CN115089708A - 一种光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂及其制备方法与应用。通过尺寸变小策略促进纳米制剂在肿瘤间质传递，并有机结合功能化多肽修饰策略促进肿瘤细胞跨细胞传递，实现治疗剂在肿瘤实质的深层穿透，相较于单一策略具有更高的肿瘤组织穿透深度；并利用人血清白蛋白作为药物载体具有更优的生物安全性、体内循环稳定性；本发明通过变更负载治疗剂类型及热敏感键类型可以按需切换不同肿瘤的治疗疗法及外部可控的治疗模式。

Description

一种光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂及其制备方 法与应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂及其制备方法与应用。
背景技术
纳米技术的兴起使得基于高分子纳米微粒的肿瘤部位药物输送得到了广泛的关注。利用肿瘤具有增强的渗透性和滞留效应(EPR效应)，纳米尺寸的药物输送系统可以被动蓄积至肿瘤组织。然而致密的肿瘤间质和异常的肿瘤血管所产生的肿瘤间质高压,阻碍了纳米载药系统传递至肿瘤的核心部位,使得其对深层肿瘤细胞治疗效果不佳，并伴随较高的肿瘤复发和转移风险。
药物递送问题不仅出现在纳米药物上，而普遍出现于常见的化疗中，因此促进药物渗透深度是增强治疗效果的一个关键点，目前针对药物穿透问题有三种主流策略，分别是降低肿瘤细胞外基质密度、构建尺寸可变的纳米系统、修饰促进穿透的配体。已有的前人研究证明采用以上策略能够在一定程度上促进药物在肿瘤组织处的穿透，但单一的促穿透策略仍十分局限，药物渗透深度不能满足实际治疗要求，若将上述两种或三种策略结合起来可能会取得更好的效果。实验表明,较小粒径的纳米颗粒具有更好的穿透效果,但较小粒径在血液循环中容易被机体清除，而较大粒径的纳米颗粒具有更好的滞留效果但其穿透效果较差,因此粒径可变的纳米递药系统在促进肿瘤间质扩散中具有较高的研究价值。另一方面，纳米药物系统可借助跨细胞物质传递过程可实现向肿瘤深层穿透。已报道的研究结果显示在碳端具有C-end Rule(CendR)基序R/KXXR/K(X为任意氨基酸)的多肽可与肿瘤细胞表面的神经毡蛋白-1(NRP-1)特异性结合，继而激活特殊的CendR运输通路通过胞内/胞外物质传递过程渗透进入肿瘤实质。值得关注的是，NRP-1在远离血管营养缺乏的肿瘤细胞中有更高的表达，以便它们借由高效的CendR运输通路获取营养物质。而针对高转移性的癌症，降低肿瘤细胞外基质密度具有促进癌细胞转移的风险，新兴的超声可激活药物在面对高转移性癌细胞也很难凸显其自身的优势。因此在本发明中，我们联用构建尺寸可变的纳米系统和修饰促进穿透的配体这两种策略，通过热刺激响应型桥连键进行可逆交联并在外围修饰具有肿瘤穿透功能的CendR多肽，采用外源激光照射纳米药物实现尺寸变小，在穿透性多肽的辅助下，同时提升纳米药物系统的肿瘤间质扩散与跨细胞传递性能将有效提高其肿瘤穿透深度。
人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子量大约为66kDa，在血液中用于运输脂肪酸等，是血液中含量最高的蛋白，具有可生物降解、无毒、无抗原性等诸多特点,被认为是一个理想的药物载体。单个的HSA分子的尺寸在10nm以下，在肿瘤间质中具有较强的扩散能力。此外，HSA分子具有60个赖氨酸残基，其裸露出的自由氨基可以实现分子间交联，以及便捷地后期修饰。
发明内容
本发明的目的是构建一种光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂，利用其外源激光刺激响应型尺寸变小以及CendR多肽的辅助，同时提升纳米药物系统的肿瘤间质扩散与跨细胞传递性能，使其具有较大的肿瘤穿透深度，以高效抑制肿瘤生长。
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂的制备方法。
本发明的另一目的在于，提供上述制备方法制备得到的光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂。
本发明的另一目的在于，提供上述光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将光热治疗剂与白蛋白加入PBS溶液中搅拌得到载药白蛋白颗粒；
(2)将含桥连敏感键的化合物进行活化得到含桥连敏感键的化合物的琥珀酸酯；
(3)将步骤(2)中得到的含桥连敏感键的化合物的琥珀酸酯加入步骤(1)中得到的载药白蛋白颗粒中反应，反应后透析得到交联的白蛋白纳米颗粒；
(4)在步骤(3)中得到的白蛋白纳米颗粒中加入马来酰亚胺聚乙二醇琥珀酸酯交联，再加入具有肿瘤穿透性能的功能化多肽修饰，得到光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂。
步骤(1)中所述的光热治疗剂与人血清白蛋白的物质的量之比为1～100:1，优选为10:1。
步骤(1)中所述的光热治疗剂为吲哚菁绿或Cypate中的至少一种，优选为还包含化疗药物(阿霉素、紫杉醇、奥沙利铂、顺铂、喜树碱)或免疫佐剂(雷西莫特、咪喹莫特)的至少一种，更优选为吲哚菁绿。
步骤(1)中所述的治疗剂负载过程可以通过共价键轭合或是疏水相互作用实现。
步骤(1)中所述白蛋白为人血清白蛋白的水溶液。
步骤(2)中所述的含桥连敏感键的化合物为热敏感的偶氮键VA044、VA046B、V50或VA057中的至少一种，优选为VA057。
步骤(2)中所述的含桥连敏感键的化合物的两个末端均为羧基或可修饰为羧基，并可以通过进一步与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺反应得到两个末端均为琥珀酸酯结构。
步骤(2)中所述的活化的具体步骤为：将含桥连敏感键的化合物与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺加入水中活化，将末端修饰为琥珀酸酯结构得到含桥连敏感键的化合物的琥珀酸酯。
上述的含桥连敏感键的化合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1～3:1～3:1，优选为2:2:1。
步骤(2)中所述的活化的条件为活化1～3h，优选为2h。
步骤(3)中所述的含桥连敏感键的化合物的琥珀酸酯与步骤(1)中所述的白蛋白的摩尔比为1～64:1，优选为16～32:1，更优选为16:1。
步骤(3)中所述的反应的时间为1～24h，优选为8～12h，更优选为12h。
步骤(3)中所述的反应优选为在水相中进行。
步骤(3)中所述的透析的条件为将产物装入截留分子量为8～12kDa的透析袋在水中透析，优选为10kDa的透析袋。
步骤(3)中所述的透析时长为6～24h，优选8～12h；优选地，透析开始的前三小时，每半小时换一次水，之后每两小时换一次水。
步骤(4)中所述的马来酰亚胺聚乙二醇琥珀酸酯与步骤(1)中所述的白蛋白的摩尔比为1～10:1，优选为4:1。
步骤(4)中所述的交联的条件为搅拌30min～2h，优选为1h。
步骤(4)中所述的交联为通过酰胺反应进行交联。
步骤(4)中所述的具有肿瘤穿透性能的功能化多肽的氮端为半胱氨酸。
步骤(4)中所述的具有肿瘤穿透性能的功能化多肽为iRGD(序列为CRGDKGPDC)，LyP-1(序列为CGNKRTRGC)，tLyP-1(序列为CGNKRTR)及其他在碳端具有R/KXXR/K(X为任意氨基酸)这类CendR基序的多肽序列中的至少一种，优选为tLyP-1。
步骤(4)中所述的具有肿瘤穿透性能的功能化多肽与马来酰亚胺聚乙二醇琥珀酸酯的物质的量之比为0.8～1:1，优选为0.8:1。
步骤(4)中所述的修饰的条件为搅拌1～12h，优选为2～4h，更优选为2h。
步骤(4)中所述的修饰为通过迈克尔加成反应修饰。
一种光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂，通过上述制备方法制备得到。
上述光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂在制备治疗/抑制乳腺癌的药物中的应用。
本发明所制备的光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂可以在特定外源激光刺激下发生解体，实现尺寸由大到小转化。
本发明所制备的光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂的初始水合粒径为20～500nm，优选为50～300nm，更优选为50～200nm。
本发明所制备的光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂的解体后水合粒径为5～100nm，优选为5～30nm，更优选为5～20nm。
本发明所制备的光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂在尺寸变小及功能化多肽的辅助下能够有效穿透肿瘤实质，在模拟肿瘤组织中的穿透深度相较于不响应、未修饰的白蛋白纳米制剂有20～1000μm的提升。
本发明所制备的光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂可以在小鼠模型中有效抑制乳腺癌实体瘤的生长、转移及复发，并延长荷瘤小鼠的生存时间。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明通过尺寸变小策略促进纳米制剂在肿瘤间质传递，并有机结合功能化多肽修饰策略促进肿瘤细胞跨细胞传递，实现治疗剂在肿瘤实质的深层穿透，相较于单一策略具有更高的肿瘤组织穿透深度；
(2)本发明利用人血清白蛋白作为药物载体具有更优的生物安全性、体内循环稳定性；
(3)本发明通过变更负载治疗剂类型及热敏感键类型可以按需切换不同肿瘤的治疗疗法及外部可控的治疗模式。
附图说明
图1是光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂合成及在近红外光照下解体的示意图。
图2是不同多肽制备得到的纳米制剂的肿瘤细胞团穿透结果图。
图3是原位乳腺癌治疗实验的肿瘤生长曲线图。
图4是原位乳腺癌治疗实验后监测的小鼠生存曲线图。
图5是原位乳腺癌治疗21天后的肝脏H&E切片结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。
实验材料：
HSA人血清白蛋白(Sigma-Aldrich，美国)
ICG吲哚菁绿(百灵威，中国)
EDCl 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(阿拉丁，中国)
NHS N-羟基琥珀酰亚胺(阿拉丁，中国)
VA057偶氮二羧乙基-2-异丁基脒水合物(日本和光纯药工业株式会社，日本)
Mal-PEG2000-NHS马来酰亚胺聚乙二醇琥珀酸酯(芃圣生物，中国)
tLyP-1序列为CGNKRTR的直链7肽(诺优生物科技，中国)
乱序tLyP-1序列为RKCNGTR的直链7肽(诺优生物科技，中国)
实施例1
1)利用疏水相互作用力，将3μmol光热治疗剂ICG和0.3μmol人血清白蛋白于1mLPBS溶液中预混搅拌负载得到载药白蛋白颗粒；
2)热敏感桥连键偶氮二羧乙基-2-异丁基脒水合物(VA057，AZO)两端的羧基用琥珀酸酯活化，具体为分别称取16μmol EDCl、16μmol NHS和8μmol AZO于600μL pH＝5.0的水中室温搅拌活化2h；
3)按照每0.3μmol人血清白蛋白(用PBS稀释到原来的十倍的体积)加入4.8μmolAZO的比例，将步骤2)中制备的热敏感桥连键偶氮二羧乙基-2-异丁基脒水合物的琥珀酸酯滴加到步骤1)所得的载药白蛋白颗粒中，在水相中室温搅拌反应12h实现交联；
4)将步骤3)中制备得到的交联的白蛋白纳米颗粒在截留分子量为10kDa的透析袋中对水透析8h以除去小分子；
5)向步骤4)中透析后的白蛋白纳米颗粒中，按每0.3μmol人血清白蛋白加入1.2μmol的比例加入Mal-PEG2000-NHS进行酰胺反应交联，搅拌1h后，再加入1μmol具有肿瘤穿透性能的功能化多肽tLyP-1继续反应2h通过迈克尔加成反应进一步修饰，最终得到肿瘤深层穿透型白蛋白纳米制剂ICG@HSA-AZO-tLyP-1。
用体外肿瘤细胞团穿透深度实验验证肿瘤深层穿透型白蛋白纳米制剂ICG@HSA-AZO-tLyP-1的深层穿透性能，如图2的ICG@HSA-AZO-tLyP-1数据所示，ICG@HSA-AZO-tLyP-1能在细胞团的120μm处有效深层穿透。与此同时如图3～5所示，在抑制小鼠原位乳腺癌的实验中，ICG@HSA-AZO-tLyP-1能有效地抑制小鼠原位乳腺癌的生长、转移和复发，并可以延长荷瘤小鼠的生存时间。
实施例2
该对照例使用乱序无功能多肽修饰白蛋白纳米制剂
1)利用疏水相互作用力，将3μmol光热治疗剂ICG和0.3μmol人血清白蛋白于1mLPBS溶液中预混搅拌负载得到载药白蛋白颗粒；
2)将热敏感桥连键偶氮二羧乙基-2-异丁基脒水合物(VA057，AZO)两端的羧基用琥珀酸酯活化,具体为分别称取16μmol EDCl、16μmol NHS和8μmol AZO于pH＝5.0的水中活化2小时；
3)按照每0.3μmol人血清白蛋白(用PBS稀释到原来的十倍的体积)加入4.8μmolAZO的比例，将步骤2)中制备的热敏感桥连键偶氮二羧乙基-2-异丁基脒水合物的琥珀酸酯滴加到步骤1)所得的载药白蛋白颗粒中，在水相中反应12h实现交联；
4)将步骤3)中制备得到的交联的白蛋白纳米颗粒在截留分子量为10kDa的透析袋中对水透析以除去小分子；
5)向步骤4)中透析后的白蛋白纳米颗粒中，按每0.3μmol人血清白蛋白加入1.2μmol的比例加入Mal-PEG2000-NHS进行酰胺反应，搅拌1h后，再加入1μmol不具有肿瘤穿透性能的乱序tLyP-1多肽继续反应2h通过迈克尔加成反应进一步实现修饰,得到最终肿瘤深层穿透型白蛋白纳米制剂对照用的Random ICG@HSA-AZO。
用体外肿瘤细胞团穿透深度实验验证肿瘤深层穿透型白蛋白纳米制剂对照2中Random ICG@HSA-AZO的深层穿透性能，如图2的Random ICG@HSA-AZO数据所示，RandomICG@HSA-AZO在细胞团的80μm处穿透深度有限，不能实现整个细胞团的穿透。与此同时如图3～5所示，在抑制小鼠原位乳腺癌的实验中，Random ICG@HSA-AZO不能有效地抑制小鼠原位乳腺癌的生长、转移和复发。
实施例3
水合粒径测试：将实施例1和2制备得到的白蛋白纳米制剂用超纯水配制成1mg/mL的水溶液，使用动态光散射粒度仪Nano-ZS ZEN3600(Malvern Instruments,UK)检测。测三次取平均值后四舍五入，按整数记录。
稳定性：将实施例1和2制备得到的白蛋白纳米制剂用DMEM完全培养基配制成1mg/mL的溶液，在37℃孵育24h后观察，出现肉眼可见浑浊的记为不稳定，反之记为稳定。
肿瘤细胞团穿透深度：制备300～500μm无血管4T1肿瘤细胞团，将96孔板的底铺上1％(w/v)的琼脂糖以免细胞粘附，随后，以1000个细胞每孔的密度将4T1细胞(购自武汉普诺赛生命科技有限公司)接种于板中轻轻摇动5min，之后加入DMEM完全培养基在37℃的条件下培养7天，每2天更换新鲜的培养基，最终得到致密均一的细胞团用于肿瘤细胞团穿透实验。之后分别与实施例1制备的带穿透性多肽与实施例2制备的不带穿透性多肽的白蛋白材料共孵育4h后用808nm近红外光照射30s，随后用新鲜的培养基洗涤3次后，通过激光共聚焦显微镜观察荧光信号在肿瘤组织的穿透情况，将各组荧光信号消失处到3D肿瘤细胞团最外圈边缘的距离记作模拟肿瘤组织穿透深度，四舍五入后按整数记录。
治疗验证实验：进行原位乳腺癌荷瘤小鼠治疗实验评估白蛋白材料穿透与治疗的效果，将4T1细胞(每只小鼠5×106个细胞)注射到雌性BALB/c小鼠(5～6周，购自广东斯嘉景达生物科技有限公司)的右侧乳腺脂肪垫中构建小鼠的原位乳腺癌动物模型。当肿瘤体积达到100mm3时，将小鼠随机分为3组(每组5只小鼠)，通过尾静脉分别注射PBS、RandomICG@HSA-Azo和ICG@HSA-Azo-tLyP-1(ICG浓度为10mg kg-1)，小鼠肿瘤部位光照分为两个阶段：在注射后8小时进行第一次光照(808nm，0.5W cm-2，1min)和注射后24小时进行第二次光照(808nm,1.0W cm-2，3min)。记录治疗过程中的肿瘤生长情况，每三天用游标卡尺测量肿瘤体积，计算公式为V＝W2L/2，其中W和L分别为肿瘤的最短和最长直径，小鼠的生存情况以及制作肝脏H&E切片以观察转移结节情况(每组牺牲一只小鼠，n＝5)。在为期三周的治疗期间，PBS处理的小鼠在双阶段光照后的平均肿瘤体积明显增加，最终达到400mm3，表明单独NIR照射对肿瘤的抑制作用微不足道。用Random ICG@HSA-Azo在双阶段光照治疗下的小鼠表现出轻微的肿瘤抑制作用，5只小鼠中有3只出现大于200mm3的肿瘤。由于ICG@HSA-Azo在肿瘤部位的积累和渗透有限，肿瘤实质内部恶性细胞的光热治疗效果不佳，Random ICG@HSA-Azo组的一个肿瘤甚至增加到初始体积的12倍。然而，ICG@HSA-Azo-tLyP-1表现出明显的肿瘤抑制作用，五分之四的小鼠在15天后没有可检测到的肿瘤负荷，仅剩下的肿瘤负荷小于200mm3(图3)。ICG@HSA-Azo-tLyP-1可以通过尺寸可变的被动靶向和HP引导的选择性肿瘤结合在肿瘤部位积累，然后在第一阶段的温和光照下分解成小尺寸的组分。ICG@HSA-Azo-tLyP-1及其组分可以减少向内扩散的阻碍和HP启动的CendR转运途径，可以深入穿透肿瘤组织，在不同深度的肿瘤细胞之间实施有效的光热治疗。PBS组和Random ICG@HSA-Azo组小鼠肝转移结节较多，而ICG@HSA-Azo-tLyP-1组小鼠的转移灶可忽略不计(图5)，说明有效抑制原发肿瘤可以防止肿瘤转移。通过双阶段光照照射，ICG@HSA-Azo-HP治疗组同时抑制原发性肿瘤和肿瘤细胞的侵袭和扩散，将存活时间从50天(PBS组)延长到至少84天(图4)。
表1不同多肽制备得到的纳米制剂的属性对比
Figure BDA0003705391200000091
以上实验结果证明，本发明所制备的光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂可以通过尺寸变小策略促进纳米制剂在肿瘤间质传递，并有机结合功能化多肽修饰策略促进肿瘤细胞跨细胞传递，实现治疗剂在肿瘤实质的深层穿透，相较于单一策略具有更高的肿瘤组织穿透深度；在小鼠模型中能够有效抑制乳腺癌实体瘤的生长、转移及复发，并延长荷瘤小鼠的生存时间，通过变更负载治疗剂类型及热敏感键类型可以按需切换不同肿瘤的治疗疗法及外部可控的治疗模式，具有制备治疗/预防乳腺癌的药物的前景。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将光热治疗剂与白蛋白加入PBS溶液中搅拌得到载药白蛋白颗粒；
(2)将含桥连敏感键的化合物进行活化得到含桥连敏感键的化合物的琥珀酸酯；
(3)将步骤(2)中得到的含桥连敏感键的化合物的琥珀酸酯加入步骤(1)中得到的载药白蛋白颗粒中反应，反应后透析得到交联的白蛋白纳米颗粒；
(4)在步骤(3)中得到的白蛋白纳米颗粒中加入马来酰亚胺聚乙二醇琥珀酸酯交联，再加入具有肿瘤穿透性能的功能化多肽修饰，得到光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的光热治疗剂与人血清白蛋白的物质的量之比为1～100:1，优选为10:1；
步骤(1)中所述的光热治疗剂为吲哚菁绿或Cypate中的至少一种；
步骤(1)中所述白蛋白为人血清白蛋白的水溶液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的含桥连敏感键的化合物为热敏感的偶氮键VA044、VA046B、V50或VA057中的至少一种；
步骤(2)中所述的活化的条件为活化1～3h，优选为2h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的活化的具体步骤为：
将含桥连敏感键的化合物与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺加入水中活化，将末端修饰为琥珀酸酯结构得到含桥连敏感键的化合物的琥珀酸酯。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
所述的含桥连敏感键的化合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1～3:1～3:1。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的含桥连敏感键的化合物的琥珀酸酯与步骤(1)中所述的白蛋白的摩尔比为1～64:1；
步骤(3)中所述的反应的时间为1～24h；
步骤(3)中所述的反应为在水相中进行；
步骤(3)中所述的透析的条件为将产物装入截留分子量为8～12kDa的透析袋在水中透析；
步骤(3)中所述的透析时长为6～24h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的马来酰亚胺聚乙二醇琥珀酸酯与步骤(1)中所述的白蛋白的摩尔比为1～10:1；
步骤(4)中所述的交联的条件为搅拌30min～2h；
步骤(4)中所述的具有肿瘤穿透性能的功能化多肽的氮端为半胱氨酸；
步骤(4)中所述的具有肿瘤穿透性能的功能化多肽与马来酰亚胺聚乙二醇琥珀酸酯的物质的量之比为0.8～1:1；
步骤(4)中所述的修饰的条件为搅拌1～12h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的具有肿瘤穿透性能的功能化多肽为iRGD，LyP-1，tLyP-1及其他在碳端具有R/KXXR/K这类CendR基序的多肽序列中的至少一种。
9.一种光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂，其特征在于通过权利要求1～8任一制备方法制备得到。
10.权利要求9所述的光热响应型肿瘤深层穿透的白蛋白纳米制剂在制备治疗/抑制乳腺癌的药物中的应用。
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