CN115141797A - 一种猪冷冻精液解冻剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪冷冻精液解冻剂及其制备方法，属于猪冷冻精液解冻技术领域。本发明公开的一种猪冷冻精液解冻剂，组分为葡萄糖、果糖、柠檬酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、Tris‑HCl、HEPES、咖啡因、精浆和/或NMN。本发明的猪冷冻精液解冻剂可有效复苏猪冷冻精液、保证解冻和稀释后精子体外存活状况、保证精子理化性质指标正常、保证精子受精能力。
Description
技术领域
本发明涉及猪冷冻精液解冻技术领域，更具体的说是涉及一种猪冷冻精液解冻剂及其制备方法。
背景技术
猪精液冷冻保存技术在猪种质资源保护和生猪繁殖生产中有良好的应用价值，但猪冷冻精液存在解冻后精子活力低、精子理化性质改变、人工授精效率低等问题，因此猪冷冻精液在国内外使用率较低。国内外针对猪冷冻精液解冻这一问题进行了一系列研究，但解冻和稀释过程中使用的解冻液种类较多，不同解冻液效果不一、存在解冻后精子复苏效果差，理化性质改变，如质膜受损、顶体受损、线粒体活性降低、受精效果差等问题。造成这些问题的原因在于解冻液中能量底物、缓冲物质、精子复苏物质之间配伍不合理，无法提供精子最适的生存条件。
为进一步改善猪冷冻精液解冻后精子活力、保证其理化性质、降低猪冷冻精液使用成本、提高猪冷冻精液使用效率，针对猪冷冻精液解冻配方进行研究十分重要，如何进行解冻配方之间各组分合理配伍，为精子冻融后提供合适的生存环境是本领域技术人员重要的研究方向之一。
因此，提供一种稳定高效的猪冷冻精液解冻剂及其制备方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种猪冷冻精液解冻剂及其制备方法，可有效复苏猪冷冻精液、保证解冻和稀释后精子体外存活状况、保证精子理化性质指标正常、保证精子受精能力。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种猪冷冻精液解冻剂，在解冻剂基础配方的基础上添加精浆和NMN，或者单独添加精浆或NMN；所述精浆的添加量为1.5％～5％(v/v)；所述NMN的添加量为0.083～0.250g/L；
所述解冻剂基础配方使用超纯水作为溶剂，1L解冻剂基础配方中各组分添加量为：葡萄糖15g、果糖10g、柠檬酸钠8g、碳酸氢钠3g、磷酸二氢钾1.42g、Tris-HCl 3.152g、HEPES 0.6g、咖啡因0.6g、青霉素钠20万IU、硫酸链霉素10万IU。
进一步，所述的一种猪冷冻精液解冻剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)使用超纯水室温条件下添加葡萄糖、果糖、柠檬酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、Tris-HCl、HEPES、咖啡因、青霉素钠、硫酸链霉素，25℃磁力搅拌30分钟使各组分充分溶解，调pH值至6.8～7.2，渗透压至310～330mOsm/L，定容至1L；
(2)将步骤(1)获得的溶液使用0.22μm除菌滤器进行过滤；
(3)精浆和/或NMN在解冻猪冷冻精液前30分钟添加至步骤(2)过滤后的溶液中。
本发明的猪冷冻精液解冻剂配方按照步骤配制为解冻液后酸碱度pH(6.8～7.2)、渗透压(310～330mOsm/L)符合精子的最适生存条件。
本发明的猪冷冻精液解冻剂配方使用葡萄糖、果糖两种单糖为精子提供能量来源；
本发明的猪冷冻精液解冻剂配方使用柠檬酸钠、碳酸氢钠、Tris-HCl、HEPES作为解冻液缓冲物质，保证pH、渗透压；
本发明的猪冷冻精液解冻剂配方使用咖啡因作为精子复苏物质；
本发明的猪冷冻精液解冻剂配方使用精浆和/或NMN(β-烟酰胺单核苷酸)保证咖啡因诱导的精子复苏过程中精子理化性质正常；
本发明的猪冷冻精液解冻剂配方使用青霉素钠、硫酸链霉素作为抗菌成分，保证解冻液不受细菌污染，以免影响解冻后精子质量。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种猪冷冻精液解冻剂及其制备方法，制备的猪冷冻精液解冻剂可有效复苏猪冷冻精液、保证解冻后精子体外存活状况、保证精子理化性质指标正常、保证精子受精能力。本发明的猪冷冻精液解冻剂配方添加猪自体精浆和/或NMN，精浆作为精液的组成部分，自然条件下是维持精子生存的必需介质，为精子提供了适合的生理条件，如pH和渗透压。此外，精浆含有清除小分子质量自由基的功能，在维持精子生存能力及代谢、运动和获能调节中起着关键作用。另外NMN是一种生物活性核苷酸，属于维生素B族衍生物一种，广泛参与多种生理生化反应，与机体免疫、代谢、抗氧化息息相关。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
精浆通过离心制备，通过手握法采精，收集富集精子质量好的中段部分，采集好的精液置于集精袋中，放入保温杯内，15min内带回实验室进行处理，以2500g离心30min，收集上请，弃去沉淀，后对上清重复离心操作两次，对最终获得的上清液进行显微检查，确保视野中无精子存在，之后将获得的精浆分装至0.5mL EP管置于-80℃保存。
NMN(β-烟酰胺单核苷酸)购自西格玛奥德里奇公司，货号为N3501。
实施例1
一种猪冷冻精液解冻剂及其制备方法，具体步骤如下：
(1)使用超纯水在室温条件下添加下列物质：葡萄糖15g、果糖10g、柠檬酸钠8g、碳酸氢钠3g、磷酸二氢钾1.42g、Tris-HCl 3.152g、HEPES 0.6g、咖啡因0.6g、青霉素钠20万IU、硫酸链霉素10万IU，25℃磁力搅拌30分钟使各组分充分溶解，调pH值至7.2，渗透压至310mOsm/L，定容为1L；
(2)将步骤(1)获得的溶液使用0.22μm除菌滤器进行过滤；
(3)解冻猪冷冻精液前30分钟，添加精浆2.5％(v/v)、NMN 0.167g/L至步骤(2)过滤后的溶液中。
试验例1
(一)一种猪精液冷冻保存方法，步骤如下：
(1)取一份配制好的原精预稀释液，37℃预热40min，原精预稀释液为BetsvilleThawing Solution(简称BTS)，1L原精预稀释液中溶质及浓度如下：乙二胺四乙酸1.25g、碳酸氢钠1.25g、氯化钾0.75g、二水柠檬酸三钠14.8g、D-葡萄糖37g、青霉素20万IU、硫酸链霉素10万IU，磁力搅拌器搅拌充分溶解于超纯水中，调pH值至7.2，渗透压至310mOsm/L，定容为1L。
(2)大白猪采精一份，对采集的新鲜精液进行常规精液检查，正常的精液色泽为乳白色、无杂质、无异味、略带血腥味，活率90％以上，活力80％以上，称重并测量精子密度。
(3)将预热好的原精预稀释液与原精进行等温1:1稀释。
(4)将稀释后的精液室温静置1h，后将精液分装到50mL的离心管中，测量离心管重量w1(g)，离心管放置在装有等温水的烧杯中，后转移到17℃恒温箱中使其缓慢降温，约2-3h后精液降温至17℃。
(5)17℃平衡后，离心机空转降温至17℃，在17℃环境温度离心机中，以800g离心12min，弃上清，留沉淀，电子天平称量离心管加精子沉淀重记为w0(g)，减离心管重w1(g)，估得精子粥体积V1(ml)＝w0-w1。
(6)用17℃平衡的猪精子冷冻保存I液，重新悬浮精子，加入I液的体积V2(mL)＝总精子数(亿)/目标(亿/mL)÷2-V1(mL)。
加入I液后，轻弹50ml离心管，使沉淀重悬浮完全，若沉淀难以混匀，必要时可用移液枪缓慢吹吸数次。I液在冷冻基础液添加20％(v/v)的新鲜鸡蛋卵黄，磁力搅拌器搅拌30min，使其充分混匀，分装至50mL离心管中，1900g离心15min，弃沉淀，取上清即为Ⅰ液；
其中1L冷冻基础液中溶质及浓度如下：D-葡萄糖32g、三羟甲基氨基甲烷(Tris)2g、三羟甲基甲胺基乙磺酸(TES)12g、青霉素钠0.13g、硫酸链霉素0.1g、氨基-钠-十二烷基硫酸脂(OEP)5mL，使用磁力搅拌器搅拌充分溶解于超纯水中，定容为1L；
所述冷冻保存液I中20％(v/v)的新鲜鸡蛋卵黄制备方法为取新鲜鸡蛋，去干净蛋清，将完整蛋黄置于灭菌无绒吸水纸上，将剩余蛋清吸净，用注射器抽取相应体积蛋黄。
(7)将I液重悬浮后的精子置于盛有17℃水的烧杯中，后转移至4℃冰箱中降温平衡，同时冷冻保存II液置于4℃冰箱里充分平衡，此过程用酒精温度计监测精液温度变化，使精液缓慢降温至4-5℃；在降温过程中每隔40min左右轻微摇匀精液，防止精子“假死”；
冷冻保存II液为冷冻保存液I基础上添加3％终浓度的甘油或乙二醇，添加后，于震荡仪震荡5min，使其充分混匀。
(8)精液约经过3h降温至4℃，此时加入平衡好的冷冻保存II液等量稀释、混匀，冷冻保存II液体积V3＝V2(mL)+V1(mL)(精子粥体积)，充分混匀后在4℃中继续平衡30min。
(9)在4℃条件下将最终稀释好的精液灌装至0.5ml冷冻细管中、封口。灌装后的细管在码架上码好；
灌装方式为在1mL注射器前端接入小段软胶管，将0.5mL的冷冻细管含有聚乙烯粉末端插入软胶管中，细管另一端浸入平衡后的精液样品中，利用注射器将稀释后的精液吸入细管内，并用聚乙烯粉末进行封口。
(10)程序冷冻仪法：将冻精细管放置在托架上，启动程序冷冻仪，按设定的降温曲线进行冷冻，冷冻程序为4-1℃，-2℃/min；1至-140℃，-30℃/min；-140℃，15min，样品达到-140℃，待程序运行10min取出投入液氮。
(二)猪冷冻精液解冻及指标检测流程，步骤如下：
(1)冷冻精液解冻：
(a)对照组：涉及到一种BTS稀释液作为对照，1L BTS中溶质及浓度如下：乙二胺四乙酸1.25g、碳酸氢钠1.25g、氯化钾0.75g、二水柠檬酸三钠14.8g、D-葡萄糖37g、青霉素20万IU、硫酸链霉素10万IU，磁力搅拌器搅拌充分溶解于超纯水中，调pH值至7.2，渗透压至310mOsm/L，定容为1L。
实验组：实施例1制备的猪冷冻精液解冻剂。
(b)将两种配制好的解冻液置于36℃水浴锅中预热30min～40min，从液氮罐中取出0.5ml冻精细管迅速放入50℃水浴锅中，16s后取出，剪断细管两端，将精液加入装有10mL解冻液的的离心管中，盖上盖子轻轻混匀，36℃孵育5min后进行检测。
(2)解冻后精子相关指标检测：
(a)精子活力检测
精子活力检测采用德国Minitube
精液分析仪检测，计算机辅助精子分析(Computer-Assisted-Sperm Analysis，CASA)系统进行分析。具体如下：将装有孵育后的精子的管子握在手中缓慢上下颠倒三次，使精子全面复苏。用移液器移取10μL精液滴到37℃预热的载玻片上，从一侧贴面盖上盖玻片，防止有气泡影响观察，将样品放置到37℃恒温载物台上，调好焦距，启动程序进行检测，选择3个以上视野，统计的精子总数不少于800个。
精子活力(sperm motility)：指呈直线运动的精子数占精子总数的百分比精子活力＝直线前进运动的精子数/精子总数×100％。
(b)质膜完整性检测
采用精子尾部低渗肿胀实验(Hypo-osmotic Swelling Test，HOST)计算精子弯尾率，来测定精子质膜完整性，精子质膜完整性＝弯尾精子数/计数精子数×100％。
加1mL提前配制好的低渗液到2mL离心管，放入37℃恒温水浴锅中预热10min；将精液样品解冻，取100μL解冻后的精液加入到装有低渗液的离心管中，缓慢上下颠倒，使其混合均匀，然后放入37℃恒温烘箱中孵育30min；吸取10μL精液样品滴到载玻片上，从一侧贴面盖上盖玻片，在相差显微镜的400×下镜检，计算精子的弯尾率，至少计数200个精子，至少重复3次。
(c)精子顶体完整性检测
采用FITC-PNA进行染色，检测精子顶体完整性，取500μL解冻后的精液于加入到预热的1.5mL PVP中，轻轻晃动使其混合均匀；以1500r/min的速率离心3min，弃去上清液，再重复该过程一次；加入PBS缓冲液1mL重悬精子；用移液枪吸取30μL精液样品均匀涂抹在载玻片上，待完全干燥后，用甲醇固定10min；吸取30μLFITC-PNA染液均匀滴在整个载玻片上，立即放置到37℃恒温的黑暗潮湿环境中孵育30min；用PBS缓慢冲洗载玻片后放置到实验台上待其自然干燥；滴加少量增光剂到载玻片上，盖上盖玻片；利用荧光相差显微镜在400×下镜检，激发光波长480nm、发射光波长530nm，至少计数200个精子，至少重复3次。
顶体完整率＝顶体完整精子数/计数精子总数×100％。
在荧光显微镜下可以观察到四种类型精子：
精子顶体部分成帽状半球型绿色荧光：顶体完整的精子；
精子头部无完整的帽状半球型荧光或荧光着色不均匀：顶体部分破坏的精子；
精子仅赤道区可见不规则荧光：顶体缺失的精子；
精子头部观察不到荧光：顶体完全遭到破坏的精子。
(d)线粒体活性检测
利用PI/Rh123染色检测线粒体活性，将精液样品放入37℃恒温水浴锅解冻，用等温的BTS液稀释，调整精子密度到3～6×106个/mL，用移液器吸取100μL HEPES/BSA缓冲液，加入1.5mL离心管中，放入37℃恒温水浴锅中预热10min；向预热过的HEPES/BSA缓冲液中加入浓度为2mg/mL的1μL PI和0.2mg/mL的1μL Rh123，在37℃黑暗环境中孵育10min；孵育完成后，加入50μL精液样品，在37℃黑暗潮湿环境中继续孵育30min；用移液器吸取10μL精液样品滴到载玻片上，滴加少量增光剂，盖上盖玻片，利用荧光相差显微镜在400×下镜检，激发波长488nm、发射波长513nm。计算线粒体膜功能良好的精子所占百分比，至少计数200个精子，至少重复3次。
精子线粒体活性＝线粒体活性精子数/计数精子总数×100％。
(三)猪冷冻精液解冻后精子质量检测结果
应用对照组和本发明实施例1的猪冷冻精液解冻剂及精液冷冻-解冻方法，大白猪精液质量检测结果如表1所示。
表1大白猪精液精子质量检测结果
注：每组实验三次重复，结果以平均值±标准差表示，同列数据标有相同小写字母表示差异不具有统计学意义(P>0.05)，同列数据标有不同小写字母表示差异具有统计学意义(P<0.05)。
由表1可知，与对照组相比，使用本发明实施例1的猪冷冻精液解冻剂解冻并稀释大白猪冷冻精液后，精子活力有显著提升，并且精子理化性质，如：质膜完整性、顶体完整性、线粒体活性均显著优于对照组，证明使用本发明实施例1的猪冷冻精液解冻剂解冻并稀释大白猪冷冻精液后，既可以有效复苏精子，同时减少解冻过程中对精子造成的理化性质损伤。
(四)猪冷冻精液解冻后精子受精能力检测
对照组：涉及到一种mTBM解冻液，将0.661g的氯化钠、0.224g的氯化钾、0.110g的二水合氯化钙、0.242的三氨基甲烷、0.198g的葡萄糖、0.055g的丙酮酸钠、0.067g的咖啡因和0.200g的牛血清白蛋白溶于100mL的超纯水中，调pH至7.2～7.4，调渗透压至295～300mOsm。使用mTBM解冻冻精后，精子孵育5min，进行体外受精，于第6天统计囊胚发育率。
处理组：使用本发明实施例1的解冻剂配方解冻并稀释大白猪冻精后，36℃孵育30min，进行体外受精，于第6天统计囊胚发育率。
应用对照组和处理组进行体外受精，大白猪冻精解冻后受精能力检测结果如表2所示。
表2大白猪冻精解冻后受精能力检测结果
注：每组实验三次重复，结果以平均值±标准差表示，同列数据标有相同小写字母表示差异不具有统计学意义(P>0.05)，同列数据标有不同小写字母表示差异具有统计学意义(P<0.05)。
由表2可知，与对照组相比，使用本发明实施例1的猪冷冻精液解冻剂解冻并稀释大白猪冷冻精液后，进行体外受精试验，卵裂率、囊胚率和对照组(采用mTBM通用体外受精流程)无显著差异，表明本发明的猪冷冻精液解冻剂解冻并稀释大白猪冷冻精液后，不会影响精子受精能力。
实施例2
一种猪冷冻精液解冻剂及其制备方法，具体步骤如下：
(1)使用超纯水在室温条件下添加下列物质：葡萄糖15g、果糖10g、柠檬酸钠8g、碳酸氢钠3g、磷酸二氢钾1.42g、Tris-HCl 3.152g、HEPES 0.6g、咖啡因0.6g、青霉素钠20万IU、硫酸链霉素10万IU，25℃磁力搅拌30分钟使各组分充分溶解，调pH值至7.2，渗透压至310mOsm/L，定容为1L；
(2)将步骤(1)获得的溶液使用0.22μm除菌滤器进行过滤；
(3)解冻猪冷冻精液前30分钟，添加NMN 0.167g/L至步骤(2)过滤后的溶液中。
实施例3
一种猪冷冻精液解冻剂及其制备方法，具体步骤如下：
(1)使用超纯水在室温条件下添加下列物质：葡萄糖15g、果糖10g、柠檬酸钠8g、碳酸氢钠3g、磷酸二氢钾1.42g、Tris-HCl 3.152g、HEPES 0.6g、咖啡因0.6g、青霉素钠20万IU、硫酸链霉素10万IU，25℃磁力搅拌30分钟使各组分充分溶解，调pH值至7.2，渗透压至310mOsm/L，定容为1L；
(2)将步骤(1)获得的溶液使用0.22μm除菌滤器进行过滤；
(3)解冻猪冷冻精液前30分钟，添加精浆2.5％(v/v)至步骤(2)过滤后的溶液中。
试验例2
(一)一种猪精液冷冻保存方法，步骤如下：
(1)取一份配制好的原精预稀释液BTS，37℃预热40min，1L BTS中溶质及浓度如下：乙二胺四乙酸1.25g、碳酸氢钠1.25g、氯化钾0.75g、二水柠檬酸三钠14.8g、D-葡萄糖37g、青霉素20万IU、硫酸链霉素10万IU，磁力搅拌器搅拌充分溶解于超纯水中，调pH值至7.2，渗透压至310mOsm/L，定容为1L。
(2)通城猪采精一份，对采集的新鲜精液进行常规精液检查，正常的精液色泽为乳白色、无杂质、无异味、略带血腥味，活率90％以上，活力80％以上，称重并测量精子密度。
(3)将预热好的原精预稀释液与原精进行等温1:1稀释。
(4)将稀释后的精液室温静置1h，后将精液分装到50mL的离心管中，测量离心管重量w1(g)，离心管放置在装有等温水的烧杯中，后转移到17℃恒温箱中使其缓慢降温，约2-3h后精液降温至17℃。
(5)17℃平衡后，离心机空转降温至17℃，在17℃环境温度离心机中，以800g离心12min，弃上清，留沉淀，电子天平称量离心管加精子沉淀重记为w0(g)，减离心管重w1(g)，估得精子粥体积V1(ml)＝w0-w1。
(6)用17℃平衡的猪精子冷冻保存I液，重新悬浮精子，加入I液的体积V2(mL)＝总精子数(亿)/目标(亿/mL)÷2-V1(mL)。
加入I液后，轻弹50ml离心管，使沉淀重悬浮完全，若沉淀难以混匀，必要时可用移液枪缓慢吹吸数次。I液在冷冻基础液添加20％(v/v)的新鲜鸡蛋卵黄，磁力搅拌器搅拌30min，使其充分混匀，分装至50mL离心管中，1900g离心15min，弃沉淀，取上清即为Ⅰ液；
其中1L冷冻基础液中溶质及浓度如下：D-葡萄糖32g、三羟甲基氨基甲烷(Tris)2g、三羟甲基甲胺基乙磺酸(TES)12g、青霉素钠0.13g、硫酸链霉素0.1g、氨基-钠-十二烷基硫酸脂(OEP)5mL，使用磁力搅拌器搅拌充分溶解于超纯水中，定容为1L；
所述冷冻保存液I中20％(v/v)的新鲜鸡蛋卵黄制备方法为取新鲜鸡蛋，去干净蛋清，将完整蛋黄置于灭菌无绒吸水纸上，将剩余蛋清吸净，用注射器抽取相应体积蛋黄。
(7)将I液重悬浮后的精子置于盛有17℃水的烧杯中，后转移至4℃冰箱中降温平衡，同时冷冻保存II液置于4℃冰箱里充分平衡，此过程用酒精温度计监测精液温度变化，使精液缓慢降温至4-5℃；在降温过程中每隔40min左右轻微摇匀精液，防止精子“假死”；
冷冻保存II液为冷冻保存液I基础上添加3％终浓度的甘油或乙二醇，添加后，于震荡仪震荡5min，使其充分混匀。
(8)精液约经过3h降温至4℃，此时加入平衡好的冷冻保存II液等量稀释、混匀，冷冻保存II液体积V3＝V2(mL)+V1(mL)(精子粥体积)，充分混匀后在4℃中继续平衡30min。
(9)在4℃条件下将最终稀释好的精液灌装至0.5ml冷冻细管中、封口。灌装后的细管在码架上码好；
灌装方式为在1mL注射器前端接入小段软胶管，将0.5mL的冷冻细管含有聚乙烯粉末端插入软胶管中，细管另一端浸入平衡后的精液样品中，利用注射器将稀释后的精液吸入细管内，并用聚乙烯粉末进行封口。
(10)程序冷冻仪法：将冻精细管放置在托架上，启动程序冷冻仪，按设定的降温曲线进行冷冻，冷冻程序为4-1℃，-2℃/min；1至-140℃，-30℃/min；-140℃，15min，样品达到-140℃，待程序运行10min取出投入液氮。
(二)猪冷冻精液解冻及指标检测流程，步骤如下：
(a)对照组：涉及到一种BTS稀释液作为对照，1L BTS中溶质及浓度如下：乙二胺四乙酸1.25g、碳酸氢钠1.25g、氯化钾0.75g、二水柠檬酸三钠14.8g、D-葡萄糖37g、青霉素20万IU、硫酸链霉素10万IU，磁力搅拌器搅拌充分溶解于超纯水中，调pH值至7.2，渗透压至310mOsm/L，定容为1L。
对比例组：1L基础解冻液中溶质及浓度如下：葡萄糖15g、果糖10g、柠檬酸钠8g、碳酸氢钠3g、磷酸二氢钾1.42g、Tris-HCl 3.152g、HEPES 0.6g、咖啡因0.6g、青霉素钠20万IU、硫酸链霉素10万IU，磁力搅拌器搅拌充分溶解于超纯水中，调pH值至7.2，渗透压至310mOsm/L，定容为1L。
实验组：实施例1-3制备的猪冷冻精液解冻剂。
(b)将上述配制好的解冻液置于36℃水浴锅中预热30min～40min，从液氮罐中取出0.5ml冻精细管迅速放入50℃水浴锅中，16s后取出，剪断细管两端，将精液加入装有10mL解冻液的的离心管中，盖上盖子轻轻混匀，36℃孵育5min后进行检测。
(2)解冻后精子相关指标检测：
(a)精子活力检测：同试验例1。
(b)质膜完整性检测：同试验例1。
(c)精子顶体完整性检测：同试验例1。
(d)线粒体活性检测：同试验例1。
(三)猪冷冻精液解冻后精子质量检测结果
应用对照组、对比例组、本发明实施例1-3的猪冷冻精液解冻剂及精液冷冻-解冻方法，通城猪精液质量检测结果如表3所示。
表3通城猪精液精子质量检测结果
注：每组实验三次重复，结果以平均值±标准差表示，同列数据标有相同小写字母表示差异不具有统计学意义(P>0.05)，同列数据标有不同小写字母表示差异具有统计学意义(P<0.05)。
由表3可知，与对照组相比，使用本发明实施例1-3的猪冷冻精液解冻剂解冻并稀释通城猪冷冻精液后，实施例1-3精子活力均有显著提升，并且精子理化性质，如：质膜完整性、顶体完整性、线粒体活性均显著优于对照组，证明使用本发明猪冷冻精液解冻剂解冻并稀释通城猪冷冻精液后，既可以有效复苏精子，同时减少解冻过程中对精子造成的理化性质损伤。
(四)猪冷冻精液解冻后精子受精能力检测
对照组：涉及到一种mTBM解冻液，将0.661g的氯化钠、0.224g的氯化钾、0.110g的二水合氯化钙、0.242的三氨基甲烷、0.198g的葡萄糖、0.055g的丙酮酸钠、0.067g的咖啡因和0.200g的牛血清白蛋白溶于100mL的超纯水中，调pH至7.2～7.4，调渗透压至295～300mOsm。使用mTBM解冻冻精后，精子孵育5min，进行体外受精，于第6天统计囊胚发育率。
处理组：使用本发明实施例1的解冻剂配方解冻并稀释通城猪冻精后，36℃孵育30min，进行体外受精，于第6天统计囊胚发育率。
应用对照组和处理组进行体外受精，通城猪冻精解冻后受精能力检测结果如表4所示。
表4通城猪冻精解冻后受精能力检测结果
注：每组实验三次重复，结果以平均值±标准差表示，同列数据标有相同小写字母表示差异不具有统计学意义(P>0.05)，同列数据标有不同小写字母表示差异具有统计学意义(P<0.05)。
由表4可知，与对照组相比，使用本发明实施例1的猪冷冻精液解冻剂解冻并稀释通城猪冷冻精液后，进行体外受精试验，卵裂率、囊胚率和对照组(采用mTBM通用体外受精流程)无显著差异，表明本发明的猪冷冻精液解冻剂解冻并稀释通城猪冷冻精液后，不会影响精子受精能力。
实施例4
一种猪冷冻精液解冻剂及其制备方法，具体步骤如下：
(1)使用超纯水在室温条件下添加下列物质：葡萄糖15g、果糖10g、柠檬酸钠8g、碳酸氢钠3g、磷酸二氢钾1.42g、Tris-HCl 3.152g、HEPES 0.6g、咖啡因0.6g、青霉素钠20万IU、硫酸链霉素10万IU，25℃磁力搅拌30分钟使各组分充分溶解，调pH值至7.1，渗透压至315mOsm/L，定容为1L；
(2)将步骤(1)获得的溶液使用0.22μm除菌滤器进行过滤；
(3)解冻猪冷冻精液前30分钟，添加精浆1.5％(v/v)、NMN 0.250g/L至步骤(2)过滤后的溶液中。
实施例5
一种猪冷冻精液解冻剂及其制备方法，具体步骤如下：
(1)使用超纯水在室温条件下添加下列物质：葡萄糖15g、果糖10g、柠檬酸钠8g、碳酸氢钠3g、磷酸二氢钾1.42g、Tris-HCl 3.152g、HEPES 0.6g、咖啡因0.6g、青霉素钠20万IU、硫酸链霉素10万IU，25℃磁力搅拌30分钟使各组分充分溶解，调pH值至7.0，渗透压至320mOsm/L，定容为1L；
(2)将步骤(1)获得的溶液使用0.22μm除菌滤器进行过滤；
(3)解冻猪冷冻精液前30分钟，添加精浆5％(v/v)、NMN 0.083g/L至步骤(2)过滤后的溶液中。
实施例6
一种猪冷冻精液解冻剂及其制备方法，具体步骤如下：
(1)使用超纯水在室温条件下添加下列物质：葡萄糖15g、果糖10g、柠檬酸钠8g、碳酸氢钠3g、磷酸二氢钾1.42g、Tris-HCl 3.152g、HEPES 0.6g、咖啡因0.6g、青霉素钠20万IU、硫酸链霉素10万IU，25℃磁力搅拌30分钟使各组分充分溶解，调pH值至6.9，渗透压至325mOsm/L，定容为1L；
(2)将步骤(1)获得的溶液使用0.22μm除菌滤器进行过滤；
(3)解冻猪冷冻精液前30分钟，添加NMN 0.083g/L至步骤(2)过滤后的溶液中。
实施例7
一种猪冷冻精液解冻剂及其制备方法，具体步骤如下：
(1)使用超纯水在室温条件下添加下列物质：葡萄糖15g、果糖10g、柠檬酸钠8g、碳酸氢钠3g、磷酸二氢钾1.42g、Tris-HCl 3.152g、HEPES 0.6g、咖啡因0.6g、青霉素钠20万IU、硫酸链霉素10万IU，25℃磁力搅拌30分钟使各组分充分溶解，调pH值至6.8，渗透压至330mOsm/L，定容为1L；
(2)将步骤(1)获得的溶液使用0.22μm除菌滤器进行过滤；
(3)解冻猪冷冻精液前30分钟，添加NMN 0.250g/L至步骤(2)过滤后的溶液中。
实施例8
一种猪冷冻精液解冻剂及其制备方法，具体步骤如下：
(1)使用超纯水在室温条件下添加下列物质：葡萄糖15g、果糖10g、柠檬酸钠8g、碳酸氢钠3g、磷酸二氢钾1.42g、Tris-HCl 3.152g、HEPES 0.6g、咖啡因0.6g、青霉素钠20万IU、硫酸链霉素10万IU，25℃磁力搅拌30分钟使各组分充分溶解，调pH值至7.2，渗透压至310mOsm/L，定容为1L；
(2)将步骤(1)获得的溶液使用0.22μm除菌滤器进行过滤；
(3)解冻猪冷冻精液前30分钟，添加精浆1.5％(v/v)至步骤(2)过滤后的溶液中。
实施例9
一种猪冷冻精液解冻剂及其制备方法，具体步骤如下：
(1)使用超纯水在室温条件下添加下列物质：葡萄糖15g、果糖10g、柠檬酸钠8g、碳酸氢钠3g、磷酸二氢钾1.42g、Tris-HCl 3.152g、HEPES 0.6g、咖啡因0.6g、青霉素钠20万IU、硫酸链霉素10万IU，25℃磁力搅拌30分钟使各组分充分溶解，调pH值至7.2，渗透压至310mOsm/L，定容为1L；
(2)将步骤(1)获得的溶液使用0.22μm除菌滤器进行过滤；
(3)解冻猪冷冻精液前30分钟，添加精浆5％(v/v)至步骤(2)过滤后的溶液中。
采用本发明实施例4-9的猪冷冻精液解冻剂解冻并稀释大白猪或通城猪冷冻精液后，精子活力均有显著提升，并且精子理化性质，如：质膜完整性、顶体完整性、线粒体活性均显著优于对照组，证明使用本发明猪冷冻精液解冻剂解冻并稀释大白猪或通城猪冷冻精液后，既可以有效复苏精子，同时减少解冻过程中对精子造成的理化性质损伤。
使用本发明实施例4-9的猪冷冻精液解冻剂解冻并稀释大白猪或通城猪冷冻精液后，进行体外受精试验，卵裂率、囊胚率和对照组(采用mTBM通用体外受精流程)无显著差异，表明本发明的猪冷冻精液解冻剂解冻并稀释大白猪或通城猪冷冻精液后，不会影响精子受精能力。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (2)
1.一种猪冷冻精液解冻剂，其特征在于，在解冻剂基础配方的基础上添加精浆和NMN，或者单独添加精浆或NMN；所述精浆的添加量为1.5％～5％(v/v)；所述NMN的添加量为0.083～0.250g/L；
所述解冻剂基础配方使用超纯水作为溶剂，1L解冻剂基础配方中各组分添加量为：葡萄糖15g、果糖10g、柠檬酸钠8g、碳酸氢钠3g、磷酸二氢钾1.42g、Tris-HCl 3.152g、HEPES0.6g、咖啡因0.6g、青霉素钠20万IU、硫酸链霉素10万IU。
2.权利要求1所述的一种猪冷冻精液解冻剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)使用超纯水室温条件下添加葡萄糖、果糖、柠檬酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、Tris-HCl、HEPES、咖啡因、青霉素钠、硫酸链霉素，25℃磁力搅拌30分钟使各组分充分溶解，调pH值至6.8～7.2，渗透压至310～330mOsm/L，定容为1L；
(2)将步骤(1)获得的溶液使用0.22μm除菌滤器进行过滤；
(3)精浆和/或NMN在解冻猪冷冻精液前30分钟添加至步骤(2)过滤后的溶液中。
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