CN115109114A - MOFs材料UIO-66-NH2用作消化地龙蛋白的试剂的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于肽组学和蛋白质组学研究技术领域，具体涉及一种MOFs材料UIO‑66‑NH2用作消化地龙蛋白的试剂的用途。本发明提供MOFs材料UIO‑66‑NH2用作消化地龙蛋白的试剂的用途，其消化地龙蛋白的方法包括如下步骤：步骤1，将MOFs材料UIO‑66‑NH2用水分散，得到UIO‑66‑NH2分散液；步骤2，取地龙蛋白样品溶液，加入步骤1中得到的UIO‑66‑NH2分散液，得到反应液，孵育反应，分离上清液，即得消化后的样品。本发明的方法能够更加高效地将地龙蛋白消化为多肽，在利用质谱对多肽进行检测时，本发明能够检测到更多种类的肽段并得到更强的肽段信号。本发明在地龙蛋白的相关研究中具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于肽组学和蛋白质组学研究技术领域，具体涉及一种MOFs材料UIO-66-NH2用作消化地龙蛋白的试剂的用途。
背景技术
肽组学和蛋白质组学研究中，利用质谱等设备检测样品的多肽组成是一种重要的研究手段。而酶消化是多肽检测中的关键样品制备步骤。天然酶对外部pH值、温度和有机溶剂敏感，需要小心处理，以获得最佳酶解效率。酶固定化已被证明是提高酶稳定性的有效方法。由于具有较高的比表面积和超高的孔隙率，MOFs作为固定化酶的载体被广泛应用。蛋白酶可以通过共价结合、非共价吸附和仿生矿化等多种方法固定在MOF中。将酶封装到MOF中不仅可以保护它们不变性，还可以提高酶的性能。MOF–酶杂交已被证明是酶解肽和蛋白质的有力工具。
最近，具有内在蛋白酶样活性的MOF已经出现，用于酶解蛋白质。由于不含任何天然酶，这些化学合成的材料与恶劣环境相容，有望成为肽组学和蛋白质组学研究的强大纳米反应器。在许多蛋白酶的活性位点中，Lewis酸性金属离子在酶解过程中发挥着重要作用。由于MOFs与多肽/蛋白质之间的相互作用，MOFs中的Lewis酸性金属离子也可以促进催化活性。此外，MOFs的大表面积有利于肽或蛋白底物的结合。多孔结构模拟了酶活性位点的笼状环境。这些发现为MOFs作为纳米酶降解多肽和蛋白质奠定了基础。
MOFs材料MOF-808、NU-1000和UIO-66-NH2等是一种具有Zr6的水稳定MOFs，这些材料也被发现具有蛋白质水解活性(Sci Rep,2014,4:6759；J Am Chem Soc,2018,140(20):6325-6335)。然而，人们发现MOFs材料和蛋白质分子间的作用具有一定的特异性，即对于特定结构的蛋白质分子，一些MOFs材料对其具有很好的降解作用，而另一些MOFs材料则对其不具有降解作用。因此，寻找能够高效消化特定蛋白的MOFs材料仍然是本领域重要的研究课题。
地龙蛋白是指从中药材地龙中提取得到的蛋白质，地龙中的蛋白质已被证明具有活血化瘀、溶栓降压、抗肿瘤、平喘止咳和消炎止痛等功效。对于地龙蛋白的组成、作用机理的研究深受本领域研究者的关注。然而，目前对于能够降解地龙蛋白的MOFs材料尚未见到文献报道。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明提供MOFs材料UIO-66-NH2用作消化地龙蛋白的试剂的用途，目的在于提供一种能够高效消化地龙蛋白的MOFs材料。
MOFs材料UIO-66-NH2用作消化地龙蛋白的试剂的用途。
本发明还提供一种地龙蛋白消化试剂盒，所述试剂盒中包括MOFs材料UIO-66-NH2
本发明还提供一种消化地龙蛋白的方法，包括如下步骤：
步骤1，将MOFs材料UIO-66-NH2用水分散，得到UIO-66-NH2分散液；
步骤2，取地龙蛋白样品溶液，加入步骤1中得到的UIO-66-NH2分散液，得到反应液，孵育反应，分离上清液，即得消化后的样品。
优选的，所述反应液中，MOFs材料UIO-66-NH2和地龙蛋白样品的用量比例为重量比(0.5-2.0):5。
优选的，所述反应液中，MOFs材料UIO-66-NH2和地龙蛋白样品的用量比例为重量比1.5:5。
优选的，所述反应液中，MOFs材料UIO-66-NH2的浓度为2.00～5.00mg/mL。
优选的，所述反应液中，地龙蛋白样品的浓度为2.00～5.00mg/mL。
优选的，所述孵育反应的温度为25-80℃。
优选的，所述孵育反应的温度为60℃。
优选的，所述孵育反应的时间为大于等于5min。
本发明还提供一种检测地龙蛋白的方法，包括如下步骤：
步骤A，按照上述方法消化地龙蛋白；
步骤B，将消化后的样品送入MALDI-MS或LC-MS/MS进行检测。
本发明中，所述“地龙蛋白”是指从中药材地龙中提取得到的蛋白质。本发明的实施例中所用的地龙蛋白样品具体为百川地龙蛋白粉(购自西安百川生物科技有限公司)，然而，由于本领域公知百川地龙蛋白粉中的主要成分与其他地龙蛋白产品基本一致，因此本申请的技术方案也适用于百川地龙蛋白粉之外的其他地龙蛋白产品。
所述“UIO-66-NH2”为一种现有的MOFs材料，其结构及合成可参考文献“International Journal of Smart and Nano Materials,2013,Vol.4,No.1,72–82”。
本发明采用MOFs材料UIO-66-NH2作为纳米酶降解地龙蛋白，发现相比于传统的胰蛋白酶和其他多种MOFs材料，UIO-66-NH2能够更加高效地将地龙蛋白消化为多肽，在利用质谱对多肽进行检测时，本发明能够检测到更多种类的肽段并得到更强的肽段信号。因此，MOFs材料UIO-66-NH2非常适合用作消化地龙蛋白的试剂，在地龙蛋白的相关研究中具有很好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为UIO-66-NH2的扫描电镜(a、b)和UIO-66-NH2的结构(c、d)；
图2为UIO-66-NH2的X射线粉末衍射谱图；
图3为UIO-66-NH2的X射线光电子能谱图；其中，(a)全谱图，(b)Zr元素精细图；
图4为地龙蛋白消化前后的MALDI-TOF质谱；
图5为地龙蛋白粉不同消化方法的MALDI-TOF质谱；其中，(a)胰蛋白酶酶解；(b)UIO-66-NH2酶解；
图6为地龙蛋白消化产物的MALDI-TOF质谱(UIO-66-NH2的量分别为(a)0.25mg，(b)0.5mg，(c)1mg，(d)1.5mg，(e)2.0mg)；
图7为地龙蛋白消化产物的MALDI-TOF质谱(孵育时间分别为(a)5min，(b)15min，(c)30min，(d)45min，(e)60min)；
图8为地龙蛋白消化产物的MALDI-TOF质谱(孵育温度分别为(a)20℃，(b)40℃，(c)60℃，(d)80℃，(e)室温无处理)。
具体实施方式
以下实施例和实验例中所用的试剂和材料均采用市售品。
所用试剂和材料包括：
UIO-66-NH2(自合成)、百川地龙蛋白粉(购自西安百川生物科技有限公司)。三氟乙酸(99％)购自Sigma-Aldrich公司；乙腈(AS#75-05-8)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)均购自Brook公司；甲酸(FA，质谱级)、碳酸氢铵(质谱级)、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)均购自Sigma-Aldrich。水为超纯水。
实施例1地龙蛋白的消化方法
一、样品的制备
1、UIO-66-NH2的制备
本实施例的UIO-66-NH2是根据Abid等人(International Journal of Smart andNano Materials,2013,4(1):72-82)的方法合成，具体为：
氯化锆(ZrCl4,1.47g)和2-氨基对苯二甲酸(H2BDC-NH2,1.06g)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF,150mL)中。然后将混合物转移到200mL内衬Teflon的不锈钢高压釜中进行均相反应，在393K下保持24h。混合物冷却至室温，分别用DMF和乙醇反复洗涤3次。在393K下干燥得到黄色晶体。
分别采用扫描电镜、XRD、红外光谱和XPS对制备的UIO-66-NH2进行表征。
UIO-66-NH2的扫描电镜图像(图1a、b)显示其形态为微米级不规则球状颗粒。颗粒大小均匀，单分散性优异。
XRD图谱(图2)显示UIO-66-NH2在小角度范围内的主要衍射峰与报道一致(Materials(Basel),2018,11(4).)。
从图3(a)中UIO-66-NH2的全光谱可以看出，合成的UIO-66-NH2含有C、O、Zr元素，符合图1(d)中UIO-66-NH2的结构。根据图3(b)中Zr元素的详细图解，可以得出Zr3d3和Zr3d5的结合能分别为185.32eV和182.92eV，与XPS数据手册和XPS数据网站的信息一致。
以上表征结果表明，本实施例成功合成了UIO-66-NH2。
2、样品溶液的配制
准确称量5.00mg的地龙蛋白粉末，加入1mL浓度为25mmol/L的碳酸氢铵溶液中，将地龙蛋白溶液配制成5.00mg/mL，并于超声波清洗机中超声10min，使其充分溶解。于37℃的水浴锅中孵育20h即得到样品溶液的原液。其他浓度样品溶液通过对原液进行逐级稀释得到。配置好的溶液保存在-20℃条件下备用。
二、消化地龙蛋白
称取1.00mg合成的UIO-66-NH2，加入300.00μL的超纯水配置成0.3333mg/ml，于超声波清洗机中超声10min，并在摇床上反应30min，使溶液分散均匀。加入50μL配制的未经处理的样品溶液，将混合溶液放入60℃水浴锅中反应30min，10000r离心10min。取上清液即为消化后的样品溶液。
下面通过实验对本发明的技术方案作进一步说明。
实验例1与胰蛋白酶酶解效果的比较
一、实验方法
1、消化方法
UIO-66-NH2消化地龙蛋白的方法与实施例1相同。
胰蛋白酶消化地龙蛋白的方法为：准确称量5.00mg的地龙蛋白粉末，加入1mL浓度为25mmol/L的碳酸氢铵溶液中，将地龙蛋白溶液配制成5.00mg/mL，并于超声波清洗机中超声10min，使其充分溶解。加入2.5μL的胰蛋白酶，于37℃的水浴锅中孵育20h。
2、检测方法
1)MALDI-MS检测
取消化后的样品溶液(上清液)进行MALDI-TOF-MS检测。
2)LC-MS/MS检测
还原烷基化：1)于取消化后的样品溶液(上清液)中加入DTT溶液使其终浓度为10mmol/L，于56℃水浴中还原1h；2)加入IAA溶液使其终浓度为50mmol/L，避光反应40min；3)使用自填脱盐柱脱盐，于45℃真空离心浓缩仪中挥干溶剂。
毛细管液相色谱条件：
1)预柱：300μm i.d.×5mm,packed with Acclaim PepMap RPLC C18,5μm,
2)分析柱：150μm i.d.×150mm,packed with Acclaim PepMap RPLC C18,1.9μm,
3)流动相A：0.1％甲酸；
4)流动相B：0.1％甲酸，80％ACN；
5)流速：600nL/min；
6)每个组分分析时间：66min；
质谱条件：
1)一级质谱参数：
Resolution：70,000
AGCtarget：3e6
MaximumIT：100ms
Scanrange：300to 1800m/z
2)二级质谱参数：
Resolution：17,500
AGCtarget：1e5
MaximumIT：50ms
TopN：20
NCE/steppedNCE：28。
二、实验结果
如图4所示，在地龙蛋白未被UIO-66-NH2消化前，5900m/z、9000m/z处出现蛋白信号峰。经过UIO-66-NH2消化后，蛋白信号峰消失。说明UIO-66-NH2能够消化地龙蛋白。
利用胰蛋白酶和UIO-66-NH2对地龙蛋白进行消化的结果对比如图5所示，UIO-66-NH2相比于传统酶解方法能够酶解出更多的肽段。以上结果表明，本发明采用UIO-66-NH2能够更加有效地消化地龙蛋白，得到更多的肽段。
实验例2不同MOFs材料对地龙蛋白的消化作用对比
一、实验方法
1、制备方法
UIO-66-NH2的制备方法与实施例1相同。
请补充其他五种MOFs的制备方法
1.1 HKUST-1的制备方法
在超声波作用下将提供金属铜离子的铜盐(8.62mmol)溶解于24mL水、DMF和乙醇的混合溶剂中(其中，水、DMF、乙醇的体积比为1:1:1)，均苯三酸(1.00g，4.76mmol)溶解于24mL同样的混合溶剂中。将两种溶液混合后加入到100mL离心管中，搅拌10min，加TEA(1.0mL，6.93mmol)，搅拌均匀后，在300W超声功率下间歇式超声30min(超声2s，停3s)，反应温度20℃～50℃。所得产物抽滤后，用水置换两次，用DMF置换三次，并浸泡在一定量的DMF中12h；抽滤，用二氯甲烷置换三次，将产物浸泡在二氯甲烷中12h；抽滤，所得样品真空下干燥24h，即可得HKUST-1。
1.2 MOF-808FA的制备方法
分别称取0.21g均苯三甲酸和0.70g四水氯化锆溶于盛有N.N-二甲基甲酰胺/甲酸(45mL/45mL)烧瓶中，搅拌l h。随后将所得混合溶剂转移至微波炉中，在400KW条件下反应20min。待反应结束后，冷却至室温，所得固体经抽滤，洗涤，干燥。
1.3 NU-1000的制备方法
通过超声波溶解70.00mg ZrCl4(0.30mmol)、2.70g(22mmol)苯甲酸和8.00mL DMF的混合物。将澄清溶液在80℃的烘箱中孵育1小时，向溶液中加入40.00mg 1，3，6，8-四(对苯甲酸)芘(0.06mmoll)，并将混合物超声处理20分钟。黄色悬浮液在120℃的烘箱中加热72小时。过滤分离黄色物质，通过索氏提取器在甲醇中提取过夜，并在80℃真空干燥过夜，得到合成样品(表示为NU-1000)。将NU-1000(400.00mg)浸泡在120mL DMF中，然后加入3.3mLHCl，混合物在100℃的烘箱中加热24小时。冷却至室温后，过滤混合物，用索氏提取器在甲醇中提取固体过夜。然后将固体在80℃下真空干燥，得到活性样品NU-1000。
1.4 UIO-66h的制备方法
以四氯化锆和对苯二甲酸为原料，在室温条件下分别溶解到8mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)和1.2mL的冰乙酸混合溶液中。搅拌5分钟后，待固体全部溶解，将混合溶液转移至规格为50mL的聚四氟乙烯材质内衬的不锈钢反应釜中，并置于烘箱中恒温保持24小时，取出并室温冷却。将反应釜中的混合液通过离心机分离，分离上清液和沉淀，并在此过程中分别用5mL的N,N-二甲基甲酰胺洗涤固体三次，然后将固体置于烘箱中干燥12小时，最后得到白色固体粉末，此时得到的固体我们记为UiO-66h。在UiO-66h材料中，Zr6簇的化学式为[Zr6(μ3-O)4(μ3-OH)4]并且溶剂分子(如水、DMF、乙酸等)仍然存留在孔道中。为了得到除去溶剂分子的UiO-66材料，我们进一步将UiO-66h置于300℃的烘箱中真空干燥2小时。
1.5 UIO-66-OH的制备方法
在30.0mL小瓶中，装入ZrCl4(125mg，0.54mmol)、5.00mLDMF和1.00mL浓HCl并超声处理10分钟，直到所有固体完全溶解。然后，向溶液中添加2-羟基对苯二甲酸(135mg，0.75mmol)和10.0mLDMF，并超声处理20分钟以上。将所得混合物置于烘箱中，并在80℃下加热12h。冷却至室温后，过滤所得固体，用DMF反复洗涤数次，然后用乙醇洗涤。最后，在120℃下真空干燥，得到MOF。
2、消化方法
UIO-66-NH2消化地龙蛋白的方法与实施例1相同。
其他五种MOFs材料消化地龙蛋白的方法与实施例1基本相同，区别在于替换了MOFs材料的种类。
3、检测方法
检测方法与实验例1相同。
二、实验结果
结果如图6所示，经6种MOFs材料处理后，地龙蛋白被成功消化，但不同MOFs材料消化蛋白的程度不同。从肽段数量及肽段信号的强度进行对比，在六种MOFs材料中，UIO-66-NH2的消化程度较其他5种MOFs材料效果更优。
以上结果表明，在MOFs材料中，UIO-66-NH2对地龙蛋白具有更好的消化效果。
实验例3消化条件优化
一、实验方法
1、UIO-66-NH2的用量对消化效果的影响
本实验的消化方法与实施例1基本相同，区别在于UIO-66-NH2的用量分别采用0.25mg、0.5mg、1mg、1.5mg和2.0mg。
2、孵育时间对消化效果的影响
本实验的消化方法与实施例1基本相同，区别在于孵育时间分别为5min、15min、30min、45min和60min。
3、孵育温度对消化效果的影响
本实验的消化方法与实施例1基本相同，区别在于孵育温度分别为20℃、40℃、60℃、80℃和室温。
二、实验结果
UIO-66-NH2的用量对消化效果的影响如图6所示，在消化的过程中，随着加入UIO-66-NH2的量的不断增多，目标肽的信号先升高后下降。当UIO-66-NH2的用量为1.5mg时(相当于MOFs材料UIO-66-NH2和地龙蛋白样品的用量比例为重量比1.5:5)，具有最佳的目标肽信号。
孵育时间对消化效果的影响如图7所示，在分别进行5min、15min、30min、45min、60min水浴孵育后，结果没有较大的差别。所以最佳选择为5min水浴孵育的时间，能够大大降低实验所需的时间。
孵育温度对消化效果的影响如图8所示，当温度达到60℃时得到的多肽的信号值明显高于其他温度，60℃为UIO-66-NH2与地龙蛋白反应的最佳温度。
通过上述实施例和实验例可以看到，本发明提供了利用UIO-66-NH2对地龙蛋白进行消化的方法，并且优选了消化过程中的反应条件。相比于传统的胰蛋白酶和其他多种MOFs材料，本发明的方法能够更加高效地将地龙蛋白消化为多肽，在利用质谱对多肽进行检测时，本发明能够检测到更多种类的肽段并得到更强的肽段信号。本发明在地龙蛋白的相关研究中具有很好的应用前景。
Claims (10)
1.MOFs材料UIO-66-NH2用作消化地龙蛋白的试剂的用途。
2.一种地龙蛋白消化试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括MOFs材料UIO-66-NH2。
3.一种消化地龙蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，将MOFs材料UIO-66-NH2用水分散，得到UIO-66-NH2分散液；
步骤2，取地龙蛋白样品溶液，加入步骤1中得到的UIO-66-NH2分散液，得到反应液，孵育反应，分离上清液，即得消化后的样品。
4.按照权利要求3所述的消化地龙蛋白的方法，其特征在于：所述反应液中，MOFs材料UIO-66-NH2和地龙蛋白样品的用量比例为重量比(0.5-2.0):5。
5.按照权利要求4所述的消化地龙蛋白的方法，其特征在于：所述反应液中，MOFs材料UIO-66-NH2和地龙蛋白样品的用量比例为重量比1.5:5。
6.按照权利要求3所述的消化地龙蛋白的方法，其特征在于：所述反应液中，MOFs材料UIO-66-NH2的浓度为2.00～5.00mg/mL。
7.按照权利要求3所述的消化地龙蛋白的方法，其特征在于：所述反应液中，地龙蛋白样品的浓度为2.00～5.00mg/mL。
8.按照权利要求3所述的消化地龙蛋白的方法，其特征在于：所述孵育反应的温度为25-80℃。
9.按照权利要求3所述的消化地龙蛋白的方法，其特征在于：所述孵育反应的时间为大于等于5min。
10.一种检测地龙蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤A，按照权利要求3-9所述的任一项所述的方法消化地龙蛋白；
步骤B，将消化后的样品送入MALDI-MS或LC-MS/MS进行检测。
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