CN115136959B - 一种豆大蓟马取食抑制剂及其筛选方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种豆大蓟马取食抑制剂及其筛选方法与应用，属于生物防治技术领域。本发明的豆大蓟马取食抑制剂包括如下质量份数的组分：木犀草素2~3.6份、4‑香豆酸65~70份、芥子酸24~25.2份、根皮苷4~5.6份。本发明的取食抑制剂，天然、绿色、安全，对田间豆大蓟马的防治效果可以达到82.6%，为一种新的植物保护剂，是防治豆大蓟马的新的生物药剂。

Description

一种豆大蓟马取食抑制剂及其筛选方法与应用
技术领域
本发明涉及生物防治技术领域，尤其涉及一种豆大蓟马取食抑制剂及其筛选方法与应用。
背景技术
豆大蓟马在亚洲热带地区广泛分布，是豆科作物上重要害虫之一，为寡食性昆虫，偏好取食豆科植物，危害豇豆的整个生育期，主要通过取食植株和传播植物病毒进行危害。豆大蓟马造成的危害在逐年扩大，随着气候变暖等因素，出现了危害持续时间增加、地理范围北移和危害植物范围扩大等现象。豆大蓟马体型小、世代周期短，具有躲藏在心叶和花中的习性，使得化学农药防治的难度增大且效果不理想。目前，海南防控豆大蓟马主要是大量混合施用多种化学农药，防控成本较高，且不利于生态环境安全。
取食抑制剂是一种常见的害虫绿色防控手段。如羟基-α-山椒素等作为取食抑制剂在鳞翅目和半翅目多种害虫防治中广泛应用。但目前国内外并没有豆大蓟马取食抑制剂研制及其应用技术的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种豆大蓟马取食抑制剂及其筛选方法与应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种豆大蓟马取食抑制剂，包括如下质量份数的组分：
木犀草素2~3.6份、4-香豆酸65~70份、芥子酸24~25.2份、根皮苷4~5.6份。
作为优选，包括如下质量份数的组分：
木犀草素2.8份、4-香豆酸67.5份、芥子酸24.6份、根皮苷4.8份。
本发明还提供了所述的豆大蓟马取食抑制剂的筛选方法，包括如下步骤：
（1）将豆大蓟马成虫接入含有豆科植物叶片的养虫盒中，记录豆大蓟马在不同豆科植物叶片中聚集的虫数，得到豆大蓟马对不同豆科植物取食的影响；
（2）提取豆科植物叶片中的次生代谢物，检测所述次生代谢物的种类和含量，筛选对豆大蓟马取食偏好最低的豆科植物中含量显著高于其他豆科植物的次生代谢物，得到初步筛选的豆大蓟马取食抑制剂；
（3）对所述初步筛选的豆大蓟马取食抑制剂进行定量分析，再按照不同组分的比例配制得到豆大蓟马取食抑制剂。
作为优选，所述豆科植物为豇豆、芸豆、蚕豆和豌豆。
作为优选，步骤（2）所述提取的方法为超声提取；
所述超声提取的步骤为：将豆科植物研磨成粉得到粉剂，将所述粉剂与甲醇混合，在24℃条件下超声提取25~35min；
所述甲醇的浓度为80%。
作为优选，步骤（2）所述检测的方法为高效液相色谱质谱联用；
色谱条件为：
流速345~355μL/min，流动相A为：0.1vt%乙酸水溶液，流动相B为：0.1vt%乙酸乙腈溶液，进样量为9~11μL；
质谱条件为：
离子源ESI，电压2.1~2.3kv，柱温310~330℃，扫描范围80~1200 m/z。
作为优选，步骤（2）所述筛选的方法为OPLS-DA法。
作为优选，步骤（3）所述定量分析的方法为Spearman Rank Correlation Test法。
本发明还提供了所述的豆大蓟马取食抑制剂在制备防治豆大蓟马的药剂中的应用。
本发明还提供给了所述的筛选方法筛选得到的豆大蓟马取食抑制剂在制备防治豆大蓟马的药剂中的应用。
本发明提供了一种豆大蓟马取食抑制剂及其筛选方法与应用。
本发明豆大蓟马取食抑制剂为从豆科植物中筛选出的抑制剂，为一种绿色、安全的抑制剂。该抑制剂能够有效的抑制豆大蓟马群集取食，将该抑制剂按照次生代谢物在豌豆内的含量制备成药剂后，进行田间防效，对豆大蓟马的防效能达到82.6%，是一种新的植物保护剂，是防治豆大蓟马的新的生物药剂。
附图说明
图1为豆大蓟马成虫在不同豆科植物叶碟上的聚集情况（从左到右依次为豇豆、芸豆、蚕豆和豌豆）。
图2为负离子模式下VIP值>1.5且豌豆叶片中含量显著高于其他植物的次生代谢物。
图3为正离子模式下VIP值>1.7且豌豆叶片中含量显著高于其他植物的次生代谢物。
图4为正离子模式下VIP值>1.7且豌豆叶片中含量显著高于其他植物的次生代谢物。
图5为豆大蓟马取食抑制剂对豆大蓟马的取食抑制效果。
图6为豆大蓟马取食抑制剂对豆大蓟马的田间控制效果。
具体实施方式
本发明提供了一种豆大蓟马取食抑制剂，包括如下质量份数的组分：
木犀草素2~3.6份，优选为2.8份；
4-香豆酸65~70份，优选为67.5份；
5-芥子酸24~25.2份，优选为24.6份；
6-根皮苷4~5.6份，优选为4.8份。
本发明还提供了所述的豆大蓟马取食抑制剂的筛选方法，包括如下步骤：
（1）将豆大蓟马成虫接入含有豆科植物叶片的养虫盒中，记录豆大蓟马在不同豆科植物叶片中聚集的虫数，得到豆大蓟马对不同豆科植物取食的影响；
（2）提取豆科植物叶片中的次生代谢物，检测所述次生代谢物的种类和含量，筛选对豆大蓟马取食偏好最低的豆科植物中含量显著高于其他豆科植物的次生代谢物，得到初步筛选的豆大蓟马取食抑制剂；
（3）对所述初步筛选的豆大蓟马取食抑制剂进行定量分析，再按照不同组分的比例配制得到豆大蓟马取食抑制剂。
在本发明中，所述豆科植物为豇豆、芸豆、蚕豆和豌豆。在本发明中，步骤（2）所述提取的方法为超声提取；所述超声提取的步骤为：将豆科植
物研磨成粉得到粉剂，将所述粉剂与甲醇混合，在24℃条件下超声提取25~35min；所述甲醇的浓度为80%。
在本发明中，步骤（2）所述检测的方法为高效液相色谱质谱联用；
色谱条件为：
流速345~355μL/min，流动相A为：0.1vt%乙酸水溶液，流动相B为：0.1vt%乙酸乙腈溶液，进样量为9~11μL；
质谱条件为：
离子源ESI，电压2.1~2.3kv，柱温310~330℃，扫描范围80~1200 m/z。
全扫分辨率为60000，二级质谱dd-MS/MS分辨率15000，Isolation windows 1.0m/z，Fixed first mass 50.0 m/z。
在本发明中，步骤（2）所述筛选的方法为OPLS-DA法。
在本发明中，步骤（3）所述相关性分析的方法为Spearman Rank CorrelationTest法。
本发明还提供了所述的豆大蓟马取食抑制剂在制备防治豆大蓟马的药剂中的应用。
本发明还提供给了所述的筛选方法筛选得到的豆大蓟马取食抑制剂在制备防治豆大蓟马的药剂中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
在本发明实施例中所述的豆大蓟马采集于海南豇豆种植基地中。
实施例1
选取无病饱满的豇豆、芸豆、蚕豆和豌豆种子，在实验室中进行种植，备用。
采集得到的豆大蓟马利用芸豆饲养于温度26℃，相对湿度73%，光照L：D=18：6的培养箱中。实验室多代培养建立稳定种群后用于试验。分别摘取豇豆、芸豆、蚕豆和豌豆植株第二片真叶的展开叶，用直径1.0cm的打孔器打取叶碟，背面朝上贴在2.5%水琼脂培养皿中。选择羽化3d的豆大蓟马成虫，15雄15雌为一组，二氧化碳昏迷后接入养虫盒中，保鲜膜覆盖密封以防逃逸，使用零号昆虫针扎10个小孔用于透气。24h后记录每种豆科植物叶
碟上的虫数。用独立样本非参数K-W检验比较4种豆科植物叶片上的豆大蓟马聚集数目差异性。结果如图1所示。
图1显示，豆大蓟马对不同豆科植物的取食危害选择性存在明显差异。偏好选择芸豆和豇豆叶片，在芸豆和豇豆上群集取食的豆大蓟马数量显著高于其他两种豆科植物；对蚕豆叶片的选择偏好程度居其次；对豌豆叶片的选择偏好性最低。
实施例2
分别选取豇豆、芸豆、蚕豆和豇豆幼苗各10株，取第二片真叶的展开叶后，迅速放入液氮冷冻淬灭，使用全自动组织研磨仪低温研磨成冻干粉。80%甲醇水浴24℃超声提取，30min。离心取上清液检测。使用高效液相色谱质谱联用技术检测4种豆科植物叶片中的次生代谢物。
色谱分离梯度，流速350μL/min ，流动相组成A：0.1vt%乙酸水溶液，B：0.1vt%乙酸乙腈溶液，进样量为10μL。样品正、负离子模式均进行采集。离子源ESI，电压2.2kv，温度320℃，S-lens RF level 60.0。全扫分辨率60000，Scan range 80-1200 m/z；二级质谱dd-MS/MS分辨率15000，Isolation windows 1.0m/z，Fixed first mass 50.0 m/z。
通过MS-DIAL平台进行搜库，通过OPLS-DA的VIP 值进行分析，筛选对豆大蓟马取食偏好最低的豌豆植物中含量显著高于其他豆科植物的次生代谢物。具体结果如图2~4所示。
图2显示，4种豆科植物含有的抗虫次生物质的种类和含量有明显差异。负离子模式下VIP值>1.5且豌豆叶片中含量显著高于其他植物的次生代谢物主要包括：羟基肉桂酸糖苷Sinapoyl hexoside 、槲皮素3-O- [2''-O-(6'''-O-p-香豆酰基)-b-D-吡喃葡萄糖基]-α-L-鼠李糖吡喃糖苷、根皮素-2'-O-葡萄糖苷（根皮苷）、芥子酸、育亨宾生物碱Isoreserpin；还包括吲哚乳酸、Dihydrostilbene base+3O,1carboxy,O-Hex、庚二酸、苏氨酸、糖基化合物Benzyl 6-O-(6-deoxy-alpha-L-mannopyranosyl)-beta-D-glucopyranoside、2-甲基戊二酸、谷胱甘肽氧化态、单糖和二糖的脂肪酰基糖苷、前列腺素及相关化合物、谷氨酰胺、5'-二磷酸腺苷、阿魏酸、异豆香脂树脂。图2中结果的显著性分析使用Welch’s ANOVA进行分析，通过Games-Howell Test进行比较得到的，大写字母表示P<0.01，小写字母表示P<0.05。
图3~4显示，正离子模式下VIP值>1.7且豌豆叶片中含量显著高于其他植物的次生代谢物主要包括槲皮素-7-O-鼠李糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、木犀草素、4-香豆酸、花翠素-3-O-β-吡喃葡萄糖苷、芥子酸 (A和B为同分异构体)、二萜生物碱、异黄酮糖苷Ononin 、单萜吲哚生物碱11,12-亚甲基二氧甲庚啉、矢车菊素-3-O-半乳糖苷。图3~4结果的显著性分析使用Welch’s ANOVA进行分析，通过Games-Howell Test进行比较得到的，大写字母表示P<0.01，小写字母表示P<0.05。
之后利用Spearman Rank Correlation Test方法分析次生代谢物相对含量和豆大蓟马取食选择偏好性的相关性。具体分析结果如表1所示。
表1 次生代谢物的相对含量对豆大蓟马取食选择偏好性的相关性分析结果
Figure 766781DEST_PATH_IMAGE002
表1显示，4种豆科植物间各个次生代谢物的相对含量差异显著。木犀草素、根皮苷、4-香豆酸和芥子酸的相对含量与豆大蓟马的取食选择偏好性相关，而木犀草素和根皮苷的相对含量与豆大蓟马的取食选择偏好性呈极显著负相关。
实施例3
将购买的木犀草素、根皮苷、4-香豆酸和芥子酸标准品按照其在豌豆中的含量和比例制备成豆大蓟马取食抑制剂，豆大蓟马取食抑制剂中木犀草素、根皮苷、4-香豆酸和芥子酸的质量比为2.86: 67.62: 24.67: 4.85。利用25%的丙酮溶液将豆大蓟马取食抑制剂溶解，分别配置成浓度为3%、5%和10%的抑制剂备用。将洗净的芸豆切成1cm长的豆角块，分别在3%、5%、10%
的抑制剂以及水溶液中浸泡30s后取出、晾干，分别放入铺有2%水琼脂的9cm培养皿中。每皿接入35头豆大蓟马，在接虫后的1小时、3小时、6小时、20小时和26小时观察统计豆角块上豆大蓟马的聚集数目。重复三次。按下面公式计算聚集抑制率。具体抑制效果如图5所示。
3%、5%和10%的抑制剂浸泡后作为处理组；水溶液浸泡作为对照组。
抑制率=[（对照芸豆块中的虫数-处理芸豆块中的虫数）/对照芸豆块中的虫数]×100%。
图5所示，不同浓度的豆大蓟马抑制剂对豆大蓟马的平均取食抑制率为47.86~83.88%，26小时后的最高平均取食抑制率为76.52%。
应用实施例1
利用实施例3得到的5%的豆大蓟马取食抑制剂对海南三亚市崖州区坝头豇豆实验基地的豆大蓟马进行防治，采用无人机每亩地喷施3.5L作为处理组。以不施用任何抑制剂的豇豆地块作为对照组，检验取食抑制剂对豇豆地豆大蓟马的防治效果。结果如图6所示。
防治效果=（对照组豇豆地中的豆大蓟马虫数-处理组豇豆地中豆大蓟马虫数）/（对照组豇豆地中的豆大蓟马虫数+处理组豇豆地中豆大蓟马虫数）。
图6显示，本发明得到的豆大蓟马取食抑制剂在豇豆中防治豆大蓟马的效果能达到82.6%。可以显著控制豆大蓟马对豇豆的危害。
由以上实施例可知，本发明提供一种豆大蓟马取食抑制剂及其筛选方法与应用，本发明的豆大蓟马取食抑制剂绿色、安全，对豆大蓟马的田间防效能达到82.6%，为田间生物制剂的制备提供依据，也为防治豆大蓟马的生物药剂的开发提供有力证据。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种豆大蓟马取食抑制剂的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将豆大蓟马成虫接入含有豆科植物叶片的养虫盒中，记录豆大蓟马在不同豆科植物叶片中聚集的虫数，得到豆大蓟马对不同豆科植物取食的影响；
（2）提取豆科植物叶片中的次生代谢物，检测所述次生代谢物的种类和含量，筛选对豆大蓟马取食偏好最低的豆科植物中含量显著高于其他豆科植物的次生代谢物，得到初步筛选的豆大蓟马取食抑制剂；
（3）对所述初步筛选的豆大蓟马取食抑制剂进行定量分析，再按照质量份数为2~3.6份木犀草素、65~70份4-香豆酸、24~25.2份芥子酸、4~5.6份根皮苷配制得到豆大蓟马取食抑制剂。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述豆科植物为豇豆、芸豆、蚕豆和豌豆。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤（2）所述提取的方法为超声提取；
所述超声提取的步骤为：将豆科植物研磨成粉得到粉剂，将所述粉剂与甲醇混合，在24℃条件下超声提取25~35min；
所述甲醇的浓度为80%。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，步骤（2）所述检测的方法为高效液相色谱质谱法；
色谱条件为：
流速345~355μL/min，流动相A为：0.1vt%乙酸水溶液，流动相B为：0.1vt%乙酸乙腈溶液，进样量为9~11μL；
质谱条件为：
离子源ESI，电压2.1~2.3kv，柱温310~330℃，扫描范围80~1200 m/z。
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤（2）所述筛选的方法为OPLS-DA法。
6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，步骤（3）所述定量分析的方法为Spearman Rank Correlation Test法。
7.权利要求1~6任意一项所述的筛选方法筛选得到的豆大蓟马取食抑制剂在制备防治豆大蓟马的药剂中的应用。
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