CN115125228B - 蛆激酶及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛆激酶及其用途，所述蛆激酶具有溶栓功能，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1‑15所示。本发明的蛆激酶具有降解纤维蛋白、分解纤维蛋白原、激活纤溶酶原的功能，为多靶点、高效、廉价的溶栓药物以及治疗高纤维蛋白原血症药物的开发提供了基础。

Description

蛆激酶及其用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及抗血栓酶特别是蛆激酶及其用途。
背景技术
血栓栓塞型疾病一直以来严重危害着人类的健康，是引起人类死亡的三大疾病之一，它对心、脑、肺等血管系统造成损害，严重可致人死亡。绝大多数情况下，血栓的形成可能存在于下肢造成下肢静脉血栓，引起严重水肿，心脏及静脉内血栓脱落可能引起肺栓塞，冠状动脉血栓形成可能引起心肌梗塞，大脑中动脉血栓形成可能引发脑梗死等致命疾病。全世界每年新增1500万血栓性病人，在我国每年约有200多万人死于心脑血管疾病，成为我国居民死亡的四大疾病之一。并且，我国卫生部主要疾病类别年龄统计发现，青年人群血栓类疾病的患病率在不断上升。对血栓栓塞的治疗和预防成为了人类迫切需要解决的问题。
除了手术治疗手段，开发抗血栓药物是治疗血栓疾病的重要途径。按药物作用机制，临床上使用的抗血栓药物包括以下几类：(1)抗血小板凝集药物：阿司匹林、磺吡酮、氯吡格雷、噻氯匹定等；(2)抗凝药物：阿加曲班(Argatroban)、比伐卢定(bivalirudin)、水蛭素(hirudin)、希美加群(Ximelagatran)、达比加群(Dabigatran)等；(3)纤溶酶原激活剂，例如尿激酶、链激酶等，商品包括注射用尿激酶、施爱克、瑞通立、铭复乐等；(4)直接溶解血栓的药物：瑞替普酶(r-PA)、兰托普酶(n-PA)、TNK-组织型纤溶酶原激活剂(TNK-TPA)等。药物的来源，包括合成的小分子化合物如阿司匹林，也包括天然大分子化合物如尿激酶、链激酶。
但仍然需要具有多靶点，活性高的溶栓酶，为廉价、高效溶栓药物的开发提供基础。
发明内容
本发明通过筛选获得了具有溶栓活性的蛋白，其具有良好的溶栓活性，溶栓靶点多，溶栓效果强，为溶栓药物的开发提供新的物质来源和基础。
具体来说，本发明提供了以下技术方案：
一方面，本发明提供具有溶栓功能的蛆激酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1-15所示；或与如SEQ ID NO:1-15所示序列相比具有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失和/或插入，且其活性与如SEQ ID NO:1-15所示的氨基酸序列组成的蛋白相同；或与如SEQ ID NO:1-15所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％或85％，更优选至少90％、95％或99％同一性，且其活性与如SEQ ID NO:1-15所示的氨基酸序列组成的蛋白相同。
在一些实施方案中，所述蛆激酶降解精氨酸酰胺键。
在一些实施方案中，所述蛆激酶降解纤维蛋白。
在一些实施方案中，所述蛆激酶分解纤维蛋白原。
在一些实施方案中，所述蛆激酶激活纤溶酶原。
另一方面，本发明提供分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸编码上述述蛆激酶。
另一方面，本发明提供表达载体，其特征在于，所述表达载体包含上述分离的核酸。
另一方面，本发明提供重组非人细胞，其特征在于，所述细胞包含上述核酸或上述表达载体。
在一些实施方案中，所述重组非人细胞选自动物细胞、植物细胞和微生物细胞。
另一方面，本发明提供蛆激酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括上述细胞，并分离蛆激酶。
另一方面，本发明提供药物组合物，其特征在于，其包含上述蛆激酶和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包括但不限于赋形剂、辅料、填充剂、甜味剂、崩解剂、湿润剂和润滑剂。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体选自赋形剂、辅料、填充剂、甜味剂、崩解剂、湿润剂和润滑剂。
另一方面，本发明提供上述蛆激酶在制备溶栓药物中的用途。
另一方面，本发明提供上述蛆激酶在制备治疗与血栓相关的疾病、与高纤维蛋白原血症相关的疾病、口腔中因纤维蛋白沉积在口腔粘膜诱发的牙周炎的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述与血栓相关的疾病选自：动脉性血栓性疾病例如冠心病、脑血栓、肾血管血栓、上下肢动脉的血栓，静脉性血栓性疾病例如肠系膜下血管的血栓、肺栓塞，肺梗塞，毛细血管的血栓性疾病。
在一些实施方案中，所述与高纤维蛋白原血症相关的疾病选自：高血压、高脂血症、冠心病、糖尿病、肿瘤、细菌感染、结核性疾病、风湿免疫性疾病和/或炎症诱发的高纤维蛋白原血症。
另一方面，本发明提供上述蛆激酶在制备降解纤维蛋白的药物中的用途。
定义
蛆激酶：蝇蛆中具有溶解血栓功能的蛋白酶。
纤维蛋白原：主要由肝细胞合成的、具有凝血功能的蛋白质，是纤维蛋白的前体，是血浆中含量最高的凝血因子。
纤维蛋白：在凝血过程中，凝血酶将纤维蛋白原转化为不溶于水的纤维蛋白，纤维蛋白单体聚集形成纤维蛋白多聚体，从而启动血凝块的形成，纤维蛋白参与血液凝固过程。
纤溶酶原：纤溶酶可以降解纤维蛋白和纤维蛋白原，保持血管和分腺管通畅，纤溶酶原是纤溶酶无活性的前体，纤溶酶原被激活以后可以转化为纤溶酶。
凝血酶：凝血酶可以将可溶性纤维蛋白原转变成不溶的纤维蛋白，纤维蛋白进一步与血小板形成凝块，参与血液凝固。
附图说明
图1示出了制备的纤维蛋白平板的示意图，以蛆激酶作为阳性对照，在纤维蛋白平板上点样，依据溶纤圈大小，制作测定待测样品溶纤活力的标准曲线。
图2示出了测定待测样品溶纤活力的标准曲线。
图3示出了蛆激酶对纤维蛋白形成的抑制作用示意图。1号为对照组；2号为加入纤维蛋白原和蛆激酶后，立即加入凝血酶；3号为纤维蛋白原与蛆激酶孵育2h后，再加入凝血酶；4号为凝血酶与蛆激酶孵育2h后，再加入纤维蛋白原。
图4示出了纤维蛋白原与凝血酶生成纤维蛋白后，呈白色，加入纤溶酶后，白色沉淀逐渐减少，转化为透明的液体。在蛆激酶加入19h后，纤维蛋白被完全溶解。表明蛆激酶降解纤维蛋白，具有降解血栓的功能。
图5示出了蛆激酶对兔血块的溶解，A为血块中加入生理盐水，B为血块中加入蛆激酶。
图6示出了液相色谱图，a为N-α-苯甲酰-DL-精氨酰-4-硝基苯胺盐酸盐(BAPNA)标准品、对硝基苯胺标准品及苯甲酰精氨酸标准品液相色谱图；b为BAPNA(底物)被蛆激酶分解后的液相色谱图。
图7示出了N-苯甲酰-L-精氨酰乙酯盐酸盐(BAEE)标准品、苯甲酰精氨酸标准品以及BAEE被蛆激酶分解后的液相色谱图。
图8示出了蛆激酶对纤溶酶原的激活作用。A示出了纤维蛋白平板中不含有纤溶酶原，作为对照，B示出了纤维蛋白平板中含有纤溶酶原。图B中溶纤圈大于图A中溶纤圈，说明蛆激酶激活了B中的纤溶酶原。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
本发明中待测物质为蛆激酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1-15所示。
实施例1蛆激酶的溶纤维效果的评价
溶纤活力测定：参照国家食品药品监督管理局国家药典委员会审定国家药品标准WS1-(X-052)-2001Z进行。取纤维蛋白原溶液39ml(每1ml中含1.5mg的可凝蛋白溶液)(中国食品药品检定研究院，编号：140607)，置烧杯中，边搅拌边加入55℃琼脂糖溶液39ml、凝血酶溶液(中国食品药品检定研究院，编号：140605)3.0ml(每1ml中含1BP单位的凝血酶)(BP是凝血酶的活力单位)，立即混匀，快速倒入直径14cm的塑料培养皿中，室温水平放置1小时，打孔。精密量取不同浓度的蚓激酶标准品溶液(中国食品药品检定研究院，编号：140650)及待测样品溶液，将标准品及待测样品点在纤维蛋白平皿上，加盖，置37℃恒温箱中反应18小时。取出后用卡尺测量溶纤圈垂直两直径，以蚓激酶标准品单位数的对数为横坐标，垂直两直径乘积的对数为纵坐标，计算回归方程，制作标准曲线，将待测样品垂直两直径乘积的对数代入回归方程，计算待测样品效价单位数。
以蚓激酶标准品溶纤圈为标准(图1)绘制标准曲线如图2所示，计算得出如SEQ IDNO:1-15所示蛆激酶的比活力分别为933262U/mg、891201U/mg、882922U/mg、889760U/mg、876031U/mg、721000U/mg、603052U/mg、712078U/mg、671503U/mg、732044U/mg、642125U/mg、756082U/mg、653235U/mg、637459U/mg、667843U/mg。
可以看出，如SEQ ID NO:1-15所示蛆激酶均具有较强的溶解纤维蛋白的能力。
实施例2蛆激酶的溶栓活力检测
为了研究如SEQ ID NO:1-15所示蛆激酶的体外溶栓和抗凝作用，将如SEQ ID NO:1-15所示的蛆激酶(待测样品)(13000U/mL)、纤维蛋白原(1.5mg/mL)、凝血酶(1BP/mL)(以上用于检测的生化试剂均购置于中国食品药品检定研究院)，按以下4种方式混合：
①150μL纤维蛋白原+25μL凝血酶作为对照组。
②150μL纤维蛋白原和17.5μL蛆激酶混合，立即加入25μL凝血酶(拍照并记录)。
③150μL纤维蛋白原和17.5μL蛆激酶混合，孵育2h，加入25μL凝血酶(拍照并记录)。
④25μL凝血酶和17.5μL蛆激酶，孵育2h，加入150μL纤维蛋白原(拍照并记录)。
如图3所示(仅示出了SEQ ID NO:1的结果，其它序列的结果未示出，但与本实施例的结果一致)：
1号试管中，对照组的纤维蛋白原与凝血酶混合后，溶液迅速由透明变浑浊，此现象是由于不溶性的纤维蛋白产生。
2号试管中，纤维蛋白原和蛆激酶预混合后立即加入凝血酶，溶液无明显变化。因此推测，蛆激酶的加入会抑制纤维蛋白的形成。而蛆激酶的作用方式，仍需后续实验证明。
3号试管中，纤维蛋白原与蛆激酶混匀后，在室温下反应2h，加入凝血酶后，无明显的沉淀产生。推测蛆激酶可与纤维蛋白原发生反应，因此凝血酶加入后，无纤维蛋白产生。
4号试管中，凝血酶与蛆激酶混合，室温下反应2h，加入纤维蛋白原，不产生沉淀，证明蛆激酶可与凝血酶反应，破坏凝血酶的功能。
综上所述，本发明的蛆激酶可以与凝血过程中的纤维蛋白原和凝血酶发生反应，抑制凝血过程，同时，蛆激酶可以降解已经形成的纤维蛋白。
实施例3蛆激酶的溶栓活力检测
试剂为如SEQ ID NO:1-15所示蛆激酶(待测样品)(13000U/mL)、纤维蛋白原(1.5mg/mL)、凝血酶(1BP/mL)(以上用于检测的生化试剂均购置于中国食品药品检定研究院)。离心管中加入150μL纤维蛋白原和25μL凝血酶，孵育2h，纤维蛋白原转化为白色不溶于水的纤维蛋白固体，往离心管中加入17.5μL蛆激酶，在室温下孵育，计时观察纤维蛋白溶解现象并拍照(记录完全溶解所需的时间)。图4示出了，纤维蛋白原与凝血酶生成纤维蛋白后，呈白色，加入纤溶酶(SEQ ID NO:1-15)后，白色沉淀逐渐减少，转化为透明的液体。在蛆激酶加入19h后，纤维蛋白被完全溶解。表明蛆激酶降解纤维蛋白，具有降解纤维蛋白的功能(仅示出了SEQ ID NO:1的结果，其它序列的结果未示出，但与本实施例的结果一致)。
实施例4蛆激酶对血凝块的降解
取1.5mL离心管加入约30mg的血凝块，分别加入100μL生理盐水冲洗3次。其中一支管加入400μL生理盐水作为对照，其他试管中加入200μL如SEQ ID NO:1-15所示的蛆激酶(比活力约为3300U/mL)和200μL生理盐水，将试管置于水浴摇床上37℃保温，转速约为90r/min。分别在反应10h及24h后，迅速取30μL上清液放入-20℃冰箱测定溶液中血块降解的蛋白含量变化，计算血块降解情况。
检测如SEQ ID NO:1-15所示蛆激酶对血凝块的降解情况，可以验证蛆激酶降解血栓的能力，这可以为后续体内实验提供实验基础。以加入生理盐水的试管作为对照组，以加入蛆激酶的试管作为实验组。如表1所示，对照组中血凝块重量几乎不变，仅有少量蛋白解离下来；随反应时间的延长实验组血凝块重量逐渐减少，在酶解0～10h内，血凝块的溶解速度较慢，24h后血块被完全溶解，研究结果表明，本发明的蛆激酶可以有效降解血块。
表1.实验组血块的降解率
蛆激酶蛋白编码 血块10小时降解率 血块24小时降解率
SEQ ID NO:1 15.15％ 100％
SEQ ID NO:2 15.21％ 100％
SEQ ID NO:3 14.54％ 100％
SEQ ID NO:4 14.89％ 100％
SEQ ID NO:5 14.56％ 100％
SEQ ID NO:6 14.21％ 100％
SEQ ID NO:7 14.44％ 100％
SEQ ID NO:8 14.12％ 100％
SEQ ID NO:9 13.89％ 100％
SEQ ID NO:10 13.81％ 100％
SEQ ID NO:11 13.78％ 100％
SEQ ID NO:12 13.67％ 100％
SEQ ID NO:13 13.11％ 100％
SEQ ID NO:14 13.26％ 100％
SEQ ID NO:15 13.55％ 100％
实施例5蛆激酶的酶切位点分析
取5个1.5mL离心管每管加入5μL蛆激酶(SEQ ID NO:1)(比活力约13000U/mL)，将蛆激酶和BAPNA(N-α-苯甲酰-DL-精氨酰-4-硝基苯胺盐酸盐)(阿拉丁，货号B100879，纯度>98％)在37℃预热10min。4个试管分别加入3mL底物BAPNA混匀开始反应，反应过程中温度保持在37℃，分别在反应进行到30min、1h、3h、5h和24h时，取出1管。使用乙腈稀释4倍后，经过0.22μm的有机滤膜过滤，利用高效液相色谱分析不同时刻的BAPNA底物的降解情况。
液相色谱系统分离柱为安捷伦6470，4.6×150mm，5μm，色谱检测器为PDA检测器，检测波长设定为253nm，流动相流速0.8mL/min，分析时注入样品体积20μL。流动相：A相水、B相乙腈，采用二元高压梯度洗脱，梯度程序为0～10min B泵浓度20～100％，10～15min B泵浓度100％5min，15～20min B泵浓度100～20％5min。
本发明利用高效液相色谱仪分析蛆激酶对N-α-苯甲酰-DL-精氨酰-4-硝基苯胺盐酸盐(BAPNA)降解情况，验证酶解产物。BAPNA是一种含有精氨酸结构的小分子化合物，BAPNA分解可产生黄色产物对硝基苯胺和苯甲酰精氨酸。根据图6a可知，标准品BAPNA的保留时间约为13.3min、对硝基苯胺保留时间约8.6min以及苯甲酰精氨酸的保留时间为2.1min。
蛆激酶与BAPNA进行酶解，将产物经HPLC分析，分析图6b可知，在保留时间2.1min及8.6min处出现色谱峰，与标准品对硝基苯胺和苯甲酰精氨酸的保留时间一致，提示BAPNA已被酶降解，产生了苯甲酰精氨酸和对硝基苯胺。继续酶解，随着反应时间的延长，检测到的苯甲酰精氨酸和对硝基苯胺信号值明显升高，BAPNA的吸收峰逐渐降低，证明在这段时间内BAPNA不断被降解，生成了产物苯甲酰精氨酸和对硝基苯胺。证明蛆激酶具有降解Arg-X酰胺键(精氨酸酰胺键，“X”代表任意一种氨基酸)的能力。
实施例6蛆激酶的酶切位点分析
以N-苯甲酰-L-精氨酰乙酯盐酸盐(BAEE)(阿拉丁，货号B105947、纯度>98％)为底物，将蛆激酶(SEQ ID NO:1)与BAEE混合进行酶解反应，通过液相色谱对样品进行检测，对比不同时间酶解产物与底物BAEE在253nm处的液相色谱图，确定蛆激酶降解活性的作用位点。
底物配制：称取17.14mg BAEE，溶解于25mL的20mM(pH8)Tris-HCl缓冲液中，配制成2mM底物母液，将母液稀释10倍，配制成0.2mM底物。
酶解体系：取5μL(7500U/mL)蛆激酶样品，于37℃预热5min，加入已预热(使反应体系均处于37℃)的3mL底物，分别于37℃反应15min、2h。
苯甲酰精氨酸标准品：称取15mg苯甲酰精氨酸(上海易恩化学技术有限公司，货号R015421，AR)，溶解于5mL乙腈中，配制成3mg/mL母液，将母液稀释，配制成0.06mg/mL苯甲酰精氨酸标准品溶液。
液相色谱样品处理：将0.2mM底物、15min酶分解产物样品、2h酶分解产物样品、苯甲酰精氨酸标准品用乙腈稀释2倍，过0.22μm有机滤膜后，利用高效液相色谱仪于253nm波长下检测分析不同待测样品中苯甲酰精氨酸的含量变化。
液相色谱系统：试验使用4.6×150mm，5μm的分离柱ZORBAX SB-C18进行分离。色谱检测器为PDA检测器，流动相为乙腈(B)和水(A)，流速为0.8mL/min。注入样品体积为20μL。洗脱程序为：0～10min，20～100％B；10～15min，100％B；15～20min，100～20％B(A是水，作为流动相，用来稀释B)
BAEE是一种人工合成的具有精氨酸酯键的底物，可用于检测酶对精氨酸酰胺键的作用，其被降解后产生的苯甲酰精氨酸在253nm下有强吸收，便于检测。本发明选用BAEE作为底物对蛆激酶的作用位点进行初步测定，结果如图7所示。在253nm下，苯甲酰精氨酸标准品在2.269min左右出现峰，底物BAEE在经过蛆激酶酶解后，出现了苯甲酰精氨酸吸收峰，说明产物中含有苯甲酰精氨酸，且随着时间的增加，样品中苯甲酰精氨酸含量增大，提示在肽链中精氨酸酰胺键是蛆激酶的作用位点。
实施例7蛆激酶活性的抑制
将苯甲基磺酰氟(PMSF)(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号A610425，纯度>99％)溶于异丙醇，浓度为5.23mg/mL(30mM)，使用之前加水稀释至3mM，在水溶液中易分解，现用现配。抑肽酶(Aprotinin)溶液(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号A100429)，用水作为溶剂，配置浓度为3mM的水溶液。
待测样品配制：取离心管，加入蛆激酶(SEQ ID NO:1)(比活力为4000U/mL)20μL，离心管中加入10μL浓度为3mM PMSF溶液，或加入10μL浓度为3mM抑肽酶(Aprotinin)溶液，离心管中PMSF或Aprotinin的终浓度为1mM。以20μL蛆激酶液加10μL蒸馏水作为对照，观察PMSF或Aprotinin对蛆激酶活力的影响。
用纤维平板法测定蛆激酶的溶纤活力。测定方法同实施例1，数据处理时以对照组的相对酶活力为100％，计算其余各组的相对酶活。PMSF(苯甲基磺酰氟)和Aprotinin(抑肽酶)对酶活有强烈的抑制作用，在浓度1mM的PMSF作用下，蛆激酶残余酶活24.6％(作用时间18h)；1mM的Aprotinin(作用时间18h)就可以完全抑制蛆激酶的活力。PMSF和Aprotinin都是丝氨酸蛋白酶专一性抑制剂，因此本发明的蛆激酶属于丝氨酸蛋白酶。
实施例8蛆激酶对纤溶酶原的激活
试剂配制：
纤维蛋白溶酶原(纤溶酶原)(购置于中国食品药品检定研究院，编号140606，规格18个酪蛋白单位/瓶)，将标准品为18个酪蛋白单位/瓶，加入1.8mL水溶解制成10酪蛋白单位/mL的溶液。
供试品溶液配制：取2只1.5mL离心管，各管均加入蛆激酶20μL(比活力为5600U/mL)，分别向1号管加入10μL纤溶酶原溶液配制成0.1酪蛋白单位/管的溶液；2号管中加入10μL蒸馏水作为对照。
测定方法：量取配制好的纤维蛋白原约39mL，置烧杯中(37℃预热10min)，搅拌同时加入55℃琼脂糖溶液39mL，最后加入3mL凝血酶溶液，立即混匀，快速倒入塑料培养皿中，室温水平放置1h，打孔。取配制好的供试品溶液各30μL，每个样品点在同一个平皿后，加盖，置于37℃恒温培养箱中反应。反应18h。
数据处理：取出后用卡尺测量溶圈垂直两直径，将透明溶纤圈垂直两直径乘积的对数代入方程，计算酶液效价单位数。待测样品各做3个平行。以平均值计算。不加纤溶酶原作为对照组，以对照组相对酶活力为100％，计算实验组的相对酶活。
注：纤溶酶原常用的活力测定方法是酪蛋白水解法，即以酪蛋白作为单位定义纤溶酶原活力，本发明配制的纤溶酶原活力为0.1酪蛋白单位/管。
图8示例性示出了蛆激酶可以作为纤溶酶原激活剂的效果。由图8可知，不含有纤溶酶原的平板A相比含有纤溶酶原的平板B，在A、B平板上加上相同的蛆激酶，B平板上的溶纤圈要大于A平板，说明溶纤活力B组较A组高。含纤溶酶原的纤维蛋白平板上的溶纤圈更大，蛆激酶具有激活纤溶酶原的作用，可以间接降解平板中的纤维蛋白凝块。综上所述，蛆激酶可以作为纤溶酶原激活剂，间接发挥纤溶作用。表2示出了如SEQ ID NO:1-5序列所示的蛆激酶激活纤溶酶原的效果。
表2.蛆激酶对纤溶酶原的激活作用
氨基酸序列
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等(比如，将序列中部分(25％)氨基酸进行修饰或替换，蛆激酶依旧具有溶栓效果)，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.蛆激酶，其具有溶栓功能，其特征在于，所述蛆激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸编码根据权利要求1所述的蛆激酶。
3.表达载体，其特征在于，所述表达载体包含根据权利要求2所述的核酸。
4.重组非人细胞，其特征在于，所述细胞包含根据权利要求2所述的核酸或权利要求3所述的表达载体。
5.蛆激酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括培养根据权利要求4所述的细胞，并分离蛆激酶。
6.药物组合物，其特征在于，其包含根据权利要求1所述的蛆激酶和药学上可接受的载体。
7.根据权利要求1所述的蛆激酶在制备溶栓药物中的用途。
8.根据权利要求1所述的蛆激酶在制备降解纤维蛋白的药物中的用途。
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