，使原成型支架本体上的细胞可以迁移、增殖或分化至新的成型支架本体上，完成传代培养。
上述技术方案中，所述预成型支架本体采用金属材料或者非金属材料3D打印一体成型；采用非金属材料时，根据数字化3D打印机类型的不同，在非金属材料中添加光引发剂或粘稠剂。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1.本发明中在支架本体上设置细胞培养孔，并且支架本体采用3D打印技术将支架本体一体打印成型，3D打印的支架本体给予细胞培养提供了一个更加接近体内的三维生长环境，增加了细胞外基质的分泌，增强了细胞之间的接触，使得细胞的生物学特性能够充分的表达出来，更加利于激发细胞的生物活性，有效提高细胞的培养效果；
2.本发明中采用的是3D结构的支架本体，与以往采用2D结构的平面培养增殖结构相比，3D结构的支架本体能够提供更大培养面积，供贴壁细胞贴覆增殖，有效提高培养效率；
3.本发明中支架本体具备凸块及凹槽，用于与相邻的支架本体进行拼接，构成一个拼接结构，这样可以在细胞长满一个支架本体之后，拼接一个新的支架本体，从而达到细胞的迁移、增殖、分化功能，并且拼接结构，能够进行拓展式的拼接，能够实现细胞大批量增殖，不仅杜绝了传代培养过程中因人为操作造成的污染，而且能够增加培养效率，还能够实现大批量的培养；
4.本发明中支架本体采用惰性材料或具有生物活性的材料，不会对细胞增殖产生负面影响；
5.本发明中支架本体的表面具有涂层，采用具有增加细胞粘附和细胞活性功能的涂层，这样能够增加细胞的培养质量及培养效率。
附图说明
图1是本发明实施例一中支架本体的结构示意图；
图2是本发明实施例一中支架本体的立体结构示意图；
图3是本发明实施例一中多组支架本体相互搭接配合的结构式示意图(细胞培养孔未画出)。
其中：1、支架本体；2、细胞培养孔；3、凸块；4、凹槽。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：参见图1～3所示，一种细胞培养3D打印支架，包括支架本体1，所述支架本体为3D打印一体成型结构，所述支架本体上设有多组细胞培养孔2，所述细胞培养孔的两端分别与所述支架本体的外壁相连通。
在本实施例中，支架本体采用3D打印一体成型，为3D结构，将其用于细胞培养时，将支架本体放在培养器具中，放入需要培养的细胞和培养基，细胞则会在支架本体上面进行培养，并且，在培养的时候，由于细胞培养孔的存在，这样支架本体能够给予更多的培养面积，比常规的培养皿的表面积多上百倍，解决了以往物理空间的限制，便于细胞粘附增殖，有效的提高培养效率，同时，支架本体为3D结构，给予细胞培养提供了一个更加接近于体内的三维生长环境，增加了细胞外基质的分泌，增强了细胞之间的接触，更有利于激发细胞的生物活性，使得细胞的生物学特性能够得到充分的表达，能够提高细胞的培养质量。
其中，细胞培养孔的存在，给予细胞培养的一个空间，其中，细胞培养孔的孔径大小可以一致，也可以不一致，细胞培养孔的截面可以为圆形、椭圆形、多边形等，根据所需要培养细胞的种类和特点进行设计，然后3D打印一体成型即可，只要便于所需培养细胞能够快速的高质量的增殖培养即可。同时，细胞培养孔可以为直线型结构，也可以自一端朝下另一端为弧形结构，结构不受限制，只要细胞培养孔的两端分别与支架本体的外壁连通即可，这样给予细胞培养的通道及空间。
同时，在本实施例中，对于培养同一种细胞的支架本体，可以对细胞培养孔的孔径大小进行调节，从而实现同种细胞的迁移、增殖、分化等多个功能。
参见图1～3所示，所述支架本体的外壁上设有凸块3及凹槽4，所述凸块能够卡设于相邻所述支架本体的凹槽内。
在本实施例中，通过凸块及凹槽的设置，凸块能够卡入到相邻支架本体的凹槽内，这样支架本体在使用的时候，采用拼接形式，可以在细胞长满一组支架本体后，再拼接一个全新的支架本体，从而达到细胞增殖、迁移、分化等功能，能够进行拓展式的拼接，能够实现细胞大批量增殖，不仅杜绝了传代培养过程中的污染，而且能够增加培养效率，还能够实现大批量、大规模的培养。
参见图1～3所示，所述支架本体的外壁上分别设有两组凸块及两组凹槽，两组所述凸块分别设置于所述支架本体相邻的两侧壁上，两组所述凹槽分别设置于所述支架本体相邻的另外两侧壁上，且每组所述凹槽设置于一组所述凸块的相对侧。
在本实施例中，以两组凸块分别设置在支架本体右侧面及前侧面上为例，则两组凹槽分别设置在支架本体左侧面及后侧面上，这样在一组支架本体的四周，都能够进行支架本体的拼接，也就是支架本体能够朝向四方拼接，拼接拓展的结构最优化，能够从各个方位进行拼接拓展，尽可能的减少空间的占用，减少拓展的限制。
其中，所述支架本体的长度为5毫米～80毫米，所述支架本体的宽度为5毫米～80毫米，所述支架本体的高度为3毫米～30毫米；所述细菌培养孔的孔径为100微米～800微米，所述支架本体的孔隙率为50％～90％。
在本实施例中，支架本体的尺寸优选为长、宽均为10毫米，高度选择为5毫米～10毫米。
其中，所述支架本体上设有涂层，所述涂层设置于所述本体外壁以及所述细胞培养孔的内壁上。
所述涂层为胶原蛋白、甲基丙烯酸酯化胶原、多聚-D-赖氨酸、丝素蛋白、细胞纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、明胶、甲基丙烯酸酯化明胶中的一种或多种。
在本实施例中，涂层具有增加细胞粘附和增加支架生物活性的功能，使得细胞培养的过程中，能够更好的在支架本体上生长，提高培养效率，而且，涂层为具有生物活性的材料，不会对细胞增殖产生负面影响。同时，涂层为可降解材料，在支架本体对细胞培养好之后，需要进行收集的时候，可以采用特异性酶将涂层进行快速酶解，使得培养好的细胞自然脱落，被冲洗进行快速的收集，这种操作便于后续的收集，而且酶解也不会对细胞产生其他影响。
其中，所述支架本体采用金属材料或非金属材料，所述金属材料为钛、钛合金、钽金属、不锈钢、钴基合金中的一种或多种；所述非金属材料为聚乙二醇及其聚合物、聚乙二醇二丙烯酸酯、胶原蛋白、甲基丙烯酸酯化胶原、明胶、甲基丙烯酸酯化明胶、氧化铝、氧化锆、聚醚醚酮、羟基磷灰石、磷酸三钙、硅酸盐纳米黏土中的一种或多种。
在本实施例中，支架本体采用金属材料或非金属材料的时候，采用的是惰性材料或者具有生物活性的材料，不会对细胞增殖产生负面影响。而且，采用具有生物活性的材料，例如胶原蛋白可以通过加入特异性酶(如胶原蛋白酶)被酶解，这样便于后续培养好的细胞的收集。
而且，在本实施例中，支架本体还适用于各种具有贴壁功能的细胞，例如各种癌细胞、干细胞和免疫细胞，包括但不限于各种实体瘤细胞、间充质干细胞、IPS细胞、乳腺细胞、纤维细胞、神经细胞、内皮细胞、角蛋白细胞、T细胞、NK细胞等各种具有贴壁功能的细胞。
为达到上述目的，本发明采用了一种细胞培养3D打印支架的细胞培养方法，其步骤为：
①通过三维软件设计支架本体，得到数字化支架模型，其中，数字化支架模型具有与被设计支架一致的形貌参数；
②用数字化3D打印机将步骤①中得到的数字化支架模型一体打印成型，得到预成型支架本体；
③对预成型支架本体进行清理、干燥；
④对步骤③中的预成型支架本体进行灭菌处理，得到成型支架本体；其中，可以采用伽马辐照灭菌或者电子束辐照灭菌；
⑤将成型支架本放入培养皿、培养板或培养瓶内，用滴管在成型支架本体上滴入需扩增细胞和培养基，使培养基充分浸没成型支架本体；
⑥将装有成型支架本体及细胞的培养皿、培养板或培养瓶放入二氧化碳培养箱内进行培养并定期更换培养基；在细胞培养的时候，细胞成型支架本体外壁、细胞培养孔内进行增殖培养，其培养空间、面积大。
同时，如果需要进行Sub-culture(传代培养)时，取全新的成型支架本体，将其边缘通过凸块及凹槽与原成型支架进行拼接，并让全新的成型支架本体浸没在培养基内，从而快速的实现细胞的迁移功能；
⑦待细胞培养达到使用目的后进行冲洗，将细胞进行收集。
在将预成型支架本体灭菌之前，将预成型本体支架浸没于涂层材料的溶液内，静置4小时～24小时后，将预成型本体支架取出，将其进行烘干，完成涂层涂覆，涂层涂覆完成之后，再进行步骤④的灭菌处理。
在本实施例中，支架本体表面可以不设置涂层，也可以设置涂层，如果需要设置涂层，按照上述步骤，在灭菌之前进行涂层工作即可。
针对具有涂层的成型支架本体，待细胞培养达到使用目的后，对成型支架本体或具有涂层的成型支架本体先加入特异性酶，使得涂层或成型支架本体被特异性酶进行酶解，涂层或成型支架本体被酶解后细胞自然脱落，然后再进行冲洗，将培养好的细胞进行收集。例如胶原蛋白材料的涂层，加入胶原蛋白蛋白酶，等待涂层被酶解后，细胞自然会脱落，再进行冲洗，即可对培养好的细胞进行收集。
在步骤⑥中，一组成型支架本体上的细胞培养完成之后，在需要对细胞进行传代培养时，取全新的成型支架本体，将全新的成型支架本体的边缘与已培养细胞的成型支架本体进行拼接，经过凸块与凹槽进行拼接，并使全新的成型支架本体浸没于培养基内，使原成型支架本体上的细胞可以迁移、增殖或分化至新的成型支架本体上，完成传代培养。
同时，在本实施例中，在细胞开始培养的时候，可以先采用不可降解材料作为支架本体，或者降解速度特别慢(需要数月以上才能降解)的材料作为支架本体，进行细胞的培养。后续需要收集培养好的细胞的时候，采用可以快速降解的材料，或者其表面具有可以快速降解涂层的支架本体，然后将其与之前的支架本体通过凸块及凹槽进行拼接，这样就可以将培养好的细胞迁移到新的支架本体上，然后采用酶解的方式，将涂层或者支架本体酶解后，培养好的细胞就自然脱落，然后进行冲洗收集即可。
所述预成型支架本体采用金属材料或者非金属材料3D打印一体成型；采用非金属材料时，根据数字化3D打印机种类的不同，在非金属材料中添加光引发剂或粘稠剂。
在本实施例中，支架本体采用金属材料或者非金属材料。采用金属材料的时候，会采用选区激光熔融3D打印技术或者选区电子束熔融3D打印技术，以及激光熔覆3D打印技术。
采用非金属材料的时候，会采用挤出式沉淀成型3D打印技术，或者采用立体光刻3D打印技术，其中，挤出式成型3D打印技术在非金属材料不能形成粘稠状态时需要添加粘稠剂，例如甲基纤维素，使得非金属溶液变成凝胶状态，方便其挤出进行3D打印成型；立体光刻3D打印技术包括面光源3D打印技术和点光源3D打印技术，采用立体光刻3D打印技术的时候，在非金属材料中天界0.2％～2％w/v的光引发剂，光引发剂包括但不限于Irgacure2959、苯基(2,4,6-三甲基甲酰基)、磷酸锂盐、TPO、原花青素、丙酮酸乙酯中的一种或几种。

Claims (12)

1.一种细胞培养3D打印支架，其特征在于：包括支架本体，所述支架本体为3D打印一体成型结构，所述支架本体上设有多组细胞培养孔，所述细胞培养孔的两端分别与所述支架本体的外壁相连通。
2.根据权利要求1所述的细胞培养3D打印支架，其特征在于：所述支架本体的外壁上设有凸块及凹槽，所述凸块能够卡设于相邻所述支架本体的凹槽内。
3.根据权利要求2所述的细胞培养3D打印支架，其特征在于：所述支架本体的外壁上分别设有两组凸块及两组凹槽，两组所述凸块分别设置于所述支架本体相邻的两侧壁上，两组所述凹槽分别设置于所述支架本体相邻的另外两侧壁上，且每组所述凹槽设置于一组所述凸块的相对侧。
4.根据权利要求1所述的细胞培养3D打印支架，其特征在于：所述支架本体的长度为5毫米～80毫米，所述支架本体的宽度为5毫米～80毫米，所述支架本体的高度为3毫米～30毫米；所述细菌培养孔的孔径为100微米～800微米，所述支架本体的孔隙率为50％～90％。
5.根据权利要求1所述的细胞培养3D打印支架，其特征在于：所述支架本体上设有涂层，所述涂层设置于所述本体外壁以及所述细胞培养孔的内壁上。
6.根据权利要求5所述的细胞培养3D打印支架，其特征在于：所述涂层为胶原蛋白、甲基丙烯酸酯化胶原、多聚-D-赖氨酸、丝素蛋白、细胞纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、明胶、甲基丙烯酸酯化明胶中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的细胞培养3D打印支架，其特征在于：所述支架本体采用金属材料或非金属材料，所述金属材料为钛、钛合金、钽金属、不锈钢、钴基合金中的一种或多种；所述非金属材料为聚乙二醇及其聚合物、聚乙二醇二丙烯酸酯、胶原蛋白、甲基丙烯酸酯化胶原、明胶、甲基丙烯酸酯化明胶、氧化铝、氧化锆、聚醚醚酮、羟基磷灰石、磷酸三钙、硅酸盐纳米黏土中的一种或多种。
8.一种应用权利要求1所述的细胞培养3D打印支架的细胞培养3D打印支架的细胞培养方法，其步骤为：
①用数字化3D打印机将设计的数字化支架模型一体打印成型，得到预成型支架本体；
②对预成型支架本体进行清理、干燥；
③对步骤②中的预成型支架本体进行灭菌处理，得到成型支架本体；
④将成型支架本放入培养皿、培养板或培养瓶内，用滴管在成型支架本体上滴入需扩增细胞和培养基，使培养基充分浸没成型支架本体；
⑤将装有成型支架本体及细胞的培养皿、培养板或培养瓶放入二氧化碳培养箱内进行培养并定期更换培养基；
⑥待细胞培养达到使用目的后进行冲洗，将细胞进行收集。
9.根据权利要求8所述的细胞培养3D打印支架的细胞培养方法，其特征在于：在将预成型支架本体灭菌之前，将预成型本体支架浸没于涂层材料的溶液内，静置4小时～24小时后，将预成型本体支架取出，将其进行烘干，完成涂层涂覆，涂层涂覆完成之后，再进行步骤③的灭菌处理。
10.根据权利要求9所述的细胞培养3D打印支架的细胞培养方法，其特征在于：待细胞培养达到使用目的后，对成型支架本体或具有涂层的成型支架本体先加入特异性酶，使得涂层或成型支架本体被特异性酶进行酶解，涂层或成型支架本体被酶解后细胞自然脱落，然后再进行冲洗，将细胞进行收集。
11.根据权利要求8所述的细胞培养3D打印支架的细胞培养方法，其特征在于：在步骤⑤中，一组成型支架本体上的细胞培养完成之后，在需要对细胞进行传代培养时，取全新的成型支架本体，将全新的成型支架本体的边缘与已培养细胞的成型支架本体进行拼接，经过凸块与凹槽进行拼接，并使全新的成型支架本体浸没于培养基内，使原成型支架本体上的细胞可以迁移、增殖或分化至新的成型支架本体上，完成传代培养。
12.根据权利要求8所述的细胞培养3D打印支架的细胞培养方法，其特征在于：所述预成型支架本体采用金属材料或者非金属材料3D打印一体成型；采用非金属材料时，在非金属材料中添加光引发剂或粘稠剂。
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