CN115135663A - 固相支持物上的寡核苷酸合成 - Google Patents

Abstract

官能化的固相支持物可用于寡核苷酸的合成。所述官能化的固相支持物含有连接到末端官能团或第一核苷酸或核苷组成部分的延长连接物。所述延长连接物允许寡核苷酸合成在距所述固相支持物更远的距离处以更高的效率进行。

Description

固相支持物上的寡核苷酸合成

相关申请

本申请要求2020年2月24日提交的美国临时申请号62/980,880的优先权，所述临时申请整体通过参考并入本文。

技术领域

本发明涉及用于寡核苷酸合成的官能化的固相支持物。

背景技术

固相寡核苷酸合成通常发生在由可控孔玻璃(CPG)粒子构成的熔块上。CPG由孔隙网络结构组成，可促进合成过程中的快速物料转移，孔隙直径范围为500至

对于寡核苷酸合成来说，CPG粒子均匀地包被有底物，例如(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，其含有充当非核苷连接物或核苷琥珀酸酯的附连点的反应性氨基，连接物随后充当合成过程中寡核苷酸的附连点。所述寡核苷酸通过它们的3'-末端羟基共价结合到所述连接物，并在整个链组装过程中保持附连，随后它们被切掉并去保护。在高通量/并行/小规模寡核苷酸合成中，所述固相支持物被包含在多孔板的孔中。

为了最大化合成规模，底物的分子结构应该具有高密度的均匀分布的附连点用于最适的寡核苷酸合成。然而，如此高的密度会导致合成过程中寡聚物的拥挤和空间位阻，特别是对于较长的寡聚物来说，这可能在最终产物中导致错误。

避免空间位阻的一种方式是使用更大的孔眼尺寸。然而，由于CPG的表面积与孔眼尺寸反相关并且硅醇附连基团的密度是表面积的函数，因此大孔CPG具有更少的配体装载能力。此外，不是所有的硅醇附连点都是均匀分布的，其中一些拥挤在一起而不可用于全长寡聚物合成。

避免空间位阻的另一种方式是使用间隔物，将寡核苷酸系连到其上，用于将所述寡核苷酸和合成过程放置得远离所述底物。这种方式允许更大的灵活性和更多的用于合成的空间。

一种常用的间隔物是长链烷基胺(LCAA；图1A和1B)。LCAA被附连到氨基丙基CPG(图1A)。在某些情况下，LCAA通过连接物例如乙酰基甘油来附连(图1B)。然后将所述附连的LCAA的氨基用作适合于寡核苷酸合成的连接物例如琥珀酰基间隔物的锚定点。

发明内容

本发明涉及固相寡核苷酸合成，其中使用包含一个或多个聚亚烷基二醇磷酸酯/膦酸酯单元的延长连接物使合成发生在距固相支持物(例如CPG粒子)的表面更远的距离处。所述延长连接物充当寡核苷酸合成的起点。所述聚亚烷基二醇磷酸酯/膦酸酯单元可以通过亚磷酰胺化学附连。本文描述的延长连接物与用于寡核苷酸合成的通用连接物和传统连接物臂相容。

一方面，公开了式(I)的官能化的固相支持物或其盐，

其中：

A是固相支持物材料；

L¹是由选自碳、氢、氧、氮、硫、磷、硅和卤素的原子组成的二价化学连接物，

其中

(a)所述二价连接物的原子排列形成任选取代的链或被任选取代的环中断的任选取代的链；并且

(b)所述链或链和环一起包含选自碳、氧、氮、硫、磷和硅的原子的12至40元连续线性排列；

L²在每次出现时独立地是–(CH₂CH₂O)_m–、–(CHCH₃CH₂O)_m–或–(CH₂CHCH₃O)_m–；

G¹是氢、PG¹或–P(O)(R¹)–L³–R²；

R¹在每次出现时独立地是R^1a或–OR^1a；

R^1a在每次出现时独立地是C_1-10烷基、C_2-10烯基、C_2-10炔基、C_3-10环烷基或C_5-10环烯基，其中R^1a任选地被1-6个独立地选自卤素、氰基、氧代、OH、–OC_1-4烷基、–OC_1-4卤代烷基或C_3-6环烷基的取代基取代，所述C_3-6环烷基任选地被卤素或C_1-4烷基取代；

L³是–(OCH₂CH₂)_p–、–(OCHCH₃CH₂)_p–、–(OCH₂CHCH₃)_p–、–OC_2-10亚烷基–、–OC_0-4亚烷基–C_3-10亚环烷基–C_0-4亚烷基–或–OC_0-4亚烷基–亚苯基–C_0-4亚烷基–，其中L³中的亚烷基任选地被1-6个卤素取代，并且所述亚环烷基和亚苯基任选地被1-4个独立地选自卤素、C_1-4烷基、C_1-4卤代烷基、氰基、–OC_1-4烷基和–OC_1-4卤代烷基的取代基取代；

R²是–NR^2aR^2b；

R^2a是氢、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、C_3-6环烷基或–C_1-3亚烷基–C_3-6环烷基；

R^2b是氢、PG²、C(O)-L⁴-OH、C(O)-L⁴-OPG³、C(O)-L⁴-G^1a、C(O)-L⁵–H、C(O)-L⁵–PG¹、C(O)-L⁵–P(O)(R¹)–G^1a、C(O)-L⁵–P(O)(OH)–G^1a或C(O)-L⁶-G^1a，或

R^2a和R^2b与它们附连到的氮一起形成受保护的氮原子；

L⁴是C(O)或L⁷–C(O)；

L⁵是L⁷–O；

L⁶是L⁷–Si(C_1-4烷基)₂；

L⁷是由选自碳、氢、氧、氮、硫、磷、硅和卤素的原子组成的二价化学连接物，

其中

(a)所述二价连接物的原子排列形成任选取代的链、任选取代的环或任选取代的链和环的组合；并且

(b)所述链、环或其组合包含选自碳、氧、氮、硫、磷和硅的原子的1至20元连续线性排列；

G^1a是核苷酸组成部分或核苷组成部分；

PG¹是羟基保护基团；

PG²是氨基保护基团；

PG³是羧酸保护基团；

m和p独立地是3至10的整数；并且

n是1至20的整数。

另一方面，本发明提供了一种制备其中G¹是氢或PG¹的式(I)的官能化的固相支持物的方法，所述方法包括：

a)将式(II)的官能化的固相支持物与其中R²⁰和R²¹独立地是C_1-6烷基的式(III)的化合物反应，

以提供式(IV)的官能化的固相支持物，

b)氧化所述式(IV)的官能化的固相支持物，以提供其中G¹是PG¹并且n是1的式(I)的官能化的固相支持物；以及

c)任选地除去保护基团PG¹，以提供所述其中G¹是氢并且n是1的式(I)的官能化的固相支持物。

另一方面，本发明提供了一种制备其中G¹是–P(O)(R¹)–L³–R²的式(I)的官能化的固相支持物的方法，所述方法包括将其中G¹是氢的式(I)的官能化的固相支持物与其中R²⁰和R²¹独立地是C_1-6烷基的式(V)的化合物反应，

以提供式(VI)的官能化的固相支持物

以及

氧化所述式(VI)的官能化的固相支持物，以提供所述其中G¹是–P(O)(R¹)–L³–R²并且R^2b是C(O)-L⁴-G^1a的式(I)的官能化的固相支持物。

另一方面，本发明提供了一种制备其中G¹是–P(O)(R¹)–L³–R²的式(I)的官能化的固相支持物的方法，所述方法包括将其中R^2b是C(O)-L⁷–C(O)OH的式(I)的官能化的固相支持物与核苷或核苷酸在3’或5’OH处反应，以提供具有式(IX-a)的式(I)的官能化的固相支持物，

另一方面，本发明提供了一种制备其中G¹是–P(O)(R¹)–L³–R²的式(I)的官能化的固相支持物的方法，所述方法包括将其中R^2b是C(O)-L⁷–OH的式(I)的官能化的固相支持物与其中R²⁰和R²¹独立地是C_1-6烷基并且G^1a是核苷酸组成部分或核苷组成部分的式(VII)的化合物反应，

以提供式(VIII-a)的官能化的固相支持物，

以及氧化所述式(VIII-a)的官能化的固相支持物，以提供具有式(X-a)的式(I)的官能化的固相支持物，

另一方面，本发明提供了一种合成寡核苷酸的方法。

附图说明

图1A示出了用链官能化的可控孔玻璃(CPG)，所述链具有源自于3-氨基丙基硅烷的第一部分1和被称为长链烷基胺(LCAA)的第二部分2。

图1B示出了用具有源自于乙酰基甘油的部分3的链官能化的CPG。

具体实施方式

1.定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。在有冲突的情况下，以包括定义在内的本文件为准。下面描述了优选的方法和材料，尽管与本文中描述的那些相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献整体通过参考并入本文。本文公开的材料、方法和实例仅仅是说明性的而不打算是限制性的。

当在本文中使用时，术语“包含”、“包括”、“具有”、“可以”、“含有”及其变化形式，打算作为开放式过渡性短语、术语或词语，其不排除其他行动或结构的可能性。单数形式包括复数指称物，除非上下文明确叙述不是如此。本公开还设想了“包含”本文中提出的实施方式或要素、“由它们组成”和“基本上由它们组成”的其他实施方式，不论是否明确阐述。

与数量相关联使用的修饰语“约”包括所述陈述的值，并具有由上下文所规定的含义(例如它至少包括与特定数量的测量相关的误差程度)。修饰语“约”还应该被认为是公开了由两个端点的绝对值所定义的范围。例如，表述“约2至约4”也公开了“2至4”的范围。术语“约”可以是指指定数字的正负10％。例如，“约10％”可能指示9％至11％的范围，“约1”可以指0.9-1.1。“约”的其他含义可以从上下文明显看出，例如四舍五入，因此例如“约1”也可以指0.5至1.4。

在下文中更详细地描述了特定官能团和化学术语的定义。出于本公开的目的，化学元素根据元素周期表(CAS版，《化学和物理学手册》(Handbook of Chemistry andPhysics)第75版，内封面)来鉴定，并且特定官能团通常如其中所述来定义。此外，有机化学的一般性原理以及特定官能团和反应性描述在下述文献中：《有机化学》(OrganicChemistry)，Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito,1999；Smith和March，《March高等有机化学》(March's Advanced Organic Chemistry，第5版，JohnWiley&Sons,Inc.,New York,2001；Larock，《全面有机转化》(Comprehensive OrganicTransformations)，VCH Publishers,Inc.,New York,1989；Carruthers，《有机合成的一些现代方法》(Some Modern Methods of Organic Synthesis)，第3版，CambridgeUniversity Press,Cambridge,1987；每个所述文献的全部内容通过参考并入本文。

当在本文中使用时，术语“烷基”意味着直链或支链饱和烃链。术语“低级烷基”或“C_1-6烷基”意味着含有1至6个碳原子的直链或支链烃。术语“C_1-4烷基”意味着含有1至4个碳原子的直链或支链饱和烃。烷基的代表性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基。

当在本文中使用时，术语“烯基”意味着含有至少一个碳-碳双键的直链或支链烃链。

当在本文中使用时，术语“亚烷基”是指源自于例如1至6个碳原子的直链或支链饱和链烃的二价基团。亚烷基的代表性实例包括但不限于-CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂CH₂-和-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-。

当在本文中使用时，术语“亚烯基”是指源自于具有至少一个碳-碳双键的直链或支链烃的二价基团。

当在本文中使用时，术语“烷氧基”是指基团–O–烷基。烷氧基的代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基和叔丁氧基。

当在本文中使用时，术语“烷氧基烷基”是指通过本文中所定义的亚烷基附连到母体分子组成部分的本文中所定义的烷氧基。

当在本文中使用时，术语“芳基”是指苯基或附连到母体分子组成部分并稠合到环烷烃基团(例如茚满-4-基)、稠合到6元芳烃基团(即所述芳基是萘基)或稠合到非芳香族杂环(例如所述芳基可以是苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)的苯基。术语“苯基”在指称取代基时使用，而术语6元芳烃在指称稠合环时使用。所述6元芳烃是单环的(例如苯或苯并)。所述芳基可以是单环(苯基)或双环的(例如9-至12元稠合双环系统)。

当在本文中使用时，术语“环烷基”或“环烷烃”是指所有碳原子均为环成员并含有零个双键的饱和环系统。术语“环烷基”在本文中用于指称作为取代基存在的环烷烃。环烷基可以是单环环烷基(例如环丙基)、稠合的双环环烷基(例如十氢萘基)、螺环或其中两个不相邻的环原子通过1、2、3或4个碳原子的亚烷基桥连接的桥接的环烷基(例如双环[2.2.1]庚烷基)。环烷基的代表性实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、金刚烷基和双环[1.1.1]戊基。

当在本文中使用时，术语“环烯基”或“环烯烃”意味着所有碳原子均为环成员并含有至少一个碳-碳双键并且每个环优选地具有5-10个碳原子的非芳香族单环或多环环系统。术语“环烯基”在本文中用于指称作为取代基存在环烯烃。环烯基可以是单环环烯基(例如环戊烯基)、稠合的双环环烯基(例如八氢萘烯基)或其中两个不相邻的环原子通过1、2、3或4个碳原子的亚烷基桥连接的桥接的环烯基(例如双环[2.2.1]庚烯基)。示例性的单环环烯基环包括环戊烯基、环己烯基或环庚烯基。

当在本文中使用时，术语“氟代烷基”意味着其中1、2、3、4、5、6、7或8个氢原子被氟代替的本文中所定义的烷基。氟代烷基的代表性实例包括但不限于2-氟乙基、2,2,2-三氟乙基、三氟甲基、二氟甲基、五氟乙基和三氟丙基例如3,3,3-三氟丙基。

当在本文中使用时，术语“卤素”或“卤”意味着Cl、Br、I或F。

当在本文中使用时，术语“卤代烷基”意味着其中1、2、3、4、5、6、7或8个氢原子被卤素代替的本文中所定义的烷基。

当在本文中使用时，术语“杂芳基”是指含有杂原子的芳香族单环(单环杂芳基)或含有至少一个单环杂芳环的双环环系统(双环杂芳基)。术语“杂芳基”在本文中用于指称作为取代基存在的杂芳烃。所述单环杂芳基是含有至少一个独立地选自N、O和S的杂原子(例如1、2、3或4个独立地选自O、S和N的杂原子)的5或6元环。所述5元芳香族单环具有两个双键，所述6元芳香族单环具有三个双键。所述双环杂芳基是8至12元环系统，并包括稠合的双环杂芳环系统(即10π电子系统)，例如稠合到6元芳烃的单环杂芳基环(例如喹啉-4-基、吲哚-1-基)、稠合到单环杂芳烃的单环杂芳基环(例如萘啶基)和稠合到单环杂芳烃的苯基(例如喹啉-5-基、吲哚-4-基)。双环杂芳基/杂芳烃基团包括具有4个双键和至少一个向完全芳香族10π电子系统贡献孤对电子的杂原子的9元稠合双环杂芳环系统，例如在环联结部具有氮原子的环系统(例如咪唑并吡啶)或苯并

二唑基。双环杂芳基还包括由一个杂芳环和一个非芳香环组成的稠合双环环系统，例如稠合到单环碳环的单环杂芳环(例如6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶基)或稠合到单环杂环的单环杂芳环(例如2,3-二氢呋喃并[3,2-b]吡啶基)。所述双环杂芳基在芳香环原子处附连到母体分子组成部分。杂芳基的其他代表性实例包括但不限于吲哚基(例如吲哚-1-基、吲哚-2-基、吲哚-4-基)、吡啶基(包括吡啶-2-基、吡啶-3-基、吡啶-4-基)、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、吡唑基(例如吡唑-4-基)、吡咯基、苯并吡唑基、1,2,3-三唑基(例如三唑-4-基)、1,3,4-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,3,4-

二唑基、1,2,4-

二唑基、咪唑基、噻唑基(例如噻唑-4-基)、异噻唑基、噻吩基、苯并咪唑基(例如苯并咪唑-5-基)、苯并噻唑基、苯并

唑基、苯并

二唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、呋喃基、

唑基、异

唑基、嘌呤基、异吲哚基、喹喔啉基、吲唑基(例如吲唑-4-基、吲唑-5-基)、喹唑啉基、1,2,4-三嗪基、1,3,5-三嗪基、异喹啉基、喹啉基、咪唑并[1,2-a]吡啶基(例如咪唑并[1,2-a]吡啶-6-基)、萘啶基、吡啶并咪唑基、噻唑并[5,4-b]吡啶-2-基和噻唑并[5,4-d]嘧啶-2-基。

当在本文中使用时，术语“杂环”或“杂环的”意味着单环杂环、双环杂环或三环杂环。术语“杂环基”在本文中用于指称作为取代基存在的杂环。单环杂环是含有至少一个独立地选自O、N和S的杂原子的3、4、5、6、7或8元环。所述3或4元环含有0或1个双键和一个选自O、N和S的杂原子。所述5元环含有0或1个双键和1、2或3个选自O、N和S的杂原子。所述6元环含有0、1或2个双键和1、2或3个选自O、N和S的杂原子。所述7和8元环含有0、1、2或3个双键和1、2或3个选自O、N和S的杂原子。单环杂环基的代表性实例包括但不限于氮杂环丁烷基、氮杂环庚烷基、氮杂环丙烷基、二氮杂环庚烷基、1,3-二氧杂环己烷基、1,3-二氧杂环戊烷基、1,3-二硫杂环戊烷基、1,3-二硫杂环己烷基、咪唑基、咪唑烷基、异噻唑基、异噻唑烷基、异

唑基、异

唑烷基、吗啉基、2-氧代-3-哌啶基、2-氧代氮杂环丁烷-3-基、

二唑啉基、

二唑烷基、

唑啉基、

唑烷基、氧杂环丁烷基、氧杂环庚烷基、氧杂环辛烷基、哌嗪基、哌啶基、吡喃基、吡唑啉基、吡唑烷基、吡咯啉基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢噻吩基、噻二唑啉基、噻二唑烷基、1,2-噻嗪烷基、1,3-噻嗪烷基、噻唑基、噻唑烷基、硫代吗啉基、1,1-二氧化硫代吗啉基(硫代吗啉砜)、硫代吡喃基和三噻烷基。所述双环杂环是稠合到6元芳烃的单环杂环、或稠合到单环环烷烃的单环杂环、或稠合到单环环烯烃的单环杂环、或稠合到单环杂环的单环杂环、或稠合到单环杂芳烃的单环杂环、或螺杂环基、或其中两个不相邻的环原子通过1、2、3或4个碳原子的亚烷基桥或2、3或4个碳原子的亚烯基桥桥接的单环杂环环系统。所述双环杂环基在非芳香环原子处附连到母体分子组成部分(例如吲哚啉-1-基)。双环杂环基的代表性实例包括但不限于色烷-4-基、2,3-二氢苯并呋喃-2-基、2,3-二氢苯并噻吩-2-基、1,2,3,4-四氢异喹啉-2-基、2-氮杂螺环[3.3]庚-2-基、2-氧杂-6-氮杂螺环[3.3]庚-6-基、氮杂双环[2.2.1]庚基(包括2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)、氮杂双环[3.1.0]己基(包括3-氮杂双环[3.1.0]己-3-基)、2,3-二氢-1H-吲哚-1-基、异吲哚啉-2-基、八氢环戊二烯并[c]吡咯基、八氢吡咯并吡啶基、四氢异喹啉基、7-氧杂双环[2.2.1]庚烷基、六氢-2H-环戊二烯并[b]呋喃基、2-氧杂螺环[3.3]庚烷基和3-氧杂螺环[5.5]十一烷基。三环杂环的实例是稠合到6元芳烃的双环杂环、或稠合到单环环烷烃的双环杂环、或稠合到单环环烯烃的双环杂环、或稠合到单环杂环的双环杂环、或其中双环的两个不相邻原子通过1、2、3或4个碳原子的亚烷基桥或2、3或4个碳原子的亚烯基桥连接的双环杂环。三环杂环的实例包括但不限于八氢-2,5-环氧戊搭烯、六氢-2H-2,5-桥亚甲基环戊二烯并[b]呋喃、六氢-1H-1,4-桥亚甲基环戊二烯并[c]呋喃、氮杂金刚烷(1-氮杂三环[3.3.1.13,7]癸烷)和氧杂金刚烷(2-氧杂三环[3.3.1.13,7]癸烷)。所述单环、双环和三环杂环基在非芳香环原子处连接到母体分子组成部分。

当在本文中使用时，术语“羟基”意味着-OH基团。

当在本文中使用时，术语“羟基烷基”意味着至少一个-OH基团通过本文中所定义的亚烷基附连到母体分子组成部分。

诸如亚环烷基、亚芳基、亚苯基、亚杂环基等的术语是指源自于所述基础环例如环烷烃、杂环等的二价基团。出于说明的目的，亚环烷基和亚苯基的实例分别包括

亚环烷基包括1,1-亚环烷基(例如

)，例如1,1-亚环丙基(即

)。

诸如“烷基”、“环烷基”、“亚烷基”等的术语可以在前方带有指示在特定情况下在所述基团中存在的原子数目的指定(例如“C_1-4烷基”、“C_3-6环烷基”、“C_1-4亚烷基”)。这些指定如本领域技术人员通常理解的使用。例如，后面跟有下标数字的表述“C”指示在后面的基团中存在的碳原子的数目。因此，“C₃烷基”是具有3个碳原子的烷基(即正丙基、异丙基)。在给出范围的情况下，例如在“C_1-4”中，后面的基团的成员可能具有落于所叙述的范围内的任何数目的碳原子。例如“C_1-4烷基”是具有1至4个碳原子的烷基，不论如何排列(即直链或支链)。

对于本文中描述的化合物来说，基团及其取代基可以根据所述原子和取代基允许的化合价进行选择，使得所述选择和取代产生稳定的化合物，例如，其不会通过例如重排、环化、消除等自发地经历转化。

对于本文中数字范围的叙述来说，明确地设想了在其之间具有相同精度的每个居间数字。例如，对于6-9的范围来说，除了6和9之外还考虑到了数字7和8，并且对于范围6.0-7.0来说，明确考虑到了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

2.官能化的固相支持物

本发明的各个方面提供了式(I)的官能化的固相支持物，其中A、L¹、L²、R¹、G¹和n如本文中所定义。

在式(I)的固相支持物中，A是适用于寡核苷酸合成的固相支持物材料。适合的固相支持物材料包括可控孔玻璃(CPG)、硅胶、大孔交联聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸乙烯醇共聚物、硅芯片、玻璃、聚苯乙烯珠、聚丙烯片、无孔硅珠、聚丙烯酰胺或聚丙烯酸酯。固相支持物在本领域中是公知的，如《核酸化学现代方法》(Current Protocols in Nucleic AcidChemistry)，2000，第3章，第3.1节中的“用于寡核苷酸合成的固相支持物”(Solid-PhaseSupports for Oligonucleotide Synthesis)中所描述。CPG可以具有适合于容纳寡核苷酸合成(例如

)的孔隙尺寸，例如1000或

所述CPG支持物可以具有40-500目的粒度，0.1-1.0g/cc的堆积密度，10-200M²/g的SS面积，和0.2-3.0 50cc/g的孔隙体积。

在式(I)中，L¹是由选自碳、氢、氧、氮、硫、磷、硅和卤素的原子组成的二价化学连接物，其中(a)所述二价连接物的原子排列形成任选取代的链或被任选取代的环中断的任选取代的链；并且(b)所述链或链和环一起包含选自碳、氧、氮、硫、磷和硅的原子的12至40元连续线性排列。

原子的12至40元连续线性排列是指一串不中断的原子，至少某些原子是链原子或非环原子，并且任选地某些原子是环原子。原子的12至40元连续线性排列通过下述实例说明，其中所述连续线性原子排列的原子用粗体示出。

在连续线性排列(a)中，所述排列的所有原子均为链原子。连续线性排列(b)-(f)含有链原子和环原子的混合物，其中(b)具有1个环原子，(c)具有2个环原子，(d)具有3个环原子，并且(e)和(f)具有4个环原子。

连续线性排列可以在相邻原子之间具有不饱和键，例如

或如在(f)中。

L¹上的任选取代基包括卤素(例如氟)、C_1-6烷基(例如甲基)、C_1-6卤代烷基(例如三氟甲基)、氧代(即＝O)、硫酮(即＝S)、OH、–OC_1-6烷基(例如甲氧基)、–OC_3-6环烷基、–OCH₂C_3-6环烷基、–OC(O)C_1-6烷基(例如–OC(O)CH₃)、–OC(O)C_3-6环烷基、–OC(O)CH₂C_3-6环烷基、C_1-6羟基烷基和C_1-6烷氧基C_1-6烷基(例如–CH₂CH₂OCH₃)。L¹上任选的取代基允许L¹具有分支结构。

L¹与其任选的取代一起可以包含各种不同的官能团例如胺(例如–NH–、–N(C_1-6烷基)–)、酰胺(例如–NHC(O)–、–N(C_1-6烷基)C(O)–)、硫代酰胺(例如–NHC(S)–、–N(C_1-6烷基)C(S)–)、醚(–O–)、酯(–OC(O)–)、硫酯(–OC(S)–)、硫醚(–S–)、亚砜(–S(O)–)、砜(–S(O)₂–)、磺酰胺(例如–NHS(O)₂–、–N(C_1-6烷基)S(O)₂–)、甲硅烷基、烷基原硅酸酯(例如–OSi(OC_1-6烷基)₂O–)、氨基甲酸酯(例如–NHC(O)O–、–N(C_1-6烷基)C(O)O–)、脲(例如–NHC(O)NH–、–N(C_1-6烷基)C(O)NH–、–N(C_1-6烷基)C(O)N(C_1-6烷基)–)、酰肼(例如–NHNHC(O)–)、胍(例如–NHC(NH)＝N–)和磷酸酯(例如–OP(O)(OC_1-6烷基)O–)。因此，L¹可以包含一个或多个共价键合的成员，包括含有杂原子的官能团、亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚杂环基、亚芳基(例如亚苯基)和亚杂芳基。例如，L¹可以包含一个或多个独立地选自C_2-10亚烷基、–NH–、–NHC(O)–、甲硅烷基和–OCH₂CH(OC(O)C_1-4烷基)CH₂O–的共价键合的成员。L¹可以是键合到甲硅烷基的C_11-39亚烷基，所述甲硅烷基被键合到所述固相支持物材料，其中所述C_11-39亚烷基的2-6个亚甲基单元被–NH–、–O–或–NHC(O)–代替，并且所述C_11-39亚烷基任选地被–OC(O)CH₃取代。L¹可以是L^1a-L^1b，其中L^1a被键合到所述固相支持物材料。L^1a可以是–甲硅烷基-C_2-4亚烷基-NH–C_2-10亚烷基–NH–。L^1a可以是–甲硅烷基-C_2-4亚烷基-NH–C_3-10亚环烷基–NH–。L^1a可以是–甲硅烷基-C_2-4亚烷基-C(O)NH–C_2-10亚烷基–NH–。L^1a可以是–甲硅烷基-C_2-4亚烷基-NH–C(O)C_2-10亚烷基–C(O)NH–C_2-10亚烷基–NH–。L^1a可以是–甲硅烷基-C_2-4亚烷基-NHC(O)NH–C_2-10亚烷基–NH–。L^1b可以是–C(O)C_1-10亚烷基–。L¹可以是–甲硅烷基-C_2-4亚烷基-NH–C_2-10亚烷基–NHC(O)-C_2-10亚烷基–或–甲硅烷基-C_2-4亚烷基-OCH₂CH(OC(O)CH₃)CH₂OC(O)NH-C_2-10亚烷基–NHC(O)-C_2-10亚烷基–。L¹可以是–甲硅烷基-(CH₂)₃-NH–(CH₂)₆–NHC(O)-(CH₂)₅–或–甲硅烷基-(CH₂)₃-OCH₂CH(OC(O)CH₃)CH₂OC(O)NH-(CH₂)₆–NHC(O)-(CH₂)₅–。

当L¹包含末端甲硅烷基，所述甲硅烷基可以键合到所述固相支持物材料例如下式中示出的CPG上的氧原子，其中Si-L^1*是L¹(即L^1*代表L¹减去它的12至40元连续线性原子排列中的一个成员(即甲硅烷基))。

甲硅烷基与所述固相支持物材料的其他成键排列是可能的，例如

L²在每次出现时独立地是–(CH₂CH₂O)_m–、–(CHCH₃CH₂O)_m–或–(CH₂CHCH₃O)_m–，其中m是3、4、5、6、7、8、9或10，即所述式(I)的固相支持物是

优选地，L²是–(CH₂CH₂O)_m–。优选地，m是6。

为了进一步说明，式(I)的官能化的固相支持物包括例如

R¹在每次出现时独立地是R^1a或–OR^1a，其中R^1a在每次出现时独立地是C_1-10烷基、C_2-10烯基、C_2-10炔基、C_3-10环烷基或C_5-10环烯基，其中R^1a任选地被1-6个独立地选自卤素(例如氟)、氰基、氧代、OH、–OC_1-4烷基、–OC_1-4卤代烷基或C_3-6环烷基的取代基取代，所述C_3-6环烷基任选地被卤素(例如氟)或C_1-4烷基取代。R¹在每次出现时可以独立地是C_1-4烷基、–OC_1-4烷基或–OCH₂CH₂CN。R¹在每次出现时可以独立地是–CH₃、–CH₂CH₃、–OCH₃、–OCH₂CH₃、–OCH(CH₃)₂或–OCH₂CH₂CN。

G¹可以是氢，即式(I)在右手侧上结束于羟基。

G¹可以是PG¹，其中PG¹是羟基保护基团。羟基保护基团在本领域中是公知的，如在PGM Wuts和TW Greene，Greene的书籍《有机合成中的保护基团》(Protective Groups inOrganic Synthesis)(第4版)，John Wiley&Sons，NY(2006)中所述，所述书籍整体通过参考并入本文。适合的羟基保护基团包括例如三苯甲基类基团(例如三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、甲氧基三苯甲基)、乙酰基、苯甲酰基、苯甲基、对甲氧基苯甲基、β-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、甲氧基甲基(MOM)、甲硫基甲基、新戊酰基、四氢吡喃基(THP)、四氢呋喃基(THF)、甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、甲基和乙氧基乙基。

G¹可以是–P(O)(R¹)–L³–R²，其中R¹、R²和L³如本文中所描述。

L³是–(OCH₂CH₂)_p–、–(OCHCH₃CH₂)_p–、–(OCH₂CHCH₃)_p–、–OC_2-10亚烷基–、–OC_0-4亚烷基–C_3-10亚环烷基–C_0-4亚烷基–或–OC_0-4亚烷基–亚苯基–C_0-4亚烷基–，其中L³中的亚烷基任选地被1-6个卤素(例如氟)取代，并且所述亚环烷基和亚苯基任选地被1-4个独立地选自卤素、C_1-4烷基、C_1-4卤代烷基、氰基、–OC_1-4烷基和–OC_1-4卤代烷基的取代基取代；并且p是3、4、5、6、7、8、9或10。优选地，p是6。

L³可以是–(OCH₂CH₂)_p–，例如–(OCH₂CH₂)₆–。

L³可以是–OC_2-10亚烷基–，例如–OC_4-8亚烷基–、–OC₆亚烷基–或–O(CH₂)₆–。

R²是–NR^2aR^2b，其中R^2a是氢、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、C_3-6环烷基或–C_1-3亚烷基–C_3-6环烷基；R^2b是氢、PG²、C(O)-L⁴-OH、C(O)-L⁴-OPG³、C(O)-L⁴-G^1a、C(O)-L⁵–H、C(O)-L⁵–PG¹、C(O)-L⁵–P(O)(R¹)–G^1a、C(O)-L⁵–P(O)(OH)–G^1a或C(O)-L⁶-G^1a，或者R^2a和R^2b与它们附连到的氮一起形成受保护的氮原子(例如邻苯二甲酰亚胺)。

R^2a和R^2b可以各自是氢(即R²是NH₂)。

R^2a可以是氢、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、C_3-6环烷基或–C_1-3亚烷基–C_3-6环烷基；其中R^2b是PG²，并且PG²是氨基保护基团。氨基保护基团在本领域中是公知的，如在PGM Wuts和TWGreene，Greene的书籍《有机合成中的保护基团》(Protective Groups in OrganicSynthesis)(第4版)，John Wiley&Sons，NY(2006)中所述。适合的氨基保护基团包括例如羰基苯甲氧基(Cbz)、对甲氧基苯甲基羰基(MeOZ)、叔丁氧基羰基(BOC)、9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)、乙酰基、苯甲酰基、苯甲基、氨基甲酸酯、对甲氧基苯甲基(PMB)、3,4-二甲氧基苯甲基(DMPM)、对甲氧基苯基(PMP)、甲苯磺酰基和三氯乙基羰基(Troc)。R^2a可以是氢，其中R^2b是PG²，并且PG²优选为BOC。

R^2a可以是氢、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、C_3-6环烷基或–C_1-3亚烷基–C_3-6环烷基；其中R^2b是C(O)-L⁴-OH、C(O)-L⁴-OPG³或C(O)-L⁴-G^1a；并且L⁴是C(O)或L⁷–C(O)。因此，L⁴通过C(O)组成部分键合到OH、OPG³和G^1a。R^2b可以是C(O)-C(O)-OH、C(O)-C(O)-OPG³或C(O)-C(O)-G^1a。可选地，R^2b可以是C(O)-L⁷–C(O)-OH、C(O)-L⁷–C(O)-OPG³或C(O)-L⁷–C(O)-G^1a，当L⁴是L⁷–C(O)时。R^2a可以是氢，其中R^2b是C(O)-L⁴-OH、C(O)-L⁴-OPG³或C(O)-L⁴-G^1a，其中L⁴如本文中所示或描述。

L⁷是由选自碳、氢、氧、氮、硫、磷、硅和卤素的原子组成的二价化学连接物，其中(a)所述二价连接物的原子排列形成任选取代的链、任选取代的环或任选取代的链和环的组合；并且(b)所述链、环或其组合包含选自碳、氧、氮、硫、磷和硅的原子的1至20元连续线性排列。所述L⁷中的1至20元原子连续线性排列是指与L¹类似的一串不中断的原子。

L⁷上的任选取代基包括卤素(例如氟)、C_1-6烷基(例如甲基)、C_1-6卤代烷基(例如三氟甲基)、氧代(即＝O)、硫酮(即＝S)、OH、–OC_1-6烷基(例如甲氧基)、–OC_3-6环烷基、–OCH₂C_3-6环烷基、–OC(O)C_1-6烷基(例如–OC(O)CH₃)、–OC(O)C_3-6环烷基、–OC(O)CH₂C_3-6环烷基、C_1-6羟基烷基和C_1-6烷氧基C_1-6烷基(例如–CH₂CH₂OCH₃)。L⁷上的任选取代允许L⁷具有分支结构。

L⁷与其任选的取代一起，可以包含各种不同的官能团例如胺(例如–NH–、–N(C_1-6烷基)–)、酰胺(例如–NHC(O)–、–N(C_1-6烷基)C(O)–)、硫代酰胺(例如–NHC(S)–、–N(C_1-6烷基)C(S)–)、醚(–O–)、酯(–OC(O)–)、硫酯(–OC(S)–)、硫醚(–S–)、亚砜(–S(O)–)、砜(–S(O)₂–)、磺酰胺(例如–NHS(O)₂–、–N(C_1-6烷基)S(O)₂–)、甲硅烷基、烷基原硅酸酯(例如–OSi(OC_1-6烷基)₂O–)、氨基甲酸酯(例如–NHC(O)O–、–N(C_1-6烷基)C(O)O–)、脲(例如–NHC(O)NH–、–N(C_1-6烷基)C(O)NH–、–N(C_1-6烷基)C(O)N(C_1-6烷基)–)、酰肼(例如–NHNHC(O)–)、胍(例如–NHC(NH)＝N–)和磷酸酯(例如–OP(O)(OC_1-6烷基)O–)。因此，L⁷可以包含一个或多个共价键合的成员，包括含杂原子官能团、亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚杂环基、亚芳基(例如亚苯基)和亚杂芳基。

L⁴可以是–C_0-4亚烷基–C(O)–、–C_1-3亚烷基–O–C_1-3亚烷基–C(O)–、–C_1-3亚烷基–N(C_1-3烷基)C(O)–C_1-3亚烷基–C(O)–、–亚苯基–C(O)–、–C_1-3亚烷基–O–亚苯基–O–C_1-3亚烷基–C(O)–、–亚苯基–C_1-3亚烷基–O–C(O)–、–C_1-3亚烷基–O–亚苯基–C_1-3亚烷基–O–C(O)–、–C_1-3亚烷基–C(O)NH–亚芴基–C_1-3亚烷基–O–C(O)–或

其中所述亚苯基任选地被1-4个独立地选自NO₂、–OC_1-4烷基、卤素、C_1-4烷基和C_1-4卤代烷基的取代基取代。L⁴的每个前述选项对应于L⁴是L⁷–C(O)，除了–C_0-4亚烷基–C(O)–的–C₀–C(O)–之外。因此，在这些实例中L⁷是–C_1-4亚烷基–、–C_1-3亚烷基–O–C_1-3亚烷基–、–C_1-3亚烷基–N(C_1-3烷基)C(O)–C_1-3亚烷基–、–亚苯基–、–C_1-3亚烷基–O–亚苯基–O–C_1-3亚烷基–、–亚苯基–C_1-3亚烷基–O–、–C_1-3亚烷基–O–亚苯基–C_1-3亚烷基–O–、–C_1-3亚烷基–C(O)NH–亚芴基–C_1-3亚烷基–O–或

为了进一步说明L⁴的成键排列，C(O)-L⁴-G^1a可以是C(O)–C_0-4亚烷基–C(O)–G^1a、C(O)–C_1-3亚烷基–O–C_1-3亚烷基–C(O)–G^1a、C(O)–C_1-3亚烷基–N(C_1-3烷基)C(O)–C_1-3亚烷基–C(O)–G^1a、C(O)–亚苯基–C(O)–G^1a、C(O)–C_1-3亚烷基–O–亚苯基–O–C_1-3亚烷基–C(O)–G^1a、C(O)–亚苯基–C_1-3亚烷基–O–C(O)–G^1a、C(O)–C_1-3亚烷基–O–亚苯基–C_1-3亚烷基–O–C(O)–G^1a、C(O)–C_1-3亚烷基–C(O)NH–亚芴基–C_1-3亚烷基–O–C(O)–G^1a或

L⁴可以是–C(O)–，或者L⁴可以是–CH₂–C(O)–、–(CH₂)₂–C(O)–、–CH₂–O–CH₂–C(O)–、–CH₂–N(CH₃)C(O)–(CH₂)₂–C(O)–、

即L⁷是–CH₂–、–(CH₂)₂–、–CH₂–O–CH₂–、–CH₂–N(CH₃)C(O)–(CH₂)₂–、

其中L⁷基团的连续线性原子排列用粗体示出。

R^2b可以是C(O)-L⁴-OH或C(O)-L⁴-OPG³；其中L⁴是–C(O)–或L⁴是–CH₂–C(O)–、–(CH₂)₂–C(O)–、–CH₂–O–CH₂–C(O)–、–CH₂–N(CH₃)C(O)–(CH₂)₂–C(O)–、

PG³是羧酸保护基团。羧酸保护基团在本领域中是公知的，如在PGM Wuts和TWGreene，Greene的书籍《有机合成中的保护基团》(Protective Groups in OrganicSynthesis)(第4版)，John Wiley&Sons，NY(2006)中所述。适合的羧酸保护基团包括例如甲基、苯甲基、叔丁基、2,6-双取代的苯酚(例如2,6-二甲基苯酚、2,6-二异丙基苯酚、2,6-二叔丁基苯酚)和甲硅烷基。

其中G¹是–P(O)(R¹)–L³–R²、R²是–NR^2aR^2b并且R^2b是C(O)-L⁴-OH、C(O)-L⁴-OPG³或C(O)-L⁴-G^1a的式(I)的官能化的固相支持物，分别具有式(I-A)、(I-B)和(I-C)，其中A、L¹、L²、L³、L⁴、R¹、R^2a、PG³、n和G^1a如本文中所定义。

例如，在式(I-A)、(I-B)和(I-C)中是官能化的固相支持物，其中L¹是–甲硅烷基-(CH₂)₃-NH–(CH₂)₆–NHC(O)-(CH₂)₅–或–甲硅烷基-(CH₂)₃-OCH₂CH(OC(O)CH₃)CH₂OC(O)NH-(CH₂)₆–NHC(O)-(CH₂)₅–；L²是–(CH₂CH₂O)₆–；n是4-7；L³是–O(CH₂)₃–；R¹在每次出现时独立地是–CH₃、–CH₂CH₃、–OCH₃、–OCH₂CH₃、–OCH(CH₃)₂或–OCH₂CH₂CN；R^2a是氢；L⁴如本文中所定义，例如–C(O)–、–CH₂–C(O)–、–(CH₂)₂–C(O)–、–CH₂–O–CH₂–C(O)–、–CH₂–N(CH₃)C(O)–(CH₂)₂–C(O)–、

并且PG³和G^1a如本文中所定义。

此外，例如，在式(I-A)、(I-B)和(I-C)中是官能化的固相支持物，其中L¹是–甲硅烷基-(CH₂)₃-NH–(CH₂)₆–NHC(O)-(CH₂)₅–或–甲硅烷基-(CH₂)₃-OCH₂CH(OC(O)CH₃)CH₂OC(O)NH-(CH₂)₆–NHC(O)-(CH₂)₅–；L²是–(CH₂CH₂O)₆–；n是4-7；L³是–(OCH₂CH₂)₆–；R¹在每次出现时独立地是–CH₃、–CH₂CH₃、–OCH₃、–OCH₂CH₃、–OCH(CH₃)₂或–OCH₂CH₂CN；R^2a是氢；L⁴如本文中所定义，例如–C(O)–、–CH₂–C(O)–、–(CH₂)₂–C(O)–、–CH₂–O–CH₂–C(O)–、–CH₂–N(CH₃)C(O)–(CH₂)₂–C(O)–、

并且PG³和G^1a如本文中所定义。

R^2a可以是氢、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、C_3-6环烷基或–C_1-3亚烷基–C_3-6环烷基；其中R^2b是C(O)-L⁵–H、C(O)-L⁵–PG¹、C(O)-L⁵–P(O)(R¹)–G^1a或C(O)-L⁵–P(O)(OH)–G^1a；并且L⁵是L⁷–O，其中L⁷如本文中所定义。因此，L⁵(L⁷–O)通过L⁵的右手侧上的氧原子键合到H、PG¹、P(O)(R¹)–G^1a和P(O)(OH)–G^1a。

L⁵(即L⁷–O)可以是L^5b或L^5a-L^5b，其中L^5a是–C_0-4亚烷基–C(O)–、–C_1-3亚烷基–O–C_1-3亚烷基–C(O)–、–C_1-3亚烷基–N(C_1-3烷基)C(O)–C_1-3亚烷基–C(O)–、–亚苯基–C(O)–、–C_1-3亚烷基–O–亚苯基–O–C_1-3亚烷基–C(O)–、–亚苯基–C_1-3亚烷基–O–C(O)–、–C_1-3亚烷基–O–亚苯基–C_1-3亚烷基–O–C(O)–或–C_1-3亚烷基–C(O)NH–亚芴基–C_1-3亚烷基–O–C(O)–；L^5b是

–(CH₂)_1-10–O–或–(CH₂CH₂O)_2-6–；并且R¹⁰是苯基、C_1-10烷基或C_1-10卤代烷基；其中所述亚苯基和苯基任选地被1-4个独立地选自NO₂、–OC_1-4烷基、卤素、C_1-4烷基和C_1-4卤代烷基的取代基取代。为了进一步说明L⁵的成键排列，C(O)-L⁵–P(O)(R¹)–G^1a可以是C(O)-L^5a-L^5b–P(O)(R¹)–G^1a，其进而可以是C(O)–C_0-4亚烷基–C(O)–L^5b–P(O)(R¹)–G^1a、C(O)–C_1-3亚烷基–O–C_1-3亚烷基–C(O)–L^5b–P(O)(R¹)–G^1a、C(O)–C_1-3亚烷基–N(C_1-3烷基)C(O)–C_1-3亚烷基–C(O)–L^5b–P(O)(R¹)–G^1a、C(O)–亚苯基–C(O)–L^5b–P(O)(R¹)–G^1a、C(O)–C_1-3亚烷基–O–亚苯基–O–C_1-3亚烷基–C(O)–L^5b–P(O)(R¹)–G^1a、C(O)–亚苯基–C_1-3亚烷基–O–C(O)–L^5b–P(O)(R¹)–G^1a、C(O)–C_1-3亚烷基–O–亚苯基–C_1-3亚烷基–O–C(O)–L^5b–P(O)(R¹)–G^1a或C(O)–C_1-3亚烷基–C(O)NH–亚芴基–C_1-3亚烷基–O–C(O)–L^5b–P(O)(R¹)–G^1a；其中–L^5b–P(O)(R¹)–G^1a是

–(CH₂)_1-10–O–P(O)(R¹)–G^1a或–(CH₂CH₂O)_2-6–P(O)(R¹)–G^1a；并且R¹⁰是苯基、C_1-10烷基或C_1-10卤代烷基。

L^5b基团

可用于在除去邻苯二甲酰亚胺基团后制备具有3’末端氨基的寡核苷酸。

L⁵(即L⁷–O)可以是L^5b或L^5a-L^5b，其中L^5a是–C(O)–、–CH₂–C(O)–、–(CH₂)₂–C(O)–、–CH₂–O–CH₂–C(O)–、–CH₂–N(CH₃)C(O)–(CH₂)₂–C(O)–、

并且L^5b是

–CH₂–O–、–(CH₂)₃–O–或–(CH₂CH₂O)₄–。

L⁵(即L⁷–O)可以是L^5b，其中L^5b是

–(CH₂)_1-10–O–或–(CH₂CH₂O)_2-6–；并且所述苯基任选地被1-4个独立地选自NO₂、–OC_1-4烷基、卤素、C_1-4烷基和C_1-4卤代烷基的取代基取代。L⁵(即L⁷–O)可以是L^5b，其中L^5b是

–CH₂–O–、–(CH₂)₃–O–或–(CH₂CH₂O)₄–。

L⁵(即L⁷–O)可以是L^5a-L^5b，其中L^5a是–C_0-4亚烷基–C(O)–、–C_1-3亚烷基–O–C_1-3亚烷基–C(O)–、–C_1-3亚烷基–N(C_1-3烷基)C(O)–C_1-3亚烷基–C(O)–、–亚苯基–C(O)–、–C_1-3亚烷基–O–亚苯基–O–C_1-3亚烷基–C(O)–、–亚苯基–C_1-3亚烷基–O–C(O)–、–C_1-3亚烷基–O–亚苯基–C_1-3亚烷基–O–C(O)–或–C_1-3亚烷基–C(O)NH–亚芴基–C_1-3亚烷基–O–C(O)–；L^5b是

并且R¹⁰是苯基、C_1-10烷基或C_1-10卤代烷基；其中所述亚苯基和苯基任选地被1-4个独立地选自NO₂、–OC_1-4烷基、卤素、C_1-4烷基和C_1-4卤代烷基的取代基取代。L⁵(即L⁷–O)可以是L^5a-L^5b，其中L^5a是–C(O)–、–CH₂–C(O)–、–(CH₂)₂–C(O)–、–CH₂–O–CH₂–C(O)–、–CH₂–N(CH₃)C(O)–(CH₂)₂–C(O)–、

并且L^5b是

因此，例如L⁵(即L⁷–O)可以是

-CH₂–O–、–(CH₂)₃–O–或–(CH₂CH₂O)₄–，其中所述L⁵的L⁷部分的连续线性原子排列用粗体示出。

R^2b可以是C(O)-L⁵–H或C(O)-L⁵–PG¹；其中PG¹如本文中所定义，并且L⁵是

-CH₂–O–、–(CH₂)₃–O–或–(CH₂CH₂O)₄–。

R^2b可以是C(O)-L⁶-G^1a；其中G^1a如本文中所定义，并且L⁶是L⁷–Si(C_1-4烷基)₂，并且L⁷如如本文中所定义。例如，L⁶可以是

即L⁷是

例如，L⁶可以是

为了说明L⁶的成键，C(O)-L⁶-G^1a可以是

G^1a是核苷酸组成部分或核苷组成部分，所述组成部分各自对应于相应的核苷酸或核苷酸减去其附连点处的氢。核苷酸是指单核苷酸和寡核苷酸(即多核苷酸)两者。核苷根据定义被限于单个核苷残基。核苷酸和核苷包括脱氧核糖核苷酸/脱氧核糖核苷和核糖核苷酸/核糖核苷。

所述寡核苷酸可以是DNA寡核苷酸、RNA寡核苷酸或反义寡核苷酸(例如反义RNA)。

核苷酸和核苷包括游离的(未保护的)、修饰的核苷酸和核苷，以及核苷酸和核苷的受保护的版本。

修饰的核苷酸或核苷包括在核碱基、糖上或在多核苷酸的情况下核苷酸间连键上具有化学修饰或取代的分子，例如在下述文献中所描述的：Ann.Rev.Biochem.1998,67:99-134；Int.J.Mol.Sci.2017,18(8),1683；Curr.Opin.Biotechnol.1995,6:12-19；和Tetrahedron 1993,49(28),6123-6194；所述文献通过参考并入本文。例如，对核苷酸间连键的修饰可以包括硫代磷酸酯、N3’-O5’氨基磷酸酯、O3’-N5’氨基磷酸酯、3-硫代磷酸酯、5’-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和三唑。

核苷酸和核苷包括那些不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基，而且含有修饰的嘌呤和嘧啶碱基和其他已被修饰的杂环碱基的组成部分(这些组成部分有时被合称为“嘌呤和嘧啶碱基及其类似物”)。此类修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶等。核碱基修饰可以包括例如去氮嘌呤、N-1-甲基鸟苷、异鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、1,3-二氮杂-2-氧代吩噻嗪、1,3-二氮杂-2-氧代吩

嗪、7-硝基-1,3-二氮杂-2-氧代吩噻嗪、2,6-二氨基嘌呤、嘌呤、6-硫鸟嘌呤、次黄嘌呤、2-嘧啶酮、2-吡啶酮、4-硫尿苷、咪唑-4-甲酰胺、N-取代的5-(羧酰胺)尿苷例如5-(N-苯甲基羧酰胺)-尿苷、5-氟-脱氧尿苷。

糖修饰可以例如包括无碱基核苷酸/核苷、4’-碳环类似物、4’-硫代类似物、4’氨基类似物和2’-取代的糖例如氟、氨基、甲氧基、烯丙氧基，例如

其他修饰的核苷酸或核苷包括用可以通过间隔物单元附连的非放射活性标记物例如荧光标记物或荧光猝灭剂取代。荧光团的类别包括呫吨类(例如荧光素类、罗丹明类)、花青类(例如花青3、3.5、5、5.5)和硼-二吡咯甲川(BODIPY^TM染料)。荧光猝灭剂的类别包括偶氮猝灭剂(例如dabcyl、IOWA

FQ)和蒽醌猝灭剂(例如IOWA

RQ)。荧光标记物和猝灭剂可以被附连到核碱基或糖的3’-或5’-位置，例如

其他核苷酸/核苷修饰在本领域中是公知的，例如用聚乙二醇基团、胆甾醇基团、生物素基团、脂质基团和各种不同的官能团例如氨基、醛、羧酸和炔烃取代。

保护基团可以存在于核苷酸或核苷的糖或核碱基部分的氧或氮原子上。保护基团可以存在于核苷酸的磷酸酯部分的氧上。核苷酸和核苷保护基团在本领域中是公知的。

代表性的保护基团被公开在Beaucage,S.L.，Uyer,R.P.，“通过亚磷酰胺方法合成寡核苷酸的进展》(Advances in the Synthesis of oligonucleotides by thePhosphoramidite Approach)，Tetrahedron,1992,48,2223-2311中，所述文章整体通过参考并入本文。说明性的可以在酸性或中性条件下除去的保护基团包括三苯甲基(Tr)、二甲氧基三苯甲基(DMTr)、单甲氧基三苯甲基、9-苯基呫吨-9-基(Pixyl)、9-(对甲氧基苯基)呫吨-9-基(Mox)和4,4',4"-三-叔丁基三苯甲基(TTTr)。说明性的可以在中性条件下除去的保护基团是碱不稳定性保护基团，例如酰基或芳酰基。

核碱基上的环外氨基可以通过酰化来保护。苯甲酰基用于保护腺嘌呤和胞嘧啶两者，而异丁酰基和二甲基甲酰胺基可用于保护鸟嘌呤。其他可选保护基团是已知的，例如用于腺嘌呤的氨基的苯氧乙酰基、邻苯二甲酰基或二-N-丁基氨基亚甲基，用于胞嘧啶的乙酰基，和用于鸟嘌呤的异丙基苯氧乙酰基。

正如本领域技术人员认识到的，5'-羟基或3'-羟基通常用三苯基甲基(三苯甲基)、4-甲氧基三苯基甲基(甲氧基三苯甲基)或4,4'-二甲氧基三苯基甲基(二甲氧基三苯甲基)保护。二甲氧基三苯甲基保护基团通常是优选的。2’-羟基保护基团包括甲硅烷基(例如叔丁基二甲基甲硅烷基)、缩醛以及在《核酸化学现代方法》(Current Protocols inNucleic Acid Chemistry，2000，第3.5章)中《根据亚磷酰胺方法合成寡核糖核苷酸的策略》(Strategies for Oligoribonucleotide Synthesis According to thePhospharamidite Method)中描述的其他保护基团。磷酸酯保护基团包括2-氰基乙基和甲基。

G^1a的核苷酸或核苷组成部分通过核苷酸或核苷组成部分中的3’或5’氧原子键合到式(I)中的母体分子组成部分。

出于说明的目的，其中R^2b是C(O)-L⁷–C(O)-G^1a的键合到G^1a的3’氧的式(I)的官能化的固相支持物可以是

其中A、L¹、L²、L³、L⁷、R¹、R^2a和n如本文中所定义。

其中R^2b是C(O)-L^5a-L^5b–P(O)(R¹)–G^1a的键合到G^1a的3’氧的式(I)的官能化的固相支持物的另一个实例可以是

其中A、L¹、L²、L³、L^5a、L^5b、R¹、R^2a和n如本文中所定义。

其中R^2b是C(O)-L⁶-G^1a并且其中L⁶是L⁷–Si(C_1-4烷基)₂的键合到3’氧的式(I)的官能化的固相支持物的另一个实例可以是

其中A、L¹、L²、L³、L⁷、R¹、R^2a和n如本文中所定义。

G^1a的代表性实例包括

在整个本发明的化合物的实施方式和描述中，卤代烷基的所有情况可以是氟代烷基(例如任何C_1-4卤代烷基可以是C_1-4氟代烷基)。

其中存在不对称或手性中心的化合物可以作为立体异构体存在。取决于手性碳原子周围的取代基的构型，立体异构体是“R”或“S”。本文中使用时的术语“R”和“S”是在IUPAC1974年对基础立体化学E部分的建议(Recommendations for Section E,FundamentalStereochemistry)，Pure Appl.Chem.,1976,45:13-30中所定义的构型。本公开设想了各种不同的立体异构体及其混合物，并且它们被具体包括在本发明的范围内。立体异构体包括对映异构体和非对映异构体以及对映异构体或非对映异构体的混合物。化合物的单个立体异构体可以从可商购的含有不对称或手性中心的起始材料合成制备，或通过制备消旋混合物，然后使用本领域普通技术人员公知的拆分方法来制备。这些拆分方法的实例是：(1)将对映异构体的混合物附连到手性助剂，通过重结晶或层析分离得到的非对映异构体的混合物，并任选地从所述助剂上释放光学纯产物，正如在Furniss,Hannaford,Smith和Tatchell，《Vogel实用有机化学教科书》(Vogel's Textbook of Practical OrganicChemistry)，第5版，(1989)，Longman Scientific&Technical,Essex CM202JE,England中所描述的，或(2)在手性层析柱上直接分离光学对映异构体的混合物，或(3)分级重结晶方法。

应该理解，所述化合物可能具有互变异构形式以及几何异构体，并且它们也构成本发明的一个方面。

本公开还包括同位素标记的化合物，其一个或多个原子被具有与自然界中通常发现的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子代替。适合于包含在本发明的化合物中的同位素的实例是氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯，分别例如但不限于²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O、¹⁷O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F和³⁶Cl。用较重的同位素例如氘即²H取代，可以带来由更高的代谢稳定性造成的某些治疗优点，例如体内半衰期增加或剂量要求降低，并且因此在某些情况下可能是优选的。所述化合物可以并入用于医学成像和正电子发射断层扫描(PET)的正电子发射同位素，用于确定受体的分布。可以并入到式(I)的化合物中的适合的正电子发射同位素是¹¹C、¹³N、¹⁵O和¹⁸F。同位素标记的式(I)的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术来制备，或者通过与随附的实施例中描述的类似的过程，使用适合的同位素标记的试剂代替非同位素标记的试剂来制备。

本公开的化合物可能作为盐存在。所述盐可以在所述化合物的最终分离和纯化期间制备，或者通过将所述化合物的氨基与适合的酸反应独立地制备。例如，可以将化合物溶解在适合的溶剂例如但不限于甲醇和水中，并用至少一个当量的酸例如盐酸处理。得到的盐可能沉淀出来，并可以通过过滤分离并在减压下干燥。或者，可以在减压下除去溶剂和过量的酸以提供盐。代表性的盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、甲酸盐、羟乙基磺酸盐、富马酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、草酸盐、马来酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、谷氨酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐等。所述化合物的氨基也可以用烷基氯化物、溴化物和碘化物季铵化，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、月桂基、肉豆蔻基、硬脂基等。

碱加成盐可以在本公开的化合物的最终分离和纯化期间，通过羧基与适合的碱的反应来制备，所述碱例如金属阳离子如锂、钠、钾、钙、镁或铝的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，或有机伯胺、仲胺或叔胺。可以制备季胺盐，例如源自于甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺、三丁胺、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己胺、普鲁卡因、二苯甲胺、N,N-二苯甲基苯乙胺、1-ephenamine和N,N’-二苯甲基乙二胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。

B.合成方法

本发明的各个方面提供了用于制备式(I)的官能化的固相支持物的方法。所述式(I)的官能化的支持物包括被核苷酸或核苷组成部分取代的支持物，以及作为制备被核苷酸或核苷组成部分取代的支持物的化学中间体的支持物。可以将某些化学中间体支持物反应以制备其他化学中间体支持物。也可以使用公知的寡核苷酸合成技术将带有核苷酸或核苷组成部分的官能化的支持物反应以制备寡核苷酸，例如在Biochem.Soc.Trans.2011,39,575-580和《核酸化学现代方法》(Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry)，2000，第3章中的“未修饰的寡核糖核苷酸的合成”(Synthesis of UnmodifiedOligoribonucleotides)中所描述的技术，所述文献的每个部分通过参考并入本文。可以使用已确立的方案将寡核苷酸从本发明的固相支持物切下。

本发明的一个方面提供了其中G¹是PG¹并且n是1的式(I)的中间体的合成，其包括：

(a)将式(II)的官能化的固相支持物与其中R²⁰和R²¹独立地是C_1-6烷基的式(III)的化合物反应，

以提供式(IV)的官能化的固相支持物，

和

(b)氧化所述式(IV)的官能化的固相支持物，以提供下述式(I-a)的官能化的固相支持物，其中A、L¹、L²、R¹和PG¹如本文中所定义

步骤(a)和(b)可以使用标准的亚磷酰胺偶联和氧化程序来进行。

在步骤(c)中，可以将式(I-a)的官能化的支持物与适合的试剂反应以除去保护基团PG¹，提供下述式(I-b)的官能化的固相支持物

在步骤(d)中，可以使用式(III)的化合物将式(I-b)的官能化的支持物转变成其他化学中间体，以提供式(IV-A)的官能化的固相支持物；

以及(e)氧化式(IV-A)的官能化的固相支持物，以提供式(I-c)的官能化的固相支持物，其中A、L¹、L²、R¹和PG¹如本文中所定义

步骤(d)和(e)可以使用标准的亚磷酰胺偶联和氧化程序来进行。

在步骤(f)中，可以将式(I-c)反应以除去保护基团PG¹并提供式(I-c1)，并按照步骤(d)和(e)或(d)、(e)和(f)对得到的醇进行进一步反应以提供式(I)的官能化的固相支持物，其中G¹是氢或PG¹并且n是3至20的整数。除去特定序列末端处的PG¹提供式(I-c2)

反应路线1

反应路线1中说明了代表性的合成，示出了使用特定A、L¹、L²和G¹基团的步骤(a)-(f)的实施。

本发明的另一方面提供了本发明的式(I)的其他中间体的制备，其包括在步骤(g)中将其中G¹是氢的式(I)与其中R²⁰和R²¹独立地是C_1-6烷基的式(V-a)的化合物反应，

以提供式(VI-a)的官能化的固相支持物

并且

(h)氧化式(VI-a)的官能化的固相支持物，以提供式(I-d)的官能化的固相支持物，其中A、L¹、L²、L³、R¹、R^2a、n和PG²如本文中所定义(即在式(I)中，G¹是–P(O)(R¹)–L³–R²，R²是NR^2aR^2b，并且R^2b是PG²)

在某些实施方式中，R^2a是氢。步骤(g)和(h)可以使用标准的亚磷酰胺偶联和氧化程序来进行。

在步骤(i)中，可以将式(I-d)的官能化的支持物与适合的试剂反应以除去保护基团PG²，提供下述式(I-e)的官能化的固相支持物

在某些实施方式中，R^2a是氢。

反应路线2

反应路线2中说明了代表性的合成，示出了使用特定A、L²、L³和R^2b基团的步骤(g)-(i)的实施。

式(I-e)的官能化的固相支持物(例如其中R^2a是氢)可以被进一步处理以提供本发明的其他中间体，所述处理包括与琥珀酸酐反应，以提供采取式(I-f)的形式的式(I)的官能化的固相支持物，其中R^2b是C(O)-CH₂CH₂COOH：

式(I-e)的官能化的固相支持物(例如其中R^2a是氢)可以被进一步处理以提供本发明的其他中间体，所述处理包括与式HO-C(O)-L⁷–C(O)OH或HO-C(O)-L⁷–C(O)OPG³的化合物反应，其提供采取式(I-g)或(I-h)的形式的式(I)的官能化的固相支持物，其中R^2b是C(O)-L⁷–C(O)OH或C(O)-L⁷–C(O)OPG³：

式(I-h)可以使用本领域中公知的用于除去羧酸保护基团的标准条件，通过除去保护基团PG³而转变成式(I-g)。

反应路线3

反应路线3中说明了代表性的合成，示出了琥珀酸酐与具有特定A、L²、L³、R^2a和R^2b基团的式(I-e)的代表即(i-e2)的偶联，以产生(i-f1)。

式(I-e)的官能化的固相支持物(例如其中R^2a是氢)可以被进一步处理以提供本发明的其他中间体，所述处理包括与式HO-C(O)-L⁷–OH或HO-C(O)-L⁷–OPG¹的化合物反应，以提供采取式(I-i)和(I-j)的形式的式(I)的官能化的固相支持物，其中R^2b是C(O)-L⁷–OPG¹或C(O)-L⁷–OH(即R^2b是C(O)-L⁵–PG¹或C(O)-L⁵–H)

在式(I-i)和(I-j)中，L⁷被配置成使得L⁷–O–PG¹是醚组成部分并且L⁷–O–H是醇组成部分。式(I-i)可以使用本领域中公知的用于除去醇保护基团的标准条件，通过除去保护基团PG¹而转变成式(I-j)。

反应路线4

反应路线4中说明了代表性合成，示出了与代表性通用连接物的酰胺偶联以形成式(i-i)，然后进行醇去保护以提供式(i-j)。通用连接物在本领域中是公知的，正如在下述文献中所描述的：Org.Process Res.Dev.(2008)12(3):399-410；Nucleosides,Nucleotides,and Nucl.Acids(2010)29(11):867-878；“用于寡核苷酸合成的固相支持物”(Solid-Phase Supports for Oligonucleotide Synthesis)，《核酸化学现代方法》(Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry)，2000，第3章，第3.1节；US6,770,754；US7,202,264；US7,491,817和WO2018/177881。

可以将式(I-b)、(I-c1)、(I-c2)、(I-e)、(I-f)、(I-g)和(I-j)的中间体进一步反应，以制备带有核苷酸或核苷组成部分G^1a的式(I)的官能化的固相支持物。

式(I-b)、(I-c1)和(I-c2)被合称为式(I-c3)，

可以使用标准的亚磷酰胺偶联条件与其中R²⁰和R²¹独立地是C_1-6烷基的式(V-b)的化合物反应，

以提供式(VI-b)的官能化的固相支持物

并氧化式(VI-b)的官能化的固相支持物，以提供式(I-k)的官能化的固相支持物，其中A、L¹、L²、L³、L⁴、R¹、R^2a和G^1a如本文中所定义(即在式(I)中，G¹是–P(O)(R¹)–L³–R²，R²是NR^2aR^2b，并且R^2b是C(O)–L⁴–G^1a)

在某些实施方式中，R^2a是氢。

可以使用标准的酰胺键形成条件，将式(I-e)与式HO-C(O)-L⁴-G^1a的化合物反应，以提供采取式(I-k)的形式的式(I)的官能化的固相支持物，其中R^2b是C(O)-L⁴-G^1a。

反应路线5

反应路线5说明了带有核苷酸或核苷组成部分G^1a和式(I)中的特定A、L³、R^2a和R^2b基团的式(i-k)的官能化的固相支持物的代表性合成。

可以在酯形成条件下将式(I-g)与核苷或核苷酸在3’或5’OH处反应，以提供具有式(IX-a)的式(I)的官能化的固相支持物

式(I-f)的反应提供式(IX-a)，其中L⁷是–CH₂CH₂–。

可以将式(I-j)与其中R²⁰和R²¹独立地是C_1-6烷基并且G^1a是核苷酸组成部分或核苷组成部分的式(VII)的化合物反应

以提供式(VIII-a)的官能化的固相支持物，

并且氧化式(VIII-a)的官能化的固相支持物，以提供具有式(X-a)的式(I)的官能化的固相支持物

反应路线6

反应路线6中说明了带有核苷酸或核苷组成部分G^1a和式(I)中的特定A、L⁵、R^2a和R^2b基团的式(x-a)的官能化的固相支持物的代表性合成。

本发明的另一方面提供了一种合成寡核苷酸的方法，所述方法包括(a)对式(I)的官能化的固相支持物进行一个或多个核苷酸添加化学的循环，其中G¹是–P(O)(R¹)–L³–R²；R²是–NR^2aR^2b；R^2b是C(O)-L⁴-G^1a、C(O)-L⁵–P(O)(R¹)–G^1a或C(O)-L⁶-G^1a；G^1a是核苷酸组成部分或核苷组成部分；所述核苷酸组成部分和核苷组成部分包含单个核苷酸或核苷残基；以及

(b)获得式(I)的官能化的固相支持物，其中G¹是–P(O)(R¹)–L³–R²；R²是–NR^2aR^2b；R^2b是C(O)-L⁴-G^1a、C(O)-L⁵–P(O)(R¹)–G^1a或C(O)-L⁶-G^1a；并且G^1a是寡核苷酸组成部分。

所述一个或多个核苷酸添加化学的循环可以是一个或多个亚磷酰胺介导的核苷酸添加的循环。

使用本发明的官能化的固相支持物，可以以每10,000个碱基对少于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个碱基对的平均错误和/或缺失率制备寡核苷酸。

所述寡核苷酸合成方法还可以包括从所述官能化的固相支持物切下所述寡核苷酸组成部分。所述方法还可以包括在切割之前从所述寡核苷酸组成部分除去一个或多个保护基团。所述方法还可以包括在切割后从所述寡核苷酸除去一个或多个保护基团。

本发明的官能化的固相支持物可以使用本领域技术人员已知的大量技术和合成方案来合成。

亚磷酰胺偶联可以通过使用酸性唑类催化剂在诸如乙腈的溶剂中活化适合的亚磷酰胺，然后将过量的所述活化的亚磷酰胺与醇反应配偶体反应，并将中间体亚磷酸三酯氧化来实现。唑类催化剂包括1H-四唑、5-乙硫基-1H四唑、2-苯甲硫基四唑、4,5-二氰基咪唑或大量类似化合物，正如在“用于通过亚磷酰胺方法合成寡核苷酸的偶联活化剂”(Coupling activators for the oligonucleotide synthesis via phosphoramiditeapproach)，Tetrahedron(2013)69(18):3615–3637中所描述的。所述不稳定的三价亚磷酸三酯可以通过使用THF/吡啶/水中的0.1M或0.02M碘，氧化成稳定的五价磷酸三酯。

酰胺偶联可以使用公知的条件来进行，例如使用偶联试剂例如HATU、EDC、PyBOP、DCC、HBTU或TBTU，在溶剂例如THF、DMF、二氯甲烷、乙酸乙酯或DMSO中，在添加或不添加胺碱例如N-甲基吗啉、Hünig碱、吡啶、2,6-二甲基吡啶或三乙胺的情况下，将胺与羧酸反应以提供产物。例如，将胺(1当量)与酸(2.5当量)和HATU(2.5当量)在二异丙基乙胺(3当量)存在下，在DMSO中在大约室温下反应。

用于除去醇和胺保护基团的条件在本领域中是公知的，如在PGM Wuts和TWGreene，Greene的书籍《有机合成中的保护基团》(Protective Groups in OrganicSynthesis)(第4版)，John Wiley&Sons，NY(2006)中所述，所述书籍通过参考并入本文。例如，DMTr基团可以通过与二氯甲烷(DCM)中的3％三氯乙酸(TCA)、DCM中的3％二氯乙酸(DCA)或甲苯中的5％DCA反应来除去。用于胺的Boc保护基团可以使用DCM中的三氟乙酸(TFA)或二

烷/水混合物中的HCl来除去。

寡核苷酸合成可以通过向生长中的链的5'-末端逐步添加核苷酸残基直至组装出所需序列来进行。每次添加被称为合成循环，并且通常由四个化学反应组成：(1)去阻断；(2)偶联；(3)封端；和(4)氧化。去阻断可以包括除去5’-DMTr基团以提供带有游离5’-末端羟基的固相支持物结合的前体。用于DMTr去除的常用条件包括与酸溶液例如惰性溶剂(二氯甲烷或甲苯)中的2％三氯乙酸(TCA)或3％二氯乙酸(DCA)反应。游离的5’-羟基可以在乙腈中与被酸性唑类催化剂活化的核苷亚磷酰胺偶联，以形成亚磷酸三酯连键，所述催化剂例如1H-四唑、5-乙硫基-1H四唑、2-苯甲硫基四唑、4,5-二氰基咪唑或许多类似化合物。然后将任何具有未反应的5’-OH的分子通过乙酰化封端。最后，通常使用碘和水在弱碱(例如吡啶、二甲基吡啶、colline)存在下将亚磷酸三酯连键氧化成磷酸三酯。或者，寡核苷酸合成可以在3’-方向上进行，正如在Appl.Sci.2019,9,1357中所述。

在合成后，可以将寡核苷酸从支持物上切下并去保护。通常，去保护条件由掺入到寡核苷酸中的修饰类型决定。它们也可以由用于合成所述寡核苷酸骨架的核碱基的保护决定。N-酰基碱基保护和2-氰基乙基磷酸酯保护可以通过用无机碱或胺处理同时除去。固相支持物结合的寡核苷酸可以用碱在有机溶剂中的溶液，例如用乙腈中的50％三乙胺或乙腈中的10％二乙胺处理。用传统基团(Bz-dA、Bz-dC和iBu-dG)保护的标准的DNA碱基可以使用氢氧化铵溶液去保护。然而，这种去保护通常是缓慢的，并且不与所有修饰相容。使用28％(或更高)氢氧化铵和40％甲胺水溶液的1:1混合物，Ac-dC和dmf-dG以及相应的RNA碱基允许快得多的去保护。如果寡核苷酸含有任何2'-O保护的核糖核苷酸残基，则去保护方案包括第二步，其中通过用各种不同的方法用氟离子处理，来除去2'-O-保护的甲硅烷基。完全去保护的产物可以原样使用，或者可以通过多种方法纯化所需的寡核苷酸。最通常地，使用乙醇沉淀、孔径排阻层析或反相HPLC将粗产物脱盐。为了消除不想要的截短的产物，可以将寡核苷酸通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换HPLC进行纯化，然后脱盐。寡核苷酸可以被合成为“带有DMT”，并且最终的二甲氧基三苯甲基仅在纯化期间或之后除去。为此，在最后个亚磷酰胺添加后不进行去阻断处理。将寡核苷酸切下并根据需要去保护。如果在纯化期间DMTr基团得以保留。则它可以通过用酸(80％乙酸水溶液)处理来去除。为了完全除去通用连接物，可以使用下述之一：(1)氢氧化铵溶液，在80℃下17h；(2)28％(或更高)氢氧化铵和40％甲胺水溶液的1:1混合物，在80℃下5h；或(3)28％(或更高)氢氧化铵和40％甲胺水溶液的1:1混合物，在55℃下过夜。在去保护期间，Q连接物可以通过与28％(或更高)氢氧化铵和40％甲胺水溶液的1:1混合物在70℃下反应2.5h来除去。

本公开的化合物可以使用本章节中描述的示例性反应和技术来制备。所述反应在适合于所使用的试剂和材料的溶剂中进行，并适合于使所述转化有效。此外，在下面描述的合成方法的描述中，应该理解，所有提出的反应条件包括溶剂、反应气氛、反应温度、实验持续时间和净化程序被选择成是该反应的标准条件，这应该被本领域技术人员容易地认识到。本领域普通技术人员可以调整本文中描述的一个或多个条件。有机合成领域的技术人员理解，存在于所叙述的分子的各个不同部分上的官能团必须与提出的试剂和反应相容。不是所有本公开的落于给定类别中的化合物都可以与所描述的某些方法中需要的某些反应条件相容。此类对与反应条件相容的取代基的限制对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且可以使用可选方法。

缩略语：

Ac-dC＝N-乙酰基-2’-脱氧胞苷

Ac₂O＝乙酸酐

aq.＝水性

Bz-dA＝苯甲酰基-2’-脱氧腺苷

Bz-dC＝苯甲酰基-2’-脱氧胞苷

conc.＝浓的

DCC＝N,N′-二环己基碳二亚胺

DCM＝二氯甲烷，CH₂Cl₂

DIPEA＝二异丙基乙胺

dmf-dG＝N-二甲基甲脒-2’-脱氧鸟苷

DMSO＝二甲基亚砜

EDC＝1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺

eq＝当量

EtOH＝乙醇

EtOAc＝乙酸乙酯

Et₃N＝三乙胺

h＝小时

HOAc＝乙酸

HATU＝1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐

HBTU＝(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐

iBu-dG＝异丁基-2’-脱氧鸟苷

MeCN＝乙腈

MeOH＝甲醇

min＝分钟

PyBop＝溴代三吡咯烷鏻六氟磷酸盐

r.t.＝室温

rt＝室温

sat.＝饱和的

TBDMS＝叔丁基二甲基甲硅烷基

TBTU＝2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵四氟硼酸盐

TFA＝三氟乙酸

THF＝四氢呋喃

TMS＝三甲基甲硅烷基

wt.＝重量

XantPhos＝4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基呫吨

C.实施例

实施例1.延长连接物CPG支持物的合成

反应路线7示出了示例性前体分子8的合成。将孔径为

的LCAA CPG珠子与过量ε-己内酯7在甲苯中，在回流下反应24小时。这种产生的结构8具有基于醇的支持物，有利于随后的亚磷酰胺化学。

反应路线7

如反应路线8中所示，然后使用多达4个标准亚磷酰胺化学的循环附连1至4个具有氰基乙基保护基团的间隔物18亚磷酰胺9，产生延长连接物CPG 10。

反应路线8

如反应路线9中所示，在将延长连接物10去保护后，然后通过标准的亚磷酰胺化学将可切割的修饰的dT亚磷酰胺11附连到10以产生12，通过标准的亚磷酰胺化学向其附连后续核苷酸，以产生最终的寡核苷酸产物。

反应路线9

实施例2.使用延长连接物CPG支持物结构的寡核苷酸合成的偶联效率

使用作为化合物12的通用类型的官能化的支持物，以每10,000bp低于3bp的错误和缺失率生产了寡核苷酸。

实施例3.延长连接物CPG支持物的合成

延长连接物CPG的其他实施方式涉及间隔物18的修饰，以延长保质期和抑制分支和副反应。例如，可以对间隔物18亚酰胺进行修饰，以用不可切割的或更稳定的基团例如甲基、乙基、甲氧基、乙氧基和异丙氧基代替氰基乙基保护基团。

为了制备这些修饰的结构，将在一个末端上用结合到该末端处的游离OH的DMTr保护的间隔物18 14与N,N,N',N'-四异丙基二氨基磷酸乙酯15而不是N,N,N',N'-四异丙基二氨基磷酸2-氰基乙基酯，在MixerMill 400球磨均质机中，在吡啶三氟乙酸盐(Py·TFA)存在下反应。这产生仍被DMTr保护的在亚磷酰胺上具有乙基保护基团的间隔物18亚酰胺16。

反应路线10

然后将所述间隔物18亚酰胺16偶联到具有用ε-己内酯衍生的LCAA的基于醇的CPG8，氧化，并将所述偶联-氧化过程重复6次，以提供18。

反应路线11

为了在延长连接物的末端上添加胺基，对另一个间隔物18 19进行修饰，使得一个末端上的游离OH被受到叔丁氧基羰基(Boc)基团保护的游离胺代替20。然后如上所述附连乙基保护的亚酰胺15，以产生21。

反应路线12

然后将化合物21附连到延长连接物18以产生产物22，其含有8个连接物18，在磷酸酯上通过乙基进行保护，并在末端处具有游离胺。

反应路线13

使用类似的化学，可以制备官能化的固相支持物27和28。

应该理解，上面详细描述的说明和随附的实施例仅仅是说明性的，并且不应被当作对本发明范围的限制，本发明的范围仅由权利要求书和它们的等同物定义。

对于本领域技术人员来说，各种不同的变化和修改是显而易见的。此类变化和修改，包括但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用方法相关的变化和修改，可以在不背离其精神和范围的情况下做出。

Claims (51)

1.一种式(I)的官能化的固相支持物或其盐，

(I)

其中：

A是固相支持物材料；

L¹是由选自碳、氢、氧、氮、硫、磷、硅和卤素的原子组成的二价化学连接物，

其中

(a)所述二价连接物的原子排列形成任选取代的链或被任选取代的环中断的任选取代的链；并且

(b)所述链或链和环一起包含选自碳、氧、氮、硫、磷和硅的原子的12至40元连续线性排列；

L²在每次出现时独立地是–(CH₂CH₂O)_m–、–(CHCH₃CH₂O)_m–或–(CH₂CHCH₃O)_m–；

G¹是–P(O)(R¹)–L³–R²、氢或PG¹；

R¹在每次出现时独立地是–OR^1a或R^1a；

R^1a在每次出现时独立地是C_1-10烷基、C_2-10烯基、C_2-10炔基、C_3-10环烷基或C_5-10环烯基，其中R^1a任选地被1-6个独立地选自氰基、卤素、氧代、OH、–OC_1-4烷基、–OC_1-4卤代烷基或C_3-6环烷基的取代基取代，所述C_3-6环烷基任选地被卤素或C_1-4烷基取代；

L³是–(OCH₂CH₂)_p–、–(OCHCH₃CH₂)_p–、–(OCH₂CHCH₃)_p–、–OC_2-10亚烷基–、–OC_0-4亚烷基–C_3-10亚环烷基–C_0-4亚烷基–或–OC_0-4亚烷基–亚苯基–C_0-4亚烷基–，其中L³中的亚烷基任选地被1-6个卤素取代，并且所述亚环烷基和亚苯基任选地被1-4个独立地选自卤素、C_1-4烷基、C_1-4卤代烷基、氰基、–OC_1-4烷基和–OC_1-4卤代烷基的取代基取代；

R²是–NR^2aR^2b；

R^2a是氢、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、C_3-6环烷基或–C_1-3亚烷基–C_3-6环烷基；

R^2b是C(O)-L⁴-G^1a、氢、PG²、C(O)-L⁴-OH、C(O)-L⁴-OPG³、C(O)-L⁵–H、C(O)-L⁵–PG¹、C(O)-L⁵–P(O)(R¹)–G^1a、C(O)-L⁵–P(O)(OH)–G^1a或C(O)-L⁶-G^1a，或

R^2a和R^2b与它们附连到的氮一起形成受保护的氮原子；

L⁴是L⁷–C(O)或C(O)；

L⁵是L⁷–O；

L⁶是L⁷–Si(C_1-4烷基)₂；

L⁷是由选自碳、氢、氧、氮、硫、磷、硅和卤素的原子组成的二价化学连接物，

其中

(a)所述二价连接物的原子排列形成任选取代的链、任选取代的环或任选取代的链和环的组合；并且

(b)所述链、环或其组合包含选自碳、氧、氮、硫、磷和硅的原子的1至20元连续线性排列；

G^1a是核苷酸组成部分或核苷组成部分；

PG¹是羟基保护基团；

PG²是氨基保护基团；

PG³是羧酸保护基团；

m和p独立地是3至10的整数；并且

n是1至20的整数。

2.根据权利要求1所述的官能化的固相支持物，其中G¹是氢。

3.根据权利要求1所述的官能化的固相支持物，其中G¹是PG¹。

4.根据权利要求1所述的官能化的固相支持物，其中G¹是P(O)(R¹)–L³–R²。

5.根据权利要求1或4所述的官能化的固相支持物，其中L³是–(OCH₂CH₂)_p–。

6.根据权利要求1、4或5中的任一项所述的官能化的固相支持物，其中p是6。

7.根据权利要求1或4所述的官能化的固相支持物，其中L³是–OC_2-10亚烷基–。

8.根据权利要求1、4或7中的任一项所述的官能化的固相支持物，其中L³是–OC_4-8亚烷基–。

9.根据权利要求1、4、7或8中的任一项所述的官能化的固相支持物，其中L³是–OC₆亚烷基–。

10.根据权利要求1、4、7或8中的任一项所述的官能化的固相支持物，其中L³是–O(CH₂)₆–。

11.根据权利要求1或4-10中的任一项所述的官能化的固相支持物，其中R^2a是氢。

12.根据权利要求1或4-11中的任一项所述的官能化的固相支持物，其中R^2b是氢。

13.根据权利要求1或4-11中的任一项所述的官能化的固相支持物，其中R^2b是PG²。

14.根据权利要求1或4-11中的任一项所述的官能化的固相支持物，其中R^2b是C(O)-L⁴-G^1a、C(O)-L⁴-OH或C(O)-L⁴-OPG³。

15.根据权利要求14所述的官能化的固相支持物，其中

L⁴是–C_0-4亚烷基–C(O)–、–C_1-3亚烷基–O–C_1-3亚烷基–C(O)–、–C_1-3亚烷基–N(C_1-3烷基)C(O)–C_1-3亚烷基–C(O)–、–亚苯基–C(O)–、–C_1-3亚烷基–O–亚苯基–O–C_1-3亚烷基–C(O)–、–亚苯基–C_1-3亚烷基–O–C(O)–、–C_1-3亚烷基–O–亚苯基–C_1-3亚烷基–O–C(O)–、–C_1-3亚烷基–C(O)NH–亚芴基–C_1-3亚烷基–O–C(O)–或

其中所述亚苯基任选地被1-4个独立地选自NO₂、–OC_1-4烷基、卤素、C_1-4烷基和C_1-4卤代烷基的取代基取代。

16.根据权利要求15所述的官能化的固相支持物，其中

L⁴是–(CH₂)₂–C(O)–、–C(O)–、–CH₂–C(O)–、–CH₂–O–CH₂–C(O)–、–CH₂–N(CH₃)C(O)–(CH₂)₂–C(O)–、

17.根据权利要求1或4-11中的任一项所述的官能化的固相支持物，其中R^2b是C(O)-L⁵–H、C(O)-L⁵–PG¹、C(O)-L⁵–P(O)(R¹)–G^1a或C(O)-L⁵–P(O)(OH)–G^1a。

18.根据权利要求17所述的官能化的固相支持物，其中

L⁵是L^5b或L^5a-L^5b；

L^5a是–C_0-4亚烷基–C(O)–、–C_1-3亚烷基–O–C_1-3亚烷基–C(O)–、–C_1-3亚烷基–N(C_1-3烷基)C(O)–C_1-3亚烷基–C(O)–、–亚苯基–C(O)–、–C_1-3亚烷基–O–亚苯基–O–C_1-3亚烷基–C(O)–、–亚苯基–C_1-3亚烷基–O–C(O)–、–C_1-3亚烷基–O–亚苯基–C_1-3亚烷基–O–C(O)–或–C_1-3亚烷基–C(O)NH–亚芴基–C_1-3亚烷基–O–C(O)–；

–(CH₂)_1-10–O–或–(CH₂CH₂O)_2-6–；并且

R¹⁰是苯基、C_1-10烷基或C_1-10卤代烷基；

其中所述亚苯基和苯基任选地被1-4个独立地选自NO₂、–OC_1-4烷基、卤素、C_1-4烷基和C_1-4卤代烷基的取代基取代。

19.根据权利要求18所述的官能化的固相支持物，其中

L^5a是–C(O)–、–CH₂–C(O)–、–(CH₂)₂–C(O)–、–CH₂–O–CH₂–C(O)–、–CH₂–N(CH₃)C(O)–(CH₂)₂–C(O)–、

并且

L^5b是

–CH₂–O–、–(CH₂)₃–O–或–(CH₂CH₂O)₄–。

20.根据权利要求19所述的官能化的固相支持物，其中L⁵是

–CH₂–O–、–(CH₂)₃–O–或–(CH₂CH₂O)₄–。

21.根据权利要求14所述的官能化的固相支持物，其中

R^2b是C(O)-L⁴-OH或C(O)-L⁴-OPG³；并且

L⁴是–C(O)–、–CH₂–C(O)–、–(CH₂)₂–C(O)–、–CH₂–O–CH₂–C(O)–、–CH₂–N(CH₃)C(O)–(CH₂)₂–C(O)–、

22.根据权利要求17所述的官能化的固相支持物，其中

R^2b是C(O)-L⁵–H或C(O)-L⁵–PG¹；并且

L⁵是

CH₂–O–、–(CH₂)₃–O–或–(CH₂CH₂O)₄–。

23.根据权利要求1或4-11中的任一项所述的官能化的固相支持物，其中R^2b是C(O)-L⁶-G^1a；并且L⁶是

24.根据权利要求23所述的官能化的固相支持物，其中L⁶是

25.根据权利要求1-24中的任一项所述的官能化的固相支持物，其中L¹包含一个或多个共价键合的成员，所述一个或多个成员独立地选自C_2-10亚烷基、–NH–、–NHC(O)–、甲硅烷基和–OCH₂CH(OC(O)C_1-4烷基)CH₂O–。

26.根据权利要求1-24中的任一项所述的官能化的固相支持物，其中L¹是键合到甲硅烷基的C_11-39亚烷基，所述甲硅烷基键合到所述固相支持物材料，其中所述C_11-39亚烷基的2-6个亚甲基单元被–NH–、–O–或–NHC(O)–代替，并且所述C_11-39亚烷基任选地被–OC(O)CH₃取代。

27.根据权利要求1-24中的任一项所述的官能化的固相支持物，其中L¹是–甲硅烷基-C_2-4亚烷基-NH–C_2-10亚烷基–NHC(O)-C_2-10亚烷基–或–甲硅烷基-C_2-4亚烷基-OCH₂CH(OC(O)CH₃)CH₂OC(O)NH-C_2-10亚烷基–NHC(O)-C_2-10亚烷基–。

28.根据权利要求1-24中的任一项所述的官能化的固相支持物，其中L¹是–甲硅烷基-(CH₂)₃-NH–(CH₂)₆–NHC(O)-(CH₂)₅–或–甲硅烷基-(CH₂)₃-OCH₂CH(OC(O)CH₃)CH₂OC(O)NH-(CH₂)₆–NHC(O)-(CH₂)₅–。

29.根据权利要求1-28中的任一项所述的官能化的固相支持物，其中L²在每次出现时独立地是–(CH₂CH₂O)_m–。

30.根据权利要求1-29中的任一项所述的官能化的固相支持物，其中m是6。

31.根据权利要求1-30中的任一项所述的官能化的固相支持物，其中n是4-7。

32.根据权利要求1-31中的任一项所述的官能化的固相支持物，其中R¹在每次出现时独立地是–OCH₂CH₂CN、–CH₃、–CH₂CH₃、–OCH₃、–OCH₂CH₃或–OCH(CH₃)₂。

33.根据权利要求1-32中的任一项所述的官能化的固相支持物，其中所述固相支持物材料是可控孔玻璃(CPG)、硅胶、大孔交联聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸乙烯醇共聚物、硅芯片、玻璃、聚苯乙烯珠、聚丙烯片、无孔硅珠、聚丙烯酰胺或聚丙烯酸酯。

34.一种制备根据权利要求1-3或25-33中的任一项所述的官能化的固相支持物的方法，其中G¹是氢或PG¹，所述方法包括：

(a)将式(II)的官能化的固相支持物与其中R²⁰和R²¹独立地是C_1-6烷基的式(III)的化合物反应，

以提供式(IV)的官能化的固相支持物，

(b)氧化所述式(IV)的官能化的固相支持物以提供所述其中G¹是PG¹并且n是1的式(I)的官能化的固相支持物；以及

(c)任选地除去保护基团PG¹，以提供所述其中G¹是氢并且n是1的式(I)的官能化的固相支持物。

35.根据权利要求34所述的方法，其还包括：

(d)将所述其中G¹是氢并且n是1的式(I)的官能化的固相支持物与所述式(III)的化合物反应，以提供式(IV-A)的官能化的固相支持物；

(e)氧化所述式(IV-A)的官能化的固相支持物以提供其中G¹是PG¹并且n是2的式(I)的官能化的固相支持物；

(f)任选地除去保护基团PG¹以提供所述其中G¹是氢并且n是2的式(I)的官能化的固相支持物；以及

任选地重复所述步骤(d)和(e)或(d)、(e)和(f)的反应，以提供所述其中G¹是氢或PG¹并且n是3至20的整数的式(I)的官能化的固相支持物。

36.一种制备根据权利要求1或4-33中的任一项所述的官能化的固相支持物的方法，其中G¹是–P(O)(R¹)–L³–R²，所述方法包括

(g)将其中G¹是氢的式(I)的官能化的固相支持物与其中R²⁰和R²¹独立地是C_1-6烷基的式(V)的化合物反应，

以提供式(VI)的官能化的固相支持物

并且

(h)氧化所述式(VI)的官能化的固相支持物，以提供其中G¹是–P(O)(R¹)–L³–R²的式(I)的官能化的固相支持物。

37.根据权利要求36所述的方法，其中

R^2a是氢；并且

R^2b是C(O)-L⁴-G^1a。

38.根据权利要求36所述的方法，其中

R^2a是氢；并且

R^2b是PG²。

39.根据权利要求38所述的方法，其还包括除去所述保护基团PG²以提供其中R^2b是氢的式(I)的官能化的固相支持物。

40.根据权利要求39所述的方法，其还包括将所述其中R²是–NH₂的式(I)官能化的固相支持物与式HO-C(O)-L⁴-G^1a的化合物反应，以提供其中R^2b是C(O)-L⁴-G^1a的式(I)的官能化的固相支持物。

41.根据权利要求39所述的方法，其还包括将其中R²是–NH₂的式(I)的官能化的固相支持物与琥珀酸酐反应，以提供其中R^2b是C(O)-CH₂CH₂COOH的式(I)的官能化的固相支持物。

42.根据权利要求39所述的方法，其还包括将所述其中R²是–NH₂的式(I)的官能化的固相支持物与式HO-C(O)-L⁷–C(O)OH或HO-C(O)-L⁷–C(O)OPG³的化合物反应，以提供所述其中R^2b是C(O)-L⁷–C(O)OH或C(O)-L⁷–C(O)OPG³的式(I)的官能化的固相支持物。

43.根据权利要求42所述的方法，其中R^2b是C(O)-L⁷–C(O)OPG³，所述方法还包括除去保护基团PG³。

44.根据权利要求41-43中的任一项所述的方法，其还包括将所述其中R^2b是C(O)-L⁷–C(O)OH的式(I)的官能化的固相支持物与核苷或核苷酸在3’或5’OH处反应，以提供具有式(IX)的式(I)的官能化的固相支持物

45.根据权利要求39所述的方法，其还包括将所述其中R²是–NH₂的式(I)的官能化的固相支持物与式HO-C(O)-L⁷–OH或HO-C(O)-L⁷–OPG¹的化合物反应，以提供所述其中R^2b是C(O)-L⁷–OH或C(O)-L⁷–OPG¹的式(I)的官能化的固相支持物。

46.根据权利要求45所述的方法，其中R^2b是C(O)-L⁷–OPG¹，所述方法还包括除去所述保护基团PG¹。

47.根据权利要求45或46所述的方法，其还包括将所述其中R^2b是C(O)-L⁷–OH的式(I)的官能化的固相支持物与其中R²⁰和R²¹独立地是C_1-6烷基并且G^1a是核苷酸组成部分或核苷组成部分的式(VII)的化合物反应，

以提供式(VIII)的官能化的固相支持物，

(VIII)；并且

氧化所述式(VIII)的官能化的固相支持物以提供具有式(X)的式(I)的官能化的固相支持物

48.一种合成寡核苷酸的方法，所述方法包括

(a)对式(I)的官能化的固相支持物进行一个或多个核苷酸添加化学的循环，

其中

G¹是–P(O)(R¹)–L³–R²；R²是–NR^2aR^2b；

R^2b是C(O)-L⁴-G^1a、C(O)-L⁵–P(O)(R¹)–G^1a或C(O)-L⁶-G^1a；

G^1a是核苷酸组成部分或核苷组成部分；并且所述核苷酸组成部分和核苷组成部分包含单个核苷酸或核苷残基；并且

A、L¹、L²、L³、L⁴、L⁵、L⁶、R¹、R^2a和n如权利要求1-33中的任一项所定义；以及

(b)获得式(I)的官能化的固相支持物，其中

G¹是–P(O)(R¹)–L³–R²；

R²是–NR^2aR^2b；

R^2b是C(O)-L⁴-G^1a、C(O)-L⁵–P(O)(R¹)–G^1a或C(O)-L⁶-G^1a；并且

G^1a是寡核苷酸组成部分。

49.根据权利要求48所述的方法，其还包括从所述官能化的固相支持物上切下所述寡核苷酸组成部分，以提供所述寡核苷酸。

50.根据权利要求48或49所述的方法，其还包括在切割之前从所述寡核苷酸组成部分除去一个或多个保护基团。

51.根据权利要求48-50中的任一项所述的方法，其还包括在切割后从所述寡核苷酸除去一个或多个保护基团。

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