CN115105507A - 帕唑帕尼在制备抑制肠道病毒71型嗜神经性病毒药物中的应用 - Google Patents

帕唑帕尼在制备抑制肠道病毒71型嗜神经性病毒药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，提供了帕唑帕尼在制备抑制肠道病毒71型嗜神经性病毒（EV‑A71）药物中的应用。本发明还包括相应的药物组合、使用方法、试剂盒等。本发明的研究表明，帕唑帕尼能够有效的抑制肠道病毒71型嗜神经性病毒的活性，帕唑帕尼治疗后RD细胞的病毒减少，并且帕唑帕尼对RD细胞中EV‑A71的抑制作用呈现剂量依赖性关系。本发明从已上市药品中筛选具有抗EV‑A71病毒活性的药物，将节约药物筛选过程中有关药物代谢、药物安全和毒理等方面的研究费用，降低药物研发的风险，为EV‑A71感染疾病的对症治疗和新药开发提供新的思路和途径。

Description

帕唑帕尼在制备抑制肠道病毒71型嗜神经性病毒药物中的 应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及肠道病毒71型嗜神经性病毒的一种新型抑制剂。具体而言，本发明涉及帕唑帕尼在制备抑制肠道病毒71型嗜神经性病毒药物中的应用。
背景技术
肠道病毒71型(EnterovirusA71，EV-A71)是引起婴幼儿手足口病(hand-foot andmouth disease；HFMD)主要病原体之一。肠病毒在病毒学上的分类是属于微小病毒科(picornaviridae)中的肠病毒群(enterovirus)。人类肠病毒71型于1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来的，这些病毒可被培养在恒河猴肾脏细胞(rhesus monkey kidney cell；RhMK)及人胚二倍体细胞(human fetal diploidcell)中。EV-A71为目前肠病毒群中最晚发现的病毒，其感染性强且致病率高，尤其是神经系统方面的并发症。
作为一种嗜神经性病毒，肠道病毒71型属于小RNA病毒科肠道病毒属，是引起手足口病、咽峡炎、疱疹的主要病原体之一。手足口病是全球性疾病，在我国各地全年均有发生，发病率为每10万人37.01～205.06例，病死率为每10万人6.46～51.00例；在手足口病的实验室病原学诊断结果中，EV-A71阳性比例占44％，重症病例中EV-A71阳性占74％，死亡病例中占93％；EV-A71感染导致的手足口病常见于婴幼儿。疾病控制率不够理想。
目前检测肠道病毒之方式除了传统的病毒培养鉴定法外，国内已有生物科技公司利用生物芯片(Biochip)技术研发出"肠道病毒鉴定芯片"(EV typing chip)，可快速检测出肠病毒之型别，不致延误病患就诊治疗的首要时机。因肠道病毒感染易引起并发症，且往往在一星期内即转成重症，所以若能提早确知所感染的病毒类型，即可第一时间确定对症治疗的方法。
预防EV-A71感染最有效的方法是对适龄儿童接种EV-A71疫苗；尽管目前已有疫苗上市，但尚缺乏有效的免疫持久性研究数据，其免疫效力和持续时间仍有待于进一步验证。
目前，临床上尚缺乏特效的抗EV-A71感染药物，抗EV-A71药物的研究多处于基础实验阶段，高效抗病毒药物的缺乏仍是一个亟待解决的问题。由于新药开发耗时长、费用高、风险大，从已上市药品中筛选具有抗EV-A71病毒活性的药物，将节约药物筛选过程中有关药物代谢、药物安全和毒理等方面的研究费用，降低药物研发的风险，为EV-A71感染疾病的对症治疗和新药开发提供新的思路和途径。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新的抗EV-A71病毒活性的药物。
本发明要解决的另一个技术问题是提供帕唑帕尼的新用途。
一方面，本发明提供了帕唑帕尼在制备抑制病毒药物中的应用，所述的病毒是肠道病毒71型嗜神经性病毒EV-A71。
较好的，所述的药物是抑制EV-A71病毒活性的药物。
进一步的，所述的药物是降低EV-A71病毒活力、病毒载量或者VP1蛋白表达量的药物。
帕唑帕尼(Pazopanib)是由葛兰素史克公司研发的一种可干扰顽固肿瘤存活和生长所需的新血管生成的新型口服血管生成抑制剂。靶向作用于血管内皮生长因子受体(VEGFR)，通过抑制对肿瘤供血的新血管生成而起作用。适用于晚期肾细胞癌(一种在肾小管中发现癌细胞的肾癌类型)、软组织肉瘤(STS)、上皮性卵巢癌和非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗。目前主要用于治疗晚期肾细胞癌患者。
帕唑帕尼的基本信息如下：
外文名称：Pazopanib；5-[[4-[(2,3-dimethyl-2H-indazol-6-yl)methylamino]-2-pyrimidinyl]amino]-2-methylbenzenesulfonamide；Votrient；
中文名称：5-[[4-[2,3-二甲基-2H-吲哚-6-基)甲氨基]-2-嘧啶基]氨基]-2-甲基-苯磺酰胺；
分子式：C21H23N7O2S；
分子量：437.52；
CAS登录号：444731-52-6。
另一方面，本发明提供了一种抑制体外细胞中EV-A71病毒的方法，所述的方法包括以下步骤：
获得含有EV-A71病毒的体外培养细胞；和/或在含有EV-A71病毒的体外培养细胞的培养环境中添加帕唑帕尼，并孵育。
较好的，加入的帕唑帕尼并使之在体外培养细胞的培养环境中均匀分布，帕唑帕尼在体外培养细胞的培养环境中的终浓度不少于0.5μM，通常为1-25μM，更好的是1-10μM，优选的为5-10μM或者1-5μM，例如，0.8、1.0、1.3、2.5、3.0、5.0、7.0、8.0、10.0、12.5、15.0、18.0、20.0、22.5、25μM，等等。
较好的，加入的帕唑帕尼并使之在体外培养细胞的培养环境中均匀分布，孵育的时间不少于8小时；更好的，孵育的时间不少于12小时。在本发明的一个实施例中，帕唑帕尼加入体外培养细胞的培养环境中后孵育的时间不少于24小时。
本发明中，获得含有EV-A71病毒的体外培养细胞可以通过常规方法获得，例如将病毒颗粒置于细胞的培养环境中，或者在细胞中表达EV-A71病毒或者其核心组分。在本发明的一个实施例中，所述的细胞是体外培养的RD细胞。
再一方面，本发明提供了一种帕唑帕尼药物组合物，所述的偶联物含有帕唑帕尼和
a)与标记物连接的载体，或者
b)与固体连接的衔接体。
可选的，本发明提供一种帕唑帕尼药物组合物,其包含肠道病毒71型嗜神经性病毒抑制剂或其任何药学上可接受的盐,酯或前药。药学上可接受的盐,酯或前药包括但不限于：硫酸盐,二甲基异山梨醇,
Figure BDA0003655230040000031
20-80,环糊精(例如
Figure BDA0003655230040000032
),角鲨烯,第二种丙二醇,聚乙二醇(最好是低分子量,例如PEG400),聚山梨酯,泊洛沙姆,聚氧基和它们的组合。
再一方面，本发明提供了一种帕唑帕尼抑制EV-A71病毒的试剂盒，该试剂盒含有以帕唑帕尼为有效成分、辅以药学上可接受的辅料的抗EV-A71病毒药物和盛放药物的容器。
再一方面，本发明提供了一种帕唑帕尼抑制VP1蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
A)获取VP1蛋白或者产生VP1蛋白的细胞；
B)获取含有帕唑帕尼成分的药剂；
C)将含有帕唑帕尼成分的药剂与产生VP1蛋白的细胞或者VP1蛋白接触。
再一方面，本发明提供了一种抑制肠道病毒71型嗜神经性病毒的方法，该方法包括以下步骤：
i)获取含有帕唑帕尼成分的药剂；和/或
ii)将含有帕唑帕尼成分的药剂与肠道病毒71型嗜神经性病毒接触；
其中，含有帕唑帕尼成分的药剂含有帕唑帕尼和药学上可接受的辅料、盐或者载体。
本发明中，用于治疗的药物不仅会因所选的特定抑制剂而异,而且还取决于使用途径,需要哪种治疗方法以及患者的年龄、体重和状况，最终将由主治医师决定。一般而言,合适的剂量可以在约0.005的范围内至每天约30mg/kg体重,最好在0.05的范围内到10mg/kg/天。所需剂量可以方便地以单剂量或以适当的间隔(例如两次,20次)分次服用每天三,四或更多剂。根据治疗需要和/或预防,所需剂量也可以是,例如,每次两天,每三天一次,甚至每周一次。该组合物方便地以单位剂型给药；优选地,单位剂量。对于含有0.5至1500mg,方便地1至1000mg,最多25的示例每单位剂型方便地含有5至700mg活性成分。
本发明的帕唑帕尼药物组合物通常将通过口服给药,肠胃外,静脉内,肌内,皮下或其他注射剂途径,颊,直肠,阴道,经皮和/或鼻腔途径和/或通过以药学上可接受的剂型吸入。取决于待治疗的疾病和患者以及给药途径,组合物可以不同的剂量给药。药物组合物包括但不限于那些合适的药物组合物用于口腔,直肠,鼻腔,局部(包括颊和舌下),透皮,阴道或肠胃外(包括肌肉内,皮下和静脉内)给药或以适合于通过以下方式给药的形式吸入或吹入。
该组合物在适当的情况下可以是方便地以离散的剂量单位显示,可以通过药学领域众所周知的任何方法。制药业适合口服的组合物方便地列为独立包装的单位,例如胶囊,扁囊剂或药片,每个都包含一个预定量的活性物质。口服片剂和胶囊可能含有常规药物赋形剂,例如粘合剂,填充剂,润滑剂,崩解剂或润湿剂。可以根据方法对片剂进行包衣本领域已知的。可以将组合物配制成用于肠胃外给药的形式(例如通过注射(例如推注或连续输注),并且可以是小剂量安瓿瓶中的单位剂型形式输注或添加了防腐剂的多剂量容器中。组合物可采用悬浮液,溶液或油性或水性介质中的乳化液,可能含有配方剂例如悬浮剂,稳定剂和/或分散剂。
以帕唑帕尼，通常的形式是片剂，用量为800mg口服每天1次不和食物一起服药(至少在进餐前1小时或后2小时)。基线中度肝损伤–口服200mg每天1次。严重肝损伤患者不建议使用。
在其临床测试中，曾观察到血压增高并且是与血浆帕唑帕尼稳态谷浓度有关。
帕唑帕尼的QT延长潜能被评估为失控的一部分。在晚期癌症患者的一项开放，剂量递增研究。63例患者接受帕唑帕尼的剂量范围从50至2,000mg每天。在第1天系列采集ECGs和在第8，15，和22天采集单次给药前ECGs评价帕唑帕尼对QTc间隔的影响。2/63例患者有QTcF(Fridericia法校正QT)>500msec和3例患者有QTcF从基线增加>60msec。
吸收:帕唑帕尼口服吸收，给药后达峰浓度中位时间2至4小时。每天给药800mg导致几何均数AUC和Cmax分别为1,037hr g/mL和58.1g/mL(等同于132M)。在帕唑帕尼剂量超过800mg时AUC或Cmax无一致增加。
分布:帕唑帕尼在体内与人血浆蛋白的结合大于99％在范围10至100g/mL无浓度依赖性。体外研究提示帕唑帕尼是P-糖蛋白(Pgp)和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)的一种底物。
代谢:体外研究证实帕唑帕尼被CYP3A4代谢与CYP1A2和CYP2C8贡献次要。
消除:给予推荐剂量800mg后帕唑帕尼平均半衰期为30.9小时。主要通过粪消除，肾消除占给药剂量的<4％。
进食后帕唑帕尼与食物重复混合。帕唑帕尼与一种高脂或低脂餐给药导致AUC和Cmax增加约2倍。所以，帕唑帕尼应进餐前至少1小时或进餐后2小时给药。
提供以下示例以说明本发明并不局限于此,并且不应认为是对本发明的限制。以下是组合物的许多非限制性实例包含稳定的无定形杂化纳米颗粒的例子。缩写的意义如下:
“I”代表病毒抑制剂帕唑帕尼；“P”代表聚合物稳定和形成基质的组分；“S”代表增溶剂；
“I+P”代表帕唑帕尼抑制剂与聚合物稳定和形成基质的成分的物理混合物,即无需进一步处理；
“I+S”代表帕唑帕尼抑制剂与增溶剂的物理混合物；
“I+P+S”代表抑制剂的物理混合物,聚合物稳定和形成基质的成分和增溶剂；
“I/P”代表具有帕唑帕尼抑制剂的稳定,无定形杂化纳米颗粒以及聚合物稳定和基质形成组分；
“I/P+S”代表稳定的无定形杂化纳米粒子,具有15抑制剂和聚合物稳定形成基质的组分以及添加单独的增溶剂；
“I/P/S”表示稳定,无定形的杂化纳米粒子,具有抑制剂,聚合物稳定和形成基质的成分以及增溶剂。
本发明中,术语“组合物”旨在涵盖包含指定量的指定成分的产品,以及直接或间接地由指定量的指定成分的组合产生的任何产品。
术语“治疗”是指逆转,减轻,抑制或减缓这些术语适用的疾病,病症或病状或此类疾病,病症或病状的一种或多种症状的进展。
除非另有说明,否则成分的所有百分比均为每体积重量(w/v),除非另有说明,否则w/v百分比是指最终组合物的重量百分比。
如本发明所使用的,被定义为“大约”每个特定值的,与量,重量等有关的所有数值为正负10％。例如,短语“约5％w/v”应理解为“4.5％至5.5％w/v”。因此,权利要求的范围涵盖在要求保护的值的10％以内的量。
术语“药学上可接受的”描述了不是生物学上或其他方面不期望的材料,即,不会引起不可接受水平的不期望的生物学作用或以有害的方式相互作用的材料。
本发明中,术语“有效量”是指足以影响期望的生物学作用,例如有益结果的量,包括但不限于预防,减少,减轻或消除疾病或病症的体征或症状。因此,药物组合物或方法的每种活性成分的总量足以显示有意义的受试者益处。因此,“有效量”将取决于其被施用的环境。有效量可以一种或多种预防或治疗性给药方式给药。
术语“前药”是指化合物,包括本发明化合物的单体和二聚体,其具有可裂解的基团并在生理条件下变为在体内具有药物活性的化合物。
本发明中,“盐”是指保留母体化合物的生物学效力和性质并且在所施用的剂量下对生物学无害或以其他方式无害的那些盐。本发明化合物的盐可以由无机或有机酸或碱制备。
本发明的化合物可以以衍生自无机或有机酸或碱的药学上可接受的盐形式使用。短语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内,适合与人和低等动物的组织接触而没有过度毒性,刺激性,过敏反应等的盐,并且与盐类相当。合理的收益/风险比。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。例如,S.M.Berge等1977年在《药物科学》详细描述了药学上可接受的盐。
这些盐可以在本发明化合物的最终分离和纯化过程中原位制备,或者通过使游离碱官能团与合适的有机酸反应而分开制备。代表性的酸加成盐包括但不限于乙酸盐,己二酸盐,藻酸盐,柠檬酸盐,天冬氨酸盐,苯甲酸盐,苯磺酸盐,硫酸氢盐,丁酸盐,樟脑酸盐,樟脑磺酸盐,二葡萄糖酸盐,甘油磷酸酯,半硫酸盐,庚酸盐,己酸盐,富马酸盐,盐酸盐,氢溴酸盐,,2-羟基乙磺酸盐(异硫氰酸盐),乳酸盐,马来酸盐,甲磺酸盐,烟酸盐,2-萘磺酸盐,草酸盐,棕榈酸酯,果胶酸盐,过硫酸盐,3-苯基丙酸盐,苦味酸盐,新戊酸酯,丙酸盐,琥珀酸盐,酒石酸盐,硫氰酸盐,碳酸氢盐,磷酸盐,谷氨酸盐对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。另外,碱性含氮基团可以用诸如低级烷基卤化物如甲基,乙基,丙基和丁基氯化物,溴化物和碘化物的季铵化剂进行季铵化。硫酸二烷基酯,如二甲基,二乙基,二丁基和二戊基硫酸盐；长链卤化物,例如癸基,月桂基,肉豆蔻基和硬脂基氯化物,溴化物和碘化物；芳烷基卤化物,例如苄基和苯乙基溴化物等。由此获得水溶性或油溶性或分散性产物。可用于形成药学上可接受的酸加成盐的酸的实例包括诸如盐酸,氢溴酸,苹果酸,硫酸和磷酸的无机酸,以及诸如草酸,苹果酸,马来酸,甲磺酸的有机酸,琥珀酸和柠檬酸。优选的酸加成盐是由甲磺酸,苹果酸和磷酸制备的。
碱性加成盐可以在本发明化合物的最终分离和纯化过程中原位制备,方法是使含羧酸的部分与合适的碱,例如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物,碳酸盐或碳酸氢盐,或与氨或有机伯,仲或叔胺。药学上可接受的盐包括但不限于基于碱金属或碱土金属的阳离子,例如锂,钠,钾,钙,镁和铝的盐等,以及无毒的季铵盐和胺阳离子,包括铵,四甲基铵,四乙基铵甲基铵,二甲基铵,三甲基铵,三乙基铵,二乙基铵和乙基铵等。可用于形成碱加成盐的其他代表性有机胺包括乙二胺,乙醇胺,二乙醇胺,哌啶,哌嗪等。
本发明中,术语“酯”由式-OC(O)A表示1或-C(O)OA1,其中A1可以是烷基,环烷基,烯基,环烯基,炔基,环炔基,芳基,杂芳基或其他合适的取代基。
本发明中,术语“疾病控制率“(DCR)的计算公式是DCR＝CR+PR+SD。CR和PR分别指完全缓解和部分缓解，SD(stable disease)指病情稳定，基本已控制。
本发明中,术语“hpi”是指hour post infection，感染持续小时。
本发明中,术语“CC50”是指将细胞活力降低50％所需的化合物浓度。
本发明中,术语“EC50”是指达到50％保护免受病毒诱导的细胞致病性所需的化合物浓度。
本发明中,术语“SI”是指选择性指数，为CC50/EC50的比率。
本发明中,术语“患者”不限于人，或其他动物。
本发明中,术语“逐滴”是指将一种溶液递增地添加至另一溶液的任何方法。
本发明的有益效果在于：帕唑帕尼对EV-A71的抗病毒作用好，在无毒性浓度下对EV-A71感染的RD细胞均有保护作用，经帕唑帕尼治疗后RD细胞的病毒减少，在RD细胞中对EV-A71呈现剂量依赖性抑制。本发明从已上市药品中筛选具有抗EV-A71病毒活性的药物，将节约药物筛选过程中有关药物代谢、药物安全和毒理等方面的研究费用，降低药物研发的风险，为EV-A71感染疾病的对症治疗和新药开发提供新的思路和途径。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1.实施例1中RD细胞中帕唑帕尼的半数细胞毒性浓度CC50；其中，RD细胞用指定浓度的帕唑帕尼抑制剂处理，
Figure BDA0003655230040000071
发光细胞活力测定用于测量帕唑帕尼抑制剂的CC50；
图2.实施例2中帕唑帕尼治疗后RD细胞的减少；其中，用EV-A71以0.1的MOI接种用DMSO或帕唑帕尼抑制剂(10μM)处理的RD细胞，在24h后，以DMSO处理后的EV-A71病毒基于拷贝数为100％，图2A为细胞裂解物中相对病毒载量(％)；图2B为上清液中相对病毒载量(％)；图2C在TCID50测定中，还确定了抑制剂处理样品的病毒滴度；图2D通过蛋白质印迹分析EV-A71的VP1蛋白，GAPDH用作上样对照；
图3.实施例3中帕唑帕尼抑制剂在RD细胞中对EV-A71的剂量依赖性抑制；
用指定浓度的帕唑帕尼抑制剂处理的RD细胞以0.1的MOI接种EV-A71，24小时后，使用RT-qPCR分析，发现图3A细胞裂解物和图3B上清液中帕唑帕尼对EV-A71感染的剂量依赖性抑制,结果代表用指定浓度的帕唑帕尼抑制剂处理的细胞中的病毒载量相对于DMSO处理的细胞中的病毒载量；图3C在TCID50测定中，还确定了抑制剂处理样品的病毒滴度(C)；图3D通过蛋白质印迹分析EV-A71 VP1蛋白，GAPDH用作上样对照。
具体实施方式
帕唑帕尼是一个多靶点的抑制剂，作用于VEGFR-1、2、3，PDGFR-α和-β，FGFR，c-Kit和c-Fms，IL-2诱导的T细胞激酶，淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶，集落刺激因子1受体。已获批用于治疗晚期肾细胞癌，也可用于治疗软组织肉瘤、晚期卵巢癌。对子宫颈癌和分化型的甲状腺癌也显示出了一定的应用前景。
下面将对本发明帕唑帕尼在制备抑制肠道病毒71型嗜神经性病毒EV-A71药物中的应用通过实施例进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1
帕唑帕尼对RD细胞的毒性作用
为了评估帕唑帕尼(Pazopanib)的抗病毒作用，本发明测量了RD细胞中帕唑帕尼的50％细胞毒性浓度(CC50)，以排除帕唑帕尼对RD细胞活力的不利影响。
用指定浓度的帕唑帕尼处理RD细胞，使用
Figure BDA0003655230040000081
发光细胞活力试剂测定帕唑帕尼的半数细胞毒性浓度(CC50)。相应结果见图1。根据上述实验检测结果计算得出帕唑帕尼对RD细胞的CC50为226.1μM。
实施例2
帕唑帕尼对EV-A71的抗病毒作用
根据实施例1的细胞毒性结果，本发明首先选择10μM作为药物处理RD细胞的浓度。接下来，用MOI为0.1的EV-A71感染被DMSO或指定的抑制剂(10μM)处理过的RD细胞，24h后，帕唑帕尼对EV-A71的抗病毒效果通过病毒载量，病毒滴度和病毒结构蛋白VP1的表达情况进行对比，相应结果见图2A至图2D：
以EV-A71为100％，如图2A帕唑帕尼在细胞裂解物中相对病毒载量0.021372％和图2B上清液中的相对病毒载量0.15597％，如图2C Pazopanib的病毒滴度TCID50(C)的为1.59×104，如表1中所示，图2D通过蛋白质印迹分析不同组别中EV-A71 VP1的蛋白含量，GAPDH用作上样对照。数据显示三个独立实验的平均值和SD。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。****P<0.0001。
表1帕唑帕尼对EV-A71的抗病毒作用
药物 细胞裂解物(相对值％) 上清液(相对值％) TCID<sub>50</sub>/ml
EV-A71 100 100 5.01×10<sup>7</sup>
Pazopanib 0.021372 0.15597 1.59×10<sup>4</sup>
根据相应实验检测结果计算得出，帕唑帕尼在无毒性浓度下对EV-A71感染的RD细胞有很好的保护作用，即帕唑帕尼在RD细胞上对EV-A71都有抑制作用，提示帕唑帕尼具有抗EV-A71病毒活性。
实施例3
帕唑帕尼可以剂量依赖地抑制EV-A71感染和复制
用MOI为0.1的EV-A71感染被DMSO或指定的抑制剂浓度处理过的RD细胞。24h后，帕唑帕尼对EV-A71的抗病毒效果通过病毒载量，病毒滴度和病毒结构蛋白VP1的表达情况进行测定，相应结果见图3A至图3D所示：
用指定浓度的帕唑帕尼抑制剂处理的RD细胞以0.1的MOI接种EV-A71，24小时，以DMSO处理的细胞为100％对照。使用RT-qPCR分析，图3A细胞裂解物中0.5、1.0、5、10、25μM浓度的帕唑帕尼抑制剂处理的RD细胞中相对病毒载量(％)分别约为：41.6、18.7、3、、1.4、0.5；图3B上清液中RD细胞中相对病毒载量(％)分别约为：59.1、31.6、13.2、8.7、1.3；图3C在TCID50测定中随着帕唑帕尼浓度增加，TCID50值从106降至104的，详见表2。
表2帕唑帕尼可以剂量依赖地抑制EV-A71感染和复制
Pazopanib 细胞裂解物(相对值％) 上清液(相对值％) TCID50/ml
DMSO 100 100 5.01×10<sup>6</sup>
0.5 41.6 59.1 2.82×10<sup>6</sup>
1 18.7 31.6 5.01×10<sup>5</sup>
5 3 13.2 2.82×10<sup>5</sup>
10 1.41 8.66 6.05×10<sup>4</sup>
25 0.506 1.34 1.91×10<sup>4</sup>
图3D所示,以GAPDH用作上样对照，通过蛋白质印迹分析0、0.5、1.0、10、25μM的帕唑帕尼处理后细胞中的EV-A71 VP1蛋白依次降低，当浓度为10μM时，VP1蛋白几乎检测不到。数据显示三个独立实验的平均值和SD。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。****P<0.0001。
实验结果表明，在一定的浓度范围内，随着帕唑帕尼浓度逐渐升高，病毒载量，病毒滴度和病毒结构蛋白VP1的表达逐渐下降，说明帕唑帕尼可以剂量依赖地抑制EV-A71的感染和复制。
实施例4
针对EV-A71的抗病毒活性、细胞毒性和选择性指数
本发明还评估了帕唑帕尼对EV-A71感染的CC50(将细胞活力降低50％所需的化合物浓度)和EC50(达到50％保护免受病毒诱导的细胞致病性所需的化合物浓度)，以及对应的选择性指数(Selectivity index,SI，即CC50/EC50)。
实验结果表明，帕唑帕尼在RD细胞中表现出较高的细胞毒性(226.1±27.55μM)，以0.89±0.02μM的半数最大有效浓度(EC50)有效抑制EV-A71感染，SI(selectivity index)为254.0，按照CC50/EC50计算。根据上述实验检测结果计算得出，帕唑帕尼在RD细胞中抗EV-A71感染的选择性指数为254.0，能够有效的抑制EV-A71病毒活性。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (11)

1.帕唑帕尼的用途，其特征在于，帕唑帕尼在制备抑制病毒药物中的应用，所述的病毒是肠道病毒71型嗜神经性病毒。
2.根据权利要求1所述的帕唑帕尼的用途，其特征在于，所述的药物是抑制EV-A71病毒活性的药物。
3.根据权利要求1所述的帕唑帕尼的用途，其特征在于，所述的药物是降低EV-A71病毒活力、病毒载量或者VP1蛋白表达量的药物。
4.一种帕唑帕尼抑制体外细胞中EV-A71病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
（1）获得含有EV-A71病毒的体外培养细胞；和/或
（2）在含有EV-A71病毒的体外培养细胞的培养环境中添加帕唑帕尼；
（3）孵育。
5.根据权利要求4所述帕唑帕尼抑制体外细胞中EV-A71病毒的方法，其特征在于，加入的帕唑帕尼并使之在体外培养细胞的培养环境中均匀分布，帕唑帕尼在体外培养细胞的培养环境中的终浓度不少于0.5μM，
或者孵育的时间不少于8小时。
6.根据权利要求4所述帕唑帕尼抑制体外细胞中EV-A71病毒的方法，其特征在于，加入的帕唑帕尼的终浓度为1-25μM，
或者孵育的时间不少于12小时。
7.根据权利要求4所述帕唑帕尼抑制体外细胞中EV-A71病毒的方法，其特征在于，加入的帕唑帕尼的终浓度为5-10μM，
或者孵育的时间不少于24小时，
或者所述的细胞是体外培养的RD细胞。
8.一种帕唑帕尼药物组合物，其特征在于，所述的偶联物含有帕唑帕尼和
a）与标记物连接的载体，或者
b）与固体连接的衔接体。
9.一种帕唑帕尼抑制EV-A71病毒的试剂盒，其特征在于，含有以帕唑帕尼为有效成分、辅以药学上可接受的辅料的抗EV-A71病毒药物和盛放药物的容器。
10. 一种帕唑帕尼抑制肠道病毒71型嗜神经性病毒的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
i）获取含有帕唑帕尼成分的药剂或者权利要求8所述的药物组合物；和/或
ii）将含有帕唑帕尼成分的药剂或者权利要求8所述的药物组合物与肠道病毒71型嗜神经性病毒接触；
其中，含有帕唑帕尼成分的药剂含有帕唑帕尼和药学上可接受的辅料或者载体。
11.一种帕唑帕尼抑制VP1蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
A）获取VP1蛋白或者产生VP1蛋白的细胞；
B）获取含有帕唑帕尼成分的药剂；
C）将含有帕唑帕尼成分的药剂与产生VP1蛋白的细胞或者VP1蛋白接触。
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