CN115154426A - 一种纳米抗菌复合物的制备方法及其产品与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米抗菌复合物的制备方法及其产品与应用,将EGCG包裹进ZIF‑8,有效地缓解耐药性问题,并且ZIF‑8的特殊结构并不会影响EGCG的抗菌能力和抗生物被膜能力;EGCG@ZIF‑8外周包覆BSA‑MnO2和CaO2使复合物获得化学动力治疗(CDT)和光动力治疗(PDT)的能力,多组分协同抑菌,通过多种治疗方式,多靶点协同作用对抗病原微生物。
Description
技术领域
本发明属于纳米抗菌材料技术领域,具体涉及一种纳米抗菌复合物的制备方法及其产品与应用。
背景技术
随着病原微生物对抗生素的耐药性不断增加,由多重广泛耐药的病原微生物引起的感染对公共健康构成严重的威胁。与耐药性相关的两种最主要也最常见的死亡病原体:大肠杆菌和金黄色葡萄球菌逐渐引起人们的重视。此外鲍曼不动杆菌是一种革兰氏阴性非乳糖发酵的条件致病菌,在全世界重症监护病房(ICU)中越来越常见,是导致医院获得性感染的主要人类病原体,如肺炎、菌血症、脑膜炎、尿路和伤口感染。鲍曼不动杆菌等细菌引起的感染能被有效地用抗生素治疗,如β-内酰胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、四环素类和利福平。然而,随着全世界抗生素耐药性的暴发,碳青霉烯类抗生素相关的多重耐药性成为了治疗细菌感染的最大问题。
多药或广泛耐药的细菌传播甚广,迫切需要开发针对耐药细菌的新的预防和治疗策略。细菌群落往往会形成生物被膜以保护自身,致药物无法有效接触细菌导致效果下降。有必要寻找一种天然低毒的非抗生素类化合物作为优良的抗菌剂。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊,而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
作为本发明其中一个方面,本发明提供一种纳米抗菌复合物的制备方法,其由以下步骤组成,
步骤1:称取表没食子儿茶素没食子酸酯和ZIF-8溶于水中,搅拌混合,离心,得到EGCG@ZIF-8沉淀,洗涤所述EGCG@ZIF-8沉淀,烘干后溶于水中得到EGCG@ZIF-8溶液;
步骤2:将所述EGCG@ZIF-8溶液加入到BSA-MnO2溶液中,搅拌混合,离心,得到EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2沉淀,洗涤,烘干,得到EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2固体;
步骤3:将所述EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2固体均匀分散在CaO2的水溶液中,搅拌混合,离心,获得EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2/CaO2沉淀,洗涤,烘干,得到EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2/CaO2固体。
作为本发明所述的纳米抗菌复合物的制备方法的一种优选方案:所述步骤1中,所述ZIF-8,其制备方法为:称取1.388g Zn(CH3COO)2溶于150mL甲醇得到Zn(CH3COO)2溶液;称取6.22g 2-MIM溶于150mL甲醇,得到2-MIM溶液,将2-MIM溶液缓慢滴入Zn(CH3COO)2溶液,1000rpm搅拌10~20min,40KHz超声处理5~10min,37℃静置24h,8000rpm离心15min,所得沉淀用甲醇洗涤,烘干,得到ZIF-8。
作为本发明所述的纳米抗菌复合物的制备方法的一种优选方案:所述步骤1中,所述EGCG@ZIF-8沉淀的制备方法为:称取60mg EGCG和60mg ZIF-8溶于75mL水中,1000rpm搅拌混合2h,8000rpm离心10min,得到EGCG@ZIF-8沉淀。
作为本发明所述的纳米抗菌复合物的制备方法的一种优选方案:所述步骤2中,所述BSA-MnO2溶液,其制备方法为:称取63.2mgKMnO4溶于6mL水中,称取500mgBSA溶于14mL水中,37℃水浴条件下,将得到的KMnO4溶液缓慢滴入BSA溶液中,1000rpm搅拌20~30min,得到BSA-MnO2溶液。
作为本发明所述的纳米抗菌复合物的制备方法的一种优选方案:所述步骤2中,所述EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2沉淀的制备方法为:将150mL的EGCG@ZIF-8溶液加入到20mL BSA-MnO2溶液中,搅拌混合过夜,8000rpm离心10min,得到EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2/CaO2沉淀。
作为本发明所述的纳米抗菌复合物的制备方法的一种优选方案:所述步骤3中,所述CaO2,其制备方法为:将1mL浓度为2M的Cacl2水溶液缓慢滴入60mL甲醇中,1000rpm搅拌混合10min;加入500μL 30vol%的H2O2继续搅拌10min;滴加NH3·H2O直至溶液变色为蓝色,8000rpm离心15min,离心所得沉淀用甲醇洗涤;在真空干燥箱中真空烘干24h,获得CaO2固体。
作为本发明所述的纳米抗菌复合物的制备方法的一种优选方案:所述步骤3中,所述EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2/CaO2沉淀的制备方法为:称取5mg EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2固体均匀分散在5mL 0.2mg/mL的CaO2水溶液中,1000rpm搅拌混合12h;8000rpm离心10min。
本发明的有益效果:本发明成功构建了一种新型纳米复合材料,将EGCG包裹进ZIF-8,有效地缓解耐药性问题,并且ZIF-8的特殊结构并不会影响EGCG的抗菌能力和抗生物被膜能力;EGCG@ZIF-8外周包覆BSA-MnO2和CaO2使复合物获得化学动力治疗(CDT)和光动力治疗(PDT)的能力,多组分协同抑菌,通过多种治疗方式,多靶点协同作用对抗病原微生物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。其中:
图1为纳米复合物的粒径分析。
图2为纳米复合物的Zeta电位分析。
图3为纳米复合物的紫外吸收光谱。
图4为纳米复合物的红外吸收光谱。
图5为微生物生长曲线。
图6为抑菌环试验图。
图7为鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度(MIC)测试。
图8为大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)测试。
图9为金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)测试。
图10为鲍曼不动杆菌的最小杀菌浓度(MBC)测试。
图11为大肠杆菌的最小杀菌浓度(MBC)测试。
图12为金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MBC)测试。
图13为最小生物被膜清除浓度50%(MBEC50)测试。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广,因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次,此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例,也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1:
实验材料:
测试菌种:
金黄色葡萄球菌(ATCC6538) | 上海鲁微科技有限公司 |
大肠杆菌(8099) | 上海鲁微科技有限公司 |
鲍曼不动杆菌(ATCC19606) | 上海鲁微科技有限公司 |
试剂:
实验方法:
细菌的培养:
1)取冻存菌种管,在无菌环境下打开。取5mL离心管加入1980μLLB肉汤培养基,加入20μL菌种悬液,置摇床培育10h~16h(37℃,210r/min)。
2)取经摇床活化后的菌液。使用酶标仪测定OD600,将菌液浓度稀释至OD600在0.4~0.5间(菌液浓度约为108CFU/mL)。
3)将测定好浓度的菌液用水稀释100倍备用(菌液浓度约为106CFU/mL)。
4)细菌繁殖体悬液应保存在4℃冰箱内备用。
ZIF-8的制备:
1)使用分析天平称取1.388g Zn(CH3COO)2溶于150mL甲醇,使用分析天平称取6.22g 2-MIM溶于150mL甲醇;
2)将2-MIM溶液缓慢滴入Zn(CH3COO)2溶液,并在IKA磁力搅拌器中搅拌处理(1000rpm,10min);
3)将上述溶液在超声波清洗器中超声振动处理(40KHz,5min);
4)在电热恒温鼓风干燥箱(37℃)中静置24h;
5)将上述溶液在高速离心机中离心处理(8000rpm,15min),离心所得沉淀用甲醇洗涤2遍;
6)将上述沉淀在真空干燥箱中真空烘干24h,获得ZIF-8固体粉末,ZIF-8固体粉末干燥保存。
BSA-MnO2的制备:使用分析天平称取63.2mgKMnO4溶于6mL无菌蒸馏水,使用分析天平称取500mgBSA溶于14mL无菌蒸馏水;37℃水浴条件下,将KMnO4溶液缓慢滴入BSA溶液中,并在IKA磁力搅拌器中搅拌处理(1000rpm,20min),获得BSA-MnO2溶液。
CaO2的制备:将1mLCacl2(2M)缓慢滴入剧烈搅拌的60mL甲醇中,并在IKA磁力搅拌器中搅拌处理(1000rpm,10min);向上述溶液中加入500μLH2O2(30%)继续搅拌10min;向上述溶液中滴加NH3·H2O(25%)直至溶液变色为蓝色;在高速离心机中离心处理(8000rpm,15min),离心所得沉淀用甲醇洗涤2遍;在真空干燥箱中真空烘干24h,获得CaO2固体。
EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2/CaO2的制备:
1)使用分析天平称取60mg EGCG和60mg ZIF-8溶于75mL无菌蒸馏水,并在IKA磁力搅拌器中搅拌处理(1000rpm,2h);
2)将上述溶液在高速离心机中离心处理(8000rpm,10min),离心所得沉淀为EGCG@ZIF-8,用无菌蒸馏水洗涤3遍;
3)将上述EGCG@ZIF-8沉淀在真空干燥箱中真空烘干24h,溶于150mL无菌蒸馏水;
4)将150mL的EGCG@ZIF-8溶液加入到20mL BSA-MnO2溶液中,并在IKA磁力搅拌器中搅拌过夜;
5)将上述溶液在高速离心机中离心处理(8000rpm,10min),离心所得沉淀用无菌蒸馏水洗涤3遍;
6)将上述沉淀在真空干燥箱中真空烘干24h,获得EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2固体;
7)使用分析天平称取5mg EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2均匀分散在5mL CaO2(0.2mg/mL)的水溶液中,并在IKA磁力搅拌器中搅拌处理(1000rpm,12h);
8)将上述溶液在高速离心机中离心处理(8000rpm,10min),离心所得沉淀用无菌蒸馏水洗涤3遍;
9)将上述沉淀在真空干燥箱中真空烘干24h,获得EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2/CaO2固体(后续简写为E@Z/B-M/C)。
本发明纳米复合物材料在进行抗菌等试验时需暴露于5mW/cm2 660nm的近红外光下30min。
纳米复合材料表征:
粒径测定及zeta电位分析:取适量样品溶液进行颗粒粒径测量分析以及zeta电位分析。
外吸收光谱测定:取适量样品溶液于比色皿中,用蒸馏水进行空白校正,然后测定它们在300~800nm范围内的紫外吸收光谱。
红外吸收光谱测定:将适量样品溶液于60℃下旋转蒸发制成粉末,在50℃下置于真空干燥箱中2h,制得样品粉末用于FTIR表征。
纳米复合材料的体外抗菌研究:
抑菌环试验:
1)取无菌并干燥的直径约为5mm,厚不超过4mm滤纸片。每片滴加浓度为60μg/mL的药物水溶液20μL。阴性对照样片的制备:每片滴加无菌蒸馏水20μL;然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内,开盖置37℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干备用;
2)在LB琼脂培养基平板表面滴加450μL浓度为1×106CFU/mL鲍曼不动杆菌菌悬液,用无菌棉棒在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次,平板应转动60°,最后绕平板边缘涂抹一周。盖好培养皿盖,置室温干燥5min;
3)用无菌镊子取样片贴放于已涂菌的平板表面。各样片中心之间相距25mm以上,与平板的周缘相距15mm以上。贴放好后,用无菌镊子轻压样片,使其紧贴于平板表面。盖好平皿,置37℃恒温培养箱,培养10h~16h观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径(包括贴片)并记录。测量抑菌环时,应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。测量其直径应以抑菌环外沿为界。抑菌环直径大于7mm者,判为有抑菌作用;抑菌环直径小于或等于7mm者,判为无抑菌作用;阴性对照组应无抑菌环产生,否则试验无效。药物对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠杆菌(8099)的抑菌环试验步骤同上。
最小杀菌浓度(MIC)试验:参考CLSI标准。准备11支无菌离心管并编号,1号管加入MueLLer-Hinton肉汤培养基(MHB)2mL,2-11号管加入MHB1mL,1号管中加入1024μL2000μg/mL的药物溶液;震荡混匀后从1号试管取1mL加入到2号试管,按此方法倍比稀释至10号试管,10号管吸取1mL弃去,此时1-11号管纳米银浓度为1024、512、128、64、32、16、8、4、2、1、0μg/mL,11号试管为阴性对照管;在上述11支试管中分别加入50μL浓度为1×106CFU/mL鲍曼不动杆菌菌悬液,放入37℃恒温培养箱中培育10h~16h。比较各试管中液体浑浊情况,无细菌生长的最低药物浓度即为药物作用于鲍曼不动杆菌的MIC。药物对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠杆菌(8099)的MIC试验步骤同上。
最小杀菌浓度试验(MBC):根据药物作用于鲍曼不动杆菌的MIC设置本试验药物浓度,准备6支灭菌试管并编号,1号管加入MueLLer-Hinton肉汤培养基(MHB)2mL,2-6号试管加入MHB1mL,1号管中加入适量2000μg/mL的药物溶液;震荡混匀后从1号试管取1mL加入到2号试管,按此方法倍比稀释至5号试管,5号管吸取1mL弃去,此时1-6号管纳米银浓度为32MIC、16MIC、8MIC、4MIC、2MIC、0μg/mL,6号试管为阴性对照管;在上述6支试管中分别加入50μL浓度为1×106CFU/mL鲍曼不动杆菌菌悬液,放入37℃恒温培养箱中培育10h~16h;在不同LB琼脂培养基平板表面分别滴加450μL1-6号管中药物处理后的菌液,用无菌棉棒在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次,平板应转动60°,最后绕平板边缘涂抹一周。盖好培养皿盖,置室温干燥5min,放入37℃恒温培养箱中培育10~16h。观察代表不同药物浓度的培养皿中的菌落数,以小于5个菌落的最小浓度作为MBC。纳米银对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌(ATCC10231)的MIC试验以及度米芬对以上四个菌的MBC试验步骤同上。
纳米复合材料的体外抗生物被膜研究:
各菌产生物被膜能力的鉴定:在无菌96孔板实验孔中加入100μL鲍曼不动杆菌稀释菌液,设置3复孔,每孔加入100μLMHB培养基,放入37℃恒温培养箱培育1h,使生物被膜黏附在孔中;吸除菌液,并用无菌蒸馏水清洗2-3遍除去浮游菌;各孔加入100μLMHB,放入37℃恒温培养箱培育10h~16h;吸除MHB,无菌蒸馏水清洗除去残留MHB,加入100μL甲醇固定15min;吸除甲醇,晾干,结晶紫染色10min;吸除结晶紫溶液,无菌蒸馏水清洗3遍;95%乙醇溶解生物被膜10min,酶标仪600nm测定OD值。以2倍的ODc值(ODc等于空白孔的平均OD值加上其3倍标准差而得到的OD值)为界限值,将菌株分为:不成膜株(ODc≤OD≤2ODc);弱成膜能力株(2ODc≤OD≤4ODc);中等成膜能力株(4ODc≤OD≤6ODc);强成膜能力株(6ODc≤OD)。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的成膜能力试验步骤同上。
最小生物被膜清除浓度50%试验(MBEC50):MBEC50是指最小生物被膜清除浓度50%,即生物被膜生物量清除掉50%的药物的最小浓度。实验方法:无菌96孔板实验孔中加入100μL鲍曼不动杆菌稀释菌液,设置3复孔,对照孔只加100μLMHB培养基,放入37℃恒温培养箱培育1h,使生物被膜黏附在孔中;吸除菌液,并用无菌蒸馏水清洗2-3遍除去浮游菌;药物最高从4倍MIC浓度开始用无菌MHB倍比稀释,取7-9个稀释度,按照从小到大的药物浓度依次加入100μL于无菌96孔板中,放入37℃恒温培养箱培育10h~16h;吸除孔内溶液,无菌蒸馏水清洗除去残留孔内溶液,加入100μL甲醇固定15min;吸除甲醇,晾干,结晶紫染色10min;吸除结晶紫溶液,无菌蒸馏水清洗3遍;95%乙醇溶解生物被膜10min,酶标仪600nm测定OD值。小于阴性对照OD值的1/2的最小药物浓度即纳米银作用于鲍曼不动杆菌的MBEC50。药物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌MBEC50同上。
统计学分析方法:数据以均数±标准差(Mean±SD)表示,使用SPSS16.0软件进行统计分析。两组间比较采用非配对的双边t检验(two-tailedunpairedStudent’sttest);多组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析(one-wayANOVA),方差齐性采用LSD法或SNK法检验,方差不齐采用非参数检验(Kruskal-WallisH检验)方法。假设检验水准按α=0.05判定。P<0.05表示差异有统计学意义。
实验结果:
图1纳米复合物的粒径分析,a.EGCG;b.EGCG@ZIF-8;c.EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2/CaO2,如图1所示,EGCG的粒径约为116.6nm,EGCG@ZIF-8的粒径约为109.6nm,EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2/CaO2的粒径约为509.2nm。EGCG被包埋在ZIF-8中并不会对纳米复合物的粒径产生较大的影响,在ZIF-8表面包覆BSA-MnO2和CaO2后纳米复合物粒径上升。三样品的分散度(P.I.)均在0.3以下,分散较为均匀。
图2为纳米复合物的Zeta电位分析。如图2所示,EGCG的Zeta电位约为0.46mV,EGCG@ZIF-8的Zeta电位约为5.01mV,EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2/CaO2的Zeta电位约为6.00mV。EGCG@ZIF-8的正电荷由Zn2+引起,E@Z/B-M/C升高的电荷是由包覆在纳米复合物表面的MnO2和CaO2分解产生的Mn2+和Ca2+引起。
图3为纳米复合物的紫外吸收光谱,如图3所示,ZIF-8的唯一峰值约在209nm,EGCG@ZIF-8的唯一峰值约在225nm,EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2/CaO2的三个峰值分别约在258nm、390nm、575nm。209nm、225nm、258nm的波长都归于ZIF-8中存在的Zn,并且在纳米复合物组装的过程中出现红移,是因为在此过程中纳米复合物的空间结构以及极性发生了改变。390nm、575nm的波长分别归于MnO2和CaO2。图4为纳米复合物的红外吸收光谱。
抗菌性能研究:图5为微生物生长曲线,a.Control组,未经任何处理;b.Control+660nm红光照射(NIR)组。如图5a所示,鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)的对数生长期在10-16h间,由于对数期的群体细菌细胞具有生理特性比较一致、细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点,宜作为研究的良好材料。故后续试验均采用10-16h的处于对数生长期的细菌;对比图5a和图5b可知鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)的生长不会被660nm的近红光(NIR)干扰。
图6为抑菌环试验,a.鲍曼不动杆菌+EGCG;b.鲍曼不动杆菌+E@Z;c.鲍曼不动杆菌+E@Z/B-M/C;d.鲍曼不动杆菌+E@Z/B-M/C-NIR(660nm的近红光照射);e.大肠杆菌+EGCG;f.大肠杆菌+E@Z;g.大肠杆菌+E@Z/B-M/C;h.大肠杆菌+E@Z/B-M/C-NIR(660nm的近红光照射);i.金黄色葡萄球菌+EGCG;j.金黄色葡萄球菌+E@Z;金黄色葡萄球菌+E@Z/B-M/C;l.金黄色葡萄球菌+E@Z/B-M/C-NIR。
表1抑菌环直径(mm)
如图6和表1所示,EGCG、EGCG@ZIF-8、E@Z/B-M/C和E@Z/B-M/C-NIR作用于鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)时的抑菌环直径均>7mm,表明该纳米复合物对这三种细菌都有抑菌作用。EGCG@ZIF-8作用于细菌时与EGCG单独作用于细菌时的抑菌环直径并没有发生明显差异,表明EGCG包埋在ZIF-8中不会影响其抗菌性能。E@Z/B-M/C作用于细菌时的抑菌环直径明显变大,表明纳米复合物表面包覆的MnO2和CaO2发挥了抗菌作用,并且在660nmNIR照射下抑菌环直径进一步上升。
图7为鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度(MIC)。a.EGCG;b.EGCG@ZIF-8;c.E@Z/B-M/C;d.E@Z/B-M/C-NIR。图8为大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)。a.EGCG;b.EGCG@ZIF-8;c.E@Z/B-M/C;d.E@Z/B-M/C-NIR。图9为金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)。a.EGCG;b.EGCG@ZIF-8;c.E@Z/B-M/C;d.E@Z/B-M/C-NIR。
表2最小抑菌浓度(MIC)
如图7、8、9和表2所示,EGCG@ZIF-8作用于细菌时与EGCG单独作用于细菌时的MIC并没有发生明显差异,表明EGCG包埋在ZIF-8中不会影响其抑菌性能。E@Z/B-M/C作用于鲍曼不动杆菌(A.baumannii)和大肠杆菌(E.coli)时的MIC明显减小,表明纳米复合物表面包覆的MnO2和CaO2发挥了抑菌作用,在660nm NIR照射下MIC进一步减小,表明纳米复合物可能通过设想的PDT(光动力治疗)和CDT(化学动力治疗)发挥了更佳的抑菌作用。
采用棋盘微量稀释法测定EGCG和Zif-8/BSA-MnO2/CaO2对三株菌的药敏试验,以FIC判断结果表现为协同、相加、拮抗及无关四种效应,实验结果见下表:
EGCG及Zif-8/BSA-MnO2/C-NIR联合药敏试验
采用棋盘微量稀释法测定EGCG和Zif-8/BSA-MnO2/C-NIR,对三株菌的联合药敏试验,以FIC判断结果表现为协同、相加、拮抗及无关四种效应,实验结果为,EGCG和Zif-8/BSA-MnO2/C-NIR联合使用时,对以上三种菌都有协同作用(FIC≤0.5)。
图10为鲍曼不动杆菌的最小杀菌浓度(MBC),a.EGCG;b.EGCG@ZIF-8;c.E@Z/B-M/C;d.E@Z/B-M/C-NIR。图11为大肠杆菌的最小杀菌浓度(MBC),a.EGCG;b.EGCG@ZIF-8;c.E@Z/B-M/C;d.E@Z/B-M/C-NIR。图12为金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MBC),a.EGCG;b.EGCG@ZIF-8;c.E@Z/B-M/C;d.E@Z/B-M/C-NIR。
表3最小杀菌浓度(MBC)
如图10、11、12和表3所示,EGCG@ZIF-8作用于细菌时与EGCG单独作用于细菌时的MBC并没有发生明显差异,表明EGCG包埋在ZIF-8中不会影响其杀菌性能。E@Z/B-M/C作用于鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)时的MBC明显减小,表明纳米复合物表面包覆的MnO2和CaO2发挥了杀菌作用。在NIR照射下MBC进一步减小。
抗生物被膜研究:
表4菌株成膜能力鉴定
试验采用结晶紫染色法对细菌的成膜能力进行筛选,结果如表4所示,与ODc值比较,鲍曼不动杆菌OD600≥6ODc,为强成膜能力株;金黄色葡萄球菌OD600≥6ODc,为强成膜能力株;大肠杆菌4ODc≤OD600≤6ODc,为中等成膜能力株。
图13为最小生物被膜清除浓度50%(MBEC50),a.鲍曼不动杆菌+EGCG;b.鲍曼不动杆菌+E@Z;c.鲍曼不动杆菌+E@Z/B-M/C;d.鲍曼不动杆菌+E@Z/B-M/C-NIR;e.大肠杆菌+EGCG;f.大肠杆菌+E@Z;g.大肠杆菌+E@Z/B-M/C;h.大肠杆菌+E@Z/B-M/C-NIR;i.金黄色葡萄球菌+EGCG;j.金黄色葡萄球菌+E@Z;k.金黄色葡萄球菌+E@Z/B-M/C;l.金黄色葡萄球菌+E@Z/B-M/C-NIR。
表5为最小生物被膜清除浓度(MBEC50)试验(×MIC)
如图13和表5所示,EGCG@ZIF-8作用于细菌时与EGCG单独作用于细菌时的MBEC50并没有发生明显差异,表明EGCG包埋在ZIF-8中不会影响其清除生物被膜的能力。E@Z/B-M/C作用于鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)时的MBEC50明显减小,表明纳米复合物表面包覆的MnO2和CaO2可能发挥了清除生物被膜的作用。
采用棋盘微量稀释法测定了EGCG和Zif-8/BSA-MnO2/C-NIR联用对生物被膜代谢活性影响的协同相互作用,进行了联合用药BEC-2试验。EGCG和Zif-8/BSA-MnO2/C-NIR联合使用时,对以上三种菌的生物被膜都有协同抑制作用(FIC≤0.5),尤其对大肠杆菌(8099)的生物被膜协同抑制作用效果突出。实验结果见下表:
EGCG及Zif-8/BSA-MnO2/C-NIR抑制生物被膜代谢活性
综上,本发明成功构建了一种新型纳米复合材料,将EGCG包裹进ZIF-8,有效地缓解耐药性问题,并且ZIF-8的特殊结构并不会影响EGCG的抗菌能力和抗生物被膜能力;EGCG@ZIF-8外周包覆BSA-MnO2和CaO2使复合物获得化学动力治疗(CDT)和光动力治疗(PDT)的能力,通过多种治疗方式,多靶点协同作用对抗病原微生物。
应说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种纳米抗菌复合物的制备方法,其特征在于:由以下步骤组成,
步骤1:称取表没食子儿茶素没食子酸酯和ZIF-8溶于水中,搅拌混合,离心,得到EGCG@ZIF-8沉淀,洗涤所述EGCG@ZIF-8沉淀,烘干后溶于水中得到EGCG@ZIF-8溶液;
步骤2:将所述EGCG@ZIF-8溶液加入到BSA-MnO2溶液中,搅拌混合,离心,得到EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2沉淀,洗涤,烘干,得到EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2固体;
步骤3:将所述EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2固体均匀分散在CaO2的水溶液中,搅拌混合,离心,获得EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2/CaO2沉淀,洗涤,烘干,得到EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2/CaO2固体。
2.根据权利要求1所述的纳米抗菌复合物的制备方法,其特征在于:所述步骤1中,所述ZIF-8,其制备方法为:称取1.388g Zn(CH3COO)2溶于150mL甲醇得到Zn(CH3COO)2溶液;称取6.22g 2-MIM溶于150mL甲醇,得到2-MIM溶液,将2-MIM溶液缓慢滴入Zn(CH3COO)2溶液,1000rpm搅拌10~20min,40KHz超声处理5~10min,37℃静置24h,8000rpm离心15min,所得沉淀用甲醇洗涤,烘干,得到ZIF-8。
3.根据权利要求1或2所述的纳米抗菌复合物的制备方法,其特征在于:所述步骤1中,所述EGCG@ZIF-8沉淀的制备方法为:称取60mg EGCG和60mg ZIF-8溶于75mL水中,1000rpm搅拌混合2h,8000rpm离心10min,得到EGCG@ZIF-8沉淀。
4.根据权利要求1或2所述的纳米抗菌复合物的制备方法,其特征在于:所述步骤2中,所述BSA-MnO2溶液,其制备方法为:称取63.2mgKMnO4溶于6mL水中,称取500mgBSA溶于14mL水中,37℃水浴条件下,将得到的KMnO4溶液缓慢滴入BSA溶液中,1000rpm搅拌20~30min,得到BSA-MnO2溶液。
5.根据权利要求1或2所述的纳米抗菌复合物的制备方法,其特征在于:所述步骤2中,所述EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2沉淀的制备方法为:将150mL的EGCG@ZIF-8溶液加入到20mLBSA-MnO2溶液中,搅拌混合过夜,8000rpm离心10min,得到EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2/CaO2沉淀。
6.根据权利要求1或2所述的纳米抗菌复合物的制备方法,其特征在于:所述步骤3中,所述CaO2,其制备方法为:将1mL浓度为2M的Cacl2水溶液缓慢滴入60mL甲醇中,1000rpm搅拌混合10min;加入500μL 30vol%的H2O2继续搅拌10min;滴加NH3·H2O直至溶液变色为蓝色,8000rpm离心15min,离心所得沉淀用甲醇洗涤;在真空干燥箱中真空烘干24h,获得CaO2固体。
7.根据权利要求1或2所述的纳米抗菌复合物的制备方法,其特征在于:所述步骤3中,所述EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2/CaO2沉淀的制备方法为:称取5mg EGCG@ZIF-8/BSA-MnO2固体均匀分散在5mL 0.2mg/mL的CaO2水溶液中,1000rpm搅拌混合12h;8000rpm离心10min。
8.权利要求1所述的纳米抗菌复合物的制备方法得到的纳米抗菌复合物。
9.权利要求1所述的纳米抗菌复合物的制备方法得到的纳米抗菌复合物在制备抗菌剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:所述抗菌剂,包括抗鲍曼不动杆菌的抗菌剂、抗金黄色葡萄球菌的抗菌剂、抗大肠杆菌的抗菌剂。
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